CN101843903A - 一种抑制血小板活化的方法及该方法的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制血小板活化的方法及该方法的应用，是通过抑制抑素蛋白1(prohibitin 1，PHB1)和抑素蛋白2(prohibitin 2，PHB2)而抑制血小板活化。抑素蛋白prohibitin 1和2定位在血小板细胞外膜上，调节血小板活化。通过对血小板活化作用的深入研究，抗抑素蛋白1和2的抗体能够抑制凝血酶诱导的血小板活化和聚集，可用于心血管病治疗药物的制备。

Description

一种抑制血小板活化的方法及该方法的应用

技术领域

本发明涉及一种抑制血小板活化的方法及其应用，即通过抑制抑素蛋白1(prohibitin1，PHB1)和抑素蛋白2(prohibitin 2，PHB2)而抑制血小板活化的方法及该方法的应用，属生物医学领域。

背景技术

目前大规模调查结果证实，心血管病和癌症已成为我国成年人的主要死亡原因。心血管病具有高发病、高致残率和高死亡率等特点，发病年龄有年轻化的趋势，是威胁人类健康的重大疾病。近几年来，中国心血管病患者的发病率和死亡率居高不下。从1958年到现在，中国的高血压患病率增加了3倍，心脑血管病增加了4倍，占中国总死亡率的36％。为治疗这两种疾病，每年耗掉医药费近3000亿元人民币。当前，每15秒就有一位中国公民被心脑血管疾病夺去生命，每22秒就有一位中国公民因此失去工作能力。预计到2020年，缺血性心脏病将会成为危害中国人健康的头号敌人。

血小板主要参与止血与血栓形成，在动脉粥样硬化、癌症转移和炎症反应等过程中起重要作用。血小板活化过程是细胞膜接受外界刺激，通过下游一系列信号分子的活化，最终产生血小板聚集，形成血小板栓塞。血小板的活化可通过血小板膜受体的激动首先活化胞内钙库的释放，进一步活化蛋白激酶C，导致血小板GPⅡb-Ⅲa复合物的构型改变，形成黏附分子受体，并通过与纤维蛋白原的结合而使血小板之间相互黏附、聚集成团，在血管破损处形成早期止血栓。此外通过血小板的释放产物，可进一步引起血管收缩，刺激白细胞，损伤内皮细胞，促进血液凝固，有利于血栓形成。血小板活化可以是距常生理性的活化，例如在血管受到损伤后发生的初级止血过程，也可以是病理性的，而异常的血小板聚集会致使血管形成异常血栓，从而影响血液循环，产生缺血或阻塞，引发中风、心肌梗死等疾病。研制开发抑制血小板黏附、释放、聚集功能和血小板活化的抗血小板药物是抗血栓治疗的一个重要策略。阿司匹林是最早被应用于抗栓治疗的抗血小板药物，已经被确立为治疗急性心肌梗死(AMI)，不稳定心绞痛及心肌梗死(MI)二期预防的经典用药。阿司匹林作用机制在于抑制血小板的环氧化酶而抑制血栓烷A2生成，从而阻止血小板聚集和释放反应。vWF在介导血小板黏附、聚集、活化过程中发挥重要作用，因此，针对vWF功能结构域(A1、A3)的抗体具有显著抑制血栓形成的作用，目前已用于抗血栓的治疗。GP Ⅱb-Ⅲa复合物在血小板活化后形成黏附分子受体，是血小板聚集和血栓形成的“最后共同通路”。因此利用GPⅡb-Ⅲa受体拮抗剂(如替罗非班、依替巴肽以及阿昔单抗等)阻断纤维蛋白原配体与GPⅡb-Ⅲa受体的结合就能抑制血小板聚集，使血小板血栓不能形成，GPⅡb-Ⅲa受体拮抗剂替罗非班、依替巴肽以及阿昔单抗等目前已广泛应用于临床心脑血管疾病的治疗。鉴于心脑血管疾病的发病率和死亡率不断上升，通过抑制血小板活化的新方法来防治这类疾病的药物还在不断开发中。

