CN101850126A - 一种预防和/或治疗前列腺癌的产品 - Google Patents
一种预防和/或治疗前列腺癌的产品 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种预防和/或治疗前列腺癌的产品。一种具有治疗和/或预防前列腺癌功能的产品,其活性成分为以基因EphA3、蛋白EphA3、基因EphA3激活或介导的信号通路和/或蛋白EphA3激活或介导的信号通路为靶点的物质。本发明进一步设计了敲低EphA3基因表达的1504-RNAi,实验证明,该RNAi分子能够阻断前列腺癌细胞增殖、增加细胞粘附、降低癌细胞运动迁移能力,可阻断前列腺癌分子向神经内分泌分化,从而抑制前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变。对其分子机制研究表明,1504-RNAi能够抑制在肿瘤细胞中被广泛激活的AKT和ERK信号通路,为1504-RNAi阻断肿瘤进展奠定了理论基础。因此,本发明在前列腺癌的预防和治疗领域中将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防和/或治疗前列腺癌的产品。
背景技术
前列腺癌是男性泌尿生殖系统肿瘤中最重要的一种。据2009年美国癌症协会的统计,前列腺癌发病率位列第一,占男性肿瘤的25%。死亡率9%,仅次于肺癌位列第二。中国的前列腺癌发病率近年来逐年增高,流行病学数据显示,中国前列腺癌发病率从1993年的1.71人/10万男性人口增加到2005年的7.9人/10万男性人口,而且在以每年10%的速度攀升。随着我国社会老龄化现象日趋严重,10年后,每年新发病例将达到60-70/10万。我国前列腺癌的发病可能会进入高峰期。前列腺癌可能成为危害男性健康最重要的疾病之一。
内分泌治疗在前列腺癌治疗中占重要地位。早在1966年,Charls Huggins教授就因发现激素可以成功治疗前列腺癌而获得诺贝尔奖。目前,雄激素抑制的方法有:手术去势(睾丸切除术)和抗雄激素药物去势,但是这种治疗的效果并不持久,在术后18~20个月,几乎全部的患者会发展成雄激素非依赖型前列腺癌。雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)目前仍然是一种不可治愈性疾病,对化疗、放疗等各种治疗均不敏感。随着肿瘤分子生物学的发展,分子靶向治疗在诸多肿瘤的治疗中取得了突破性的进展,代表了肿瘤生物治疗的最新发展方向。近年来,对晚期前列腺癌的分子靶向治疗也进行了卓有成效的研究。目前,用于前列腺癌中最有前景的分子靶向治疗药物包括酪氨酸激酶抑制剂如Imatinib(Gleevec)、Gefitinib(Iressa)、Erlotinib(Tarceva)、Sunitinib(Sutent)和蛋白酶体抑制剂Bortezomib(Velcade)等。随着分子生物学技术的不断发展,针对前列腺癌治疗的分子靶向治疗药物也越来越多,可以预见,分子靶向药物有希望使晚期前列腺癌的治疗跨入一个全新的时代。
早期对EphA3基因功能的研究主要集中在神经系统当中,发现它可以引导轴突的导向。近年来在肿瘤中的研究结果表明,EphA3在结肠癌、肾癌、肝癌、黑色素瘤和肉瘤中表达上调,在乳腺癌、肺癌和胰腺癌中发生突变。在前列腺癌细胞系LNCaP中,基因EphA3表达水平比正常前列腺细胞中高,在恶性程度更高的PC-3ML中比PC-3中高,在雄激素非依赖的LNCaP-C81细胞中比雄激素依赖的LNCaP-C33中表达上调。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有治疗和/或预防前列腺癌功能的产品。
本发明所提供的具有治疗和/或预防前列腺癌功能的产品,其活性成分为以基因EphA3激活或介导的信号通路、蛋白EphA3激活或介导的信号通路、基因EphA3和/或蛋白EphA3为靶点的物质。
以基因EphA3激活或介导的信号通路、蛋白EphA3激活或介导的信号通路、基因EphA3和/或蛋白EphA3为靶点的物质在制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
基因EphA3作为靶点在设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能产品中的应用也属于本发明的保护范围;蛋白EphA3作为靶点在设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能产品中的应用也属于本发明的保护范围;基因EphA3激活或介导的信号通路作为靶点在设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能产品中的应用也属于本发明的保护范围;蛋白EphA3激活或介导的信号通路作为靶点在设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述以基因EphA3激活或介导的信号通路、蛋白EphA3激活或介导的信号通路、基因EphA3和/或蛋白EphA3为靶点为抑制所述基因EphA3激活或介导的信号通路、蛋白EphA3激活或介导的信号通路、基因EphA3和/或蛋白EphA3。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述物质为核酸。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述核酸为小干扰RNA、编码小干扰RNA的DNA、表达小干扰RNA的载体、shRNA、编码shRNA的DNA、表达shRNA的载体、与所述基因EphA3发生同源重组的同源序列、或含有与所述基因EphA3发生同源重组的同源序列的载体。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述shRNA由茎Ⅰ、环和茎Ⅱ构成的茎环结构;所述茎Ⅰ的序列为5’GC GGU CAG CAU CACAAC UAAU3’,所述茎Ⅱ的序列为5’AU UAG UUG UGA UGC UGA CCG C3’。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述shRNA的环的序列为5’UU CAAGAG A3’。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述茎Ⅰ的编码序列为5’GCGGTCAG CAT CAC AAC TAA T3’;所述茎Ⅱ的编码序列为5’AT TAG TTG TGA TGC TGA CCGC3’;所述环的编码序列为5’TTCAA GAG A3’;
所述shRNA的编码基因为5’GC GGTCAG CAT CAC AAC TAA T TTCAA GAGA ATTAG TTG TGA TGC TGA CCG C 3’;
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述表达所述shRNA的载体是按照如下方法得到的:将如下正义链DNA和反义链DNA进行退火连接,得到退火产物;将退火产物插入pGP-U6载体的BamH Ⅰ和Bbs Ⅰ酶切位点之间,得到的重组载体即为表达所述shRNA的载体;
正义链:5’-CAC CGC GGT CAG CAT CAC AAC TAA TTT CAA GAG AAT TAGTTG TGA TGC TGA CCG CTT TTT TG-3’
反义链:3’-GTG GCG CCA GTCGTA GTG TTG ATT AAA GTT CTC TTA ATCAACACTACG A CTGGC GAAAAAAC-5’;
