CN101652473A - 新颖的赖氨酰氧化酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经分离的赖氨酰氧化酶，其能够催化蛋白质或肽中赖氨酰基成为相应醛的氧化脱氨反应，随后将O2还原为H2O2，其中所述赖氨酰氧化酶(a)显示：针对Ac－Gly－Lys－OMe的赖氨酰氧化酶活性和针对苄胺的赖氨酰氧化酶活性之间的比例至少为1.1，优选地至少为1.3，更优选地至少为1.4，其中所述活性在37℃和7.0的pH下测定；和(b)在0和60℃之间的温度下具有最适活性。

Description

新颖的赖氨酰氧化酶
发明领域
本发明涉及新颖的氧化酶。
发明背景
赖氨酰氧化酶
胺氧化酶形成了一个异质的酶家族，其催化从伯胺底物到活性醛的氧化。根据其辅因子的性质将酶分为两组。黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是下述酶的辅因子，所述酶为单胺氧化酶A和B以及多胺氧化酶的细胞内形式(Csiszar，Progr.Nucl Ac Res and Mol Biol(2001)，70，1-32)。第二组胺氧化酶含有经修饰的酪氨酸侧链——醌用作辅因子(Wang et al，Science(1996)273，1078-1084)。赖氨酰氧化酶(LOX)属于该胺氧化酶亚家族。
胺氧化酶催化伯胺、仲胺和叔胺成为相应醛的氧化脱氨反应，随后将O2还原为H2O2，如下文所示：
RCH2NH3 ++O2→RCHO+NH4 ++H2O2
在哺乳动物中发现的胺落入上述两组中，黄素依赖型单胺氧化酶(MAOs)和含醌的铜胺氧化酶(CuAOs)(Duff et al，Biochem(2003)42，15148-15157)。MAO事实上排他地存在于所有细胞类型的线粒体外膜上，并且参与伯胺、仲胺和叔胺的降解和若干神经递质的氧化。人们相信MAO通过单电子转移或通过协同的共价催化基质发挥作用，二者均涉及FAD辅因子(Duff et al，Biochem(2003)42，15148-15157和其中引用的参考文献)。含喹啉的CuAO看起来排他地涉及伯胺的氧化脱氨反应。可以根据活性位点中存在的醌辅因子的类型：topa醌(TPQ)或赖氨酰酪氨酰醌(LYQ)将这些酶分为两类。后一类酶(已知为赖氨酰氧化酶)早已知为通过催化肽基赖氨酸侧链的决定性脱氨反应而与结缔组织形成相关，所述脱氨反应起始胶原和弹性蛋白中赖氨酸残基的交联(Csiszar，Progr.Nucl Ac Res and Mol Biol(2001)，70，1-32)。尽管尚未检查LTQ-因子的生物合成，但是TPQ生物合成已例如使用多重捕获的晶体结构被广泛地研究(Duff et al，Biochem(2003)42，15148-15157)。赖氨酸残基到TPQ的转化仅需要脱辅基-未加工的酶(apo-unprocessed enzyme)、铜和分子氧。被修饰的酪氨酸存在于保守的活性位点共有序列Asn-Tyr-Asp/Glu中(Mu et al，J Biol Chem(1992)267，7979-7982)。
CuAO的催化通过乒乓机制(ping-pong mechanism)进行(Wilmot et al，Science(1999)286，1724-1728)。关键步骤是起始醌亚胺(quinoneimine)到醌醛亚胺(quinoaldimine)的转化，这通过作用于广义碱(general base)的绝对保守的天冬氨酸从底物α-碳上脱去质子完成。水解引起醛产物的释放，得到与Cu(I)-半醌平衡的Cu(II)-氨基间苯二酚，所述Cu(II)-氨基间苯二酚随后与分子氧反应，产生H2O2和亚胺基醌。后者随后被水解，释放NH4 +并将辅因子恢复为休眠状态。
