CN101716351B - 一类吡啶化合物在制备rna干涉增强剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类吡啶化合物的新用途，即其在制备NAR干涉增强剂中的应用。实验证明，代号HP01的吡啶化合物作为一种新型医药中间体，能够有效的增强RNA干涉效率，是一类新型的RNA干涉增强剂。本发明将在siRNA的研究和开发中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一类吡啶化合物在制备RNA干涉增强剂中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一类化合物的新用途，特别是涉及一类吡啶化合物(代号HP01)在制备RNA干涉效率增强剂中的应用。
背景技术
1990年，为加深矮牵牛花的紫色，Jorgensen等导入了一个强启动子控制的色素基因，可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色，这是由于转基因和同源内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppression)(Jorgensen等，Chalcone synthase cosuppression phenotypes inpetunia flowers：comparison of sense vs antisense constructs and single-copyvs complex T-DNA sequences，Plant Mol Biol，1996，31(5)：957-973)。
1995年，康乃尔大学的Su Guo在利用反义RNA技术特异性地抑制秀丽新小杆线虫(C.elegans)中的par-1基因的表达时，意外发现对照实验中给线虫注射正义RNA(sense RNA)也能抑制par-1基因的表达(Su Guo等，Par-1，a gene required forestablishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser/Thr kinasethat is asymmetrically distributed，Cell，1995，81(4)：611-620)。该研究小组一直未能给出合理解释。直到1998年2月，Andrew Fire和Craig Mello才首次揭开这个悬疑。Su Guo遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起，当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰(RNA interference简称RNAi)。RNAi的研究有着非常重要的意义，它可能被应用在功能基因组研究、作物的品种改良、基因治疗及其它的很多领域里。RNAi作为一种调控特定基因表达的手段，被称为基因组的免疫现象，已成为当前生物医学领域的研究热点之一。
RNAi在哺乳动物中的应用
哺乳动物中导入dsRNA将引起严重的细胞毒性反应。Elbashir等用人工合成的21ntRNA双链在体外培养的人胚肾293细胞及Hela细胞取得成功(Elbashir等，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cellculture，Nature，2001，411：494-498)。随后，在许多培养的人源、猴源、鼠源细胞均证实存在siRNA的RNAi效应。这一切让人们想到是否直接在细胞内生成或体外制备siRNA便会引起RNAi现象。著名的Ambion公司及Operon公司都开始提供siRNA化学合成服务，它非常方便、简单、不受碱基的限制，但合成费用相当昂贵。哺乳动物细胞中基因内含子多，基因结构复杂，不同的siRNA效率不一，因此一般一个靶基因至少需要设计3～4对不同的siRNA进行试验，造成RNAi成本较高。许多研究小组开发表达载体如质粒，利用不同的启动子如PolIII2U6、T7合成dsRNA。质粒可以复制扩增，可以克服低转染及基因沉默的瞬时性。哈佛大学开发的载体psilence 1.0-U6已经成功地在Hela、H1299、U-20s和C-33A细胞中敲除了Cdk-2和LaminA/C的表达。科学家们证实，使用哺乳动物细胞中U6启动子去生成siRNA媒介不相同于PolIII，U6启动子不含有内源性A盒、B盒子，它直接转录出小片断RNA，3’末端有4个突出尿苷酸，且U6启动下游有针对靶基因的19nt的正义和反义核苷酸序列，它能自动生成双链siRNA，并免受细胞内核酸酶的降解，持续稳定地抑制靶基因。如今，越来越多的载体用于构建siRNA，将载体转移到细胞内合成出siRNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，siRNA能够长期发挥阻断基因的作用，如pSuper载体，Bluescript载体等。