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述表达shRNA的载体是在pGP-U6的多克隆位点插入所述编码shRNA的DNA得到的。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述治疗和/或预防前列腺癌功能为如下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和/或Ⅴ所示:
Ⅰ抑制前列腺癌细胞生长;
Ⅱ降低前列腺癌细胞的恶性程度;
Ⅲ增强前列腺癌细胞的黏附能力;
Ⅳ抑制前列腺癌细胞的迁移;
Ⅴ抑制前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述抑制前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变是通过抑制前列腺癌细胞的神经内分泌分化实现的;
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述抑制前列腺癌细胞的神经内分泌分化是通过抑制所述前列腺癌细胞中的Akt信号通路和/或抑制所述前列腺癌细胞中的ERK信号通路实现的。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述蛋白EphA3激活或介导的信号通路或基因EphA3激活或介导的信号通路为Akt信号通路或ERK信号通路;
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述基因EphA3为前列腺癌细胞中的EphA3基因。
上述任一所述产品或上述任一所述应用中,所述基因EphA3的核苷酸序列如序列表中序列1中第226-3177位核苷酸所示。
本发明发明了EphA3的新用途。通过实验证明,EphA3与前列腺癌恶的发生发展密切相关,EphA3能够介导促进前列腺癌恶性进展,以EphA3为靶点,进行治疗会明显抑制前列腺癌的发展。基于此,本发明进一步设计了敲低EphA3基因表达的1504-RNAi,实验证明,该RNAi分子能够阻断前列腺癌细胞增殖、增加细胞粘附、降低癌细胞运动迁移能力,可阻断前列腺癌分子向神经内分泌分化,从而抑制前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变。对其分子机制研究表明,1504-RNAi能够抑制在肿瘤细胞中被广泛激活的AKT和ERK信号通路,为1504-RNAi阻断肿瘤进展奠定了理论基础。因此,本发明在前列腺癌的预防和治疗领域中将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为Western blot检测不同EphA3表达水平前列腺癌细胞株中EphA3表达情况。A,野生型EphA3和磷酸化位点突变体高表达LNCaP细胞株;B,EphA3有效RNAi靶点的筛选;C,EphA3稳定RNAi C4-2B细胞株。
图2为EphA3表达对前列腺癌细胞锚着依赖生长的影响。
图3为软琼脂集落形成实验。
图4为FN黏附生长实验。
图5为划痕愈合实验检测EphA3表达对前列腺癌细胞体外迁移能力的影响。
图6为Transwell实验检测EphA3表达变化对C4-2B体外迁移的影响。
图7为EphA3高表达使LNCap细胞发生神经细胞样形态变化。
图8为EphA3促进前列腺癌细胞的神经内分泌分化.
图9为EphA3表达对AKT信号通路的影响。
图10为EphA3表达对而ERK信号通路的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
人前列腺癌细胞系LNCaP购自Urocore(Oklahoma City,OK,USA)公司,人前列腺癌细胞系C4-2B购自Urocore(Oklahoma City,OK,USA)公司。
RPMI1640培养基:每袋1640(Gibco,1L装)加入2g碳酸氢钠和4.8g Hepes,调pH值至7.4,双层0.22μm滤纸过滤除菌后使用。
胰酶购自GIBCO公司;胎牛血清为Hyclone公司产品,小牛血清为杭州四季青公司产品;HEPES为Amersham LIFE SCIENCE公司产品;细胞转染试剂LipofectAMINE2000为Invitrogen公司产品。
限制性内切酶、T4DNA连接酶、LATaq酶为大连宝生物工程有限公司产品,TaqDNA聚合酶、SupTaq酶购自上海申能博彩公司。
质粒大提、中提和小提试剂盒为Promega公司产品,PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DNA提取试剂盒为上海申能博彩公司产品;RNA提取试剂Trizol购自上海生工生物工程技术服务公司;双荧光和单荧光素酶检测试剂盒为Promega公司产品。
兔抗人EphA3多克隆抗体、兔抗人Actin的单克隆抗体I-19、鼠抗人AR单克隆抗体AR441和ProteinA/G PLUS Agarose购自Santa Crutz公司;羊抗人PSA的多克隆抗体由军事医学科学院基础医学研究所徐元基老师馈赠;兔抗人嗜铬素A(CgA)单克隆抗体SP12、鼠抗人神经元烯醇化酶(NSE)单克隆抗体NSE-P1+NSE-P2、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠和兔抗羊的IgG以及TRITC标记的羊抗鼠IgG和FITC标记的羊抗兔IgG均购自北京中杉金桥生物技术公司;鼠抗His单克隆抗体购自Invitrogen公司;硝酸纤维素膜为Amersham公司产品;蛋白定量BCA试剂盒及ECL显色试剂盒为PIECE公司产品。
实施例中使用的相关试验方法及数据统计方法如下:
蛋白浓度的测定:从细胞提取的蛋白样品,在蛋白电泳前进行浓度测定,以计算上样量。按照BioRad公司的BCA试剂产品说明书进行,将试剂盒中A液和B液按照50∶1的比例混合成工作液。将细胞裂解上清5倍稀释后取25μl加入200μl的工作液中,同时按说明书要求取标准品BSA作浓度梯度稀释,取各浓度BSA稀释液25μl加入200μl的工作液中,于一定湿度的37℃孵箱内孵育30分钟,595nm波长读取光密度吸收值,以标准品浓度为Y轴,以光吸收值为X轴,做出拟合曲线,得到拟合公式,计算出样品浓度。根据样品浓度计算蛋白电泳上样量。
Western印迹分析:样品进行SDS-PAGE后,电转移至硝酸纤维素膜,然后用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜,弃溶液,加入用5%脱脂奶粉稀释的一抗,室温轻摇1h,TBST洗膜3次后,加入用5%脱脂奶粉稀释的二抗(辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔/羊抗鼠IgG),室温轻摇1h,TBST洗膜3次后,用化学发光法显色5min,压片显影。
利用SAS软件程序进行数据的分析和处理。MTT、裸鼠成瘤实验和Casodex药物处理实验主要利用了SAS软件中的重复测量设计的方差分析方法;软琼脂集落形成实验按具体接种情况分别利用了SAS软件中的重复测量设计的方差分析方法或t检验;细胞体外迁移实验利用了SAS软件中的t检验;荧光素酶实验利用了软件中对单因素k水平(k≥3)的定量资料的方差分析方法的数据处理方法;利用SYBR荧光染料进行的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的数据按2-ΔΔCt公式计算出基因表达的相对量。
引物合成及序列测定由上海英骏生物技术有限公司和北京赛百盛生物技术有限责任公司完成。
实施例1、转基因细胞系的构建
一、基因EphA3被干扰的前列腺癌细胞的构建
C4-2B是恶性程度较高且高表达EphA3的前列腺癌细胞
(一)干扰EphA3表达效率的RNAi序列筛选
pGP-U6购自上海吉玛公司,产品目录号为F03;pcDNA3.1载体购自Invitrogen公司产品,目录号为V795-20。
