CN101732721A - 一种生物相容性纳米颗粒及其作为药物输送载体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物相容性纳米颗粒及其作为药物输送载体的应用。本发明提供的纳米颗粒为如下(a)或(b)：(a)式(I)所示化合物为壳层、式(II)所示化合物为内核的纳米颗粒，n1＝2-400；(b)式(I)所示化合物和式(III)所示化合物为壳层、式(II)所示化合物为内核的纳米颗粒，n2＝2-400。本发明还提供了所述纳米颗粒的制备方法，应用以及将所述纳米颗粒进行修饰得到的修饰后纳米颗粒。本发明得到的纳米颗粒具有良好的生物相容性及可生物降解性，方便进行进一步的配体修饰，用于药物的靶向输送。经乳糖修饰的纳米颗粒能携载阿霉素更有效进入肝癌组织的病变细胞，具有优于阿霉素的治疗效果。该纳米颗粒可广泛适用于药物输送的纳米载体领域。

式(I)；

式(II)；

Description

一种生物相容性纳米颗粒及其作为药物输送载体的应用

技术领域

本发明涉及一种生物相容性纳米颗粒及其作为药物输送载体的应用。

背景技术

纳米药物载体的研究是纳米生物医学研究领域的重要方向之一。大量的研究证明，纳米药物载体可促进药物在肿瘤组织的富集，用纳米药物载体输送药物，在癌症治疗中显示出良好的效果，具有广阔的应用前景。由于肿瘤组织的微环境与正常组织存在显著的差别，如肿瘤组织的血管是扩张、弯曲的，而且缺乏淋巴回流致使肿瘤组织内部的压力显著高于周围的正常组织，又如肿瘤细胞的大量增殖造成肿瘤组织的厌氧和低pH环境，这些差别不利于小分子药物通过血管输送到肿瘤组织的深部，药物不容易到达肿瘤细胞和作用的靶位。然而，由于肿瘤新生血管内皮细胞的不连续性，允许粒径小于200nm的纳米粒子通过血管壁进入组织间隙，因此，将药物装载到纳米颗粒中可通过渗透和滞留增强效应(enhanced permeabilityretention，EPR)在肿瘤组织中富集进而实现被动靶向。研究证实将抗癌药物包载于纳米颗粒中可5-10倍提高药物在肿瘤部位的富集，如进一步在纳米颗粒的表面偶联肿瘤细胞特异性亲合配体，可进一步提高药物在肿瘤部位的富集(与游离药物相比)。基于上述研究结果，一些抗癌药物的纳米制剂已被开发并用于临床上治疗各种肿瘤，如2005年批准的紫杉醇白蛋白纳米颗粒，临床用药表明，上述纳米药物载体促进了化疗药物在肿瘤组织的富集，明显降低药物的毒副作用，并改善患者的生存质量，治疗效果与游离药物相比明显提高。然而，这些纳米载体并非对所有实体瘤的治疗都具有理想的结果，构建高效低毒、既能实现组织渗透又能实现细胞靶向的纳米药物载体在为肿瘤的临床治疗提供有效手段和策略的同时，仍然面临严峻挑战。

目前国内外用作药物载体研究的纳米材料包括无机纳米材料(如碳纳米管、硅介孔材料)、脂质体，和有机高分子材料(包括生物相容性的合成高分子和改性天然高分子材料)等。如用单壁碳纳米管来运载铂类药物，发现经修饰的碳纳米管能够实现对铂类药物的缓释并抑制癌细胞生长。又如通过与荧光量子点键合或封存于介孔微球的孔道中，可以将小分子药物或RNA干扰药物输送到肿瘤细胞，并具有抗肿瘤药物的靶向输送的潜能。最近还有研究将药物分子如紫杉醇通过磷酸酯的桥键键合到金纳米颗粒的表面，或是键连到磁性纳米颗粒表面，显示良好的药物输送性能。尽管碳纳米管、介孔材料、磁性纳米颗粒等无机纳米材料具有良好的细胞穿透性，易于被细胞吞噬，作为药物输送的纳米载体具有潜力，但其在有机溶剂和水中的溶解性较差，需经过复杂的改良修饰，而且生物相容性和难于降解也是不可忽略的问题，这有可能限制其在药物载体领域的应用。另一类由天然磷脂和胆固醇等制备的脂质体，或者以室温下为固态的卵磷脂、三酰甘油等脂质为基质所制备的固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)也是较为常见的纳米给药体系，它通过细胞内吞和融合作用可直接将药物送入细胞内。

