CN101693918A - 一种提高核酸内切酶v切割位置特异性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法，涉及一种高通量DNA序列分析方法，特别是指一种快速低成本高通量DNA测序方法。在DNA探针中引入含有核酸内切酶V的识别位点脱氧次黄核苷dI和DNA链中一个或多个磷酸二酯键上的氧被硫代修饰的位点的单链寡核苷酸DNA片段，并且核酸内切酶V的识别位点和硫代修饰位点的相隔距离为二个或二个以上的碱基，该方法可以用于分析未知DNA即待分析的模板DNA的序列信息。由于重新杂交后的高通量引物是通过非常成熟的固相DNA方法合成并纯化得到，因此该方法没有错误延伸的累积效应，能够维持DNA模板和测序引物的量，序列的测定正确可靠，不存在测序长度的限制。

Description

一种提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法

技术领域

本发明涉及一种高通量DNA序列分析方法，特别是指一种快速低成本高通量DNA测序方法。属于生物技术领域。

背景技术

核酸(如DNA)包含着所有生物机体的蓝图，对核酸序列的研究对生命科学至关重要。随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在基础研究方面，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点：通过对于大量某一特定疾病的基因组样本中突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。通过基因组DNA序列的测定可以为理解生命的起源、疾病发生、以及个体化医疗等提供有用的相关核酸序列信息。

目前，新一代DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。新一代DNA测序技术，与现有的基于电泳的Sanger测序技术不同，主要采用延伸法和连接法测序等非电泳技术。即先用已知标记物标记的单体或者引物延伸(连接)，以形成的标记物确定第一次测序中的碱基序列，然后将第一次测序中的标记物清除，再进行下一次序列的测定，由此循环完成对模板序列的所有测定。因此标记物的有效清除就显得非常重要，因为标记物清除不彻底将导致标记物量的累积，给后续标记物量的确定带来困难，影响测序的长度和正确性；同时对标记物清除过程中是否对模板或者测序引物造成破坏也将大大影响测序的长度和正确性。

本发明将提出一种新的连接测序方法，即采用核酸内切酶V切割方法来清除杂交链接序列中荧光标记部分的方法。

核酸内切酶V是在E.coli中发现的一种DNA修复酶。它识别DNA中的脱氧次黄核苷，即脱氧腺苷的去氨基产物。核酸内切酶V，也称为脱氧次黄核苷3’内切酶，识别含脱氧次黄苷(无论配对与否)的双链或单链DNA。也可识别含脱碱基(AP)位点或尿素、碱基错配、插入/缺失错配、发夹结构、未配对loop环、折叠flaps和类-Y型结构的DNA，但是识别后者的能力不如前者。核酸内切酶V可以在距错配脱氧次黄苷第二个或第三个磷酸二酯键的3’端进行切割，切割第二个磷酸二酯键的效率是95％，第三个磷酸二酯键的效率是5％，产生一个3’羟基、5’磷酸的切口。利用该切口，进行后续的杂交连接反应，从而实现多个碱基的测定。

由于核酸内切酶V所识别DNA中的脱氧次黄核苷切割第二个磷酸二酯键的效率是95％，第三个磷酸二酯键的效率是5％。在测序过程中将会引入测序碱基位置的误差，并使测序的度受到很大的限制。提高核酸内切酶V切割位置特异性将会极大地提高DNA测序的正确性和测序长度。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法，由于重新杂交后的高通量引物是通过非常成熟的固相DNA方法合成并纯化得到，因此该方法没有错误延伸的累积效应，能够维持DNA模板和测序引物的量，序列的测定正确可靠，不存在测序长度的限制；另外，该方法按照流行的分子生物学方法进行，不存在技术难点。同时该方法具有双重纠正错误的能力。

技术方案：本发明的目的就是通过在前述能被切割的磷酸二酯键引入硫代修饰，从而达到抵制核酸内切酶V对该位置切割作用，使得核酸内切酶V切割位置的唯一性。含有该特点的测序引物，采用杂交-酶连接-酶切割的高通量测序技术。为全基因组DNA序列分析提供一种新方法，建立快速，准确，便宜的基因组序列测定技术。