1504、2635、2934、1136、GAPDH和NC(scramble)的靶点序列分别为:(1504):GC GGT CAG CAT CAC AAC TAA T;(2635):GC CAG CGA TGT ATG GAG TTA T;(2934):GG ACC AAA GCA ATG TGG ATA T;(1136):GC AGG TGT GAG AAT AATTAC T;GAPDH:GTA TGA CAA CAG CCT CAA GTT;(NC):GTT CTC CGAACGTGT CAC GTT。
1、关于1504靶点
(1)针对EphA3基因1504靶点的shRNA由茎Ⅰ、环和茎Ⅱ构成茎环结构;茎Ⅰ的序列为5’GC GGU CAG CAUCAC AACUAA U3’,茎Ⅱ的序列为5’AU UAGUUG UGA UGC UGA CCG C3’,环的序列为5’UUCAA GAG A3’。
(2)表达1504靶点的shRNA的干扰载体的构建:由下述正义链和反义链退火后连接入pGP-U6载体BamH Ⅰ和Bbs Ⅰ两个酶切位点之间,得到的载体记作pGP-U6-shRNA 1504。
针对EphA3基因靶点1504的shDNA序列如下:
正义链:5’-CAC CGC GGT CAG CAT CAC AAC TAA TTT CAA GAG AAT TAGTTG TGA TGC TGA CCG CTT TTT TG-3’
反义链:3’-GTG GCG CCA GTCGTA GTG TTG ATT AAA GTT CTC TTA ATCAACACTACG A CTGGC GAAAAAAC-5’。
2、关于靶点2635
(1)针对EphA3基因2635靶点的shRNA由茎Ⅰ、环和茎Ⅱ构成茎环结构;茎Ⅰ的序列为5’GC CAG CGA UGU AUG GAG UUAU3’,茎Ⅱ的序列为5’AU AACUCC AUA CAU CGC UGG C3’,环的序列为5’UU CAA GAG A 3’。
(2)表达的2635shRNA的载体构建方法:与1504靶点中所述一致,不同的是所用的退火序列如下:
针对EphA3基因靶点2635的shDNA序列
正义链:5’CAC CGC CAG CGA TGT ATG GAG TTA TTT CAA GAG AAT AACTCC ATA CAT CGC TGG CTT TTT TG-3’
反义链:3’-GTGG CGGTC GCTACATACCTCAATAAAGTTCTCTTATTGAGGTATGTAGCG ACCGAA AAAAC-5’。
3、针对EphA3基因靶点2634
(1)2934靶点的shRNA由茎Ⅰ、环和茎Ⅱ构成茎环结构;茎Ⅰ的序列为5’GGACC AAA GCA AUG UGG AUA U3’,茎Ⅱ的序列为5’AU AUC CAC AUUGCUUUG GUC C3’,环的序列为5’UU CAA GAG A 3’。
(2)表达的2934shRNA的载体构建方法:与1504靶点中所述一致,不同的是所用的退火序列如下:
针对EphA3基因靶点2634的shDNA序列
正义链:5’-CAC CGG ACC AAA GCA ATG TGG ATA TTT CAA GAG AAT ATCCAC ATT GCT TTG GTC CTT TTT TG-3’
反义链:3’-GTGGCCTGGTTT CGTTAC ACCTATAAA GTT CTCTTA TAGGTGTAA CGAAAC GAGGAAAAAAC-5’
4、靶点1136
(1)1136靶点的shRNA由茎Ⅰ、环和茎Ⅱ构成茎环结构;茎Ⅰ的序列为5’GCAGG UGU GAG AAU AAU UAC T3’,茎Ⅱ的序列为5’AG UAA UUA UUC UCACAC CUG C3’,环的序列为5’UU CAA GAG A 3’。
(2)表达的1136shRNA的载体构建方法:与1504靶点中所述一致,不同的是所用的退火序列如下:
针对EphA3基因靶点1136的shDNA序列
正义链:5’-CAC CGC AGG TGT GAG AAT AATTAC TTT CAA GAG AAG TAATTA TTC TCA CAC CTG CTT TTT TG-3’
反义链:3’-GTGGCGTCC ACACTC TTA TTAATGAAAGTTGTCTTCATTAATAAGAGTGTGGACGAAAAAAC-5’
5、基因GAPDH的shDNA
(1)GAPDH靶点的shRNA由茎Ⅰ、环和茎Ⅱ构成茎环结构;茎Ⅰ的序列为5’GUA UGA CAA CAG CCU CAA GUU 3’,茎Ⅱ的序列为5’AAC UUGAGG CUGUUG UCAUAC 3’,环的序列为5’UU CAA GAG A 3’。
(2)表达的GAPDHshRNA的载体构建方法:与1504靶点中所述一致,不同的是所用的退火序列如下:
针对基因GAPDH的shDNA序列
正义链:5’-CAC CGTA TGA CAA CAG CCT CAA GTT TT CAA GAG AAACTTGAGG CTG T T TCATACTT TTT TG-3’
反义链:3′-GTGGCATACTGTTGTCGGAGTTCAAAAGTTCTCTTTGAACTCCGACAAAGTATGAAAAAAC-5’。
6、RNA干扰阴性对照
(1)NC(scramble)靶点的shRNA由茎Ⅰ、环和茎Ⅱ构成茎环结构;茎Ⅰ的序列为5’GUU CUC CGA ACG UGUCAC GU 3’,茎Ⅱ的序列为5’AC GUG ACA CGUUCG GAG AAC3’,环的序列为5’UU CAA GAG A 3’。
(2)表达NCshRNA的载体构建方法:与1504靶点中所述一致,不同的是所用的退火序列如下:
RNA干扰阴性对照(NC or scramble RNAi)
正义链:5’-CAC CGTT CTC CGA ACG TGT CAC GT TT CAA GAG AAC GTGACA CGT TCG GAG AACTT TTT TG-3’
反义链:3’
-GTGGCAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGCCTCTTGAAAAAAC-5’。
针对该对照靶点的干扰载体为对照,将其记作pGP-U6-NC。
将上述重组表达载体分别与pcDNA3.1-EphA3以2∶1的比例共转染293T细胞,western blot检测不同靶点的干扰效率,结果发现靶点1504的干扰效果最佳(图1-B)。
(二)基因EphA3被干扰的C4-2B细胞的构建
将pGP-U6-shRNA1504转入C4-2B细胞的方法如下:
细胞转染:将细胞用含有10%(体积百分含量)胎牛血清的RPMI1640培养基培养。在转染前24h用不含双抗、含10%胎牛血清RPMI1640培养基将细胞接种在12孔板中,接种量以转染时细胞密度达到80%为准。将DNA用不含双抗和血清的RPMI1640培养基稀释,再用相同的培养基稀释Lipofectamine2000,将二者混合,室温放置20min后,加入到含有培养细胞和0.5ml RPMI1640培养基和10%胎牛血清的12孔板中,36h后收获细胞。
稳定转染克隆的筛选:转染细胞按1∶10传代后,培养24h,换成含G418(终浓度450μg/ml)的RPMI1640培养基进行筛选,每三天更换培养基一次。待出现肉眼可见的细胞克隆时,开始挑取细胞克隆。对肉眼可见的单克隆细胞进行标记,用吸管吸净培养液,浸有0.25%胰酶的0.3cm×0.3cm大小滤纸片置于标记好的克隆表面2-3分钟,轻轻取出,放于装有含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基的24孔板中,缓慢振荡使纸片上的细菌脱落,镜下观察取位点及接种板中细胞移取情况,或直接用毛细吸管吸取少量胰酶轻轻吸取克隆。待孔板中细胞长满后,再传代到12孔板中,依此逐渐传至大的培养瓶中,所得细胞冻存或继续维持培养。