高分子纳米颗粒作为药物的输送载体在近些年取得了迅速发展，它具有结构多样性，制备相对简单，质量容易控制，生物相容性好，通过结构控制可使其降解等优点，而且能显著增强药物的体内活性，因而备受关注。目前研究的较多的是两亲型高分子材料，它在水溶液中能自发聚集形成具有独特结构的纳米颗粒，包括胶束和囊泡等，适合输送亲水、疏水等多种药物。如K.Kataoka等发展了聚乙二醇-聚天冬氨酸衍生物的嵌段聚合物用于抗癌药物紫杉醇的输送，聚乙二醇作为亲水段，聚天冬氨酸衍生物为疏水段自组装成纳米颗粒，其中，NK105(聚乙二醇分子量12000，聚天冬氨酸衍生物分子量8000)用于治疗胃癌已进入二期临床。又如D.E.Discher等发展的基于聚乙二醇-聚乳酸PEG-PLA的纳米囊泡，同时包载亲水抗癌药物阿霉素与疏水抗癌药物紫杉醇，在肿瘤的治疗中具有协同效应。

一个不可忽视的问题是，两亲性高分子自组装的纳米颗粒的结构强烈依赖于亲、疏水性组分的相对比例，而且稳定性不高。这样的自组装纳米颗粒作为药物载体在被体液或血液稀释的状况下容易发生解离，且它的去组装往往造成药物的突释，这将直接导致纳米颗粒到达靶部位之前药物就已经释放，从而无法通过EPR效应提高药物的利用度和功效。在现阶段的研究中通常采用进一步的化学或物理交联，使其结构更加稳定，以改善药物释放和药物输送的性能，其中化学交联一般采取先合成带有可交联官能团的两亲性高分子，在其组装成纳米颗粒后，再通过可交联官能团的进一步交联反应而稳定纳米颗粒。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物相容性纳米颗粒及其作为药物输送载体的应用。

本发明提供了纳米颗粒甲，为如下(a)或(b)：

(a)式(I)所示化合物为壳层、式(II)所示化合物为内核的纳米颗粒；

式(I)；

n1＝2-400(n1具体可为2-120)；

式(II)；

(b)式(I)所示化合物和式(III)所示化合物为壳层、式(II)所示化合物为内核的纳米颗粒；

式(III)

n2＝2-400(n2具体可为2-120)。

所述的纳米颗粒甲中，碳元素、氢元素、磷元素和氮元素的质量比可为(40-60)∶(5-20)∶(1-10)∶(0-0.5)，直径分布范围可为10-1000nm。(a)所述的纳米颗粒甲中，碳元素、氢元素和磷元素的质量比具体可为(44.5-49.29)∶(7.649-8.509)∶(1.5-4.21)。(b)所述的纳米颗粒甲中，碳元素、氢元素、磷元素和氮元素的质量比具体可为(40.9-46.19)∶(7.152-8.184)∶(3.56-3.95)∶(0.185-0.458)。

(a)所述的纳米颗粒甲中，式(I)所示化合物与式(II)所示化合物的物质的量的比值可为1∶(0.5-5.1)，具体可为1∶(0.57-5.01)。(a)所述的纳米颗粒甲可采用如下方法制备：以异辛酸亚锡为催化剂，用式(I)所示化合物引发式(II)所示化合物聚合，得到纳米颗粒甲。上述制备方法中，所述聚合反应中，式(I)所示化合物、式(II)所示化合物和异辛酸亚锡的物质的量的比值具体可为(0.05-0.1)∶(0.5-2)∶(0.025-0.05)，反应条件可为40-80℃，反应溶剂可为二氧六环、二甲亚砜或四氢呋喃。

(b)所述的纳米颗粒甲中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物与式(II)所示化合物的物质的量的比值可为(0.5-0.9)∶(0.03-0.24)∶(1.4-2.0)，具体可为(0.5-0.9)∶(0.039-0.235)∶(1.436-1.912)。(b)所述的纳米颗粒甲可采用如下方法制备：以异辛酸亚锡为催化剂，用式(I)所示化合物和式(III)所示化合物引发式(II)所示化合物聚合，得到纳米颗粒甲。上述制备方法中，所述聚合反应中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物、式(II)所示化合物和异辛酸亚锡的物质的量的比值为(0.5-0.9)∶(0.1-0.5)∶6∶0.5；反应条件为60℃，反应溶剂为二甲亚砜。