RNAi不但应用于哺乳动物细胞基因功能分析，而且通过载体在体内合成或体外转录的siRNA来调节，干扰基因表达进行治疗。许多研究表明，siRNA可有效地抑制HIV病毒在原代T淋巴细胞中的复制。Novina等特异性沉默了HIV-1细胞受体CD4、病毒结构蛋白Gag和调节蛋白的Nef(Novina等，siRNA-directed inhibition of HIV-1infection，Nat Med，2002，8(7)：681-686)。有研究者用siRNA预处理的人和鼠细胞能够抵抗病毒感染。最新发现脆性X染色体综合征与RNAi相关，也为人类分子遗传学开出一个新的领域-RNAi相关机制缺陷引发的疾病研究。
RNAi在基因治疗方面的应用
RNAi与肿瘤的基因治疗：血管生成在肿瘤生长及转移过程中扮演着十分重要的角色。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成过程中起着关键作用。研究表明，使siRNA靶向作用于VEGF的mRNA，可以显著减少人前列腺癌细胞系PC3中VEGF的表达，从而使PC3细胞失去血管再生的功能。RNAi在肿瘤疾病方面的体内试验报道近来也不断增加。研究表明，当裸鼠被移植了通过siRNA预作用而抗β-catenin的结肠淋巴肿瘤细胞，其存活期可以大大延长。另外，通过RNAi使致癌基因H-Ras发生沉默，可以抑制人的卵巢癌细胞在小鼠体内的生长。胸苷酸合成酶(TS)是合成胸苷酸的十分重要的酶，抑制TS的活性可以导致DNA复制的抑制及细胞的凋亡。研究表明，RNAi可以作为一种降低TS水平的替代治疗方法。Aloy等对热休克蛋白27进行RNAi后，能提高放射治疗对肿瘤的敏感性(Aloy等，Protective role of Hsp27 protein againstgamma radiation-induced apoptosis and radio sensitization effects of Hsp27gene silencing in different human tumor cells，Int J Radiat Oncol BiolPhys，2008，70(2)：543-553)。
RNAi与感染性疾病的基因治疗：RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列过量增殖等作用，因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。借助RNAi技术治疗病毒感染性疾病仍然是其主要疾病应用研究领域，艾滋病是人类应用RNAi技术进行治疗研究最早的疾病。RNAi可以直接和有效地抑制人类疾病相关RNA病毒的复制，研究主要集中在HIV-1和丙型肝炎病毒(HCV)。此外也见于乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、疱疹病毒等。Novina等用RNAi技术实现了HIV-1病毒的阻抑(Novina等，siRNA-directed inhibition of HIV-1 infection.NatMed，2002，8(7)：681-686)。McCaf-frey等将合成的双链RNA和通过载体将双链DNA形成shRNA直接注入鼠的肝脏，均可明显抑制HCV基因的表达(McCaf-frey等，RNAinterference in adult mice，Nature，2002，418(6893)：38-39)。Song等通过静脉注射Fas的siRNA成功减轻了小鼠Fas诱导的暴发性肝炎的发生(Song等，RNAinterference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis，NatMed，2003，9(3)：347-351)。
RNAi与其它疾病的基因治疗：显性遗传疾病发生通常是由于一个等位基因突变造成的。特异性地去除突变的等位基因而保留正常的另一个等位基因以维持正常细胞功能，已经成为该疾病的治疗目标之一。三核苷酸CAG重复子的大量出现引起的多聚谷氨酰胺过量表达与多种神经性遗传疾病(如亨廷顿病、Kennedy综合征等)发生有关。最近，有学者在培养细胞中通过设计三核苷酸CAG重复子的siRNA成功抑制了多聚谷氨酰胺的表达，这无疑为这些疾病的治疗提供了新思路。此外，有关RNAi技术在自身免疫性疾病、血液疾病的研究报道也越来越多。