被转染的细胞是C4-2B细胞;转入的DNA是pGP-U6-shRNA1504或pGP-U6-NC。将转入pGP-U6-shRNA1504的细胞记作EphA3RNAi或1504RNAi;将转入pGP-U6-NC的细胞记作Scramble RNAi。
每一种细胞株挑取十个以上的单克隆用Western blot的方法鉴定EphA3的表达情况。一抗为兔抗人EphA3多克隆抗体。二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。
结果如图1C所示(C4-2B-EphA3 RNAi#2和C4-2B-EphA3 RNAi#3为同一细胞株的两个克隆,C4-2B为未进行任何处理的细胞)。C4-2B-EphA3 RNAi#2和C4-2B-EphA3RNAi#3的相同来源的细胞株的EphA3的表达情况稳定,选择该细胞株进行后续实验(将该细胞株记作EphA3 RNAi或1504RNAi)。Scramble RNAi中EphA3的表达情况与C4-2B相同。
二、过表达EphA3的前列腺癌细胞的构建
过表达载体的构建方法:过表达载体pcDNA3.1-EphA3由pcDNA3.1载体(Invitrogen公司产品,目录号为V795-20)的多克隆酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ之间插入EphA3基因获得。插入EphA3基因的核苷酸序列如序列表中序列1第226-3177位核苷酸所示。
将过表达载体转入LNCaP细胞的方法:与实验一中建立EphA3稳定低表达的C4-2B细胞株的转染方法相同。
将得到的细胞记作LNCaP-EphA3。
同时以转入空载体pCDNA3.1-neo(即pcDNA3.1)的LNCaP细胞为对照,记作LNCaP-neo(neo是pCDNA3.1本身携带的一个抗性基因)。
实施例2、过表达EphA3的前列腺癌细胞与基因EphA3被干扰的前列腺癌细胞的功能验证
将细胞LNCaP-EphA3、LNCaP-neo、1504RNAi、Scramble RNAi(阴性对照)和C4-2B(野生型对照)分别进行如下实验。
一、1504-RNAi干扰EphA3表达降低前列腺癌细胞生长
细胞培养所用培养基为:添加了10%(体积百分含量)FBS的RPMI1640培养基。FBS购自HyClone,产品目录号为SH30088.03。
接种2000-3000个细胞至96孔板中,每天检测一次细胞生长情况。在检测之前,在每个待检测孔中加入20μl MTT溶液(2.5mg/ml MTT溶解于PBS中),37℃孵育4h,吸弃培养液,加入150μl DMSO溶解紫色结晶。在酶联仪中读取490nm波长下的光吸收值OD490。接种12h后贴壁时检测所得值即为第0天值,以后第N天所测值和第0天相比即为第N天值。每个时间点平行做三个孔,每个实验重复三次。每个数据用平均数和标准差来表示。
结果如图2所示。显示,EphA3的过表达刺激了单层培养的LNCaP生长。在培养第6天时,与对照相比LNCaP-EphA3的OD490值增高(P<0.01,见图2A);与对照相比1504-RNAi的OD490值显著降低(见图2B)。未处理的C4-2B细胞与RNAi阴性对照的结果一致。这些结果显示,基因EphA3的表达可以促进前列腺癌细胞的生长。干扰基因EphA3的表达能抑制C4-2B细胞的生长。
二、1504-RNAi干扰EphA3表达降低前列腺癌细胞软琼脂克隆形成能力
在6孔板中,将800-6000个细胞悬浮于0.34%(质量百分含量)的琼脂中(用添加10%FBS的RPMI1640培养液配制),接种于同样培养液配制的0.5%(质量百分含量)的上层琼脂上。放置于37℃、5%CO2的培养箱中培养3周,多于50个细胞形成的克隆被计数。每个细胞密度重复两个孔,每个实验重复三次。每个数据用平均数和标准差来表示。
软琼脂集落形成实验表明的是细胞的锚着非依赖生长能力,是衡量细胞恶性程度的重要指标。在MTT实验的基础上进行了软琼脂集落形成实验。结果发现,不管接种的细胞数量多少,EphA3高表达都能促进细胞在软琼脂中形成克隆。当以6000个细胞/孔接种6孔板时,LNCaP-EphA3 23#和25#的稳定细胞在软琼脂中形成克隆数比对照分别增加了5.9和5.4倍(P<0.01,见图3A)。当以6000个细胞/孔接种6孔板时,EphA3 RNAi在软琼脂中形成克隆数比对照减少了34.2%(P<0.01,见图3B),未处理的C4-2B细胞与RNAi阴性对照的结果一致。这些结果提示,野生型EphA3高表达能增强癌细胞的恶性程度。1504-RNAi干扰EphA3表达后显著降了低前列腺癌细胞软琼脂克隆形成能力,即干扰EphA3表达能显著降低C4-2B细胞的恶性程度。
三、1504-RNAi干扰EphA3表达降低增强癌细胞的黏附生长能力
纤粘连蛋白(Fibronectin,FN)购自SIGMA公司,产品目录号为F2006。
提前用FN包被96孔板,每孔加入50ulFN工作液,设置0.05、0.5、5、10(μg/ml)几个浓度梯度,每个梯度设置3个重复。4℃过夜,然后将液体吸出(可重复利用),板子置于37℃培养箱3h以上,使板子干燥。0.01%EDTA消化细胞、吹散、接种于96孔板中,每孔接种100ul细胞(1105个细胞/孔),37℃培养1-4h,移出培养基,PBS轻洗一次,加入MTT测定再培养4h,测定OD490nm吸光值,将每个细胞株于37℃孵箱中培养1h与对应培养4h的OD值相比得到相对粘附率。
纤粘连蛋白(Fibronectin,FN)是细胞外基质的重要组成部分,可以介导细胞与基质的黏附。用FN模拟细胞外基质将细胞在其上进行培养,来检测EphA3表达对前列腺癌细胞FN黏附生长能力的影响。FN设置0.05、0.5、5、10(μg/ml)四个浓度梯度,细胞在其上黏附1h,PBS轻轻洗掉未黏附细胞,加入MTT测取490nmOD值,每种细胞株每个浓度设三个重复。而每种细胞株以相同体积接种后黏附4h加入MTT测取490nmOD值作为总细胞数。以黏附1h与4h的OD490相比得到相对黏附率,结果发现,在FN浓度为5和10μg/ml时,EphA3高表达的LNCaP细胞株(LNCaP-EphA3)黏附能力比对照显著下降(P<0.01)(见图4A)。而用1504-RNAi干扰前列腺癌细胞系C4-2B中内源性EphA3表达敲降以后,干扰株(EphA3RNAi)比对照组黏附能力有所增强(P<0.05)(见图4B)。未处理的C4-2B细胞与RNAi阴性对照的结果一致。这些结果表明,EphA3表达能够降低前列腺癌细胞在FN上的黏附生长能力,抑制C4-2B中EphA3的表达增强了C4-2B的黏附生长能力。
四、1504-RNAi干扰EphA3表达降低癌细胞的体外迁移能力
(一)划痕愈合(Woundhealing实验)
划痕愈合是一种简单易行且直观的检测体外迁移能力的方法。
将细胞以2×105个细胞/孔接种在12孔培养板中,用10%胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养,直至形成细胞单层(待细胞生长至汇合度大于95%时)。然后在单层培养细胞上,用移液枪头沿培养板底部呈“一”字形划痕,镜下记录痕区相对距离,然后用PBS轻轻洗涤,加入10%胎牛血清的RPMI1640培养液,继续培养12-72h,观察并照相。倒置显微镜下测量细胞向致伤区迁移的相对距离,根据原始细胞致伤区距离计算出细胞实际迁移距离。
每种细胞株平行划三个重复痕,实验重复三次。观察划痕愈合情况。结果发现,将C4-2B细胞中内源性EphA3表达敲降后,其划痕愈合能力比对照和不作处理的C4-2B细胞明显下降,在划痕后72h,阴性对照和C4-2B细胞的划痕基本上完全愈合,而转染EphA3干扰质粒的C4-2B细胞尚存在明显的划痕(见图5)。
(二)Transwell小室实验
细胞的迁移能力用24孔,膜孔径为8μM的Transwell进行。将细胞以5×104细胞/孔悬浮于0.5ml的无血清1640培养液中接种内槽;外槽加入0.5ml含10%胎牛血清的细胞培养液,于37℃、5%CO2培养箱中培养24-36h后,将内槽取出,PBS清洗,用棉棒轻轻擦去膜上层细胞,已迁移到下层的细胞用甲醇固定,用结晶紫染色,用水清洗,镜检。随机选取3个视野,计数迁移到每张膜下的细胞。重复三次。
