CN101785712A - 双半胚移植提高牛移植妊娠率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双半胚移植提高牛移植妊娠率的方法，涉及家畜繁殖学领域，属于胚胎生物技术范畴，作为提高牛繁殖力的辅助技术。本方法将胚胎分割后，将一对半胚移植到一头黄体合格受体母牛中。该方法显著提升了胚胎和受体牛的妊娠率，可显著提高牛胚胎移植技术的经济效益。

Description

双半胚移植提高牛移植妊娠率的方法

技术领域

本发明涉及家畜繁殖学领域，属胚胎生物技术的范畴，作为提高牛繁殖力的辅助技术。

背景技术

近二十年来，通过分割哺乳动物的早期胚胎来人工产生遗传上完全相同的同卵双胎或多胎动物，在绵羊、牛、小鼠、大鼠、马、兔、猪等哺乳动物中已广为开展。为生产上提供了具有优良品种(产肉、产奶量高等)的动物，同时，还给发育遗传学、生理学等领域提供了进行科学研究的宝贵材料。所谓胚胎分割系指用人工方法将一个植入前胚胎分割成两个或多个部分，每一部分移植后可发育成一个正常个体。早在1959年，Tarkowski发现一半卵裂球已被破坏的2-细胞小鼠胚胎可以发育成囊胚，并出生了小鼠。其研究结果表明：早期胚胎的每个卵裂球具有发育全能性，即能发育成正常个体。1980年，Willadsen用琼脂包埋分割的绵羊2、4、8-细胞期胚胎，使半胚在中间受体内发育时受到保护，并防止其内的卵裂球分散，取得了近似正常的妊娠率(66％)。但此方法较复杂，很难在生产上推广应用。1984年改进了方法，分割较晚期的胚胎(桑椹胚或胚泡)，分割后的胚胎立即移植，因而具有很大的实用价值。近年来，科学家们仍在寻求更加简便、完善的胚胎分割和培养方法，以提高胚胎分割的效率。在哺乳动物尤其是大型农场动物进行良种繁殖时，可用胚胎分割方式增加胚胎数目及人造同卵双胎和多胎数目，移植后便可获得更多的良种。目前，在家畜特别是经济价值较高的牛中，胚胎分割已成为常规技术在商业胚胎移植中应用。胚胎分割亦可按需要从一个胚胎切出一部份用作性别鉴定。胚胎分割的方法归纳为以下几种：

1、酶软化透明带后玻璃针分割法：用0.5％的链霉蛋白酶软化胚胎透明带，若是紧密化胚胎(如桑椹胚)，则需在无钙、镁的平衡盐溶液中处理20分钟，使胚胎去紧密化，再把玻璃微针固定在一侧的显微操作臂上，将针置于欲分割的胚胎上面，使其与胚胎呈30度角，对准胚胎的正中平分线徐徐下压，即可将一个胚胎分割成两半。

2、直接分割法：胚胎透明带不经任何处理，用显微手术刀或玻璃针将整个胚胎分割为二。该方法多用于晚期桑椹胚或胚泡期的胚胎分割。

3、微吸管吹吸法：即在显微镜下，把胚胎用微吸管吸引固定，用微细玻璃针在透明带上割开一个3/4大的切口，用吸管将卵裂球全部吸出透明带，再用一根尖端仅允许单卵裂球通过的吸管轻轻吹吸，将卵裂球分离成一半。此方法多用于分割绵羊、大鼠的2、4、8-细胞期胚胎。

Lewis的研究表明，牛的1级体内受精单整胚的移植妊娠率为70％时，其单半的移植妊娠率约为50-55％，相当于整胚的100-110％，这使胚胎的受孕机会增加了30-40％(Carl Wood，2001)。

单半胚移植虽然能增加胚胎的受孕机会，但却使受体牛的妊娠机会降低了15-20％。

发明内容

本发明的目的是针对现有单半胚移植会降低受体牛妊娠机会的问题，提出一种双半胚移植的方法，在增加胚胎受孕机会的同时，也增加受体牛的妊娠机会。同时提出一种快速简便胚胎分割方法。

双半胚移植提高牛移植妊娠率的方法，其特征在于：将胚胎分割成两半，将一对半胚移植到一头受体母牛中，同时发育。

所述胚胎为处于紧缩桑葚胚、早期囊胚、囊胚或扩张囊胚的牛1-2级胚胎。采用所述胚胎的原因为：牛非手术子宫采胚技术是在母牛发情后7-8天进行，此阶段所采集的可用胚胎均处于上述发育阶段；处于紧缩桑葚胚之前阶段的胚胎细胞数少，分割后不易成活，而处于扩张囊胚之后阶段的胚胎已经从透明带中孵化，不宜冷冻保存。

所述分割法为玻璃针分割法、直接分割法、微吸管吹吸法。

所述分割法优选为一种快速简便直接分割方法，步骤为：用双面刀片线切割成显微手术刀，做洗刀平皿清洗消毒，做分割液滴洗胚胎，分割并回收。

冷冻胚胎应在解冻后再进行分割。

所述母牛为同期发情或自然发情后7.0-8.0天的黄体合格的母牛。因为所冲出的胚胎是在供体母牛发情后7.0-8.0天的胚胎，所以需要移植到处于相同生理阶段的受体母牛体内。