RNAi基因治疗的优势：与传统的基因抑制工具相比，RNAi具有更强大、更持久的抑制基因表达的能力，如其效能是反义寡核苷酸的100到10000倍；具有高度的序列特异性，若与目的mRNA的序列不完全匹配，将会大大削弱RNAi基因沉默的效应，从而大大提高了其作用的安全性；无免疫原性，因而不会引起机体的免疫反应；不易被核糖核酸酶(RNase)降解，因此具有更强的稳定性；由于其无需同基因组整合发挥作用，因而无需进入细胞核内，也就不需要复杂的转移系统；另外，由于其体积小，可以使用一个转移系统同时转移多个siRNA分子靶向于不同mRNA，这就为治疗诸如癌症这类由多基因表达失调导致的疾病提供了可能。与传统的小分子药物相比，首先，siRNA研发周期短；其次，RNAi的作用具有高度特异性，这就减少了发生毒副作用的可能性；再者，RNAi可以成为对抗耐药性的更加有效的方法。由于耐药性通常是由靶蛋白的编码基因发生点突变引起的，在这种情况下，很难针对每一个突变点分别设计合成一种新药，而且相应新药上市也需要很长时间，然而，siRNA分子可以被很快设计出来，靶向于突变位点，使之发生沉默。
RNAi基因治疗存在的问题：RNAi技术广泛应用中所面临的关键问题之一就是如何有效的实现RNA干涉效率的提高。提高RNAi干涉效率，可以使剂量降低从而降低RNA感染的潜在副作用，这样既有助于推进RNAi相关的实验室研究而且还能进一步促进RNAi技术今后广泛应用临床治疗。目前，市场上尚无RNA干涉增强剂类产品。
另一方面，已知的吡啶类化合物已收录于小分子化合物库中，它是氢键的给体和受体，属于一类新型医药中间体(①Dolzhenko A V等，Substituted amides andhydrazides of dicarboxylic acids，Pharmaceutical ChemistryJournal，2003，37(5)：229-231，②Cocco M T等，Synthesis of ibuprofen heterocyclicamides and investigation of their analgesic and toxicological properties，European Journal of Medicinal Chemistry，2003，38(5)：513-518)，其已知的用途有抗哮喘药、抗菌药、止痛剂、抗爱滋病毒药等。
RNAi是一种在动、植物中广泛存在的序列特异性转录后水平的基因沉默过程，由于被抑制基因同源的dsRNA所启动，是生物基因组抵抗转座子或病毒之类的外来遗传元件入侵的一种保护性机制。
发明内容
本发明提供了一类吡啶化合物(代号HP01)的新用途，即在制备RNA干涉效率增强剂中的应用。
所述化合物HP01具有式I所示的分子式：
式I
R1＝H、OH、OCH3、OCH2CH3，R2＝H、CH3、CH2CH3；优选R1＝H，R2＝CH3。
使用HP01增强剂提高RNA干涉效率时，是将8-12mM(优选为10mM)HP01加入0.5mlRNA干涉体系中。
所述RNA干涉体系包括转染有RNA干涉片段的细胞，含有10％血清的Opti-MEM IReduced Serum Medium 500μl。
或者，所述RNA干涉体系包括转染有RNA干涉片段的细胞，完全培养基500μl。
本发明提供了一类吡啶化合物HP01的新用途，即作为增强剂在提高RNA干涉效率中的应用。实验证明，HP01作为一种新型医药中间体，能够有效的增强RNA干涉效率，是一类新型的RNA干涉增强剂。本发明将在siRNA的研究和开发中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为HP01合成过程示意图
图2为HP01对siGAPDH干涉效率增强效果的检测结果
图3为HP01对siNRSF干涉效率增强效果的检测结果
图4为HP01对siSIRT1干涉效率增强效果的检测结果
图5为HP01对siHath6干涉效率增强效果的检测结果
图6为HP01对siBeta-actin干涉效率增强效果的检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、HP01的合成
如图1所示，用本发明的方法合成HP01，具体方法包括以下步骤：
以3-氰基吡啶(100mmol)为原料，加入5.0g氢氧化钠水溶液(30ml)，搅拌下于70～80℃反应5h，用浓盐酸调至pH 4～5，抽滤，滤饼干燥后用乙醇重结晶得白色固体1。
氨基钠(0.81mol)、二甲苯(45ml)、N，N-二甲基苯胺(5ml)加至500ml压力釜中，加热至155℃，1h内加入白色固体1(0.60mol)，加毕于153～155℃继续搅拌3h，冷却至38～40℃，加入水(60ml)，同温搅拌30min，静置分层，水相用二甲苯(100ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液蒸出溶剂，得到HP01。(参考文献①杨建等，2-氯烟酸的合成，合成化学，2009，17(2)：252-254，②蒲通等，2-氨基-3-甲基吡啶的制备，中国医药工业杂志，2008，39(9)：653-654)