本发明还保护将(b)所述纳米颗粒甲进行化学修饰得到的纳米颗粒乙；所述化学修饰为将所述纳米颗粒甲中的式(II)所示化合物的叠氮基(-N₃)还原为氨基(-NH₂)。

本发明还保护将所述纳米颗粒乙进行化学修饰得到的纳米颗粒丙；所述化学修饰为将所述纳米颗粒乙中的所述氨基与乳糖酸进行化学连接。

式(I)所示化合物具体可为mPEG2000-5000。

本发明还保护一种制备纳米颗粒的方法，包括如下步骤：以式(IV)所示化合物中的至少一种作为引发剂，以异辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)为催化剂，引发式(II)所示化合物聚合，得到纳米颗粒；

式(IV)；

n＝2-400(n具体可为2-120)；

R₁为-OCH₃或-N₃。

所述聚合反应的反应条件可为40-80℃，反应溶剂可为二氧六环、二甲亚砜和四氢呋喃中的至少一种。

当聚乙二醇单甲醚(R₁为-OCH₃的式(IV)所示化合物，mPEG)作为引发剂时，聚合反应中，式(I)所示化合物、式(II)所示化合物和异辛酸亚锡的物质的量的比值可为(0.05-0.1)∶(0.5-2)∶(0.025-0.05)，反应条件可为40-80℃，反应溶剂可为二氧六环、二甲亚砜或四氢呋喃。

当聚乙二醇单甲醚(R₁为-OCH₃的式(IV)所示化合物)和α-羟基-ω-叠氮-聚乙二醇(R₁为-N₃的式(IV)所示化合物，N₃PEG)同时作为引发剂时，聚合反应中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物、式(II)所示化合物和异辛酸亚锡的物质的量的比值为(0.5-0.9)∶(0.1-0.5)∶6∶0.5；反应条件为60℃，反应溶剂为二甲亚砜。聚乙二醇单甲醚(R₁为-OCH₃的式(IV)所示化合物，N₃PEG)中，n具体可为44(mPEG2000)。所述α-羟基-ω-叠氮-聚乙二醇(R₁为-N₃的式(IV)所示化合物，N₃PEG)中，n具体可为76(α-羟基-ω-叠氮-PEG3400；N₃PEG3400)。

本发明还保护一种药物输送载体，它的活性成分为以上任一所述的纳米颗粒(纳米颗粒甲、纳米颗粒乙或纳米颗粒丙)。所述药物输送载体可用于药物的包载及输送。所述药物可为抗癌药物和/或核酸类药物，如阿霉素。

本发明还保护一种纳米药物，它的活性成分为如下复合物：以上任一所述的纳米颗粒及其负载的药物组成的复合物。所述药物可为抗癌药物和/或核酸类药物，如阿霉素。

式(II)所示化合物即3，6-二氧代辛烷-1，8-二乙撑磷酸酯(TEGDP)。

聚磷酸酯是一类以磷酸酯键连接的生物可降解高分子材料，已被广泛用于药物控制释放、基因治疗和组织工程等生物材料研究领域。本发明提供的制备纳米颗粒的方法非常简单，所形成的交联内核是完全可降解的聚磷酸酯，在不引入任何不可降解成分和其它具有反应性的官能基团的情况下，可获得交联稳定的纳米颗粒。

本发明得到的纳米颗粒具有良好的生物相容性和可生物降解性。由于聚乙二醇壳层的存在，赋予其良好的亲水性，将增强载药纳米颗粒在血液中的循环和稳定性，从而将可能增强药物输送的功效。同时组成内核的聚磷酸酯是一类由磷酸酯键连接的可生物降解高分子材料，使得上述纳米颗粒将最终在体内降解而排出体外，具有良好的生物相容性。本发明的纳米颗粒还可以通过改变聚合条件得到不同大小不同组分的纳米颗粒，并且其表面容易实现官能化，在构建靶向纳米药物载体方面具有显著的优势。

附图说明

图1为TEGDP的合成路线图。

图2为TEGDP的¹H NMR谱(A)及¹³C NMR谱(B)。

图3为mPEG-TEGDP纳米颗粒的合成路线图。

图4为mPEG-TEGDP纳米颗粒的¹H NMR谱(A)、¹³C NMR谱(B)及³¹P NMR谱。

图5为mPEG-TEGDP纳米颗粒的粒径分布图(A)及透射电镜图(B)。

图6为mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒的合成路线图。

图7为mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒¹H NMR谱。

图8为mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒的粒径分布图(A)及透射电镜图(B)。

图9为mPEG-TEGDP纳米颗粒的生物相容性检测结果；A：MTT比色法检验对A546细胞的毒性结果；B与C：死活染色实验结果。

图10为MTT比色法检验mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒对HepG2细胞的毒性结果。

