CN101736020A - γ-tmt和hpt基因共转化提高植物中维生素E含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，具体涉及一种双关键酶基因γ-tmt和hpt共转化提高植物中维生素E含量的方法。本发明从植物中克隆γ-tmt和hpt基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将γ-tmt和hpt基因同时导入植物并再生出植株，PCR检测外源目的基因γ-tmt和hpt的整合情况，高效液相色谱-紫外光检测器测定植物中维生素E含量，筛选获得维生素E含量提高的转基因植株。获得的转基因植物叶片中维生素E的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的4倍。本发明对提高植物营养价值具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种提高维生素E(生育酚)含量的方法，特别是一种双关键酶基因γ-tmt和hpt共转化提高植物中维生素E含量的方法。
背景技术
维生素E是一种脂类维生素，其天然产物依结构的不同分为八种类型，分别是α、β、γ、δ-生育酚(tocopherol)和α、β、γ、δ-生育三烯酚(tocotrienol)，其中α-生育酚的生物活性最高，被认为是维生素E的主要活性成分。
自1922年维生素E的生物学功能被发现后(Evans and Bishop，1922)，长期医学研究表明，维生素E不仅仅与生殖系统有关，而且与中枢神经系统、消化系统、心血管系统和肌肉系统的正常代谢都有密切关系(Traber and Sies，1996)。研究表明，维生素E参与细胞膜的构建和维持，是动物和人体内重要的抗氧化物质。显示在如下方面：维生素E是治疗冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要辅助性药物，有助于降低血脂和血胆固醇含量，抗凝血、抗氧化并且消除自由基，从而起到预防及治疗血管栓塞的作用；维生素E对于提高机体免疫能力有着重要的影响，具有抗衰老的功能，可以消除细胞色素沉淀，改善皮肤弹性，减弱性腺萎缩，因而在大量保健品和美容用品中广泛使用；维生素E可以预防和治疗多种妇科疾病，治疗早产儿溶血性贫血和蚕豆病，治疗营养不良儿童的巨幼红细胞性贫血；维生素E可以促进胆汁分泌、胆管形成和胆红素分泌，对急慢性肝炎和肝硬化有着治疗作用；维生素E可以预防癌症发生，对于癌症患者的治疗也有重要的辅助作用等等。
维生素E对于人类和动物健康有重要作用，但维生素E的合成途径只存在于绿色光合植物中，包括低等单细胞植物蓝藻和高等植物；人体和动物体内不存在维生素E合成途径，故日常营养所需的维生素E摄取自绿色植物，特别是各种油类作物的种子，以及由种子所榨取的植物油。
直接由植物油脱臭馏出物中获得的生育酚混缩液的生物活性很低，α-生育酚的含量较低。工业生产维生素E主要是以上述生育酚混缩液为原料，经过半合成法，将其中的非α-生育酚成分转变为α-生育酚。但是成本较高，而且产生的α-生育酚消旋性与天然α-生育酚不同，活性也低于天然α-生育酚。因此，提高植物天然生育酚含量及其α-生育酚比例有着十分重要和现实的应用价值。
随着植物基因组学的发展，DellaPenna于1999年提出了营养基因组学(nutritional genomics)的概念，即充分的利用基因组学的研究成果，分离植物营养代谢途径的关键酶基因，解析植物微量营养素代谢途径，深入了解代谢途径的调控方式，从而利用代谢工程的方法和手段改良作物品质，提高作物营养价值(DellaPenna，《科学》，1999年285卷375-379页)。基于营养基因组学的观点和现实情况的调研，对维生素E的生物合成途径研究的主要目标有二，其一是提高维生素E的整体含量，其二是改变维生素E的类型组成比例，提高其中α-生育酚的组成比例。为达到这种目标，必须对维生素E的生物合成途径及其调控进行研究。
基于基因组学的基础，维生素E合成途径的基因分离、克隆和功能性研究已经取得了突破性的进展。有关研究已经初步完成了对参与维生素E合成途径关键基因的分离和功能验证工作，初步分析了维生素E(生育酚)合成途径概貌。
维生素E(生育酚)合成途径主要由以下五个步骤组成。(1)4-羟苯丙酮酸(HPP)在4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的催化下，生成尿黑酸(HGA)(Norriset al.，1998)；(2)尿黑酸在尿黑酸植基转移酶(HPT)催化下，与植基二磷酸(PDP)发生缩合，生成2-甲基-6-植基-苯醌(Collakova and DellaPenna，2001)；(3)2-甲基-6-植基-苯醌在甲基植基苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)的催化下，生成2，3-二甲基-6-植基-苯醌(van Eenennaam et al.，2003)；(4)2，3-二甲基-6-植基-苯醌在生育酚环化酶(TC)的催化下，生成γ-生育酚(Porfirova et al.，2002)；(5)γ-生育酚在γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)的催化下，生成α-生育酚。
现有技术中γ-生育酚甲基转移酶(γ-tocopherol methyltransferase，γ-TMT)和尿黑酸植基转移酶(homogentisate prenyltransferase，HPT)是生育酚合成途径中的关键酶。采用基因工程手段，用关键酶γ-TMT和HPT的基因γ-tmt和hpt共转化植物，将增加维生素E的合成，从而获得维生素E高产的转基因植株，将为提高植物营养价值提供一条新途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种γ-tmt和hpt共转化提高植物中维生素E含量的方法。本发明涉及到关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、生育酚提取及含量测定等生物技术操作，建立了稳定提高植物中生育酚含量的方法，为利用基因工程技术提高农作物和经济作物中维生素E的含量奠定了坚实的基础
