CN101745438B - 利用缩微光图案对细胞进行流式计数分选的方法 - Google Patents

Abstract

利用缩微光图案对细胞进行流式计数分选的方法是通过顺序构造光图案形成细胞会聚通道、单细胞采样识别通道、细胞分离通道，进而实现连续的细胞会聚、识别、分离，在对细胞的识别过程中，同时完成各种细胞的分类计数，由以上三个通道依次构成的分选微系统最终实现生物样品中多种细胞的计数分选。本发明提供的这种生物细胞计数分离方法充分利用了缩微光图案的灵活性优势，同时避免了在芯片上制作复杂的物理实体电极阵列，在成本、功能、性能方面均优于目前的生物细胞的计数分选方法。

Description

利用缩微光图案对细胞进行流式计数分选的方法

技术领域

本发明是一种运用光电微流控器件实现对生物细胞进行流式计数分选的方法，涉及微流控领域，特别是微流控生物医学分析芯片领域。

背景技术

传统的流式细胞分析仪已经广泛应用于医疗行业和生物医学研究机构，它主要是将细胞会聚成单细胞队列，并使细胞按顺序逐个通过一个流通检测器，此时，细胞处于一束狭窄的聚焦光路中，每个细胞穿过时就会阻断一次光束，一定数量的细胞不断地打断光束，使检测器检出单位时间内光线阻断的次数，从而计算出细胞的数量。检测中常用的光散射法还可依据每个细胞通过时所产生的散射角度来判断每个细胞的体积和形态等特征。从而进行细胞分类。但这种仪器体积较大，需要熟练的专业操作人员，难以实现家庭化的即时检测的需求。此种仪器所需的被测样品量比较大，而且此类仪器成本高，价格贵。

近年来，尽管出现了一些微型化的流式细胞计数器(或分析器)，例如通过鞘流法将细胞会聚到采样通道以形成单细胞队列，或者通过动电学方法将细胞会聚到采样通道，但鞘流法需要额外的泵和阀，动电学方法需要高电场强度且需要制作复杂的电极结构。上述方法中所有的微结构都是刚性的，难以根据具体的应用需求发生改变，而且由于需要外部的泵和阀或者需要制作复杂的微电极结构，成本依然很高。

因此，提出一种无需外部流体驱动装置，在芯片上实现柔性的低成本流式细胞计数分选方法是解决上述问题的关键。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种利用缩微光图案对细胞进行流式计数分选的方法，以解决常规流式分析仪成本高，以及常规的生物细胞流式连续型微分析芯片微电极结构复杂或芯片构造复杂、制作成本高的缺陷。

技术方案：本发明提供的利用缩微光图案对细胞进行流式计数分选的方法，根据细胞受到光诱导介电泳力驱动的特性，分别依次构造由缩微光图案形成的细胞会聚通道、单细胞采样识别通道、细胞分离通道，进而实现连续的细胞会聚、识别、分选，在对细胞的识别过程中，同时完成各种细胞的分类计数，由以上三个通道顺序构成的微系统最终实现微量生物样品中多种细胞的连续计数分选。

生物细胞样本中多种细胞的计数分选的具体步骤为：

步骤1：将微量生物细胞样品溶液通过进样口注射到分离芯片的微流体腔中，并记录注射溶液的体积；

步骤2：将正弦激励电压信号加于上层铟锡氧化物薄膜透明导电层，并设定频率；

步骤3：在微流体腔中投射光图案构成由静态的斜线阵列虚拟电极、动态栅栏型虚拟电极组成的细胞会聚通道，在细胞会聚通道右侧投射光图案构成由矩形虚拟电极挡板、动态栅栏型虚拟电极、生物细胞识别模块、圆形虚拟电极组成的单细胞采样识别通道，在单细胞采样识别通道右侧投射光图案构成由折线虚拟电极挡板、动态栅栏型虚拟电极组成的细胞分离通道；

步骤4：细胞会聚通道中的动态栅栏型虚拟电极运动方向水平，速度恒定，循环运动，将待分选生物细胞顺序会聚在一条直线上；

步骤5：单细胞采样识别通道中的动态栅栏型虚拟电极速度恒定，将已经会聚在直线上的生物细胞逐个输送至生物细胞识别模块，该模块采用图像处理技术实时获取图像数据，并分析出细胞大小、位置，根据识别结果以该细胞为中心生成相应的圆形虚拟电极，由圆形虚拟电极将不同大小的细胞输送至相应的分离通道入口，同时该类细胞计数器加1；

