CN101781638B

CN101781638B - 一种以脂氧合酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法

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Publication number: CN101781638B
Application number: CN2010100391685A
Authority: CN
Inventors: 韩伟; 何宝玉; 陈应昆
Original assignee: WANFANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd YUNNAN
Current assignee: WANFANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd YUNNAN
Priority date: 2010-01-14
Filing date: 2010-01-14
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-01-14
Also published as: CN101781638A

Abstract

一种以脂氧合酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法，属于烟草复烤前添加的酶制剂。本发明以烟草种植的后期打顶废弃物预留3～5叶上部为LOX提取原料，多批次提取调制LOX酶活力为200～300U/mL的浓缩酶原液，提取过程中使用含有PMSF蛋白酶抑制剂的缓冲液，并用EDTA络合剂去除金属离子，本发明还给出一种简便的LOX酶活力测定方法。用本发明LOX稀释液代替片烟复烤第二次湿叶用水，能转化烤烟烟叶中的质体色素类胡萝卜素，提高烟香和品质。

Description

一种以脂氧合酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法

技术领域

本发明属于烟草复烤前添加的提高烟草品级的酶制剂。

背景技术

脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12)，又名：亚油酸氧化还原酶，俗称脂肪氧化酶、脂肪加氧酶、脂肪氧合酶、胡萝卜素氧化酶或类胡萝卜素氧化酶等，广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中。下列内容中，将根据相关文献和习惯使用类胡萝卜素氧化酶或LOX作为脂氧合酶的称谓，其含义都是一致的。

烟叶是光合作用的产物，其中的质体色素等与烟草香味及吸味关联，叶绿素和类胡萝卜素是主要的质体色素。在烟叶调制、醇化过程中，类胡萝卜素类物质因双键断裂的部位不同可产生很多致香物质，如大马酮、紫罗兰酮、二氢弥猴桃内酯等，降解产物的含量增加，能增加烟叶香味。烤烟烟叶中的胡萝卜素是由68％的β-胡萝卜素和32％的新-β-胡萝卜素所组成的混合物，而叶黄素的构成为60％的叶黄素，22％的新黄素和18％的紫黄质。对质体色素及相关因素的研究一直是国内外烟草业的热点。周冀衡等分析比较不同烤烟样品质体色素及中性挥发性香气物质发现：云南、津巴布韦烤烟的质体色素及其降解形成的中性致香物质明显高于其它产区[周冀衡，等。产烟国部分烟区烤烟质体色素及主要挥发性香气物质含量比较。湖南农业大学学报，2005，(2)：128～132]。杨立均等分析认为：在烟叶调制中，叶绿素和类胡萝卜素都减少，但叶绿素的降解速度远远大于类胡萝卜素的降解速度，由此引起叶组织内色素比例的变化，即类胡萝卜素占色素总量的比例由烘烤前的38％逐渐增加到烘烤后的76％[杨立均，等。烘烤过程中烟叶色素的降解及与化学成分的相关分析。中国烟草科学，2002，(2)：5～7]。云南复烤片烟进行自然陈化研究发现，烤烟中多数香味成分的含量随陈化时间的增加呈先升后降趋势，比较突出的有β-大马酮、β-二氢大马酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮(a、b、c、d异构体)以及3-羟基大马酮等[胡有持，等。云南烤烟复烤片烟自然陈化时间与质量关系的研究。中国烟草学报，2004，10(4)：1～7]。类胡萝卜素含量的增加会相应地提高烟碱、全氯及钾的含量，降低钙含量、全氮/烟碱和还原糖/烟碱比值。对评吸统计而言，烟叶中类胡萝卜含量的增加对于评吸结果较为有利。但烟叶的香味与类胡萝卜素的存在成反比，添加β-胡萝卜素的降解产物能够增浓烟香，改善醇和性，加入量越大，丰满烟香的效果越明显，但刺激性也随之增加，较为合适的用量为0.01％～0.5％。添加叶黄素的降解产物在烤烟型卷烟上的使用结果表明，吸味变得醇和，香味变得优雅，并带有清甜的果香。