合成的吡啶化合物为2-甲氨基-3-羧酸吡啶。以下实验均以此化合物为例。当然，该化合物也可用其它已公开文献介绍的方法合成。
同样，式I表示的其它化合物可按已公开文献方法合成，或参照以上合成操作改变相应基团后合成，本发明不再一一详述。
实施例2、HP01能够增强siGAPDH的干涉效率
一、GAPDH基因的RNAi抑制
Hela细胞用胰酶消化后，以2×105个细胞/孔种于24孔板。设置2孔对照组，2孔siGAPDH组。
取1μl/孔Lipofectamine2000(购自Gibco公司，使用前轻轻摇匀)，用50μlOpti-MEM I Reduced Serum Medium(购自Gibco公司)稀释，轻轻混和后在室温孵育5min。取适量siGAPDH(购自invitrogen公司，根据不同转染浓度取量，50nM为1.25μl/孔)，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释，轻轻混和均匀；稀释的Lipofectamine2000经过5min的孵育后，与稀释siGAPDH轻轻混和，室温静置20min，以形成si-GAPDH-转染试剂混和物。将siGAPDH-转染试剂混和物加入含有细胞及Opti-MEM I Reduced Serum Medium的孔中，轻轻摇晃孔板，使混和；在37℃的CO2培养箱中培养12小时后，换成含有10％血清的培养基，并在每组的一个孔中加入5μl的HP01(10mM)。
二、检测干涉前后Hela细胞中GAPDH mRNA表达量的变化情况
37℃的CO2培养箱中培养72小时后，弃去培养基，每孔加入500μl的Trizol(购自invitrogen公司)，将细胞转移至1.5ml的EP管中，加入100μl的氯仿，剧烈混匀，室温静置5min。4℃，12000转/min，离心15min。取上清，放入一新的EP管中，加入500μl预冷的异丙醇，4℃冰箱中放置10min；4℃，12000转/min，离心10min。弃去上清，加入1ml 75％乙醇，颠倒混匀；4℃，12000转/min，离心5min。弃去上清，超净台中干燥10min。用适量的DEPC水溶解，紫外分光光度仪测定浓度。
根据所测浓度取1μg的RNA，加入2μl的oligo(dT)，补1‰DEPC水至6μl，70℃恒温10min，冰浴2min。依次加入2μl 5×M-MLV Buffer，0.5μl dNTP，0.25μl Rnase Inhibitor，1μl RTase M-MLV，0.25μl的DEPC水。混匀后，42℃恒温1h，70℃恒温15min。得到的cDNA于-20℃冰箱中保存。
进行PCR反应，以Beta-actin为内参，检测干涉前后Hela细胞中GAPDH mRNA表达量的变化情况。引物序列如下：
检测GAPDH基因的引物：
上游：GAGTCAACGGATTTGGTCGT
下游：TTGATTTTGGAGGGATCTCG。
检测Beta-actin的引物：
上游：GGACTTCGAGCAAGAGATGG
下游：AGCACTGTGTTGGCGTACAG。
PCR体系如下：
10×PCR Buffer   2μl，
dNTP Mix(2.5mM)  1.6μl，
引物(上、下游)   1μl，
rTag聚合酶       0.2μl，
cDNA             1μl，
H2O              14.2μl，
总共             20μl。
PCR反应条件为：先95℃5min，然后(95℃30s，56℃30s，72℃30s)，共25个循环，最后72℃延伸7min后冷至4℃。
PCR完毕后加入4μl 6×loading buffer，进行2％琼脂糖凝胶电泳。采用AlphaImageTM3300型凝胶成像仪附带软件对目的条带进行灰度扫描分析。
进行Real-time PCR，采用SYBR GREEN染料(购自美国Bio-Rad公司)，美国Bio-Rad公司IQ5型全自动荧光实时定量PCR系统进行real-time PCR分析GAPDH干涉效果。
从结果(如图2所示，横坐标为实验条件，纵坐标为表达量，Control为对照，*表示与对照组相比有显著性差异)可以看出，HP01能够增强siGAPDH的干涉效率。
实施例3、HP01能够增强siNRSF的干涉效率
一、NRSF基因的RNAi抑制