含TPQ的CuAO广泛分布于自然界中，并且已从哺乳动物、植物和微生物中纯化。它们涉及许多短链到长链脂肪族单胺和二胺的氧化，包括若干芳香族胺的氧化(Duff et al，Biochem(2003)42，15148-15157)。在微生物中，它们在利用伯胺作为氮或碳的唯一来源中具有营养学作用。高等生物中胺氧化酶的作用不清楚。针对植物和哺乳动物中的这些酶提出了若干作用，例如创伤愈合、降低毒胺浓度、细胞生长、信号转导和粘附。
已经在大范围的动物组织和微生物中观察到了金属离子对金属蛋白的诱导(Rayton & Harris，J Biol Chem(1979)254，621-626)。该原则之后被Haywood和Large(Biochem J(1981)199，187-201)使用，在含有胺作为唯一氮源的培养基上生长时帮助诱导微生物胺氧化酶的表达。它们能够在Candida boidinii中诱导两种胺氧化酶的表达。两种胺氧化酶的存在似乎在酵母中是普遍的(Kuchar & Dooley，J Inorg Biochem(2001)83，193-204)。它们纯化了相应的酶并显示其在底物特异性方面不同。所述酶被称作甲胺氧化酶和苄胺氧化酶。随后以相似的方式显示酵母Pichia pastoris也含有两种胺氧化酶(Green et al，Biochem J(1983)211，481-493)。Tur & Lerch进一步表征了苄胺氧化酶(FEBS Letters(1988)238，74-76)。他们证明氧化酶含有醌基、铜原子并且所述酶具有广阔的底物特异性。使用赖氨酸、模型肽、弹性蛋白和胶原作为底物时，它们显示氧化酶具有重大的赖氨酰-氧化酶活性。根据使用β-氨基丙腈的抑制研究，他们提出所述酶是铜赖氨酰氧化酶(E.C.1.4.3.13)。从此时起所述酶被称作赖氨酰氧化酶。Dove et al(FEBS Letters(1996)398，231-234)显示所述铜赖氨酰氧化酶含有TPQ作为辅因子，这使其区别于均为哺乳动物并含有LTQ作为辅因子的赖氨酰氧化酶。Kuchar & Dooley(J Inorg Biochem(2001)83，193-204)将该酶克隆、测序并进一步表征。他们能够将细胞内酶过表达至每升10mg，使其成为被成功地过表达的第一种赖氨酰氧化酶。他们证实每个每分子存在1个铜离子并且存在TPQ辅因子。他们还将所述工作扩展至酶的底物特异性，显示其有些类似哺乳动物氧化酶并且能够在肽中氧化赖氨酸残基。然而，来自Pichia pastoris的赖氨酸氧化酶具有与哺乳动物酶相比广阔得多的底物特异性(Kuchar & Dooley，J Inorg Biochem(2001)83，193-204)。酶显示非常低的对其它胺氧化酶的序列同源性。与人肾二胺氧化酶具有最高的同源性(50％相似性，30％同一性)。与其它胺氧化酶的序列比较显示仅29个残基是绝对保守的，包括TPQ共有序列(Thr-Xxx-Xxx-Asn-Tyr-Glu/Asp-Tyr，其中Xxx是二十个天然氨基酸之任一)中的那些，和与铜原子复合的三个组氨酸。
已测定了来自于Escherichia coli(Parsons et al，Structure(1995)3，1171-1184)、Pisum savitum(Kumar et al，Structure(1996)4，943-955)、Hansenulapolymorpha(Li et al，Structure(1998)6，293-307)、Arthrobacter globiformis(Wilce et al，Biochemistry(1997)36，16116-16133)和Pichia pastoris(Duff etal，Biochem(2003)42，15148-15157；Duff et al，Acta crystallogr D Biolcrystallogr(2006)62，1073-1084)的五种胺氧化酶的三维结构。Pichia酶是唯一的赖氨酰氧化酶。它们的结构是相似的，显示分别称作D1、D2、D3和D4的四种结构域。D1-结构域仅在E coli酶中观察到，但是被提出同样存在于Pichia-酶中。活性位点位于大的核心结构域D4中，较小的D3和D2结构域处于D4结构域的N-端。