图11为载药纳米颗粒甲的释放动力学曲线。

图12为流式细胞计数(FACS)检验HepG2细胞对单独小分子药物阿霉素(A)，载药纳米颗粒甲(B)及载药纳米颗粒乙(C)的内吞情况；D为A，B，C的整合图。

图13为Wistar大鼠原发性肝癌的治疗结果；经PBS(A)、单独小分子药物阿霉素(B)、包载阿霉素的mPEG-TEGDP(C)及包载阿霉素的mPEG-laPEG-TEGDP(D)治疗后肝脏照片(A1-D1)，肝脏组织切片HE染色(A2-D2)以及肝脏表面直径≥3mm的肿瘤结节数目(E)。

图14为经PBS(1)、单独小分子药物阿霉素(2)、载药纳米颗粒甲(3)及载药纳米颗粒乙(4)治疗后Wistar大鼠肝脏中的甲胎蛋白(AFP)(A1-A4)，胎盘型谷胱甘肽s-转移酶(GST-P)(B1-B4)以及增殖细胞核抗原(PCNA)(C1-C4)的免疫组织化学染色；转化生长因子-α(TGF-α)与表皮生长因子受体(EGFR)的Western免疫印迹检测结果(E)；D图为对10张PCNA免疫组织化学染色照片中的PCNA阳性细胞进行统计，计算其占总体肝细胞的比例。

图15为PBS(A)，单独小分子药物阿霉素(B)，载药纳米颗粒甲(C)及载药纳米颗粒乙(D)在Wistar大鼠肝脏组织中的阿霉素分布的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)照片；阿霉素荧光(A1-D1)，Alexa fluor

phalloidin标记细胞膜(B2-D2)，DAPI标记细胞核(A3-D3)，A4-D4分别是A1-A3，B1-B3与D1-D3的叠加图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。mPEG2000(货号：202509，公司：Aldrich)；mPEG5000(货号：81323，公司：Aldrich)；N₃PEG3400(货号：88276，公司：Sigma)。

实施例1、相关化合物的合成

一、COP的合成

通过三氯化磷与乙二醇反应合成2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(2-chloro-2-oxo-1，3，2-dioxaphospholane，COP)，具体的合成方法如下：在1000mL的三口圆底烧瓶中，将三氯化磷(3.0mol)溶解于无水二氯甲烷(500mL)中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴入乙二醇(3.0mol)，待全部滴完后，继续反应0.5小时，减压下蒸去溶剂，连续减压蒸馏两次将产物蒸出(50℃，200Pa)。将产物溶解在苯中，通入O₂反应48小时，减压下蒸出溶剂苯，再于减压下连续蒸馏两次将产物(COP)蒸出(88～89℃，20Pa)，在N₂气氛下于-20℃冰箱中封存。

二、双环磷酸酯单体(TEGDP)的合成与表征

3，6-二氧代辛烷-1，8-二乙撑磷酸酯(TEGDP)的合成路线如图1所示。详述操作步骤如下：在一个干燥的500mL三口烧瓶中，用注射器依次加入0.32mol COP和200mL四氢呋喃(THF)，将体系冷却到-5℃后，边搅拌边用恒压滴液漏斗缓慢加入三甘醇的四氢呋喃溶液(0.16mol三甘醇溶于100mL四氢呋喃)与三乙胺的四氢呋喃溶液(0.32mol三乙胺溶于100mL四氢呋喃)，约1小时滴完，体系在-5℃继续反应5小时。将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下抽掉溶剂，加入50mL甲苯洗涤两次，减压抽干溶剂即得到TEGDP单体。

对TEGDP进行核磁共振氢谱(¹H NMR)及核磁共振碳谱(¹³C NMR)分析，测定其分子结构，谱图见图2。TEGDP中的质子在相对应的NMR图谱中都能找到其归属，并且积分面积与结构式吻合，证明了TEGDP结构的正确。

实施例2、mPEG-TEGDP纳米颗粒的合成与表征

mPEG-TEGDP纳米颗粒的合成示意图如图3所示。预先在干燥的圆底烧瓶中加入mPEG、TEGDP和Sn(Oct)₂，三者的摩尔投料比以及反应体系的参数见表1。体系反应12小时后用分子量为15000的透析袋在超纯水中透析72小时，冻干后得到白色粉末状产物(mPEG-TEGDP纳米颗粒)。