步骤6：在圆形虚拟电极将已识别细胞输送到相应细胞分离通道入口时，细胞分离通道中的动态栅栏型虚拟电极将已识别的生物细胞输送至相应分离通道出口，隔离虚拟电极用以隔离已分选的不同细胞，防止交叉；

步骤7：重复步骤4到步骤6的流程，直至样品中的细胞全部被分离后，各通道停止运行，输出各类细胞分类数目，完成细胞的计数分选。

本发明提供的细胞流式计数分选方法中，随着细胞会聚通道中的栅栏型虚拟电极的往复运动，杂乱无序的细胞将被顺序会聚在一条直线上，在此基础上，由单细胞采样识别通道实现单细胞的识别和计数，即动态栅栏型虚拟电极将会聚的细胞逐个输运至图像识别模块区域，实时获取该区域图像数据，再运用图像处理技术分析出细胞大小、位置后，对该类细胞进行计数，同时在该细胞位置处生成相应的圆形虚拟电极并将该细胞捕获，然后由圆形虚拟电极将细胞进一步输送至细胞分离通道，进而完成细胞的分离。上述三个通道按顺序依次放置，并行运行，构成虚拟流式细胞计数分选微系统。

有益效果：本发明利用可实时重构的缩微光图案形成各个虚拟操作模块，通过机器视觉技术自动识别细胞种类，并由此对细胞进行分选，实现不同样本细胞的快速分离，避免了在连续型细胞计数分选芯片上制作复杂的物理实体电极阵列，而且此方法仅需要微量的待测样品，故此方法大大降低了生物细胞计数分选的成本，同时也大大提高了进行细胞分析处理的效率。本发明针对待分类样本中生物细胞大小的不同，动态地增加相应的细胞分离通道，可以灵活高效实现微纳米生物细胞的分离。因此，本发明在成本、功能、性能方面均优于当前的生物细胞的计数分选方法，为生物医学检测领域的跨越式发展提供了十分必要的手段，在疾病诊断和治疗、公共卫生检疫、司法鉴定、食品卫生监督等领域有广泛应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例所使用的细胞计数分选芯片的材料结构示意图；

图2为本发明实施例中利用缩微光图案对生物细胞进行计数分选光图案示意图(芯片被揭去上基板后的俯视图)。

以上的图中有：

上基板1、进样口11、透明绝缘盖片12、上层透明的铟锡氧化物薄膜13；间隔层2；微流体腔21；下基板3、绝缘层31、光电导层32、透明导电薄膜33、下部透明基底34；由静态的呈45度倾斜的斜线阵列虚拟电极41、动态栅栏型虚拟电极42构成的细胞会聚通道；由矩形虚拟电极挡板51、动态栅栏型虚拟电极52、生物细胞识别模块53、圆形虚拟电极54构成单细胞采样识别通道；由折线虚拟电极挡板61、动态栅栏型虚拟电极62构成的细胞分离通道；隔离虚拟电极63。

具体实施方式

本发明提供的利用缩微光图案对细胞进行流式计数分选的方法的实施例参见图1和图2。本方法所能够使用的芯片结构、材料以及光图案的样式并不局限于本实施例。本实施例中所使用的细胞计数分选芯片包括进样口11，透明绝缘盖片12，上层透明的铟锡氧化物薄膜13，中间间隔层2，微流体腔21，透明绝缘基片34，由氮化硅层31、光电导层32和透明导电层33组成的光图案虚拟电极形成层。氮化硅层31可以防止水解，光电导层32具有光电导的特性，即当被光照亮时其内部载流子数量剧增，而没有被光照亮时其内部载流子数很少，其明电导与暗电导之比可达1000()以上；光电导层32的材料可以选择氢化非晶硅或者掺杂的硫化镉(CdS)或者参杂的硒化镉(CdSe)或者是硫化镉和硒化镉的组合。