酶作为二聚体结晶。罕见的是在两个D4结构域之间二聚体的内部存在大的由溶剂填充的空腔，称作湖(lake)。每个亚基中的铜位点退回湖上，TPQ辅因子位于铜原子的远侧。长且狭窄的通道将TPQ与外部溶剂连接在一起(Duff et al，Biochem(2003)42，15148-15157)。通向活性位点的该通道在Pichia酶中尤其宽阔，其中所述通道在其入口处含有酸性残基序列Asp-Asp-Glu-Thr-Glu-Glu。认为这些残基有助于带电的赖氨酸氨基通过静电相互作用进入。沿通道进一步向下变得更加疏水，促进赖氨酸基团去质子化成为中性胺形式，其可随后在活性位点中被氧化。活性位点包含与三个组氨酸(res nr 528、530和694)和与O4 foTPQ(res nr 478)协调的铜原子。活性位点中Asp398的位置与提出的该残基作为完全保守的催化基础的作用一致。
若干年来，来自Pichia pastoris的赖氨酰氧化酶是唯一已知的微生物赖氨酰氧化酶。然而，EP1 466 979描述了衍生自Aspergillus oryzae的胺氧化酶的发现，其被称作赖氨酰氧化酶。该申请的申请人使用Aspergillusoryzae的基因组筛选赖氨酰氧化酶，并且描述了对下述基因的发现，所述基因被他们表征为与来自Pichia pastoris的已知基因高度同源。专利说明书未阐明什么是被认为高度同源的。我们对来自Pichia pastoris和Aspergillus oryzae的序列进行了序列比对，并惊人地发现仅有35％的同一性，这通常不被认为是高同源性。60％、优选地70％、更优选地80％和更高的百分比会被认为是高度同源性。另外，来自Aspergillus oryzae的赖氨酰氧化酶出乎意料地在若干个重要位置上与其它赖氨酰氧化酶和胺氧化酶不同：例如EP 1 466 979中所述Asperillus oryzae基因的经注释的蛋白质(SEQ_ID NO：2)的164位是丙氨酸，而在所有其它所述胺氧化酶和赖氨酰氧化酶中，该位置是高度保守的脯氨酸。另外，该被注释的蛋白质中第78位是甲硫氨酸，而在胺氧化酶中该位置处的亮氨酸是高度保守的。另外，EP 1 466 979中所述蛋白质与哺乳动物和Pichia赖氨酰氧化酶相比时在残基109后含有2个氨基酸的额外插入。另外，EP 1 466 979中所述蛋白质中的499位是苏氨酸，尽管该位置在其它胺氧化酶中总是疏水残基。蛋白质中保守的位置通常与酶的主要功能相关，并且不能在不改变酶催化活性的前体下改变它们。值得注意的是，在该具体的赖氨酰氧化酶中，这类保守残基中若干被修饰，并且预计认为它们对酶活性有影响。
通过在基因组中随机插入基因，在Aspergillus nidulans中克隆所述基因。申请人指出，也可以使用其它菌株例如Aspergillus niger和Aspergillusoryzae代替A.nidulans。惊人的是，EP1 466 979中描述了当赖氨酰氧化酶被过表达时可在一些转化体的培养液中测量赖氨酰氧化酶活性，这与属于胞内酶的Pichia pastoris酶相反。显然，来自Aspergillus oryzae的赖氨酰氧化酶是分泌型酶。通过活性测量确立酶的存在。为了表征赖氨酰氧化酶(E.C.1.4.3.13)及其与赖氨酸氧化酶(E.C.1.4.3.14)的差异，使用正确的底物是非常重要的。EP1 466 979(所述专利中的实施例11)中针对赖氨酰氧化酶所述的测定使用赖氨酸作为唯一的底物。该氨基酸具有两个游离的氨基，一个在Cα原子上，一个在Cε原子的赖氨酸侧链中。赖氨酸氧化酶仅氧化后者，留下其它的基团未被修饰。这可以通过使用其中α-氨基通过例如乙酰化被封闭的赖氨酸底物确定。这类底物对于赖氨酰氧化酶的适当鉴定是关键性的，并且非常普遍地用于这类酶的表征中(见例如Kuchar &Dooley，J Inorg Biochem(2001)83，193-204)。因为这类底物未在EP1 466979中使用，因此不可能从EP1 466 979中提供的数据中得出发现的酶活性事实上是赖氨酰氧化酶活性的结论。