脂氧合酶测定方法较多。生吉萍等总结了蔬菜中脂氧合酶活性的快速测定，有甲基蓝染色(MBB)、胡萝卜染色(CB)和淀粉-碘化钾(KI-S)法等。对新采收的甜玉米，在液氮中用不锈钢刀粉碎成粉末，通过玉米粉与-20℃的冷丙酮以1∶20的比例混合，用Whatman过滤，残渣用丙酮处理到悬浮液无色。最终的残留物与5倍的冷丙酮混合，过滤，室温下真空干燥过夜后，在研钵中磨碎得丙酮粉，-20℃保存。由丙酮粉按1∶10(W/V)与0.2mol/L的Tris-HCl(pH8，4℃)缓冲液混合、离心获得LOX的提取液。LOX活性检测以亚油酸钠为底物，用0.3mL LOX提取液加到2.7mL底物液，用双光柱分光光度计和1cm径长的石英杯，测定OD_234nm值，以分析条件下1min内的OD_234nm变化值表示酶活力单位。对于蔬菜LOX的提取，100℃水中漂烫0、60、180s。漂烫后切成碎块，以W/V比加水2倍，用搅拌机破碎成浆液，用4层纱布过滤，滤液用于LOX的视觉分析。煮10min的LOX的滤液为对照。结果显示，不管蔬菜中是否含有类胡萝卜素，MBB法都是适用的[生吉萍，等。蔬菜中脂氧合酶活性的快速测定。食品科学，2003，4(11)：146～149]。

发明内容

本发明目的首先是率先提出一种提取LOX而变废为宝的方法，即以植物废弃物-烟草去顶预留下的3～5个上部叶为原料，提取LOX用于催化氧化烟叶中质体色素，该质体色素主要指类胡萝卜素，将其转化为烟草品级提高和改善的重要前体物，对片烟复烤后的醇化起到积极的辅助调制作用。

本发明另一目的是提出一种较为快速简易的LOX酶活力测定方法，并将该方法作为原料抽样及提取过程和烟草加工辅助添加的LOX酶制剂的检测方法。

本发明的目的通过以下方式实现：

(一)作为烟草加工的辅助酶制剂产品的LOX

该制剂脂氧合酶酶活力为200～300U/mL。

所述制剂脂氧合酶的最佳酶活力为230U/mL。

所述制剂中含有PMSF蛋白酶活性抑制剂和去除金属离子EDTA络合剂。

PMSF是抑制蛋白酶活性表现的常用生化试剂。

EDTA化学名为乙二胺四乙酸二钠，是常用的金属离子络合剂。

(二)本发明脂氧合酶酶活力测定方法

以脂氧合酶作为烟草加工辅助添加的酶制剂的脂氧合酶活力测定方法，包括以下步骤：

在8mL的比色杯中加入1mL待测酶液，加入5.0mL提取制备的脂氧合酶底物液，混匀后在分光光度计，450nm波长下即刻读取起始A＝OD_450nm值，读取A值起准确计时20min时，读取B＝OD_450nm值；

定义每分钟反应体系在450nm波长下变化0.001OD_450nm值为1个酶活力单位1U；

样品酶活力通过计算式：LOX E(U)＝N(A-B)/20得到，N为样品稀释倍数。

所述测定方法所用脂氧合酶底物液为：

(1)取烟草收购中分级确定的C₁F等级烟叶，去除烟叶中主脉和叶梗物于80℃下烘干，研成粉末密闭贮存于棕色瓶中备用；

(2)在20mL无水乙醇中加入步骤(1)C1F等级烟叶的粉末1.0g，加盖振荡浸泡60min，取上清液2.5mL与2.5mL蒸馏水混合为底物液。

酶活力测定时，将需检样品稀释成适宜酶测定的稀释倍数，所用缓冲液每100mL中补加有0.3g Ca(NO₃)₂、0.3g MgSO₄和0.1g ZnSO₄作为基本的酶稳定与激活剂，以释放酶活性而检测，检测结果计算为产品浓缩液酶活。

(三)制备以脂氧合酶作为烟草加工的辅助酶制剂的方法

将烟草后期植株上部去顶、保留3～5个顶杈叶，其后3～7天内割取，抽样检测脂氧合酶酶活力，合并酶活力相近的顶杈叶作为原料；

(2)用pH5.6缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂，使其浓度为0.01mol/L后加入顶杈叶，原料质量与含有PMSF的缓冲液体积比为1g∶4mL，打碎匀浆，过滤，收集滤液，静置1h；

(3)静置液以3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使硫酸铵终浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h后补加(NH₄)₂SO₄使终浓度为80％，静置过夜，再4℃15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10％的(NH₄)₂SO₄过夜，再4℃15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；