本发明的提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法为：在DNA探针中引入含有核酸内切酶V的识别位点脱氧次黄核苷dI和DNA链中一个或多个磷酸二酯键上的氧被硫代修饰的位点的单链寡核苷酸DNA片段，并且核酸内切酶V的识别位点和硫代修饰位点的相隔距离为二个或二个以上的碱基，该方法可以用于分析未知DNA即待分析的模板DNA的序列信息。

单链寡核苷酸DNA片段上标记有荧光基团。

单链寡核苷酸DNA片段的使用方法为，将该片段与未知单链DNA模板即待分析的模板DNA杂交、与待分析的模板DNA上引物进行连接反应，并清除未连接的寡核苷酸序列片段，然后利用核酸内切酶V对连接产物进行切割。

单链寡核苷酸DNA片段被硫代修饰的磷酸二酯键可以一个或两个氧分别被硫取代。

单链寡核苷酸DNA片段序列中含有至少1个确定的碱基即在确定位置上分别含有A、G、C、T四种碱基之一，或者不同碱基的任意组合和若干个随机组合的能跟任意目标序列互补配对的简并碱基N即每个位置均包含能够与四个碱基互补配对的碱基组合构成。

单链寡核苷酸DNA片段，若干个简并碱基可用能够与正常碱基形成氢键的其它碱基或者碱基类似物构成。

待分析的模板DNA，通过化学或者物理方法固定在平面基片、“96、384孔板”或者各种修饰的珠子等载体上；未知单链DNA模板可以通过常规的PCR，滚环扩增、固相扩增、桥式扩增以及固相酶连接反应的方法增加其分析用数量，扩增是单重的，即一次扩增一个目的片断，或是多重的，即一次扩增多个目的片断。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1.本发明的最大优点是实现了DNA序列测定的标记物的定点有效切除，由于采用硫代修饰，使得核酸内切酶V切割位置准确、切割效率高，对模板和测序引物影响少，序列的测定正确可靠。

2.本发明的高通量测序引物由于确定的碱基可以置于任定的方法来增加序列测定的阅读长度。此外，该发明均按照流行的分子生物学方法何已知的位置，因此可以通过改变测序定位引物的方法先将某些特定位置碱基序列确进行，容易在现有的技术上实施。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明。

图1是本发明含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷DNA链及其酶切割位置示意图。

图中1为含脱氧次黄嘌呤(I)及硫代修饰(s)核苷的DNA链，2为能与该修饰核苷的DNA链互补的一条DNA链。由于硫代修饰可抵制内切切酶V的切割，所以第一个脱氧次黄嘌呤主要切割位置(第二和第三个碱基之间)不能发生切割反应，而第二个脱氧次黄嘌呤次要切割位置(第四和第五个碱基之间)也不能发生切割反应，能发生切割反应的位置是第三和第四个碱基之间，切割产物是5’磷酸要(P)，从而达到切割位置唯一性的目的。

图2是本发明两组标记的含双硫代核苷的寡核苷酸(测序引物)示意图。

图中寡核苷酸序列中的上标s表示硫代修饰的磷酸二酯键，I表示脱氧次黄嘌呤，F1、F2、F3、F4分别表示4种不同标记物(如Texas Red，Cy5，Cy3，Fam等)。碱基N表示四个碱基混合，n1，n2为自然数，最佳为3-12。在这两组(四个)硫代核苷测序引物中，除明确的碱基A(或者G、或者C、或者T)位置需要与模板序列中相应的碱基配对外，其余碱基均能与模板序列的碱基配对。