利用Costar公司的Transwell细胞培养板在体外检测EphA3对C4-2B细胞体外迁移能力的影响。细胞以5.0×104细胞/孔接种至小室内槽,细胞在血清浓度梯度底作用下从膜上8μM小孔迁移至膜下表面。用棉棒轻轻刮去上层未迁移细胞后,将下层细胞固定,染色,在200×镜下观察,随机选取三个视野计数,重复3次。发现内源性EphA3表达敲降后使C4-2B细胞的迁移能力显著降低,组间有显著性差异(P<0.05,见图6)。
以上实验结果说明,EphA3表达能够增强前列腺癌细胞的体外迁移能力,抑制EphA3表达能够抑制前列腺癌细胞的体外迁移能力。
五、1504-RNAi干扰EphA3表达降低癌细胞的神经内分泌分化Marker表达
关于前列腺癌的雄激素敏感性转变的机制一直以来就存在多种学说,神经内分泌学说也是其中的一种。在筛选EphA3稳定表达细胞株时发现,EphA3高表达使LNCaP细胞发生神经细胞样形态变化(见图7)。文献报道,神经内分泌分化(neuroendocrinedifferentiation,NED)现象在很多中晚期前列腺癌病灶中出现,NED程度与前列腺癌的分级分期和复发成正相关。神经内分泌细胞是正常前列腺中即存在且不表达AR的一种细胞,可以分泌多种活性物质刺激周围细胞的增殖,这使得前列腺癌细胞耐受抗雄激素药物的治疗。为了研究EphA3高表达所引起的LNCaP形态变化是否为NED现象。本发明检测了在20μMCasodex处理条件下,EphA3高表达和对照细胞株中神经内分泌细胞的两个分子标志物嗜铬素A(CgA)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况。
20μMCasodex处理细胞的方法:在细胞培养基中加入20μMCasodex对细胞进行培养。LNCaP-EphA3和LNCaP-neo处理0d、2d、4d;1504RNAi和Scramble RNAi处理72h。
检测两个分子标志物嗜铬素A(CgA)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况的方法为Western blot。检测嗜铬素A(CgA)的一抗为兔抗人嗜铬素A(CgA)单克隆抗体SP12,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的一抗为鼠抗人神经元烯醇化酶(NSE)单克隆抗体NSE-P1+NSE-P2,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG;
结果,在EphA3高表达的LNCaP细胞(LNCaP-EphA3)中,这两个Marker随着Casodex处理时间的延长呈现明显的上升趋势,而在对照细胞(LNCaP-neo)中,这种趋势并不明显(见图8A)。然后,用C4-2B细胞瞬时转染EphA3干扰和阴性对照质粒后72h以及同步处理但不作转染的C4-2B细胞提取总蛋白,Western blot检测内源性EphA3表达敲降后CgA和NSE的表达变化。结果显示,在EphA3表达降低情况下,EphA3 RNAi的两个marker CgA和NSE的表达呈现下降趋势(见图8B)。以上这些结果表明,EphA3能够促进前列腺癌细胞的神经内分泌分化,通过这样的机制EphA3促进前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变过程。抑制EphA3的表达能够抑制前列腺癌细胞的神经内分泌分化,从而抑制前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变。
六、EphA3表达激活Akt信号通路
有文献报道,活化的Eph家族分子可以与Akt上游分子PI3K相互作用,继而调节PI3K-Akt信号通路活性。而Akt分子能够介导多种重要信号通路传递,所组成的信号通路与人类肿瘤的发生发展密切相关。该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。Akt的活化可将Bcl-2从BAD中释放出来,Bcl-2进而抑制雄激素撤除引起的凋亡。Akt信号通路可以促进前列腺癌的神经内分泌分化。
提取细胞EphA3 RNAi和Scramble RNAi的总蛋白,Western blot检测Akt信号通路的三个分子Akt、GSK-3β和PDK1的磷酸化改变情况。
检测Akt的总量所用的一抗为抗Akt兔单克隆抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;检测磷酸化的Akt所用的一抗为抗磷酸化Akt(Ser473)兔单克隆抗体,二抗为;检测磷酸化的GSK-3β所用的一抗为抗磷酸化GSK-3β(Ser9)兔单克隆抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;检测磷酸化的PDK1所用的一抗为抗磷酸化PDK1(Ser241)兔单克隆抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;抗磷酸化Akt(Ser473)兔单克隆抗体,抗磷酸化GSK-3β(Ser9)兔单克隆抗体和抗磷酸化PDK1(Ser241)兔单克隆抗体均隶属于Phospho-Akt Pathway Sampler Kit,购自Cell Signaling公司,目录号9916。
结果显示,EphA3表达降低时,Akt的Ser473位点的磷酸化水平随之降低,而阴性对照组与不转染的C4-2B细胞之间pAkt-Ser473没有明显差别。与此同时,总Akt的量在三个组之间持平。Akt信号通路中处于PI3K下游PDK1的Ser241位点的磷酸水平也随EphA3表达降低而降低,Akt信号通路中处于Akt下游的分子GSK-3β-Ser9的磷酸化水平改变趋势与此相同(见图9)。这些结果表明,EphA3表达能够激活Akt信号通路,从而促进前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变。抑制EphA3表达能够抑制Akt信号通路,从而抑制列腺癌细胞的神经内分泌分化,进而抑制前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变。
七、EphA3表达激活ERK信号通路
胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK),是MAPK家族的一员,它的信号传递途径是涉及调节细胞生长、发育及分裂的信号网络的中心。研究证实,受体酪氨酸激酶可激活ERK信号转导途径,也曾有报道在雄激素撤除的LNCaP细胞中ERK被活化。为了考察EphA3表达对ERK信号通路的影响,本发明提取细胞EphA3 RNAi和Scramble RNAi的总蛋白Western blot实验检测EphA3内源性敲降后,ERK磷酸化水平的改变。检测ERK的总量所用的一抗为抗ERK的兔多克隆抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG;检测磷酸化的ERK所用的一抗为抗磷酸化ERK(Tyr204)的鼠单克隆抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG;抗ERK的兔多克隆抗体购自Santa Cruz公司,产品目录号为sc-94。抗磷酸化ERK(Tyr204)的鼠单克隆抗体购自Santa Cruz公司,产品目录号为sc-7383。