(4)沉淀用初始缓冲液总量的一半充分溶解后，加入0.1％EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心，检测、兑配多批次上清液酶活力，使制剂酶活力为200～300U/mL。

所述在步骤(4)获得的上清液中加入浓度0.01％的蔗糖低聚物，上清液与蔗糖低聚物体积比为100∶1，经-8℃冷冻干燥浓缩8～10倍得浓缩酶原液制剂。

所述步骤(2)进一步为在滤渣中加入缓冲液，以起始原料重量与含有PMSF的缓冲液体积比为1g∶5mL，搅拌2h，过滤挤渣，滤液与前次滤液合并，静置1h。

按照本发明提供的酶活力测定方法，上述浓缩酶液经恢复活性后在浓缩原液中的脂氧合酶酶活力为200～300U/mL之间，最佳为230U/mL。

(四)本发明酶制剂的使用方法

将脂氧合酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的LOX酶活力范围为0.8～1.2U/mL。

所述的使用方法进一步是将230U/mL的浓缩脂氧合酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的脂氧合酶最佳酶活力为0.92U/mL。

以上所用的缓冲液可选择pH5.6Britton-Robinsion缓冲液，详见[印永嘉。大学化学手册。济南：山东科学出版社，1985]配制方法。改进和调制成pH8.0的方法参照[刘士清，等。农业生物环境中基础酶技术研究法修建探讨。农机化研究，2008，(10)：162～166，175]使用。

本发明具有下述积极效果：

1.上部烟叶包括上二棚叶和顶叶约占单株产量的40％，是烟叶原料重要资源。但一般在烘烤后外观质量不够疏松，叶片僵硬，杂色烟和挂灰烟多，油分少其内在质量表现为烟碱含量偏高刺激性大，杂气较重，香气量不足，在卷烟配方中不便利用，甚至无法利用，因而封顶打杈下来的部分多作为废弃物扔掉[许自成，等。不同采收方式对烤烟上部叶内在品质的影响。西北农林科技大学学报(自然科学版)，2005，33(11)：13～17]。本发明注意到：LOX是植物普遍存在的生理性酶，对植物生长、衰老及损伤具有修复和保护作用。封顶打杈造成的植株损伤，使得植株上部LOX酶活力在3～7d内表现较高。本发明率先利用在此期间采收的顶杈叶作为制备LOX的提取原料，变废为宝，提高了烟草的生物质利用率。

2.本发明率先提出了以LOX作为烟叶烘烤后，在复烤前的加工过程中辅助添加的酶制剂，进一步催化氧化促进残留于烟叶中的质体色素-类胡萝卜素等转化，成为烟草品级提高和改善所需的香气香韵物质产生的反应重要前体物。

3.以简便的方法来提取LOX底物及测量LOX酶活力。为了保证在较长时间内制剂产品的检测数据稳定性和可靠性，提出了专门测定制剂产品的检测方法。

4.提取制备的LOX需纯化LOX的工艺，提取酶可作为本发明的申请人“一种烟草品质改善与提高的烟草加工活性复合酶制剂”的调配复合酶制剂基础或酶组分之一。

5.所去除最顶杈部分用作叶绿素酶提取原料(见申请人“以叶绿素酶作为烟草加工的辅助酶制剂及制备和使用方法”)。

6.本发明不仅适用于烟草加工，也可用于生物质等领域的研发与应用。

本发明也可以与其它烟草加工活性酶制剂配合使用，或成为申请人“一种烟草品质改善与提高的烟草加工活性复合酶制剂”的酶组分或调制复合酶制剂的基础物。

附图说明

图1是本发明酶制剂的制备工艺流程图.