酶可以是赖氨酸氧化酶(E.C.1.4.3.14；L-赖氨酸：氧2-氧化还原酶)而不是赖氨酰氧化酶(E.C.1.4.3.13，蛋白质-L-赖氨酸：氧6-氧化还原酶)。另外，测量到的活性相当低，仅为未经转化的菌株背景活性的数倍(EP1 466 979，实施例11)。为了阐明该问题，我们尝试在Aspergillus niger中过表达SEQ IDNO：2(EP 1 466 979)的蛋白质(本申请的实施例1)。根据EP1 466 979，Aspergillus niger对赖氨酰氧化酶而言是一种优选的表达生物。我们不能从测试的所有转化体的培养液中分离或者以其它方式证明活性赖氨酰氧化酶。考虑到上文公开的争论，与本申请实施例1和2中所述的实验工作组合，EP1 466 979不太可能描述功能性赖氨酰氧化酶的鉴定。EP1 466 979也未描述纯化酶的尝试，而是用粗制发酵上清液进行活性测量，所述粗制发酵上清液可能含有多种未明确的酶活性。另外，并非EP 1 466 979中所述的所有转化体与未经转化的菌株相比都显示提高的活性。因此值得怀疑，EP 1 466 979中所述的蛋白质序列是否的确正确并且编码功能性赖氨酰氧化酶。因此在EP 1 466 979的一些转化体中测量的氧化酶活性可能不归因于所述基因的过表达，而是由背景胺氧化酶活性的存在引起。惊人的是在对照菌株的培养基中添加了可观量的精氨酸(EP1 466 979，实施例11)。已知可通过含胍的化合物例如精氨酸抑制胺氧化酶(Kuchar &Dooley，J Inorg Biochem(2001)83，193-204)，并且精氨酸含有这类胍基。万一空菌株会产生少量胺氧化酶活性，则可通过培养基中存在的精氨酸将其抑制。如果情况如此，则应当在不是良好对照的装置(set-up)中测试空菌株，因为背景会被人工地降低。在该情况下，这会是报道的转化体低活性的原因，所述转化体低活性仅显示为背景活性的数倍。该低活性可能是不存在精氨酸时观察到的常规背景活性。
上文所有内容表明赖氨酰氧化酶是已知的，但是从未在细胞外生产过赖氨酰氧化酶。Pichia赖氨酰氧化酶是细胞内酶，并且仅以10mg/ml的水平生产(Kuchar & Dooley，J Inorg Biochem(2001)193-204)。另外，酶必须从细胞中释放，这使得以工业规模加工酶复杂而且没有吸引力。因为其它赖氨酰氧化酶也未被过量生产至经济上感兴趣的表达水平，所以对可以大量(克每升)生产的细胞外赖氨酰氧化酶仍然存在需要。
从经济学观点来看，对下述改进手段存在明显的需要，与Pichiapastoris酶和所谓的Aspergillus oryzae酶的差生产力相比，所述手段能以大量并以相对纯净的形式生产赖氨酰氧化酶。实现此的一个优选的方式是使用重组DNA技术过量生产这样的赖氨酰氧化酶。实现此的一种尤其优选的方式是过量生产来自真菌的赖氨酰氧化酶，实现此的一种最优选的方式是过量生产来自Aspergillus的赖氨酰氧化酶。为了能够实现后一生产途径，来自Aspergillus的赖氨酰氧化酶的特有序列信息是必需的。更优选必须获得编码基因的整个核苷酸序列。
大量并以相对纯净形式生产新鉴定的分泌型赖氨酰氧化酶的一种改进手段是使用重组DNA技术过量生产Aspergillus编码的酶。实现此做的一种优选的方式是在食物级别宿主微生物中过量生产这类分泌型赖氨酰氧化酶。公知的食物级别微生物包括Aspergilli、Trichoderma、Streptomyces、Bacilli和酵母例如Saccharomyces和Kluyveromyces。这样做的一种进一步更优选的方式是在食物级别真菌例如Aspergillus中过量生产来自Aspergillus的分泌型赖氨酰氧化酶。最优选的是在食物级别真菌中过量生产分泌型赖氨酰氧化酶，其中赖氨酰氧化酶编码基因的密码子选择已针对使用的食物级别表达宿主被优化。通常，为了能够进行后一优化途径，需要分泌型赖氨酰氧化酶的特有序列信息。更优选必须获得赖氨酰氧化酶编码基因的整个核苷酸序列。一旦编码分泌型赖氨酰氧化酶的基因在优选的宿主中被转化，则选择的菌株可被用于发酵，并从发酵液中分离分泌型赖氨酰氧化酶。