Hela细胞用胰酶消化后，以5×105个细胞/孔种于6孔板。设置2孔脱靶对照组，2孔siNRSF组。去除Hela细胞的培养基，加入含有NRSF干涉片段的慢病毒毒液(杨印祥等，NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测，生物化学与生物物理进展，2008，35(2)：151～158)或者脱靶对照的慢病毒毒液，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜，次日，去除毒液，添加完全培养基(高糖DMEM+10％FBS，DMEM与FBS均购自Gibco公司)，并在每组的一个孔中加入5μl的HP01(10mM)。
二、检测干涉前后Hela细胞中NRSF mRNA表达量的变化情况
37℃的CO2培养箱中培养72小时后，弃去培养基，每孔加入500μl的Trizol，将细胞转移至1.5ml的EP管中，加入100μl的氯仿，剧烈混匀，室温静置5min。4℃，12000转/min，离心15min。取上清，放入一新的EP管中，加入500μl预冷的异丙醇，4℃冰箱中放置10min；4℃，12000转/min，离心10min。弃去上清，加入1ml 75％乙醇，颠倒混匀；4℃，12000转/min，离心5min。弃去上清，超净台中干燥10min。用适量的DEPC水溶解，紫外分光光度仪测定浓度。
根据所测浓度取1μg的RNA，加入2μl的ol igo(dT)，补1‰DEPC水至6μl，70℃恒温10min，冰浴2min。依次加入2μl 5×M-MLV Buffer，0.5μl dNTP，0.25μl Rnase Inhibitor，1μl RTase M-MLV，0.25μl的DEPC水。混匀后，42℃恒温1h，70℃恒温15min。得到的cDNA于-20℃冰箱中保存。
进行PCR反应，以Beta-actin为内参，检测干涉前后Hela细胞中NRSF mRNA表达量的变化情况。引物序列如下：
检测NRSF基因的引物：
上游：GAAGAACAGTTTGTGCATC
下游：GCTACAATACTAATCGATA。
PCR体系如下：
10×PCR Buffer  2μl，
dNTP Mix(2.5mM) 1.6μl，
引物(上、下游)  1μl，
rTag聚合酶      0.2μl，
cDNA            1μl，
H2O             14.2μl，
总共            20μl。
PCR反应条件为：先95℃5min，然后(95℃30s，56℃30s，72℃30s)，共25个循环，最后72℃延伸7min后冷至4℃。
PCR完毕后加入4μl 6×loading buffer，进行2％琼脂糖凝胶电泳。采用AlphaImageTM3300型凝胶成像仪附带软件对目的条带进行灰度扫描分析。
进行Real-time PCR，采用SYBR GREEN染料，美国Bio-Rad公司IQ5型全自动荧光实时定量PCR系统进行real-time PCR分析NRSF干涉效果。
从结果(如图3所示，横坐标为实验条件，纵坐标为表达量，Control为对照，Off-target表示脱靶对照，*表示与对照组和脱靶对照组相比均有显著性差异)可以看出，HP01能够增强siNRSF的干涉效率。
实施例4、HP01能够增强siSIRT1的干涉效率
一、SIRT1基因的RNAi抑制
He1a细胞用胰酶消化后，以5×105个细胞/孔种于6孔板。设置2孔脱靶对照组，2孔si SIRT1组。去除Hela细胞的培养基，加入含有SIRT1干涉片段的慢病毒毒液(制备方法参考：杨印祥等，NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测，生物化学与生物物理进展，2008，35(2)：151～158)或者脱靶对照的慢病毒毒液，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜，次日，去除毒液，添加完全培养基，并在每组的一个孔中加入5μl的HP01(10mM)。
二、检测干涉前后Hela细胞中SIRT1mRNA表达量的变化情况
37℃的C02培养箱中培养72小时后，弃去培养基，每孔加入500μl的Trizol，将细胞转移至1.5ml的EP管中，加入100μl的氯仿，剧烈混匀，室温静置5min。4℃，12000转/min，离心15min。取上清，放入一新的EP管中，加入500μl预冷的异丙醇，4℃冰箱中放置10min；4℃，12000转/min，离心10min。弃去上清，加入1ml 75％乙醇，颠倒混匀；4℃，12000转/min，离心5min。弃去上清，超净台中干燥10min。用适量的DEPC水溶解，紫外分光光度仪测定浓度。
根据所测浓度取1μg的RNA，加入2μl的oligo(dT)，补1‰DEPC水至6μl，70℃恒温10min，冰浴2min。依次加入2μl 5×M-MLV Buffer，0.5μl dNTP，0.25μl Rnase Inhibitor，1μl RTase M-MLV，0.25μl的DEPC水。混匀后，42℃恒温1h，70℃恒温15min。得到的cDNA于-20℃冰箱中保存。