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明从植物中克隆γ-tmt和hpt基因，构建含所述DNA分子的共转化植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将γ-tmt和hpt基因同时导入植物并筛选得到纯系植株；PCR检测外源目的基因γ-tmt和hpt的整合情况，高效液相色谱-紫外光检测器(HPLC-UVD)测定植物中维生素E(生育酚)含量，筛选获得维生素E含量显著提高的转基因拟南芥植株。
本发明包括如下具体步骤：
(1)采用基因克隆方法获得植物生育酚合成途径关键酶基因γ-tmt和hpt；
(2)把γ-tmt和hpt基因可操作性的连接于表达调控序列，形成含γ-tmt和hpt基因的植物表达载体；
(3)将含有γ-tmt和hpt基因的植物表达载体转化根癌农杆菌(为市场有公开出售的生物材料，可以从多家公司如澳大利亚CAMBIA公司获得)，获得用于转化植物的含有γ-tmt和hpt基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；
(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化植物，获得经PCR检测的转基因植株；
(5)对获得的转基因植物中的维生素E含量进行HPLC-UVD测定，筛选获得维生素E含量显著提高的转基因植株。
所述的经PCR检测的转基因植株是指，分别设计合成γ-tmt和hpt基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为转基因植株。
所述的HPLC-UVD测定转基因植物中维生素E含量，方法如下：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为98∶2，柱温为30℃，流速1.0mL/min，进样量30μL，紫外光检测器检测波长292nm。
本发明的γ-tmt和hpt基因共转化提高植物中维生素E含量的方法，采用基因工程方法，将关键酶基因γ-tmt和hpt导入植物中，获得了维生素E含量显著提高的转基因植株，转基因植株中生育酚的总量(49pmol/mg FW)是非转基因植株(12pmol/mg FW)的4倍。此外，转基因植株中生育酚各不同构型之间的比例也产生了明显的变化，其中具有维生素E活性的组分α-生育酚的比例达到了生育酚总量的91％以上，比非转基因植株(86％)提高了5％以上。该发明对提高植物营养价值具有重要意义。
具体实施方式：
下面对本发明的实施例(以植物拟南芥为例)作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
拟南芥γ-tmt和hpt基因的克隆
1.拟南芥基因组总RNA的提取
取少量拟南芥(生态型为哥伦比亚型)幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)的1.5mLEppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15see，室温放置2-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15-20min后溶于适量(30-50μL)RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
2.拟南芥γ-tmt和hpt基因的克隆
将所获的拟南芥基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述拟南芥γ-tmt基因的编码序列(序列1)和hpt基因的编码序列(序列2)分别设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的编码序列一致。
本实例采用基因克隆方法从拟南芥中获得序列正确的维生素E生物合成关键酶基因γ-tmt和hpt，为双关键酶基因共转化策略提供了重要的关键酶基因。
实施例2
含γ-tmt和hpt基因的植物双元表达载体的构建
1.中间载体pCAMBIA1304+的构建
选用pBI121和pCAMBIA1304为基本元件，构建双元植物表达载体pCAMBIA1304+。具体的，HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121表达盒，回收pCAMBIA1304大片段；连接这两个回收产物，转化DH5α，在卡那霉素LB平板上筛选得到单克隆，再抽提质粒，酶切验证(HindIII和EcoRI双酶切)；即构建好pCAMBIA1304+。
2中间载体pMD18T-γ-tmt和pMD18T-hpt的构建
首先根据酶切位点合成引物，在γ-tmt上游和下游分别引入酶切位点XbaI与SacI，在hpt上游和下游分别引入酶切位点BglII与BstEII，以便构建表达载体。继而以合成的引物分别扩增含有引入酶切位点的基因片段，经电泳验证条带大小正确后，胶回收目标基因片段，与亚克隆载体pMD18T-simple进行平末端连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，对PCR检测为阳性的载体进行测序，获得与目标片段比对无误的阳性克隆。
3.植物双元表达载体pCAMBIA1304+::γ-tmt的构建
以上述的中间载体pCAMBIA1304+与pMD18T-γ-tmt为基础，将含有γ-tmt基因的表达盒插入pCAMBIA1304+中，构建成植物双元表达载体pCAMBIA1304+::γ-tmt。具体操作如下：用XbaI与SacI双酶切pCAMBIA1304+载体，回收大片段，用XbaI与SacI双酶切pMD18T-γ-tmt载体，回收γ-tmt基因的表达盒。将γ-tmt基因的表达盒与pCAMBIA1304+大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。
4.植物双元表达载体pCAMBIA1304+::γ-tmt-hpt的构建