一旦可以大量并以相对纯净的形式获得新颖的酶，则能够以食物级别和经济的方式生产具有改进的构造(texture)的食物蛋白质或水解产物。
能够催化共价蛋白质交联物形成的酶是罕见的。一个例子是巯基氧化酶类蛋白质，其能够催化蛋白质之间二硫键的形成。然而，这些酶的可应用性根本上是有限的，因为蛋白质中游离巯基的存在有限。特别地，食物蛋白质在加工期间(例如干燥期间)被频繁地施加氧化条件，这常常导致可用的巯基的氧化。然而在一些应用例如面包中，二硫键形成和二硫键再改组(reshuffling)与适当的构造形成是高度相关的。
另一类公知的交联酶蛋白质是转谷氨酰胺酶，其能够通过赖氨酸和谷氨酰胺残基催化蛋白质之间共价交联的形成。转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)催化酰基转移反应，其中肽键合的谷氨酰胺残基的γ-氨甲酰是酰基供体。来自Streptoverticillium mobaraense的微生物转谷氨酰胺酶可以商品名Activa TG(Ajinomoto，日本)商业获得，而且来自血的转谷氨酰胺酶也是可商业获得的(商品名：Harimex)。转谷氨酰胺酶已被用于催化下述蛋白质的交联：乳清蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、牛肉肌球蛋白、酪蛋白和从机械脱骨的家禽肉精制得到的粗制肌动球蛋白(Zhu et al，Appl MicrobiolBiotechnol(1995)44，277-282)。还描述了转谷氨酰胺酶用于鱼制品、肉替代物和备选物、(经加工的)乳酪制品、米饭、面条、酸奶和(冷冻)乳制品中的用途。转谷氨酰胺酶应用的例子在以下专利中描述过：JP09206006(米饭)、JP09154512(面条)、JP092060031(鱼)、JP08224063(蛋白质凝胶)、JP08112071(豆腐)、JP08056597(油煎后良好的脆性)、JP07184554(冰激凌)、WO 9520662A(日本牡蛎)、JP06261712(螃蟹)、EP 610649(酸奶)、JP06153827(米)、WO9319610(乳)、JP02131537(乳酪)。通常目的是修饰食物构造，但是其也被用于例如提高乳酪产量。(微生物)转谷氨酰胺酶的一个缺点是其相对高的热稳定性，这使其在常规食物加工条件例如巴氏消毒、灭菌或超高热处理下难以完全失活。在70℃下，酶失活需要15分钟，在75℃下仍然需要5分钟(产物信息表Activa TG，Ajinomoto)。正常的巴氏消毒时间为72℃下15-30秒，这比转谷氨酰胺酶失活所需的时间短得多。由于食物规程，转谷氨酰胺酶的失活是必需的。对许多食物应用而言不期望在提高的温度下长时间加热，因为这导致由例如麦拉德反应引起的不期望的异味(off flavor)和杂色(off color)形成。若干其它酶种类已被描述为可用于获得蛋白质交联物，包括脂氧合酶、蛋白质二硫键异构酶、酚氧化酶、过氧化物酶、蛋白质二硫键还原酶和酪氨酸氧化酶。蛋白质交联酶的底物的例子包括衍生自动物或植物来源的所有蛋白质，例如明胶、乳蛋白质例如乳清和酪蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、谷蛋白、玉米蛋白、豌豆蛋白和胶原。
有一些专利描述了赖氨酰氧化酶的用途。JP02245166和JP04094670描述了赖氨酰氧化酶修饰鱼蛋白质用于鱼糊剂(fish paste)的用途。DE1940069描述了用于活性物质的交联的蛋白质涂层的制造，其中赖氨酰氧化酶被用于获得蛋白质交联。JP007825描述了蛋白质片层模型材料的制备，其中赖氨酰氧化酶被描述为交联蛋白质的可能方式。WO200307728描述了用酶交联的真菌蛋白质制备素食者食品，其中转谷氨酰胺酶、蛋白质二硫键异构酶、巯基氧化酶、若干多苯基氧化酶、赖氨酰氧化酶、过氧化物酶和脂氧合酶被描述为可能交联酶或真菌蛋白质。WO2004105485描述了缓释颗粒的制备，其中提到了赖氨酰氧化酶用于蛋白质交联的可能用途。这些例子证明和支持了赖氨酰氧化酶的工业用途。