进行PCR反应，以Beta-actin为内参，检测干涉前后Hela细胞中SIRT1 mRNA表达量的变化情况。引物序列如下：
检测SIRT1基因的引物：
上游：CAG CAT CTT GCC TGA TTT GTA A
下游：ACC AGA ACA GTT TCA TAG AGC A。
PCR体系如下：
10×PCR Buffer          2μl，
dNTP Mix(2.5mM)         1.6μl，
引物(上、下游)          1μl，
rTag聚合酶              0.2μl，
cDNA                    1μl，
H2O             14.2μl，
总共            20μl。
PCR反应条件为：先95℃5min，然后(95℃30s，56℃30s，72℃30s)共25个循环，最后72℃延伸7min后冷至4℃。
PCR完毕后加入4μl 6×loading buffer，进行2％琼脂糖凝胶电泳。采用AlphaImageTM3300型凝胶成像仪附带软件对目的条带进行灰度扫描分析。
进行Real-time PCR，采用SYBR GREEN染料，美国Bio-Rad公司IQ5型全自动荧光实时定量PCR系统进行real-time PCR分析SIRT1干涉效果。
从结果(如图4所示，横坐标为实验条件，纵坐标为表达量，Control为对照，Off-target表示脱靶对照，*表示与对照组和脱靶对照性比均有显著性差异)可以看出，HP01能够增强siSIRT1的干涉效率。
实施例5、HP01能够增强siHath6的干涉效率
一、Hath6基因的RNAi抑制
Hela细胞用胰酶消化后，以5×105个细胞/孔种于6孔板。设置2孔脱靶对照组，2孔si Hath6组。去除Hela细胞的培养基，加入含有Hath6干涉片段的慢病毒毒液(制备方法参考：杨印祥等，NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测，生物化学与生物物理进展，2008，35(2)：151～158)或者脱靶对照的慢病毒毒液，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜，次日，去除毒液，添加完全培养基，并在每组的一个孔中加入5μl的HP01(12mM)。
二、检测干涉前后Hela细胞中Hath6mRNA表达量的变化情况
37℃的CO2培养箱中培养72小时后，弃去培养基，每孔加入500μl的Trizol，将细胞转移至1.5ml的EP管中，加入100μl的氯仿，剧烈混匀，室温静置5min。4℃，12000转/min，离心15min。取上清，放入一新的EP管中，加入500μl预冷的异丙醇，4℃冰箱中放置10min；4℃，12000转/min，离心10min。弃去上清，加入1ml 75％乙醇，颠倒混匀；4℃，12000转/min，离心5min。弃去上清，超净台中干燥10min。用适量的DEPC水溶解，紫外分光光度仪测定浓度。
根据所测浓度取1μg的RNA，加入2μl的oligo(dT)，补1‰DEPC水至6μl，70℃恒温10min，冰浴2min。依次加入2μl 5×M-MLV Buffer，0.5μl dNTP，0.25μl Rnase Inhibitor，1μl RTase M-MLV，0.25μl的DEPC水。混匀后，42℃恒温1h，70℃恒温15min。得到的cDNA于-20℃冰箱中保存。
进行PCR反应，以Beta-actin为内参，检测干涉前后Hela细胞中Hath6mRNA表达量的变化情况。引物序列如下：
检测Hath6基因的引物：
上游：TATGAGTAGCACGGCACCTG
下游：CGGGGAAAGTTCCTACTCGT。
PCR体系如下：
10×PCR Buffer      2μl，
dNTP Mix(2.5mM)     1.6μl，
引物(上、下游)      1μl，
rTag聚合酶          0.2μl，
cDNA                1μl，
H2O                 14.2μl，
总共                20μl。
PCR反应条件为：先95℃5min，然后(95℃30s，56℃30s，72℃30s)共25个循环，最后72℃延伸7min后冷至4℃。
PCR完毕后加入4μl 6×loading buffer，进行2％琼脂糖凝胶电泳。采用AlphaImageTM3300型凝胶成像仪附带软件对目的条带进行灰度扫描分析。
进行Real-time PCR，采用SYBR GREEN染料，美国Bio-Rad公司IQ5型全自动荧光实时定量PCR系统进行real-time PCR分析Hath6干涉效果。