抑素蛋白是一类进化上保守的蛋白，英文名为prohibitin，缩写为PHB，有两个高度同源的成员，PHB1和PHB2，人抑素蛋白prohibitin 1和2的美国GenBank序列号分别为P35232和Q99623。抑素蛋白参与调节衰老及很多疾病，如炎症、肥胖、癌症等。抑素蛋白主要定位在线粒体上，与线粒体的发生、形态及功能的维持有关。此外，细胞核上的抑素蛋白可以参与调节细胞周期，抑制肿瘤细胞的增殖及细胞凋亡过程。在某些特定的细胞系中，抑素蛋白也能定位在细胞外膜上。例如：在B-淋巴细胞表面，抑素蛋白1和2与IgM表面抗原受体结合，可能与淋巴细胞的分化有关。在人小肠上皮细胞中，抑素蛋白1和2作为伤寒杆菌的Vi夹膜多糖的作用位点，使得伤寒杆菌免于被机体的免疫系统识别。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制血小板活化的方法及该方法的应用，通过抑制抑素蛋白prohibitin 1和2来抑制血小板活化，可用于心血管治疗药物的制备、用于生物医学试剂制备和制药。

本发明提供一种通过抑制抑素蛋白1和2来抑制血小板活化的方法。对抑素蛋白1和2的抑制作用可通过抗体而实现。该抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或嵌合抗体。

本发明所述的抑制血小板活化的方法的用途，是将该方法用于心血管病治疗药物的制备。

本发明的积极作用在于通过对血小板活化作用的深入研究，证明了抑素蛋白1和2存在于血小板膜表面并在血小板活化过程中发挥了作用；抗抑素蛋白1和2的抗体可抑制凝血酶诱导的血小板活化，用于心血管疾病治疗药物的制备。

附图说明

图1为本发明的血小板膜人抑素蛋白1和2鉴定图谱。

图2为本发明的人抑素蛋白1和2的免疫杂交(Western-Blot)鉴定图谱。

图3为本发明的通过流式细胞仪检测人抑素蛋白1和2在血小板上的分布图。

图4为本发明的人抑素蛋白1和2在血小板不同亚细胞组分的定位图。

图5为本发明的抗人抑素蛋白1和2的抗体对血小板聚集的抑制作用图。

图6为本发明的抗人抑素蛋白1和2的抗体对血小板钙动员的抑制作用图。

图7为本发明的人抑素蛋白1和2在血小板激动时的分布变化图。

具体实施方式

实施例1：亲和层析及质谱法鉴定人抑素蛋白prohibitin1(PHB1)和prohibitin2(PHB2)

(一)血小板洗涤

健康人富血小板血浆用台氏液A液(137mM氯化钠，0.3mM磷酸二氢钠，12mM碳酸氢钠，0.35％牛血清白蛋白，2mM乙二胺四乙酸，1mM氯化镁，5mM葡萄糖，pH6.5)洗涤两次后，血小板用台氏液B液(137mM氯化钠，0.3mM磷酸二氢钠，12mM碳酸氢钠，0.35％牛血清白蛋白，2mM乙二胺四乙酸，1mM氯化镁，5mM葡萄糖，pH7.35)悬浮，并调整浓度至5×10⁸/毫升待用。

(二)亲和层析及鉴定

将人血小板裂解液(100mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM氯化钠，1％ Triton X-100，10mM EGTA，3mM PMSF，3mM钒酸钠，10微克/毫升leupeptinh和aprotinin)经过偶联了大蹼铃蟾具有血小板激活作用的三叶因子(Bm-TFF2)的亲和层析柱后，发现有35kDa和31kDa的两个分子能够被特异性吸附；而等量人血小板裂解液分别经过偶联了甘氨酸(Glysine)及血小板膜GPVI受体特异性激动剂(Stejnulxin)的亲和层析柱后在相应位置无明显特异性被吸附分子，见图1。

通过质谱分析发现，这两个分子分别是人抑素蛋白prohibitin1和2，MS/MS二级质谱鉴定，见下表。

Mascot mass search results against Swiss-Prot

利用Mascot软件在Swiss-Prot数据库进行质谱搜索的结果

Protein name蛋白名称	Peptide Sequences肽序列	Sequence Coverage序列覆盖度
			Human PHB1(accession NoP35232)	AVIFDRFRQVAQQEAERQVSDDLTERFDAGELITQRDLQNVNITLRFVVEKAEQQKVLPSITTEILKQVAQQEAERARILFRPVASQLPRIFTSIGEDYDERLEAAEDIAYQLSRKLEAAEDIAYQLSRAAELIANSLATAGDGLIELRNVPVITGSKDLQNVNITLRSRNITYLPAGQSVLLQLPQ	57％

Protein name蛋白名称	Peptide Sequences肽序列	Sequence Coverage序列覆盖度
			Human PHB2(accession NoQ99623)	ESVFTVEGGHRISSPTGSKDLQMVNISLRDLQMVNISLRVLSRPNAQELPSMYQRSVVAKFNASQLITQRFNASQLITQRAQVSLLIRQVAQQEAQRQVAQQEAQRAQFLVEKQKIVQAEGEAEAAKMLGEALSKNPGYIKAAQNISKTIATSQNRIYLTADNLVLNLQDESFTR	48％