发明内容
惊人地发现：5个氨基酸基序的简单组合能够鉴定一类新颖的具有特有特性的分泌型微生物赖氨酰氧化酶。本发明的赖氨酰氧化酶的种类是独特的，因为它们是分泌型的，并且因为它们对肽或蛋白质中赖氨酰残基中的氨基具有超过低分子量底物(例如苄胺和色胺)中氨基的偏好。
另外，本发明提供了：
(1)Aspergillus nidulans、Cryptococcus neoformans、Podospora anserina和Fusarium graminearum的赖氨酰氧化酶；
(2)含有以下氨基酸基序的赖氨酰氧化酶(括号中的残基指出该点处允许的简并，氨基酸用单字母代码表示)：I-H-D-[NS]-L-S-G-S-M-H-D-H-V-[IL]-N-F-K(SEQ_ID NO：11)；
(3)编码(1)或(2)的赖氨酰氧化酶的DNA序列；
(4)包含(3)的DNA序列的表达载体；
(5)包含(4)的表达载体的宿主细胞；和
(6)鉴定新颖构造和提高产量的酶的工艺，包括针对来自(2)的基序的存在来筛选氨基酸序列。
(7)制备活性蛋白质中间产物的工艺，所述中间产物可以通过加热步骤形成蛋白质凝胶而被失活。
本发明的赖氨酰氧化酶能够催化蛋白质或肽中赖氨酰基成为相应醛的氧化脱氨反应，随后将O2还原为H2O2，并被有利地用于食物、饲料或营养药物制品或其中间产物的制备中。
因此，本发明提供了一种赖氨酰氧化酶，其能够催化蛋白质或肽中赖氨酰基成为相应醛的氧化脱氨反应，随后将O2还原为H2O2，其中所述赖氨酰氧化酶
(a)显示出：针对Ac-Gly-Lys-OMe的赖氨酰氧化酶活性和针对苄胺的赖氨酰氧化酶活性之间的比例至少为1.1，优选地至少为1.3，更优选地至少为1.4，其中所述活性在37℃和7.0的pH下测定；和
(b)在0和60℃之间的温度下具有最适活性，
还提供了所述赖氨酰氧化酶在食物、饲料或营养药物制品或其中间产物的制备中的优选用途。
根据另一方面，本发明提供了能够催化蛋白质或肽中赖氨酰基成为相应醛的氧化脱氨反应，随后将O2还原为H2O2的赖氨酰氧化酶，其中所述赖氨酰氧化酶包含以下的氨基酸基序(括号中的残基指出该点处允许的简并，氨基酸用单字母代码表示)：
-I H D[N S]L S G S M H D H V[IL]N F K，
还提供了所述赖氨酰氧化酶在食物、饲料或营养药物制品或其中间产物的制备中的优选用途。
本发明的另一方面提供了具有赖氨酰氧化酶活性的多肽，所述多肽选自由以下组成的组：
(a)具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1到4任一项的整个氨基酸序列具有至少60％的氨基酸序列同一性；
(b)由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在低严格度条件下与(i)SEQ ID NO：6的核酸序列或(ii)与SEQ ID NO：6的核酸序列互补的核酸序列。
赖氨酰氧化酶被有利地用于制备食物或饲料或营养药物或用于制备下述中间产物，所述中间产物用于制备食物或饲料或营养药物。
根据本发明的又一方面，提供了用于生产赖氨酰氧化酶的下述方法，所述方法包括：在适合生产赖氨酰氧化酶的条件下，培养包含下述核酸构建体的宿主细胞，以及回收赖氨酰氧化酶，所述核酸构建体包含编码赖氨酰氧化酶的多核苷酸，所述赖氨酰氧化酶包含下述氨基酸序列：
-I H D[N S]L S G S M H D H V[IL]N F K。
本发明还涉及鉴定新颖的赖氨酰氧化酶的方法，包括针对下述氨基酸序列的存在筛选氨基酸序列：
-I H D[N S]L S G S M H D H V[IL]N F K。
另外，本发明提供了修饰含有蛋白质或肽的食物或饲料制品的方法，所述方法包括通过将食物或饲料制品与本发明的赖氨酰氧化酶或本发明的赖氨酰氧化酶组合物接触来修饰所述食物或饲料制品。