表1  mPEG-TEGDP纳米颗粒的合成条件

使用元素分析方法测定纳米颗粒的组成。表2为mPEG-TEGDP纳米颗粒的元素分析结果，说明可以通过调控合成条件来得到不同组成的纳米颗粒。

表2  mPEG-TEGDP纳米颗粒元素分析

使用核磁共振氢谱(¹H NMR)、核磁共振碳谱(¹³C NMR)及核磁共振磷谱(³¹P NMR)进一步对纳米颗粒进行结构分析。图4为表1中纳米颗粒A的NMR图谱。从图中可以看出纳米颗粒A中的质子在相对应的NMR图谱中都能找到其归属，证明了结构的准确性。表1中其余7种mPEG-TEGDP纳米颗粒的NMR图谱都类似，差别在于峰面积不一样。

纳米颗粒的粒径及粒径分布分别使用动态光散射(DLS)与透射电镜(TEM)进行观察与分析。图5为mPEG-TEGDP纳米颗粒A的DLS及TEM数据，从DLS分析结果可以看到纳米颗粒粒径分布均一，从TEM图中可以看出纳米颗粒为球形颗粒，有核壳结构，颗粒大小约为200nm。其余7种mPEG-TEGDP纳米颗粒结果与纳米颗粒A相似。

实施例3、mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒的制备与表征

mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒的合成示意图如图6所示。

一、mPEG-N₃PEG-TEGDP纳米颗粒的制备

将mPEG2000、N₃PEG3400、TEGDP及Sn(Oct)₂分别加入到干燥的圆底烧瓶(摩尔投料比见表3)。在二甲亚砜中反应12小时后用分子量为15000的透析带在超纯水中透析72小时，冻干后得到表面叠氮基团官能化的纳米颗粒mPEG-N₃PEG-TEGDP。

mPEG-N₃PEG-TEGDP纳米颗粒的元素比例及各组分比例计算结果列于表3。从表3可以看到，N₃PEG在引发剂总量中的比例从0.9/0.1提高到0.5/0.5，其在纳米颗粒中的含量也随之增加，从0.9/0.039增加到0.5/0.235，这个结果表示可以通过投料比来控制纳米颗粒表面的聚乙二醇组成，并由此调整纳米颗粒的官能化程度。

表3  mPEG-N₃PEG-TEGDP纳米颗粒元素分析

二、mPEG-NH₂PEG-TEGDP纳米颗粒的制备

将100mg mPEG-N₃PEG-TEGDP纳米颗粒分散在5mL的THF中，加入10mg三苯基膦(PPh)，室温搅拌12h，后加入0.5mL H₂O，继续搅拌12h，反应结束直接将反应溶液滴入到100mL乙醚中，沉淀出来的mPEG-NH₂PEG-TEGDP纳米颗粒抽干备用。

三、mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒的制备

在50mL的MES缓冲液(0.1M，pH＝6.5)中溶解0.217g N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(sulfo-NHS)、0.198g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)与0.0895g乳糖酸(Lactobionic acid，LA)，室温搅拌15min，后加入100mg mPEG-NH₂PEG-TEGDP纳米颗粒，于4℃下反应4h，接着室温搅拌12h，反应结束后溶液直接透析(截留分子量为12000)2天，将最终得到的mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒冻干备用。

使用核磁共振氢谱(¹H NMR)对mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒进行表征，如图7所示，纳米颗粒中相应质子氢都能在谱图上找到归属，证明了其结构的正确性。动态光散射(DLS)与透射电镜(TEM)的数据表明，mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒直径在200nm左右，呈均匀分散状态(图8)。

实施例4、纳米颗粒作为药物载体的性能评价

一、纳米颗粒的生物相容性评价

使用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)比色法检测mPEG-TEGDP纳米颗粒对人肺癌细胞A549(购自ATCC，货号CCL-185)的毒性。步骤如下：首先在96孔板上每孔种10000个细胞，每孔中加入100μL RPMI 1640培养基(10％胎牛血清)，置于CO₂培养箱中(37℃，CO₂浓度为5％)培养24小时后，分别将浓度为1/128、1/64、1/32、1/16、1/8、1/4、1/2、1、5、10g/L的mPEG-TEGDP纳米颗粒A与A549细胞共培养72小时后测细胞活力，用同样浓度的十二烷基磺酸钠(SDS)作为对照。结果见图9(A)。由图可见，当mPEG-TEGDP纳米颗粒A浓度为10g/L时，90％的细胞仍存活，证明mPEG-TEGDP纳米颗粒A具有良好的生物相容性。