同时还利用羊源anti-PHB1(美国R&D公司，货号AF3470)和兔源anti-PHB2(美国Millipore公司，货号07-234)特异性抗体对这两个分子用免疫杂交(Western-blot)进一步验证。结果表明这两个分子是PHB1和PHB2，见图2。

上述结果表明：来自大蹼铃蟾的具有人血小板激活活性的三叶因子BM-TFF2能通过与人抑素蛋白prohibitin 1和2的相互作用激动人血小板。而来自竹叶青蛇毒的特异性作用血小板膜糖蛋白受体GPVI诱导血小板聚集的C-型凝集素样蛋白Stejnulxin则不作用于血小板人抑素蛋白prohibitin 1和2。

实施例2：PHB 1和PHB 2在血小板上的定位

(一)激光共聚焦免疫荧光检测

将洗涤好人血小板包被胶原的盖玻片上，加入4％多聚甲醛固定10分钟，把盖玻片吹干，移到新的6孔板，用血小板用台氏液B液洗3遍，接下来用含有3％牛血清白蛋白的台氏液B液封闭1小时。洗掉封闭液，加一抗(羊源anti-PHB1，美国R&D公司，货号AF3470；兔源anti-PHB2，美国Millipore公司，货号07-234；鼠源anti-CD61(CD61为血小板膜表面标志蛋白)，美国BD公司，货号555752)(1比1000稀释)，于室温放置1小时，然后用台氏液B液洗3遍，再加入相应的荧光标记的二抗(PHB1检测：驴抗羊二抗，美国Santa Cruz公司，货号sc-2042；PHB2检测：羊抗兔二抗，美国Santa Cruz公司，货号sc-2040；CD61检测：羊抗鼠二抗，美国Santa Cruz公司)(1比1000稀释)，室温放置1小时后用台氏液B液洗3遍，用50％甘油封片，最后在激光共聚焦上使用油镜观察。结果表明：血小板膜表面标志蛋白CD61以及PHB1和PHB2均分布于血小板膜表面。

(二)流式细胞检测

血小板洗涤后，经4％多聚甲醛固定，使用3％牛血清白蛋白封闭30分钟，加入相应的一抗(羊源anti-PHB1，美国R&D公司，货号AF3470；兔源anti-PHB2，美国Millipore公司，货号07-234)(1比100稀释)室温孵育1小时后用台式液B液洗3遍，再加入相应的荧光标记的二抗(PHB1检测：驴抗羊二抗，美国Santa Cruz公司，货号sc-2042；PHB2检测：羊抗兔二抗，美国Santa Cruz公司，货号sc-2040)(1比100稀释)，室温孵育30分钟后用台式液B液洗1遍，采用相应波长的激发光通过流式细胞仪(LCRII)检测细胞的荧光强度。结果表明：与灰色填充部分同型IgG对照相比，黑线部分特异性抗体结合血小板膜表面PHB1或PHB2后荧光强度增强，充分证明PHB1和PHB2分布于血小板膜表面，见图3。

血小板亚细胞组分分离

血小板膜蛋白制备

600毫升过期血小板中加入3mM阿司匹林，室温避光处理25分钟后，离心10分钟，沉淀的血小板团块悬浮于60毫升的缓冲液A(25mM Tris-HCl，5mM氯化镁，pH7.4)，离心15分钟，沉淀的血小板团块悬浮于30毫升的缓冲液A，悬浮液超声处理，然后离心10分钟，取出上清，上清超速离心(100,000×g)30分钟，沉淀的血小板膜团块悬浮于24毫升的缓冲液B(50mM Tris-HCl，10mM CHAPS，pH 7.4)，悬浮液于玻璃匀浆器中匀浆10次，4℃ 100,000×g超速离心30分钟，收集上清液，测定蛋白浓度，分装，-20℃冻存。

血小板线粒体制备

14毫升人富血小板血浆用Hepes-NaCl缓冲液(145mM氯化钠，10mM Hepes，10mM葡萄糖，5mM氯化钾，1mM硫酸镁，0.1％牛血清白蛋白和0.2单位/毫升apyrase，pH 7.45)洗涤，466g离心，沉淀悬于5ml预冷的低渗缓冲液MgRSB(10mM氯化钠，1.5mM氯化镁，10mM Tris-Cl，pH 7.5，外加各种蛋白酶抑制剂)中10分钟，转到匀浆器中匀浆30次，加入4毫升2.5×MS缓冲液(210mM甘露醇，70mM蔗糖，5mM乙二胺四乙酸，5mM Tris，pH 7.6)温和的上下翻转六次，以稳定线粒体。将匀浆液离心，1300g，4℃，10分钟，取上清，去除没有裂解完全的血小板。上清继续离心，17000g，4℃，10分钟，沉淀即为线粒体粗品。将沉淀悬于1毫升1×MS，置于叠加的蔗糖浓度依次为1.5M，1.2M，1M的离心管顶部，进行超速离心，110,000g，4℃，30分钟，线粒体存在于1.2M与1.5M的交界处。