本文中使用的氨基酸单字母代码是本领域普遍已知的，并可见于例如Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboraory Manual，2nd，ed.ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)中。
本发明的一个方面是使用本发明的序列时过表达分泌型赖氨酰氧化酶。另外，我们提供了可用于鉴定和选择来自不同真菌的活性分泌型赖氨酰氧化酶的序列基序。使用该途径，我们能够选择和表达来自Aspergillusnidulans、Fusarium graminearum、Podospora anserina和Cryptococcusneoformans的赖氨酰氧化酶。
在食物工业中常规使用的巴氏消毒过程中，本发明的赖氨酰氧化酶会被失活。
巴氏消毒处理可以在至少75℃的温度下，优选地在至少80℃的温度下进行。在一个实施方案中，热处理在75℃和145℃之间的温度下进行，在一个优选的实施方案中，热处理在75℃和120℃之间的温度下进行，在一个更优选的实施方案中，热处理在75℃和100℃之间的温度下进行，在一个进一步更优选的实施方案中，热处理在80℃和90℃之间进行。热处理的持续时间可以是适合达到赖氨酰氧化酶失活的任何时间。在一个实施方案中，热处理的持续时间在1秒和30分钟之间。在一个实施方案中，热处理在75℃到90℃下进行5秒到30分钟，在另一实施方案中，热处理在80℃到90℃之间进行2秒到30分钟，还在又一实施方案中，热处理在80℃到145℃下进行1秒到20分钟。热处理可通过本领域已知的任何方法进行。
根据本发明的另一方面，用蛋白质孵育的本发明的酶导致蛋白质凝胶构造的修饰。该修饰在新颖的两步过程中获得。在第一步中，用赖氨酰氧化酶处理蛋白质。在第二步中获得交联，其中蛋白质被加热到至少75℃，优选地80℃。在交联之前，蛋白质可任选地被超滤，或在不导致大量(＜1％)蛋白质交联的温度条件下干燥。干燥温度优选地低于60℃，更优选地低于50℃，最优选地低于40℃。热处理可与用于使酶失活的热处理一致。得到的交联的蛋白质可被用作食物和饲料中的成分并改进其构造。
根据本发明的另一方面，本发明的酶与蛋白质孵育时导致蛋白质凝胶构造的修饰。
本发明还提供了用于在蛋白质或肽中制备活性醛的工艺，所述工艺包括通过赖氨酰氧化酶将蛋白质或肽氧化脱氨，并优选地浓缩和/或干燥含有活性醛的蛋白质或肽。
另外，本发明提供了制备交联的蛋白质或肽的方法，所述方法包括处理(优选地通过加热处理)包含活性醛的蛋白质或肽，从而交联蛋白质或肽。
根据本发明的另一方面提供了蛋白质或肽，所述蛋白质或肽包含通过蛋白质赖氨酰胺的氧化脱氨形成的活性醛，并且优选地为干燥的形式。
发明详述
“肽”或“寡肽”在本文中定义为通过肽键连接的至少两个氨基酸的链。术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如普遍所认为的)，并且每个术语可根据上下文的需要可互换使用。
“多肽”在本文中被定义为由多于30个氨基酸残基组成的链。根据通常的实践，本文中所有的(寡)肽和多肽式和序列从左到右按照氨基端到羧基端的方向书写。本文使用的氨基酸的单字母代码是本领域普遍已知的，并见于例如Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)中。
乳蛋白表示乳、脱脂乳、无脂乳、酪乳、酸奶、在水中溶解至期望的蛋白质浓度的乳粉、在水中溶解至期望的蛋白质浓度的酪蛋白酸盐(任选地含有乳清蛋白)、来自κ-酪蛋白的配糖巨肽(GMP)的溶液或其组合。
水解产物表示通过蛋白质的水解形成的产物(或简单地称作蛋白质水解产物或经水解的蛋白质)，可溶于酸的水解产物是蛋白质水解产物的可溶级分，其在本文中也被描述为含可溶肽的组合物或包含可溶肽的组合物，或是蛋白质水解产物和可溶于酸的水解产物的混合物。