结果显示,EphA3表达降低时,ERK的位点的磷酸化水平随之降低,而阴性对照组与不转染的C4-2B细胞之间pERK-Tyr204没有明显差别。与此同时,总ERK的量在三个组之间变化不明显(见图10)。这一结果表明,EphA3表达能够激活ERK信号通路,并由此影响前列腺癌细胞的生长和神经内分泌分化,促进前列腺癌雄激素敏感性的转变。抑制EphA3表达能够抑制ERK信号通路,从而抑制列腺癌细胞的神经内分泌分化,进而抑制前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变。
八、动物实验
本发明在细胞水平上用MTT、平板克隆形成、软琼脂集落形成等试验,证明了EphA3表达有促进前列腺癌癌细胞增殖,促进肿瘤恶性进展的生物学作用。在动物水平本发明进行了裸鼠成瘤试验,8×106个EphA3高表达的LNCaP细胞株以及它们各自对应的空载体对照细胞被分别皮下注射到裸鼠后背部,一星期检查一次肿瘤形成情况和形成体积。用游标卡尺测量肿瘤大小,肿瘤体积则利用下列公式计算得到:体积=长×宽×高×0.5236。结果,EphA3表达组能在接种后4-5周长出明显的瘤块,而且到了6周以后所成肿瘤生长迅速,而对照很难成瘤,个别裸鼠7周以上才能成瘤,并且所成肿瘤生长缓慢。所成肿瘤进行组织切片HE染色,结果,在EphA3磷酸化位点突变体所成肿瘤的组织切片中病理性核分裂象随处可见,核深染,核异质,可见不对称分裂相、顿挫分裂相,且血管丰富。而对照组形成的肿瘤核较小,核均质,未见病理性核分裂象。由此可见,EphA3不仅可促进LNCaP细胞的成瘤能力,也能促进形成肿瘤的恶性程度。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120>一种预防和/或治疗前列腺癌的产品
<160>1
<210>1
<211>5799
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
cccgctctgc ttcagcgcac gctgaagacg gcactaggac ccagggaagt ccccgagcgg 60
ggttcgcgga aaggcagcca gactcctcct tatctccagt gtcaaacttg acatcagcct 120
gcgagcggag catggtaact tctccagcaa tcagagcgct ccccctcaca tcagtggcat 180
gcttcatgga gatatgctcc tctcactgcc ctctgcacca gcaacatgga ttgtcagctc 240
tccatcctcc tccttctcag ctgctctgtt ctcgacagct tcggggaact gattccgcag 300
ccttccaatg aagtcaatct actggattca aaaacaattc aaggggagct gggctggatc 360
tcttatccat cacatgggtg ggaagagatc agtggtgtgg atgaacatta cacacccatc 420
aggacttacc aggtgtgcaa tgtcatggac cacagtcaaa acaattggct gagaacaaac 480
tgggtcccca ggaactcagc tcagaagatt tatgtggagc tcaagttcac tctacgagac 540
tgcaatagca ttccattggt tttaggaact tgcaaggaga cattcaacct gtactacatg 600
gagtctgatg atgatcatgg ggtgaaattt cgagagcatc agtttacaaa gattgacacc 660
attgcagctg atgaaagttt cactcaaatg gatcttgggg accgtattct gaagctcaac 720
actgagatta gagaagtagg tcctgtcaac aagaagggat tttatttggc atttcaagat 780
gttggtgctt gtgttgcctt ggtgtctgtg agagtatact tcaaaaagtg cccatttaca 840
gtgaagaatc tggctatgtt tccagacacg gtacccatgg actcccagtc cctggtggag 900
gttagagggt cttgtgtcaa caattctaag gaggaagatc ctccaaggat gtactgcagt 960
acagaaggcg aatggcttgt acccattggc aagtgttcct gcaatgctgg ctatgaagaa 1020
agaggtttta tgtgccaagc ttgtcgacca ggtttctaca aggcattgga tggtaatatg 1080
aagtgtgcta agtgcccgcc tcacagttct actcaggaag atggttcaat gaactgcagg 1140
tgtgagaata attacttccg ggcagacaaa gaccctccat ccatggcttg tacccgacct 1200
ccatcttcac caagaaatgt tatctctaat ataaacgaga cctcagttat cctggactgg 1260
agttggcccc tggacacagg aggccggaaa gatgttacct tcaacatcat atgtaaaaaa 1320
tgtgggtgga atataaaaca gtgtgagcca tgcagcccaa atgtccgctt cctccctcga 1380
cagtttggac tcaccaacac cacggtgaca gtgacagacc ttctggcaca tactaactac 1440
acctttgaga ttgatgccgt taatggggtg tcagagctga gctccccacc aagacagttt 1500
gctgcggtca gcatcacaac taatcaggct gctccatcac ctgtcctgac gattaagaaa 1560
gatcggacct ccagaaatag catctctttg tcctggcaag aacctgaaca tcctaatggg 1620
atcatattgg actacgaggt caaatactat gaaaagcagg aacaagaaac aagttatacc 1680
attctgaggg caagaggcac aaatgttacc atcagtagcc tcaagcctga cactatatac 1740
gtattccaaa tccgagcccg aacagccgct ggatatggga cgaacagccg caagtttgag 1800
tttgaaacta gtccagactc tttctccatc tctggtgaaa gtagccaagt ggtcatgatc 1860
gccatttcag cggcagtagc aattattctc ctcactgttg tcatctatgt tttgattggg 1920
aggttctgtg gctataagtc aaaacatggg gcagatgaaa aaagacttca ttttggcaat 1980
gggcatttaa aacttccagg tctcaggact tatgttgacc cacatacata tgaagaccct 2040
acccaagctg ttcatgagtt tgccaaggaa ttggatgcca ccaacatatc cattgataaa 2100
gttgttggag caggtgaatt tggagaggtg tgcagtggtc gcttaaaact tccttcaaaa 2160
aaagagattt cagtggccat taagaccctg aaagttggct acacagaaaa gcagaggaga 2220
gacttcctgg gagaagcaag cattatggga cagtttgacc accccaatat cattcgactg 2280