以下结合具体实施方式做进一步说明。

本发明保护范围包括但不限于具体实施方式列举的内容，还应当包括与本发明相关的酶的临时混合液体或固体制剂，以及临时配比调整。

具体实施方式

(一)制备本发明LOX制剂及测定LOX酶活力方法

将烟草种植最后期的上部去顶，留3～5个上部叶，在3～7d内割取带叶部分，按田块分别收集后分散存放于阴凉处，抽样检测LOX酶活力，或以相近酶活力的合并作为提取LOX起始原料；或以LOX酶活力检测较高的原料作为起始原料，用pH5.6缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂浓度为0.01mol/L后，将其加入起始原料中，原料质量与含有PMSF的缓冲液的比为1g∶4mL，充分打碎匀浆，过滤，收集滤液。在滤渣中加入缓冲液，以起始顶杈叶质量与PMSF的缓冲液体积比为1g∶5mL，搅拌2h，过滤挤渣，滤液与前次滤液合并，静置1h后，以3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使硫酸铵终浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h，然后再补加(NH₄)₂SO₄使终浓度为80％，静置过夜，4℃15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10％的(NH₄)₂SO₄过夜，再4℃15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；用初始缓冲液总量的一半充分溶解沉淀，用0.1％EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心，得到去除金属离子酶上清液，检测酶活力调制后相互兑配调整酶活力为200～300U/mL。进一步是：在上清液中加入浓度0.01％的蔗糖低聚物，使上清液与蔗糖低聚物体积比为100∶1，经-8℃冷冻干燥浓缩8～10倍得浓缩酶液制剂。

以上LOX酶活力测定方法是：

制备脂氧合酶底物液：

(2)在20mL无水乙醇中加入步骤(1)C₁F等级烟叶的粉末1.0g，加盖振荡浸泡60min，取上清液2.5mL与2.5mL蒸馏水混合为底物液。

测定LOX酶活力：

在8mL的比色杯中加入1mL待测酶液，加入5.0mL提取制备的脂氧合酶底物液，混匀后在分光光度计450nm波长下即刻读取起始A＝OD_450nm值，读取A值起准确计时20min时，读取B＝OD_450nm值；定义每分钟反应体系在450nm波长下变化0.001OD_450nm值为1个酶活力单位1U；样品酶活力通过计算式：LOX E(U)＝N(A-B)/20得到，N为样品稀释倍数。

按照以上制备方法得到的浓缩液酶制剂相当于230U/mL的LOX酶活力。该浓缩液酶制剂以LOX为主，同时，存在有叶绿素酶、中性蛋白酶、葡萄糖氧化酶和烟碱脱氢酶。

(二)本发明的使用及效果

处理方式：以四川凉山B3L等级为处理对象，在实验室条件下模拟烟叶片烟复烤醇化过程，考察浓缩酶制剂对醇化(自然发酵)前期的影响。将230U/mL的浓缩脂氧合酶制剂用自来水稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，脂氧合酶最佳酶活力为0.92U/mL。对照用相同量的自来水作为润叶水。打叶、复烤后，各个包装500g烟叶，处理平行重复不少于3次，在相对湿度65％的室温下自然醇化60天，分别制成烟丝混匀，取样分析和卷成卷烟评吸。各处理烟叶常规分析为：

经云南瑞升烟草技术(集团)有限公司技术中心的“烟草致香成份分析检测报告表明：①处理样与对照样所测的致香成份，在定性方面无明显差别；②处理样物质致香基团的醛、酮、醇、酸、氮杂环、酯类和内脂类物质呈增加趋势；③处理样物质致香基团的呋喃、酚、烯烃类呈减少趋势；④累计总量较对照增加2.2％相比。

常规分析中，各成份的量均有不同程度的下降。在专业评吸中，与对照相比，香气较对照透发，生杂叶有一定改善，烟草基本香未受影响，烟气显得较为圆熟，余味较干净，总体吃味改善。

Claims

1.一种制备以脂氧合酶作为烟草加工的辅助酶制剂的方法，该制剂脂氧合酶酶活力为200～300U/mL，其特征是：

⑴将烟草后期植株上部去顶、保留3～5个顶杈叶，其后3～7天内割取，抽样检测脂氧合酶酶活力，合并酶活力相近的顶杈叶作为原料；

⑵用pH5.6缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂，使其浓度为0.01mol/L后加入顶杈叶，原料质量与含有PMSF的缓冲液体积比为1g︰4mL，打碎匀浆，过滤，收集滤液，静置1h；

进一步在滤渣中加入缓冲液，原料质量与含有PMSF的缓冲液体积比为1g︰5mL，搅拌2h，过滤挤渣，滤液与前次滤液合并，静置1h；

⑶静置液以3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使硫酸铵终浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h后补加(NH₄)₂SO₄使终浓度为80%，过夜，再4℃ 15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度为10%（W/V）的(NH₄)₂SO₄过夜，在4℃ 15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；

⑷沉淀用初始缓冲液量的一半充分溶解后，加入0.1% EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心，检测、兑配多批次上清液酶活力，在上清液中加入浓度0.01%的蔗糖低聚物，上清液与蔗糖低聚物体积比为100︰1，经-8℃冷冻干燥浓缩8～10倍得浓缩酶原液制剂，使制剂酶活力为200～300U/mL。