图3是本发明的序列测定方法示意图。图中有：测序定位引物1，未知DNA模板序列2，含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷测序引物3。测序定位引物(1)与固定的单链DNA模板(2)完成杂交，加入标记的一组含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷测序引物(3)完成杂交(a)，在连接酶的作用下，紧邻测序定位引物(2)的完全配对的含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷测序引物3-1与测序定位引物2完成连接反应(b)，通过清除未连接的含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷测序引物(3-2，3-3)，并扫描记录DNA模板本次杂交-连接列后出现的标记信号，实现对未知DNA模板的一个碱基T(第1个碱基)的测定(c)。重复上述过程，进行下一个碱基(第5个碱基、...)的测定(e)。

具体实施方式

本发明的含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷寡核苷酸片段(测序定位引物，或简称为引物)及其用于DNA序列测定方法。当测序定位引物与未知DNA模板完成杂交后，一组标记的含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷引物与所有未知DNA模板杂交，通过硫代核苷引物与测序定位引物的连接反应，同时清除未连接的硫代核苷引物，扫描记录该次不同位置上未知DNA模板给出的标记物信号，便可确定未知DNA模板上对应的碱基序列。由于该次连接的这段寡核苷酸序列中至少含有一个含硫代核苷，这个核苷在某些对正常核苷进行切割的酶的作用下不会被切割。利用这个特点可以将标记寡核苷酸序列选择性的切割将标记物清除以实现对下一个碱基的序列测定。

重复上述过程，每增加一次硫代核苷的标记寡核苷酸序列的杂交、连接，将增加DNA模板序列的一个碱基的阅读长度。

本发明是一种含硫代核苷引物及其用于DNA序列测定方法，DNA测序引物实际上是一组寡核苷酸序列，这组序列是所有测序模板的测序引物是一组含硫代核苷的标记寡核苷酸序列，当这组序列与未知单链DNA模板高通量平行杂交、连接反应，并清除未连接的标记寡核苷酸序列后实现对未知DNA模板的一个碱基测定，然后利用酶对正常核苷的切割、对含双硫代核苷的作用实现对含双硫代核苷标记寡核苷酸序列的标记物切割；重复上述过程，每增加一次含硫代核苷的标记寡核苷酸序列的杂交、连接，将增加DNA模板序列的一个碱基的阅读长度。

所述的含硫代核苷的标记寡核苷酸序列，这段寡核苷酸序列中至少含有一个含硫代核苷的，这个核苷在某些对正常核苷进行切割的酶的作用下不会被切割。利用这个特点可以将标记寡核苷酸序列选择性的切割将标记物清除以实现循环序列测定。

所述的含双硫代核苷的标记寡核苷酸序列，这段序列中含有一个明确的碱基和若干个简并碱基以N表示(既是每个N位置均包含能够与四个碱基杂交的碱基)构成，这样通过一组(一个明确的碱基的位置上分别含有A、G、C、T)含双硫代核苷的标记寡核苷酸序列，每个确定的碱基标记一种特定的标记物，即通过4次合成将得到4×4^N条标记序列，满足与所有未知DNA模板杂交的连接测序引物要求。

所述的含硫代核苷的标记寡核苷酸序列，硫代核苷在这段序列中的位置位于一个明确碱基位置之后，即酶切割不会切割到该碱基的位置。

所述的含硫代核苷的标记寡核苷酸序列，若干个碱基N的数目应尽可能小，最好一般为3-5个，这样可以提高测序引物的浓度。同时为了确保引物杂交的特异性，碱基N可以由除正常四个碱基(A、G、G、T)外、能与正常碱基形成氢键的其它碱基或者碱基类似物基团构成，如脱氧肌苷(I)、脱氧核糖、核糖、次黄嘌呤、甲基腺嘌呤、甲基鸟嘌呤等。

当高通量含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷测序引物实际上是一组(四个或者十六条)寡核苷酸序列，这组序列是所有测序模板的测序引物。当测序定位引物与未知DNA模板完成杂交后，加入标记的这组硫代核苷测序引物与未知DNA模板杂交，并在连接酶的作用下，将紧邻测序定位引物的，完全配对的含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷测序引物与测序定位引物完成连接，然后通过变性、清除未连接的含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷测序引物，并扫描记录DNA模板本次杂交-连接列后出现的标记信号，实现对未知DNA模板的一个碱基的测定。重复上述过程，每加入一组含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷测序引物就实现对未知DNA模板的下一个碱基的测定。