以所述的植物双元表达载体pCAMBIA1304+::γ-tmt为基础，将含有hpt基因的表达盒插入植物双元表达载体pCAMBIA1304+::γ-tmt中，构建成植物双元表达载体pCAMBIA1304+::γ-tmt-hpt。具体操作如下：用BglII与BstEII双酶切pCAMBIA1304+::γ-tmt，回收大片段，用BglII与BstEIII双酶切pMD18T-hpt，回收hpt基因的表达盒。将hpt基因的表达盒与pCAMBIA1304+::γ-tmt大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。
本实施例将维生素E生物合成途径关键酶基因γ-tmt和hpt可操作性地连接于表达调控序列，形成含γ-tmt和hpt基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高植物中维生素E含量的研究中。
实施例3
根癌农杆菌介导γ-tmt和hpt基因遗传转化拟南芥获得转基因植株
1.含γ-tmt和hpt基因双元植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例2中含γ-tmt和hpt基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如GV3101，本实施例中所用为购自英国诺丁汉大学)，并进行PCR验证。结果表明，含γ-tmt和hpt基因植物双元表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株。
2.根癌农杆菌介导γ-tmt和hpt基因转化拟南芥
2.1拟南芥菜的种植
2.1.1拟南芥无菌培养
①.拟南芥无菌培养：超净台上将种子在15％次氯酸钠洗涤10min，无菌水冲洗5次；
②.MS培养基先倒平板下层，吹干后，把消毒后的种子分装后用40～50℃的MS培养基混匀，倒入平板中，均匀地铺满一层(小培养皿大约需要4-5ml培养基)；
③.平皿封口，4℃冰箱内春化3-5天，放入到人工气候室中开始萌发生长。植物生长环境为相对湿度60％，恒温20-22℃，光照周期24h，光照强度为80-220μmol·m-2·sec-1。
2.1.2拟南芥土壤种植
①.浸土：把土装入到种植盆中至距盆口约2cm处，用花无缺复合肥(N、P、K＝20％、20％、20％)，完全浸透；
②.移栽：选取MS固体培养基上萌发生长7～10天，健壮、生长一致的苗移栽到事先用花无缺复合肥浸过的培养土中，其上覆盖保鲜膜，转入22℃，24h连续光照的人工气候室中培养，到苗生长正常后揭去保鲜膜。
2.2采用浸花(floral-dip)法转化拟南芥
①.取生长一个月左右、生长状况良好的植株(转化前可以提前一个星期将植物去顶，使植物产生较多的花苞，提高转化效率)，转化前一天浇水；
②.将含有转基因载体的农杆菌于28℃培养过夜，至OD600≈2.0，4,500rpm离心10min
③.菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度OD600≈0.8；
④.转化时小盆倒置，确保拟南芥地上部分全部花苞都被浸没入事先用转化Buffer悬浮好的菌液中约5sec；
⑤.用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放于一个密封的小盒内以保持湿度，避光过夜；
⑥.第二天将植物取出，竖直，转移到正常条件下生长。待植物长至一定程度后，将其依附竹签绑好，以便更好地结实；
⑦.T0代种子成熟后将其整株剪下，过筛。种子铺于含50μg/mL Hyg的筛选培养基上，4℃春化48h，移到人工气候室24h连续光照条件下生长一周；
⑧.待长出绿色的转基因抗性幼苗(转化子为绿色的幼苗且根较长；非转化子基本为黄化苗，或绿色无根幼苗)后移栽入土继续生长；
⑨.单株收获转基因植株(因转基因的插入位点不同，每个都是不同的)标成不同的株系；
⑩.单株收获的T2代种子已经出现性状分离。将种子均匀地铺到9cm平板上，因要确定是否是单位点插入，所以不加抗生素。待长至6-7片真叶后，喷除草剂，筛选3∶1单位点插入的株系，单株收获。继续筛选直至获得纯合的转基因植株。
3.转基因拟南芥植株的PCR检测
根据CaMV 35S的序列设计正向引物，根据γ-tmt和hpt基因的序列分别设计反向引物对目的基因进行检测。结果表明，用CaMV 35S正向引物和γ-tmt反向引物以及CaMV 35S正向引物和hpt反向引物能分别扩增出1307bp和1454bp的特异DNA片段。而以非转化拟南芥基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化拟南芥的含γ-tmt和hpt基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化拟南芥，获得经PCR检测的转基因拟南芥植株。
实施例4
利用HPLC-UVD测定转基因拟南芥中维生素E含量
1.HPLC-UVD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC：采用Waters 2695 separations module系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(Calesil ODS-100C18，4.6mm I.D.×250mm length)，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为98∶2，柱温为30℃，流速1.0mL/min，进样量30μL。
UVD：采用Waters 2996 photodiode array dectector系统，紫外光检测器检测波长292nm。
精密称取生育酚标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL生育酚标准品溶液，保存于-20℃备用。
本发明中流动相为甲醇(methanol)∶水，比例为98％∶2％时，生育酚的出峰时间为26.3min，峰型良好。
2.标准曲线的制作
将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样5μl，10μl，15μl，20μl，30μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通过研究，本发明中生育酚在10-60μg范围内呈现良好的log-log线性关系。生育酚对照品的log-log线性回归方程为：Y＝7.26e+002X+1.09e+004；R＝0.999740。
