CN101793782A - 甲醛测定试剂(盒)及甲醛浓度测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的甲醛测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定甲醛浓度的方法、试剂的组成及成分，属于食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括：缓冲液、辅酶、乙酰-辅酶A、乙醛、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度，从而测算出甲醛的浓度大小。

Description

甲醛测定试剂(盒)及甲醛浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种甲醛测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定甲醛浓度的方法，属于食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

甲醛测定的测定方法主要有分光光度法、色谱法、电化学法、化学滴定法等：

分光光度法测定的主要方法有乙酰丙酮法、铬变酸法、MBTH法、付品红法、AHMT法等几种。分光光度法的优点是操作简便；缺点是灵敏度较低，有污染介质，对测定有干扰。

色谱法主要有气相色谱、高效液相色谱法、离子色谱法等，直接利用色谱法较少，一般是和其它分析仪器相连用，如GC-MS、HPLC-UV等。色谱法方法简单、快速、直接，但是操作繁琐、试剂消耗量大、方法选择性差等缺点。

电化学法包括示波极谱法、吸附伏安法和哥腊衍生试剂法，该法空气中甲醛的灵敏度和准确度都很高，适合于测定室内空气中微量甲醛。

荧光分析法因具有快速、简便、灵敏度高、重现性好等优点而受到人们广泛的重视，尤其是用于室内空气环境中痕量甲醛的分析监测，其优点更为突出。化学发光分析法具有灵敏度高，线性范围宽，仪器设备简单等优点。

化学滴定法主要包括电位滴定法、碘量法及酸碱滴定法。

综合上述，没有一个方法可以使用自动化仪器检测甲醛的，酶法检测甲醛的试剂，酶法的优点是特异性高不受干扰、操作方便、成本低廉、可以大批量检测，方法灵敏。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定甲醛浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的甲醛测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行甲醛浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明甲醛浓度测定方法如下：

甲醛+辅酶+水 甲醛脱氢酶 甲酸+还原型辅酶

甲酸+乙酰-辅酶A 甲酸C-乙酰基转移酶  辅酶A+丙酮酸

辅酶A+乙醛+辅酶 乙醛脱氢酶(乙酰化) 乙酰-辅酶A+还原型辅酶

这种方法应用甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase；EC 1.2.1.46)酶(偶)联甲酸C-乙酰基转移酶(formate C-acetyltransferase；EC 2.3.1.54)、乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase；EC 1.2.1.10)酶促反应比色终点法。甲醛脱氢酶酶解甲醛反应产生甲酸，再通过(偶)联合甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶的作用，最终二次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算甲醛的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明甲醛测定试剂(盒)较为理想：

缓冲液                             100mmol/L

稳定剂                             500mmol/L

辅酶                               3mmol/L

甲醛脱氢酶                         10000U/L

甲酸C-乙酰基转移酶                 12000U/L

乙醛脱氢酶                         12000U/L

乙酰-辅酶A                         4mmol/L

乙醛                               12mmol/L

本发明的甲醛测定试剂(盒)可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、乙酰-辅酶A、乙醛。

试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰-辅酶A、乙醛。

试剂2

缓冲液、稳定剂、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶。

辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、乙酰-辅酶A、乙醛在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰-辅酶A、乙醛。

试剂2

缓冲液、稳定剂、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、甲醛脱氢酶。

辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、乙酰-辅酶A、乙醛在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定甲醛浓度的方法，其辅酶可以是NADP⁺、NAD⁺或thio- NAD⁺中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的甲醛测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

辅酶                             3mmol/L

甲醛脱氢酶                       10000U/L

甲酸C-乙酰基转移酶               12000U/L

乙醛脱氢酶                       12000U/L

乙酰-辅酶A                       4mmol/L

乙醛                             12mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甲醛样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出甲醛的浓度大小。

实施例二

本实施例的甲醛测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           50mmol/L

辅酶                             3mmol/L

乙酰-辅酶A                       4mmol/L

乙醛                             12mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           50mmol/L

甲醛脱氢酶                       10000U/L

甲酸C-乙酰基转移酶               12000U/L

乙醛脱氢酶                       12000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甲醛样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出甲醛的浓度大小。

实施例三

本实施例的甲醛测定试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           50mmol/L

辅酶                             3mmol/L

乙酰-辅酶A                       4mmol/L

乙醛                             12mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

甲酸C-乙酰基转移酶               12000U/L

乙醛脱氢酶                       12000U/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

甲醛脱氢酶                       10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定甲醛浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甲醛样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出甲醛的浓度大小。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0007；吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达15mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±3％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.180±0.009ΔA/mmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。

Claims (6)

1.一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的甲醛的浓度测定方法，其方法如下：

甲醛+辅酶+水  甲醛脱氢酶  甲酸+还原型辅酶

甲酸+乙酰-辅酶A    甲酸C-乙酰基转移酶    辅酶A+丙酮酸

辅酶A+乙醛+辅酶  乙醛脱氢酶(乙酰化)  乙酰-辅酶A+还原型辅酶

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，测算出甲醛的浓度大小测定结果。

2.一种甲醛测定试剂(盒)，主要成分包括：

缓冲液                          20——500mmol/L

稳定剂                          1——4000mmol/L

辅酶                            1——6mmol/L

甲醛脱氢酶                      1000——80000U/L

甲酸C-乙酰基转移酶              1000——80000U/L

乙醛脱氢酶                      1000——80000U/L

乙酰-辅酶A                      1——50mmol/L

乙醛                            1——50mmol/L

试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。

其特征在于：试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述甲醛测定试剂(盒)，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、乙酰-辅酶A、乙醛组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述甲醛测定试剂(盒)，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、乙酰-辅酶A、乙醛组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰-辅酶A、乙醛组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶组成。辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、乙酰-辅酶A、乙醛在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述甲醛测定试剂(盒)，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、乙酰-辅酶A、乙醛组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰-辅酶A、乙醛组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、甲醛脱氢酶组成。辅酶、甲醛脱氢酶、甲酸C-乙酰基转移酶、乙醛脱氢酶、乙酰-辅酶A、乙醛在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述甲醛测定试剂(盒)，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。