gaaggagttg ttaccaaaag taagccagtt atgattgtca cagaatacat ggagaatggt 2340
tccttggata gtttcctacg taaacacgat gcccagttta ctgtcattca gctagtgggg 2400
atgcttcgag ggatagcatc tggcatgaag tacctgtcag acatgggcta tgttcaccga 2460
gacctcgctg ctcggaacat cttgatcaac agtaacttgg tgtgtaaggt ttctgatttc 2520
ggactttcgc gtgtcctgga ggatgaccca gaagctgctt atacaacaag aggagggaag 2580
atcccaatca ggtggacatc accagaagct atagcctacc gcaagttcac gtcagccagc 2640
gatgtatgga gttatgggat tgttctctgg gaggtgatgt cttatggaga gagaccatac 2700
tgggagatgt ccaatcagga tgtaattaaa gctgtagatg agggctatcg actgccaccc 2760
cccatggact gcccagctgc cttgtatcag ctgatgctgg actgctggca gaaagacagg 2820
aacaacagac ccaagtttga gcagattgtt agtattctgg acaagcttat ccggaatccc 2880
ggcagcctga agatcatcac cagtgcagcc gcaaggccat caaaccttct tctggaccaa 2940
agcaatgtgg atatcactac cttccgcaca acaggtgact ggcttaatgg tgtctggaca 3000
gcacactgca aggaaatctt cacgggtgtg gagtacagtt cttgtgacac aatagccaag 3060
atttccacag atgacatgaa aaaggttggt gtcaccgtgg ttgggccaca gaagaagatc 3120
atcagtagca ttaaagctct agaaacgcaa tcaaagaatg gcccagttcc cgtgtaaagc 3180
acgggacgga agtgcttctg gacggaagtg gtggctgtgg aaggcgtagc atcatcctgc 3240
agacagacaa taattctgga gatactggtg gaagttccaa gtccaataag acactcaaat 3300
atgagtacaa atgccttaaa atggaattga aaaactcttt attttcccct atcatttatt 3360
ggatgggtgg gtggggtatt tttttgtaat tgctttttta aatattagtt aatggattaa 3420
atttaattct tcagcgtaaa atggtgaaga actagcatat agccattgat cataaactga 3480
ctatcataaa atcaaaacaa gtgaaataac aaaatggaca tggtggcttt gtttaggtag 3540
agccacaaaa gaaaagactt gtaatatttt tatatacaga ggaaatctgt aacaggtatt 3600
ttgtttcttt taaagcaagc aacacagagg aatttatacc tcaaactatc tggccatatt 3660
tactacctta tcactgcatt attctctttt atctgtttaa agcatataga gatgaagttt 3720
gtagttgttt taagtactac acatttttaa attgttagct tccttaagta tatcatgtaa 3780
agaaatgtct taatttttga aaaaagtaca tatttatttt cttttgaatt gtttttattg 3840
ttttctattt atgccttgat gatttaatat ggatttgtta cagccaagtg ccaaatgctc 3900
tctcaaattg tcagcaattt aactagacac agataataat gggtttcttt cagatttttt 3960
gaaccatcca cttacatata tttttaaaaa atgaaatcct tttcctgttc atacactaac 4020
caaatctctc aaatctgtta tcccaatcat tgttgcctct ccgtttatta taaactgtat 4080
gctcacaact tagtgtaata taccagcttg tatgcaatgg attttcaacc agataacata 4140
cctttcctgc tctggtgctt agagactatc aactccctcc tttagtgaag gagccgtgtt 4200
agagcttccg agaatagctc cactggagag aagtggaatc ctatatagaa tgctgcacta 4260
attgacaaca cagcctatag gccaatgcat gagtaaaaaa aaaaacaatt actggctcac 4320
tggctttgaa aagtcactta ctattgttgc tgaaacttgc tgagctgttt atagagaatg 4380
atgataacag aacttttcct ctgtatcact ggtgtttagg tgaattaatt aaacattgtg 4440
atcattagta ccaggtatta ttatctttaa gagtcttcca cttcaatgca catggtgcag 4500
ttttggtgtg taacttagaa ggattgaact tctttgaatt tactggacat aacattttca 4560
gaatagttgg tcatctagca accgcctcaa aatgtgtaag caggagagaa atttctcatc 4620
acagggattt agacttacta ttacataaag gctaactatg agcttgctca ttaattttga 4680
aaagatgtac ctggtggata tctagctagt aatatattct gaagcaacat tttagctcta 4740
ttgatactct ttctaatgct gatatgatct tgagtataag aaatgcatat gtcactagaa 4800
tggataaaat aatgctgcaa acttaatgtt cttatgcaaa atggaacgct aatgaaacac 4860
agcttacaat cgcaaatcaa aactcacaag tgctcatctg ttgtagattt agtgtaataa 4920
gacttagatt gtgctccttc ggatatgatt gtttctcaaa tcttggcaat attccttagt 4980
caaatcaggc tactagaatt ctgtattgga tatataagag catgaaattt ttaaaaatac 5040
acttgtgatt ataaaattaa tcacaaattt cacttatacc tgctatcagc agctagaaaa 5100
catttttttt ttaaatcaag tattttgtgt ttggaatgtt agaatgagat ctgaatgtgg 5160