实例1：杂交-连接荧光标记序列法测定包含人全基因组。

将人基因组用酶切割(或者超声破碎)成大小为50-1000碱基的片断，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接(假定均为20个碱基)，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列与测序定位引物的相同。

将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的人全基因组。并将这些微珠固定到平板基片上，通过酶切或者变性得到人全基因组测序模板。

参照附图1、图2和图3，将测序定位引物与人全基因组测序模板杂交，然后将标记不同颜料的5’Cy3-IIsNNsNNAN 3’、5’Cy5-IIsNNsNNAN 3’、5’Texas Red-IIsNNsNNAN 3’、5’Fam-IIsNNsNNAN 3’与人全基因组测序模板完成杂交-连接，并在清除未连接的含脱氧次黄嘌呤及硫代核苷测序引物后，进行扫描分析，确定哪些位置的模板进行了哪些碱基的连接反应，从而确定基因组序列上第5个位置上碱基的序列。用内切酶V切处理，切除若干个碱基及荧光分子。重复上述过程，每重复一次便增加一个碱基的序列测定，直到因每个碱基的延伸效率导致不能准确碱基序列为止，这样便可以知道位置2、7、12、17、...、等位置的碱基序列；停止该次测序，将延伸上述测定若干个碱基序列的测序定位引物变性掉，并重新杂交3端比原来少一个碱基的测序定位引物，基于同样的道理可以测定1、6、11、16、...、等位置的碱基序列；依上述原理进行便可以将未知DNA模板的序列确定。

Claims (7)

1.一种提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法，其特征在于在DNA探针中引入含有核酸内切酶V的识别位点脱氧次黄核苷dI和DNA链中一个或多个磷酸二酯键上的氧被硫代修饰的位点的单链寡核苷酸DNA片段，并且核酸内切酶V的识别位点和硫代修饰位点的相隔距离为二个或二个以上的碱基，该方法可以用于分析未知DNA即待分析的模板DNA的序列信息。

2.根据权利要求1所述的提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法，其特征在于单链寡核苷酸DNA片段上标记有荧光基团。

3.根据权利要求1所述的提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法，其特征在于单链寡核苷酸DNA片段的使用方法为，将该片段与未知单链DNA模板即待分析的模板DNA杂交、与待分析的模板DNA上引物进行连接反应，并清除未连接的寡核苷酸序列片段，然后利用核酸内切酶V对连接产物进行切割。

4.根据权利要求1所述的提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法，其特征在于单链寡核苷酸DNA片段被硫代修饰的磷酸二酯键可以一个或两个氧分别被硫取代。

5.根据权利要求1所述的提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法，其特征在于单链寡核苷酸DNA片段序列中含有至少1个确定的碱基即在确定位置上分别含有A、G、C、T四种碱基之一，或者不同碱基的任意组合和若干个随机组合的能跟任意目标序列互补配对的简并碱基N即每个位置均包含能够与四个碱基互补配对的碱基组合构成。

6.根据权利要求1或5所述的提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法，其特征在于单链寡核苷酸DNA片段，若干个简并碱基可用能够与正常碱基形成氢键的其它碱基或者碱基类似物构成。

7.根据权利要求1或3所述的提高核酸内切酶V切割位置特异性的方法，其特征在于待分析的模板DNA，通过化学或者物理方法固定在平面基片、“96、384孔板”或者各种修饰的珠子等载体上；未知单链DNA模板可以通过常规的PCR，滚环扩增、固相扩增、桥式扩增以及固相酶连接反应的方法增加其分析用数量，扩增是单重的，即一次扩增一个目的片断，或是多重的，即一次扩增多个目的片断。

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