本实施例中，利用缩微光图案对生物细胞进行计数分选的方法的具体步骤如下：

步骤1：将含有两种大小的微量生物细胞样品溶液(比如几微升)通过进样口11注射到分选芯片的微流体腔21中，并记录注射溶液的体积；

步骤2：将正弦激励信号的电压加于上层铟锡氧化物薄膜13透明导电层33，并设定频率；

步骤3：如图2所示，在微流体腔21中投射光图案构成细胞会聚通道，细胞会聚通道由静态的呈45度倾斜的斜线阵列虚拟电极41、动态栅栏型虚拟电极42组成；在细胞会聚通道右侧投射光图案构成单细胞采样识别通道，单细胞采样识别通道由矩形虚拟电极挡板51、动态栅栏型虚拟电极52、生物细胞识别模块53、圆形虚拟电极54组成；在单细胞采样识别通道右侧投射光图案构成细胞分离通道，细胞分离通道由折线虚拟电极挡板61、动态栅栏型虚拟电极62组成；

步骤4：动态栅栏型虚拟电极42按图示箭头方向运动，速度恒定，循环往复，与斜线阵列虚拟电极41共同作用，将待分选的生物细胞顺序会聚在一条直线上；

步骤5：动态栅栏型虚拟电极52运动方向如箭头所示，运动速度恒定，将已经会聚在直线上的生物细胞逐个输送至生物细胞识别模块53，该模块采用图像处理技术实时获取图像数据，分析出细胞大小、位置，根据识别结果以该细胞为中心生成相应的圆形虚拟电极54，由圆形虚拟电极54将不同大小细胞输送至相应的分离通道入口，同时该类细胞计数器加1；

步骤6：在圆形虚拟电极54将细胞输送到细胞分离通道入口时，动态栅栏型虚拟电极62按图示箭头方向运动，将已识别的生物细胞输送至分离通道出口，隔离虚拟电极63用以隔离已分选的不同细胞，防止交叉；

步骤7：重复步骤4到步骤6的流程，直至样品中的细胞全部被分离后，各通道停止运行，输出各类细胞分类数目，完成细胞的计数分选。

Claims (1)

1.一种利用缩微光图案对细胞进行流式计数分选的方法，其特征在于：通过顺序构造由缩微光图案形成的细胞会聚通道、单细胞采样识别通道、细胞分离通道，完成生物细胞连续地会聚、采样识别和分离，从而最终实现生物细胞样本中多种细胞的计数分选；

生物细胞样本中多种细胞的计数分选的具体步骤为：

步骤1：将微量生物细胞样品溶液通过进样口(11)注射到分离芯片的微流体腔(21)中，并记录注射溶液的体积；

步骤2：将正弦激励电压信号加于上层铟锡氧化物薄膜(13)透明导电层(33)，并设定频率；

步骤3：在微流体腔(21)中投射光图案构成由静态的斜线阵列虚拟电极(41)、第一动态栅栏型虚拟电极(42)组成的细胞会聚通道，在细胞会聚通道右侧投射光图案构成由矩形虚拟电极挡板(51)、运动方向与第一动态栅栏型虚拟电极(42)相同的第二动态栅栏型虚拟电极(52)、生物细胞识别模块(53)、圆形虚拟电极(54)组成的单细胞采样识别通道，在单细胞采样识别通道右侧投射光图案构成由折线虚拟电极挡板(61)、第三动态栅栏型虚拟电极(62)组成的数量与识别的生物细胞种类相同的细胞分离通道；

步骤4：第一动态栅栏型虚拟电极(42)运动方向水平，速度恒定，循环运动，将待分选生物细胞顺序会聚在一条直线上；

步骤5：第二动态栅栏型虚拟电极(52)速度恒定，将已经会聚在直线上的生物细胞逐个输送至生物细胞识别模块(53)，该模块采用图像处理技术实时获取图像数据，分析出细胞大小、位置，根据识别结果以该细胞为中心生成相应的圆形虚拟电极(54)，由圆形虚拟电极(54)将不同大小的细胞输送至相应的分离通道入口，同时该类细胞计数器加1；

步骤6：在圆形虚拟电极(54)将已识别细胞输送到相应细胞分离通道入口时，运动方向与第一动态栅栏型虚拟电极(42)相同的第三动态栅栏型虚拟电极(62)，将已识别的生物细胞输送至相应分离通道出口，隔离虚拟电极(63)用以隔离已分选的不同细胞，防止交叉；

步骤7：重复步骤4到步骤6的流程，直至样品中的细胞全部被分离后，各通道停止运行，输出各类细胞分类数目，完成细胞的计数分选。