tttcaatcta attttttccc agactactat ttctttttag gtattattct gagcatactc 5220
aacaaaaccc atgcatttca taaactaata gaagttgagg attgttgaat ctatttcact 5280
tattttggct gtggtttcca tctgaaagta gaggttgtat acaccatata ctgttcttca 5340
ttttattaat atttttctcc ttgacctctc ataaatttac tttacacaat tcttaccctg 5400
tacatatgta aacataagtg tacgattctt aaccatggag tagaggtact agaatgctta 5460
cggccatctc tttgtacagg aactgcattg actttcagta aacataaagc cacaactcct 5520
acatgatgtt atgtaccata tgatctgttt tgtatcttaa atttgattta catatattat 5580
ttatttctgg taactcactc agtttatgct gtgctaaata tcaatcaagc catgtataaa 5640
tgtgatatga ttggcaatat gtgtttatgt tgtacaatgt aaatggcctc ttactaatgt 5700
aaaatgattt gtagtggaaa catttatatt tttataataa acataatgaa aatatttttt 5760
acagattgga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 5799
Claims (10)
1.一种具有治疗和/或预防前列腺癌功能的产品,其活性成分为以基因EphA3激活或介导的信号通路、蛋白EphA3激活或介导的信号通路、基因EphA3和/或蛋白EphA3为靶点的物质。
2.以基因EphA3激活或介导的信号通路、蛋白EphA3激活或介导的信号通路、基因EphA3和/或蛋白EphA3为靶点的物质在制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能的产品中的应用;
基因EphA3作为靶点在设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能产品中的应用;蛋白EphA3作为靶点在设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能产品中的应用;基因EphA3激活或介导的信号通路作为靶点在设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能产品中的应用;蛋白EphA3激活或介导的信号通路作为靶点在设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防前列腺癌功能产品中的应用。
3.根据权利要求1所述的产品或权利要求2所述的应用,其特征在于:所述以基因EphA3激活或介导的信号通路、蛋白EphA3激活或介导的信号通路、基因EphA3和/或蛋白EphA3为靶点为抑制所述基因EphA3激活或介导的信号通路、蛋白EphA3激活或介导的信号通路、基因EphA3和/或蛋白EphA3。
4.根据权利要求1或3所述的产品或权利要求2或3所述的应用,其特征在于:所述物质为核酸。
5.根据权利要求1或3或4所述的产品或权利要求2或3或4所述的应用,其特征在于:所述核酸为小干扰RNA、编码小干扰RNA的DNA、表达小干扰RNA的载体、shRNA、编码shRNA的DNA、表达shRNA的载体、与所述基因EphA3发生同源重组的同源序列、或含有与所述基因EphA3发生同源重组的同源序列的载体。
6.根据权利要求1-5中任一所述的产品或权利要求1-5中任一所述的应用,其特征在于:所述shRNA由茎Ⅰ、环和茎Ⅱ构成的茎环结构;所述茎Ⅰ的序列为5’-GCGGU CAG CAU CAC AAC UAA U-3’,所述茎Ⅱ的序列为5’-AU UAG UUG UGAUGC UGA CCG C-3’。
7.根据权利要求1-6中任一所述的产品或权利要求1-6中任一所述的应用,其特征在于:所述shRNA的环的序列为5’-UU CAA GAG A-3’。
8.根据权利要求1-7中任一所述的产品或权利要求1-7中任一所述的应用,其特征在于:
所述茎Ⅰ的编码序列为5’-GC GGTCAG CAT CAC AAC TAA T-3’;所述茎Ⅱ的编码序列为5’-AT TAG TTG TGA TGC TGA CCG C-3’;所述环的编码序列为5’-TTCAA GAGA-3’;
所述shRNA的编码基因为5’-GC GGTCAG CAT CAC AAC TAA T TTCAA GAG A ATTAGTTGTGATGCTGACCGC-3’;
所述治疗和/或预防前列腺癌功能为如下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和/或Ⅴ所示:
Ⅰ抑制前列腺癌细胞生长;
Ⅱ降低前列腺癌细胞的恶性程度;
Ⅲ增强前列腺癌细胞的黏附能力;
Ⅳ抑制前列腺癌细胞的迁移;
Ⅴ抑制前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变。
9.根据权利要求1-8中任一所述的产品或权利要求1-8中任一所述的应用,其特征在于:
所述表达所述shRNA的载体是将所述shRNA的编码基因插入载体pGP-U6的多克隆位点得到的;
所述抑制前列腺癌从雄激素依赖向雄激素非依赖的转变是通过抑制前列腺癌细胞的神经内分泌分化实现的;
所述抑制前列腺癌细胞的神经内分泌分化是通过抑制所述前列腺癌细胞中的Akt信号通路和/或抑制所述前列腺癌细胞中的ERK信号通路实现的。
10.根据权利要求1-9中任一所述的产品或权利要求1-9中任一所述的应用,其特征在于:所述表达所述shRNA的载体是按照如下方法得到的:将如下正义链DNA和反义链DNA进行退火连接,得到退火产物;将退火产物插入pGP-U6载体的BamHI和Bbs I酶切位点之间,得到的重组载体即为表达所述shRNA的载体;
正义链:5’-CAC CGC GGT CAG CAT CAC AAC TAA TTT CAA GAG AAT TAGTTG TGA TGC TGA CCG CTT TTT TG-3’
反义链:3’-GTG GCG CCA GTCGTA GTG TTG ATT AAA GTT CTC TTA ATCAACACTACG A CTGGC GAAAAAAC-5’;
所述蛋白EphA3激活或介导的信号通路或基因EphA3激活或介导的信号通路为Akt信号通路或ERK信号通路;
所述基因EphA3为前列腺癌细胞中的EphA3基因;或所述基因EphA3的核苷酸序列如序列表中序列1中第226-3177位核苷酸所示。
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CN105646662A (zh) * | 2014-03-24 | 2016-06-08 | 朱育盼 | 特异性结合前列腺癌的短肽pcp9及其应用 |
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CN1768139A (zh) * | 2003-02-10 | 2006-05-03 | 独立行政法人产业技术总合研究所 | 通过dna干扰调控基因的表达 |
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Patent Citations (1)
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