从结果(如图5所示，横坐标为实验条件，纵坐标为表达量，Control为对照，Off-target表示脱靶对照，*表示与对照组和脱靶对照组相比均有显著性差异)可以看出，HP01能够增强siHath6的干涉效率。
实施例6、HP01能够增强siBeta-actin的干涉效率
一、Beta-actin基因的RNAi抑制
Hela细胞用胰酶消化后，以2×105个细胞/孔种于24孔板。设置2孔对照组，2孔siBeta-actin组。
取1μl/孔Lipofectamine2000(使用前轻轻摇匀)，用50μl Opti-MEM I ReducedSerum Medium稀释，轻轻混和后在室温孵育5min。取适量siBeta-actin(购自invitrogen公司，根据不同转染浓度取量，50nM为1.25μl/孔)，用50μl Opti-MEMI Reduced Serum Medium稀释，轻轻混和均匀；稀释的Lipofectamine2000经过5min的孵育后，与稀释siBeta-actin轻轻混和，室温静置20min，以形成siBeta-actin-转染试剂混和物。将siBeta-actin-转染试剂混和物加入含有细胞及Opti-MEM IReduced Serum Medium的孔中，轻轻摇晃孔板，使混和；在37℃的CO2培养箱中培养12小时后，换成含有10％血清的培养基，并在每组的一个孔中加入5μl的HP01(8mM)。
二、检测干涉前后Hela细胞中Beta-actin mRNA表达量的变化情况
37℃的CO2培养箱中培养72小时后，弃去培养基，每孔加入500μl的Trizol，将细胞转移至1.5ml的EP管中，加入100μl的氯仿，剧烈混匀，室温静置5min。4℃，12000转/min，离心15min。取上清，放入一新的EP管中，加入500μl预冷的异丙醇，4℃冰箱中放置10min；4℃，12000转/min，离心10min。弃去上清，加入1ml 75％乙醇，颠倒混匀；4℃，12000转/min，离心5min。弃去上清，超净台中干燥10min。用适量的DEPC水溶解，紫外分光光度仪测定浓度。
根据所测浓度取1μg的RNA，加入2μl的oligo(dT)，补1‰DEPC水至6μl，70℃恒温10min，冰浴2min。依次加入2μl 5×M-MLV Buffer，0.5μl dNTP，0.25μl Rnase Inhibitor，1μl RTase M-MLV，0.25μl的DEPC水。混匀后，42℃恒温1h，70℃恒温15min。得到的cDNA于-20℃冰箱中保存。
进行PCR反应，以GAPDH为内参，检测干涉前后Hela细胞中Beta-actin mRNA表达量的变化情况。PCR体系如下：
10×PCR Buffer   2μl，
dNTP Mix(2.5mM   1.6μl，
引物(上、下游)   1μl，
rTag聚合酶       0.2μl，
cDNA             1μl，
H2O              14.2μl，
总共             20μl。
PCR反应条件为：先95℃5min，然后(95℃30s，56℃30s，72℃30s)共25个循环，最后72℃延伸7min后冷至4℃。
PCR完毕后加入4μl 6×loading buffer，进行2％琼脂糖凝胶电泳。采用AlphaImageTM3300型凝胶成像仪附带软件对目的条带进行灰度扫描分析。
进行Real-time PCR，采用SYBR GREEN染料，美国Bio-Rad公司IQ5型全自动荧光实时定量PCR系统进行real-time PCR分析Beta-actin干涉效果。
从结果(如图6所示，横坐标为实验条件，纵坐标为表达量，Control为对照，*表示与对照组相比具有显著性差异)可以看出，HP01能够增强siBeta-actin的干涉效率。
以上实验以2-甲氨基-3-羧酸吡啶为例，验证了式I表示的化合物能提高RNA干涉效率。本发明用同样方法也验证了式I表示的其它化合物也具有类似效果，这里不再一一详述实验过程。

Claims (4)

1.2-甲氨基-3-羧酸吡啶在制备RNA干涉增强剂中的应用。
2.一种RNA干涉组合物，其特征在于：是将权利要求1所述化合物2-甲氨基-3-羧酸吡啶8-12mM加入0.5ml RNA干涉体系中。
3.根据权利要求2所述的RNA干涉组合物，其特征在于：所述RNA干涉体系包括转染有RNA干涉片段的细胞，含有10％血清的Opti-MEM IReduced Serum Medium 500μl。
4.根据权利要求2所述的RNA干涉组合物，其特征在于：所述RNA干涉体系包括转染有RNA干涉片段的细胞及完全培养基500μl。
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