用MTT方法检验mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒A对人肝癌细胞HepG2(购自ATCC，货号HB-8065)的毒性，方法同上，以未处理细胞为对照，结果如图10所示。从图中可以看出mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒A对细胞未表现出任何毒性。

借助“细胞死活染色”方法(LIVE/Viabi lity/Cytotoxicity Kit)检验mPEG-TEGDP纳米颗粒的生物相容性：将浓度为10g/L的mPEG-TEGDP纳米颗粒A与人肺癌细胞A549共培养72小时，以未经处理的A549细胞为对照，然后用死活染色的方法测试纳米颗粒的生物相容性，结果如图9(B，C)所示。由图中可见，mPEG-TEGDP纳米颗粒A浓度为10g/L时，对A549细胞未产生毒性，显示出具有良好的生物相容性。

二、纳米颗粒对药物的包载及释放能力

载药纳米颗粒的载药量及载药效率通过高效液相色谱(HPLC，Highperformance liquid chromatography)测定。HPLC由Waters 1525双向泵、Waters2475荧光检测器、1500柱温箱及

C18分离柱组成，流动相使用“乙腈与水”混合体系(pH为2.7)，两者比例为50/50(v/v)，温度30℃，流速为1.0mLmin^-1，荧光激发波长为460nm，发射波长为570nm。结果通过Breeze软件进行分析。

载药量与载药效率用如下公式计算：

1、载药纳米颗粒对药物的包载能力

将PEG-TEGDP纳米颗粒A与阿霉素溶于Milli-Q水中，室温搅拌两天，使用G50葡聚糖凝胶柱分离除去未包载的游离阿霉素，冻干后得到载药纳米颗粒甲(包载阿霉素的mPEG-TEGDP纳米颗粒)。

mPEG-TEGDP纳米颗粒A与阿霉素的投料比及最终的载药量与载药效率见表4。

从表4所列的数据中可以看到，在载药效率高达91.00％的时候，载药量依然有9.10％，可见纳米颗粒对阿霉素具有高效的包载能力。

表4  mPEG-TEGDP纳米颗粒A对阿霉素的载药量和载药效率

载药纳米颗粒	纳米颗粒与阿霉素的投料比(g/g)	载药量(％)	载药效率(％)
				A	10/1	9.10±0.59	91.00±5.82
B	10/5	28.90±2.60	57.79±5.13

将mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒A与阿霉素溶于Milli-Q水中，室温搅拌两天，使用G50葡聚糖凝胶柱分离除去未包载的游离阿霉素，冻干后得到载药纳米颗粒乙(包载阿霉素的mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒)。

mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒A与阿霉素的投料比及最终的载药量与载药效率见表5。

表5  mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒A对阿霉素的载药量和载药效率

载药纳米颗粒	纳米颗粒与阿霉素的投料比(g/g)	载药量(％)	载药效率(％)
				A	10/0.5	4.4±0.7	87.6±12.8
B	10/1	8.3±0.2	83.4±1.4

从表中5可见，mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒A具有高效的药物包载能力。

2、载药纳米颗粒对药物的释放能力

药物体外释放实验在37℃于磷酸缓冲液(PB，0.02M，pH＝7.4，镁离子浓度10mmol L^-1)中进行，具体操作如下：将表4中的载药纳米颗粒甲用磷酸缓冲液重悬，纳米颗粒的终浓度为1.0mg mL^-1；取6份3mL的溶液，其中3份直接置于透析管中(Spectra/

Float-A-Lyzer，载留分子量25,000)，37℃下置于22mL磷酸盐缓冲溶液中搅拌，另外3份每份加入磷酸二酯酶(磷酸二酯酶在磷酸缓冲液中的终浓度为5unit L^-1)，然后置于透析管中，37℃下置于22mL磷酸盐缓冲溶液中搅拌。在不同的时间间隔，将透析管的外液(22mL磷酸盐缓冲溶液)全部取出，并补充以同体积的磷酸盐缓冲溶液。将取出的磷酸盐缓冲溶液冻干后通过HPLC测量阿霉素的积累释放量，结果为三个重复试验的平均值。