所述移植是将一对半胚用4段液法装入一支0.25ml细管的中段，细管装入移植枪，将胚胎移植到受体有黄体一侧子宫角的上1/3——1/2处。

本方法将胚胎分割后将一对半胚移植到一头受体母牛的子宫中同时发育，既能提高整胚的妊娠率，同时也能提高牛的妊娠率。

附图说明：

图1为4段液法装管图示。左端为棉栓(未显示)，右端为细管塞(未显示)，1-3阴影部分均为冷冻液，4阴影部分为Holding液或冷冻液，空白部分为气泡。各段长度为1：25mm；2：15mm；3：20mm，装有胚胎；4：不定，直到封满口。

具体实施方式：

实施例1：对弗拉威赫牛鲜整胚进行试验

胚胎：选择处于紧缩桑葚胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚的弗拉威赫牛鲜整胚进行分割。

仪器：使用OLUMPUS倒置显微镜和一个显微操作机械手。

工具：用双面刀片线切割成宽为1.5mm，长为7-8mm，尖端角度为40°-50°之间的显微手术刀，显微手术刀固定在一直径2mm，弯成约150°，长臂长约48mm，短臂长约27mm的塑料材质的柄上。刀柄短臂与显微操作机械手固定。

器皿：4孔或6孔培养皿1个(放置和洗涤胚胎)，￠60mm培养皿1个(盖和底均可做分割液滴)，￠35mm培养皿4个(清洗消毒刀)。

溶液：胚胎体外保存液Holding(含血清或血清替代品)，胚胎分割液Splitting(不加任何蛋白源)

分割操作：

(1)调节显微手术刀的方位、角度：刀面严格垂直于分割皿底面，刀刃线与分割皿底面几乎平行，刀尖略低。

(2)做洗刀平皿清洗消毒显微手术刀：给4个￠35mm培养皿编号：1#皿加超纯水，2#皿加75％乙醇，3#皿加超纯水，4#皿加Splitting。4个培养皿放在一个边长约120mm的正方皿中，便于移动洗刀。每分割1-2个胚胎按顺序清洗刀一遍。

(3)做分割液滴洗胚胎：在￠60mm培养皿的盖或底上做分割液滴，每滴50-70ul，将1-2枚胚胎从Holding液中取出，在Splitting液中洗2-3次后放入分割液滴中，准备分割。

(4)胚胎分割和回收：将显微手术刀的尖端部置于欲分割的胚胎上面，以刀尖刚探出胚胎为宜，对准胚胎的正中平分线徐徐下压，即可将一个胚胎分割成两半。分割后的胚胎用吸有Holding液的吸管进行回收，一对半胚放入一个培养孔中。

双半胚的移植：用同期发情或自然发情后7.0-8.0天的黄体合格的母牛做受体进行移植。将一对半胚用4段液法装入一支0.25ml细管的中段，细管装入移植枪。将胚胎移植到受体有黄体一侧子宫角的上1/3——1/2处。

结果：分割弗拉威赫牛鲜整胚20枚，分割成功率达100％，双半胚同侧移植到20头受体牛，60天妊娠检查，移植妊娠率达80％；对照组鲜整胚移植妊娠率为61％。同时，同卵双犊率达到25％。

实施例2：对弗拉威赫牛冷冻-解冻后整胚进行试验

操作及所用试剂器皿同实施例1

结果显示，分割弗拉威赫牛冷冻-解冻后整胚10枚，分割成功率达100％，双半胚同侧移植到10头受体牛，60天妊娠检查，移植妊娠率达60％；同期分割弗拉威赫牛鲜整胚25枚，分割成功率达100％，双半胚同侧移植到25头受体牛，60天妊娠检查，移植妊娠率达68％：对照组鲜整胚移植妊娠率为57％。

以上研究表明，从胚胎的角度讲，双半胚移植可以使整胚的妊娠率提高到约100％；从受体牛的角度讲，双半胚移植可以使受体牛的移植妊娠率比单整胚提高10-20％。该方法可显著提高牛胚胎移植技术的经济效益。

Claims (10)

1.双半胚移植提高牛移植妊娠率的方法，其特征在于：将胚胎分割成两半，将一对半胚移植到一头受体母牛中。

2.根据权利要求1所述方法，所述胚胎为紧缩桑葚胚、早期囊胚、囊胚或扩张囊胚的牛1-2级胚胎。

3.根据权利要求1所述方法，所述分割采用的方法为玻璃针分割法、直接分割法、微吸管吹吸法。

4.根据权利要求1所述方法，所述分割采用步骤为：用双面刀片线切割成显微手术刀，做洗刀平皿清洗消毒，做分割液滴洗胚胎，分割并回收。

5.根据权利要求4所述方法，所述洗刀平皿清洗消毒步骤为：准备四个培养皿，分别加超纯水，75％乙醇，超纯水，PBS溶液Splitting，每分割1-2个胚胎按顺序清洗刀一遍。

6.根据权利要求3所述方法，所述分割液滴洗胚胎步骤为：在培养皿的盖或底上做分割液滴，每滴50-70ul，将1-2枚胚胎从Holding液中取出，在Splitting液中洗2-3次后放入分割液滴中，准备分割。

7.根据权利要求3所述方法，所述回收为将分割后的胚胎用吸有Holding液的吸管进行回收，一对半胚放入一个培养孔中。

8.根据权利要求1-4任一所述的方法，所述胚胎为冷冻胚胎，所述方法还包括在分割前对冷冻胚胎进行解冻。

9.根据权利要求1所述方法，所述受体母牛为同期发情或自然发情后7.0-8.0天的黄体合格的母牛。

10.根据权利要求1所述方法，所述移植是将一对半胚用4段液法装入一支细管的中段，细管装入移植枪，将胚胎移植到受体有黄体一侧子宫角的上1/3——1/2处。