将分离的亚细胞组分利用抗PHB1、抗PHB2、抗线粒体标志蛋白CoxIV以及抗膜蛋白CD41进行Western-blot检测，发现抑素蛋白1和2存在于血小板的线粒体及血小板膜组分里，结果见图4。

上述3个结果表明：人抑素蛋白prohibitin 1和2在血小板外膜及血小板线粒体均有分布。

实施例3：抗PHB 1和PHB 2的抗体制备

抗原制备：1)质粒构建：PHB1/2构建入pET-17b方法如下。设计上下游引物，在下游引物上引入组蛋白标签，分别为PHB1，F：5-ggaattccatatggctgccaaagtgtttgagtc-3，R：5-ccggaattc ttagtggtggtggtggtggtgctggggaagctggagaagc-3；PHB2，F：5-ggaattc catatggcccagaacttgaaggacttag-3，

R：5-ccg gaattc ttagtggtggtggtggtggtgatttcttacccttaatgagg-3利用PHB1或2的cDNA作模板扩增，产物酶切后插入pET-17b中，分别转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3 plus)(购自Novagen)中，选取阳性克隆进行插入片段的核酸测序进行鉴定。测序正确的的阳性单克隆菌株接种到5ml LB培养基，37℃培养过夜，将5ml培养液接种到1升培养基中放大培养，待600nm OD值达到0.6后，加入0.5mM IPTG，再培养3.5小时后收集菌液，8,000g离心10分钟，细菌再用100毫升平衡缓冲液(50mM磷酸钠，pH 8.0，含0.3M氯化钠和10mM咪唑)重悬。在冰浴上超声破碎细菌(Ultrasonic Cell CrusherJY92-2D，350W，60个循环)。16,000g离心15分钟后收集上清可溶性部分，过镍亲和柱，用20倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，pH 8.0含0.3M氯化钠和20mM咪唑)冲洗后，用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，pH 8.0，含0.3M氯化钠和250mM咪唑)洗脱，洗脱后分别得到PHB1或PHB2带组蛋白标签的融合蛋白。

2)抗体制备：新西兰兔2.2公斤左右，抽取免疫前血清2毫升备用。第一次注射：每只兔子用1毫克融合蛋白，加入等体积(1ml)的进口福氏完全佐剂。8号针头，0.5ml打左脚掌(先去毛)，0.5ml打右脚掌。剩下的1ml打背部皮内16-18个点，沿着脊柱两侧皮内注射。第二次免疫：打腘窝淋巴结(第一次注射的24天后)，0.5mg融合蛋白溶于同等体积(0.5mL)的进口福氏完全佐剂)。第三次免疫(第一次注射后的42天)：打腘淋巴结，有的腘窝淋巴结已肿大，0.5mg融合蛋白溶于同等体积(0.5ml)的进口福氏不完全佐剂。第一次注射的56天后，固定兔子，抽0.5ml耳垂血，做琼脂双扩散检测(效价≥1∶16)。第二天，心脏放血或耳动脉放血。4℃冰箱放置3小时，分离抗血清，加入0.05％NaN3后于-70℃保存抗血清。

实施例4：抗PHB 1和PHB 2的抗体抑制凝血酶诱导的血小板聚集

血小板聚集抑制实验在恒定转速(1100转/分)转动的血液聚集仪(普利生，北京)上进行分析。洗涤好的血小板用台式液B液稀释至终浓度为5×108/毫升，300微升反应体系，加凝血酶(10单位/毫升)5微升，记录5分钟内光吸收值的变化，并以此为对照。

抗人PHB1的抗体来源于美国R&D公司(货号为AF3470)或自制；抗人PHB2的抗体来源于美国Millipore公司(货号为07-234)或自制。

对于抑制实验，在反应体系中加入30微克/毫升抗人抑素蛋白1的抗体(商品化或自制)及30微克/毫升抗人抑素蛋白2的抗体(商品化或自制)，保温10分钟后，再加入10nM的凝血酶，记录5分钟内的光吸收值的改变。然后在反应体系分别加入30微克/毫升抗抑素蛋白1的抗体或抗抑素蛋白2的抗体，分别记录他们各自的抑制效果。