释放动力学曲线结果见图11，结果显示不加磷酸二酯酶时，阿霉素在10小时内有一个4％的暴释，而在接下的158个小时时间仅释放4.4％；而在磷酸二酯酶存在下，10小时内释放约12％，168小时后共释放了24.8％(以上百分比指的是释放的阿霉素占负载阿霉素的质量百分含量)。说明磷酸二酯酶可以特异性地催化磷酸酯内核的降解，并随后促进阿霉素从纳米颗粒中释放。这种酶促降解的行为将在体内应用时具有积极的意义。纳米颗粒在血液中循环并不会大量释放药物，而进入癌细胞后，载药纳米颗粒在各种酶的催化下降解并释放药物，达到抑制癌细胞的作用。

实施例5、纳米颗粒作为药物载体的应用

哺乳动物肝细胞向朝肝窦一侧的细胞膜上大量表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)，它是一种专一性识别末端含有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白。使用表面带半乳糖残基的mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒A作为抗癌药物阿霉素的输送载体，用于治疗Wistar大鼠体内的原发性肝癌模型。

一、肝癌细胞HepG2对载药纳米颗粒乙的特异性识别

肝癌细胞HepG2高表达去唾液酸糖蛋白受体，可特异性识别表面带半乳糖残基的纳米颗粒，并介导其内吞。在24孔板中将乳糖酸(终浓度为0、30或60mM)、小分子药物阿霉素、载药纳米颗粒甲(包载阿霉素的mPEG-TEGDP纳米颗粒)和载药纳米颗粒乙(包载阿霉素的mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒)与HepG2细胞预先在4℃下培养2h(阿霉素的浓度均为20μg/mL，每孔1mL RPMI 1640培养基)，让纳米颗粒与细胞充分结合，然后用PBS缓冲液清洗，继续在37℃下培养1h。使用流式细胞计数(FACS)方法分析了上述三者对HepG2细胞的内在化情况，结果如图12所示。结果显示，HepG2细胞内吞载药纳米颗粒乙的量要明显多于载药纳米颗粒甲，由此可见HepG2细胞能特异性与载药纳米颗粒乙结合，并随后介导内吞行为，证明了载药纳米颗粒乙表面糖基配体对肝细胞的靶向效果。此外，载药纳米颗粒乙进入细胞具有小分子抑制剂乳糖酸(lactobionic acid)的浓度依赖性，而这种现象并未在小分子药物阿霉素以及载药纳米颗粒甲中发现，更充分证明了载药纳米颗粒乙进入细胞是由于去唾液酸糖蛋白受体介导的内吞机制所导致。

二、载药纳米颗粒乙对大鼠原发性肝癌的治疗

1、大鼠原发性肝癌模型的构建

使用化学致癌药物二乙基亚硝胺(DEN)诱导Wistar大鼠(购白中国科学院上海实验动物中心)生成原发性肝癌。具体方法为：在Wistar大鼠的饮水中加入100ppm的DEN，持续时间为8周。

2、载药纳米颗粒乙对大鼠原发性肝癌的治疗

随机将大鼠分为四组，每组10只，进行如下给药处理：

第一组(mPEG-TEGDP纳米颗粒)：尾静脉注射载药纳米颗粒甲；

第二组(mPEG-laPEG-TEGDP纳米颗粒)：尾静脉注射载药纳米颗粒乙；

第三组(阿霉素)：尾静脉注射小分子药物阿霉素；

第四组(PBS缓冲液)：尾静脉注射PBS缓冲液。

每月给药8次，第一组至第三组处理中，单次给药剂量为1μg/g阿霉素。

一个月后，治疗结果如图13所示。从图中可以看出，在给药一个月后，第二组的肝癌的恶化程度要明显好于其它三个实验组(图13A1，B1，C1，D1)，肝组织切片同样证实了观察的结果(图13A2，B2，C2，D2)。对整个肝脏组织表面的直径大于3mm的肿瘤结节进行计数，结果显示第二组与其它三组都存在着统计学上的显著差异性(图13E)，体现了这种靶向性纳米颗粒对肝癌具有明显的抑制效果。

进一步在蛋白分子水平上检验肝癌的治疗效果，结果如图14所示。肝脏组织中的甲胎蛋白(AFP)，胎盘型谷胱甘肽s-转移酶(GST-P)以及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达量通过免疫组织化学染色方法进行检测(图14A，14B，14C)，转化生长因子-α(TGF-α)与表皮生长因子受体(EGFR)则通过Western免疫印迹进行定量检测(图14E)。结果表明经载药纳米颗粒乙治疗的大鼠，其肝脏中这些肿瘤相关蛋白的表达量都明显低于其它三组，显示了较好的肝功能及优越的肿瘤抑制效果。