3.样品的制备和生育酚含量的测定
生育酚的提取过程如下：取少量新鲜的拟南芥叶片(1-2g鲜重)，液氮研磨，用4mL正己烷提取，超声30分钟。离心，收集上清液，用氮吹仪吹干，用适量甲醇溶解提取物，用于HPLC检测。
采用HPLC-UVD测定生育酚含量，样品进样体积为30μl，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的生育酚含量(mg)，折合成物质的量(pmol)，再除以样品的拟南芥叶片鲜重(mg)，从而计算出拟南芥植株中生育酚的含量。
在本发明中共转γ-tmt和hpt基因显著提高了拟南芥叶片中维生素E含量。共转γ-tmt和hpt基因使得转基因植株中维生素E的含量达到对照的4倍。
本实例采用HPLC-UVD法测定了转基因拟南芥中生育酚的含量，采用共转化γ-tmt和hpt基因的代谢工程策略获得了维生素E含量提高的拟南芥植株，为提高植物营养价值提供了一种理想方法。
序列表：
<110>复旦大学
<120>γ-tmt和hpt基因共转化提高植物中维生素E含量的方法
<160>2
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>1350
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>1
ccacgcgtcc gcaaataatc cctgacttcg tcacgtttct ttgtatctcc aacgtccaat 60
aaatgaaagc aactctagca gcaccctctt ctctcacaag cctcccttat cgaaccaact 120
cttctttcgg ctcaaagtca tcgcttctct ttcggtctcc atcctcctcc tcctcagtct 180
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tggcggctcc aggaggtagg ataataatag tgacatggtg ccatagaaat ctatctgcgg 780
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<211>1182
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>2
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ctcttttatg cagagtactt gctgttacct tttttgaagt ga 1182
Claims (4)
1.一种γ-tmt和hpt基因共转化提高植物中维生素E含量的方法，其特征在于，从植物中克隆γ-tmt和hpt基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将γ-tmt和hpt基因同时导入植物并筛选得到纯系植株，PCR检测外源目的基因γ-tmt和hpt的整合情况，高效液相色谱-紫外光检测器测定植物中维生素E含量，筛选获得维生素E含量提高的转基因植株。
2.根据权利要求1所述的γ-tmt和hpt基因共转化提高植物中维生素E含量的方法，其特征是，包括如下具体步骤：
(1)采用基因克隆方法获得植物维生素E关键酶基因γ-tmt和hpt；
(2)把γ-tmt和hpt基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含γ-tmt和hpt基因的植物表达载体；
(3)将含γ-tmt和hpt基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化植物的含γ-tmt和hpt基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；
(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化植物，获得经PCR检测的转基因植株；
(5)对获得的转基因植株中维生素E含量进行高效液相色谱法及紫外光检测器测定，获得维生素E含量提高的转基因植株。
3.根据权利要求2所述的γ-tmt和hpt共转化提高植物中维生素E含量的方法，其特征是，所述的经PCR检测的转基因植株是指，分别设计合成γ-tmt和hpt基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为转基因植株。
4.根据权利要求2所述的γ-tmt和hpt基因共转化提高植物中维生素E含量的方法，其特征是，所述的高效液相色谱法及紫外光检测器测定植株中维生素E含量，通过如下方法：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为98∶2，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量30μL，紫外光检测器检测波长292nm。
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| CN102839199A (zh) * | 2012-08-16 | 2012-12-26 | 熊军 | 一种酶工程法生产d-α-生育酚的方法 |
| CN110423732A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-11-08 | 浙江大学 | 一种在酿酒酵母中表达的酶及高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌及其构建方法 |
| CN110951728A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-04-03 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 转基因玉米bbhtl8-1外源插入片段旁侧序列及其应用 |
-
2008
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