实验结果表明：同时加入抗抑素蛋白1的抗体及抗抑素蛋白2的抗体后，可以完全抑制10nM凝血酶诱导的血小板聚集；单独加入抑素蛋白1的抗体或抗抑素蛋白2的抗体对10nM凝血酶诱导的血小板聚集的抑制率约为50％，见图5。

实施例5：抗PHB 1和PHB 2的抗体抑制凝血酶诱导的血小板钙动员

2ml的人富血小板血浆(PRP)(1.4×109血小板/ml)先与阿斯匹林(终浓度100μM)在37℃避光保温40分钟，加入终浓度为0.2U/ml的三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)后，PRP与胞内钙离子荧光指示剂Fluo 3-AM(终浓度5μM)在37℃避光保温标记45分钟，再加入80μl的柠檬酸-葡萄糖缓冲液，500g离心2分钟，沉淀的血小板团块悬浮于羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)缓冲液A，pH 6.6(136mM NaCl，10mM葡萄糖，5mMHepes，2.7mM KCl，2mM MgCl2，0.2U/ml Apyrase，0.1％(w/v)BSA)，重复离心一次后，沉淀的血小板团块悬浮于Hepes缓冲液B，pH 7.5(成分相同于Hepes缓冲液A，pH用Tris碱上调)，血小板浓度用Hepes缓冲液B调至为5×107个血小板/ml。所有缓冲液中加入2.5mM的丙磺舒(Probenecid)阻止钙离子的外流。在加激动剂刺激血小板之前，加终浓度为0.1mM的乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，以螯合血小板胞外钙。Fluo3-AM-Ca2+复合物的荧光用Perkin-Elmer LS50B型荧光分光光度仪测定，激发波长505nm，发射波长530nm，荧光强度的变化经公式[Ca2+]i＝Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)换算成血小板胞内钙离子的变化。

对于凝血酶诱导血小板内钙动员测定，2ml反应体系，加入凝血酶5 1(100U/ml)，记录5分钟内光吸收值的改变。对于抑制实验，2ml反应体系，加入商品化或自制10 1人prohibitin 1(1mg/ml)及商品化或自制10 1人prohibitin2的抗体(1mg/ml)，37℃搅拌5分钟，再加入5 1凝血酶(100U/ml)，测定5分钟内的光吸收值。

结果表明：同时加入人prohibitin 1和人prohibitin 2的多克隆抗体能够完全抑制低剂量凝血酶诱导的血小板内的钙动员，而分别单独加入抗人prohibitin 1及抗人prohibitin2的多克隆抗体，其抑制效果只能达到50％左右，见图6。

实施例6：血小板活化时PHB 1和PHB 2在脂筏中的招募

使用蔗糖密度梯度离心的方法分离人血小板脂筏。洗涤血小板样品250微升(静息及活化的血小板)使用等体积的2×裂解液裂解(100mM Tris，pH 7.4，150mM氯化钠，1％Triton X-100，10mM EGTA，3mM PMSF，3mM钒酸钠，10微克/毫升leupeptinh和aprotinin)，冰上放置15分钟，裂解液与等体积的冰冷的80％蔗糖混匀，放置在离心管的底部，上面依次铺上1.5毫升30％蔗糖，0.75毫升5％蔗糖，在100,000×g离心18个小时，由上至下，一次取0.32毫升为一管，共收集11管。

将分离的样品进行Western-blot检测，所用的检测抗体为：抗人抑素蛋白1和2的抗体(商品化或自制)、抗蛋白酶激活受体PAR 1、抗血小板脂筏标志物flotilin-1抗体以及抗胞内标志蛋白p85/PI3K的抗体来检测。

结果表明：活化状态与静息状态的血小板相比，抑素蛋白1和2的分布有明显的差异，活化状态下，抑素蛋白1和2的分布与flotillin-1的分布相同，说明它们在血小板激动时，被招募到脂筏中而富集，见图7。

Claims (4)

1.一种抑制血小板活化的方法，其特征在于：通过抑制抑素蛋白1和2来抑制血小板活化。

2.根据权利要求1所述的抑制血小板活化的方法，其特征在于：对抑素蛋白1和2的抑制作用可通过抗体而实现，

3.根据权利要求2所述的抑制血小板活化的方法，其特征在于：该抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或嵌合抗体。

4.如权利要求1所述的抑制血小板活化的方法的应用，其特征在于：将该方法用于心血管病治疗药物的制备。

Images