进一步观察单独小分子药物阿霉素、载药纳米颗粒甲及载药纳米颗粒乙这三个实验组的阿霉素在肝组织中的定位。图15为肝脏组织的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)照片，从照片中可以看到三者的阿霉素分布具有明显的差异性，单独阿霉素实验组的荧光较弱(图15B1)，载药纳米颗粒甲及载药纳米颗粒乙在肝实质细胞与kupffer细胞中都有分布，但载药纳米颗粒乙整体呈均匀分散状态，并且在肝实质细胞中分布的比例要显著高于载药纳米颗粒甲(图15C1，15D1)。这种在肝脏组织中药物分布模式的差异性解释了三者在抑制肝原发性肿瘤发展中起的功效的不同。单独阿霉素在体内代谢过快，在较低的阿霉素给药剂量下，到达肝组织的有效药量比较低，不能达到抑制与治疗的效果。载药纳米颗粒甲与肝实质细胞的接触未能高效地进入肝实质细胞，大部分被kupffer细胞吞噬。载药纳米颗粒乙由于表面带有与肝实质细胞特异性结合的半乳糖配体基团，在长循环的过程中，能不断与肝细胞进行接触，最终在去唾液酸糖蛋白受体的介导下通过内吞途径进入肝实质细胞，所以载药纳米颗粒乙对肝细胞的靶向性在降低体内毒性的同时，并且增加了对癌变细胞的杀伤能力，故此能起到抑制新肿瘤的生成或者已有肿瘤的生长。

Claims (10)

1.纳米颗粒甲，为如下(a)或(b)：

(a)式(I)所示化合物为壳层、式(II)所示化合物为内核的纳米颗粒；

式(I)；

n1＝2-400；

式(II)；

(b)式(I)所示化合物和式(III)所示化合物为壳层、式(II)所示化合物为内核的纳米颗粒；

式(III)；

n2＝2-400。

2.如权利要求1所述的纳米颗粒甲，其特征在于：n1＝2-120；n2＝2-120。

3.如权利要求1或2所述的纳米颗粒甲，其特征在于：(a)所述的纳米颗粒甲中，式(I)所示化合物与式(II)所示化合物的物质的量的比值为1∶(0.5-5.1)；(b)所述的纳米颗粒甲中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物与式(II)所示化合物的物质的量的比值为(0.5-0.9)∶(0.03-0.24)∶(1.4-2.0)。

4.如权利要求1至3中任一所述的纳米颗粒甲，其特征在于：(a)所述的纳米颗粒甲采用如下方法制备：以异辛酸亚锡为催化剂，用式(I)所示化合物引发式(II)所示化合物聚合，得到纳米颗粒甲；(b)所述的纳米颗粒甲采用如下方法制备：以异辛酸亚锡为催化剂，用式(I)所示化合物和式(III)所示化合物引发式(II)所示化合物聚合，得到纳米颗粒甲。

5.如权利要求4所述的纳米颗粒甲，其特征在于：(a)所述的纳米颗粒甲的制备方法中：所述聚合反应中，式(I)所示化合物、式(II)所示化合物和异辛酸亚锡的物质的量的比值为(0.05-0.1)∶(0.5-2)∶(0.025-0.05)，反应条件为40-80℃，反应溶剂为二氧六环、二甲亚砜或四氢呋喃；(b)所述的纳米颗粒甲的制备方法中：所述聚合反应中，式(I)所示化合物、式(III)所示化合物、式(II)所示化合物和异辛酸亚锡的物质的量的比值为(0.5-0.9)∶(0.1-0.5)∶6∶0.5；反应条件为60℃，反应溶剂为二甲亚砜。

6.将权利要求1至5中的(b)所述纳米颗粒进行化学修饰得到的纳米颗粒乙；所述化学修饰为将所述纳米颗粒甲中的式(II)所示化合物的叠氮基还原为氨基。

7.将权利要求6所述纳米颗粒乙进行化学修饰得到的纳米颗粒丙；所述化学修饰为将所述纳米颗粒乙中的所述氨基与乳糖酸进行化学连接。

8.一种制备纳米颗粒的方法，包括如下步骤：以式(IV)所示化合物中的至少一种作为引发剂，以异辛酸亚锡为催化剂，引发式(II)所示化合物聚合，得到纳米颗粒；

式(IV)；

n＝2-400；R₁为-OCH₃或-N₃。

9.一种药物输送载体，它的活性成分为权利要求1至7中任一所述的纳米颗粒。

10.一种纳米药物，它的活性成分为如下复合物：权利要求1至7中任一所述的纳米颗粒及其负载的药物组成的复合物。

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