本文使用的术语营养药物表示在营养和药物应用领域二者中的有用性。因此，包含本发明组合物的新颖的营养药物组合物可用作食物和饮料的补剂，或作为药物配制物或药物用于肠内或肠胃外应用，其可以是固体配制物例如胶囊或片剂，或液体配制物例如溶液、悬浮液或乳剂。
用于根据本发明的交联的合适底物为蛋白质、肽、水解产物、经修饰的蛋白质或肽和具有胺功能性的其它化合物。
上文所述的交联酶在蛋白质分子之间建立共价键。酶转谷氨酰胺酶直接使用谷氨酰胺和赖氨酸残基催化键形成。转谷氨酰胺酶作用的效果通常是立即可见的，例如显示为粘度的提高或改进的紧致度(改进的构造)，(见例如Technical information by Ajinomoto：
Figure A20088000927800161
WM，Das enzym mitbiss；Thought TNO newletter，TNO Research Institute，Netherlands，No 25，October 1998，page 3)，并且不需要进一步加工步骤来获得交联。例如使用巯基氧化酶或产过氧化氢酶的其它酶交联策略也导致蛋白质交联而不需要进一步的加工步骤。同样也对赖氨酰氧化酶也进行了说明，所述赖氨酰氧化酶通过对蛋白质中赖氨酸残基的作用而产生了活性醛功能，这些被修饰的蛋白质的应用描述于例如EP 0988859中。在该专利申请中，描述了赖氨酰氧化酶用于获得蛋白质交联的用途。作者明确地指出，经修饰的蛋白质应当在低于80℃，优选地低于60℃的温度下处理。显然，热处理不必须获得蛋白质连接。在相似条件下与非交联的蛋白质相比，交联的蛋白质的溶液通常显示提高的粘度和提高的水结合能力。当交联的蛋白质在从成分供应商运输给用户如食物加工商之前需要被进一步加工时，这是一个缺点。因为含交联蛋白质的溶液的高粘度，交联的蛋白质更难以处理并且更难以加工(例如过滤)；处理交联的蛋白质时其它加工步骤例如干燥也变得更加困难和昂贵。与未交联的蛋白质相比，交联的蛋白质的干燥过程耗费更多能量，因为其具有更好的水结合能力。会感兴趣的是能够从起始蛋白质底物制备活性蛋白质中间产物，所述起始蛋白质底物在需要时在所述应用中容易交联。这会预防在成分制造商处形成粘稠并与水高度结合的制剂，从而预防过量的操作成本和处理。活性蛋白质中间产物需要起始蛋白质底物的修饰(功能化)。在本专利申请中我们显示，用本申请中的赖氨酰氧化酶修饰的蛋白质惊人地具有这类活性蛋白质中间产物的特征。蛋白质例如用赖氨酰氧化酶修饰的乳清蛋白和酪蛋白不显示提高的粘度。随后加热功能化的蛋白质时，活性蛋白质中间产物形成蛋白质交联物，导致提高的蛋白质溶液粘度和提高的构造。
如上所述，文献中已描述了若干种赖氨酰氧化酶。它们中大部分来自于哺乳动物来源，并且由于其较差的溶解度特征而未以高水平被过表达(Kuchar & Dooley，J Inorg Biochem(2001)83，193-204)。另外，来自Pichiapastoris的赖氨酰氧化酶表达较差(10mg/L，Kuchar & Dooley，J InorgBiochem(2001)83，193-204)，并且该酶也是细胞内生产的。EP 1 466 979描述了一种所谓的赖氨酰氧化酶，但是我们在上文中已经争辩了我们为何相信这不是赖氨酰氧化酶。另外，我们在实施例1中证明EP 1 466 979中所述赖氨酰氧化酶(所述专利中的SEQ_ID NO：2)的克隆和表达不导致赖氨酰氧化酶活性的产生。
我们已惊人地发现，含有氨基酸序列基序SEQ_ID NO：11的多肽编码活性真菌赖氨酰氧化酶，所述酶从细胞中分泌至培养基中。我们提供了这类赖氨酰氧化酶的四个例子。赖氨酰氧化酶ZGR的序列得自Aspergillusnidulans(SEQ_ID NO 1和6分别编码编码该蛋白质的氨基酸序列和合成基因)；赖氨酰氧化酶ZGT得自Cryptococcus neoformans(SEQ_ID NO 2和7分别编码编码该蛋白质的氨基酸序列和合成基因)；赖氨酰氧化酶GLO1得自Fusarium graminearum(SEQ_ID NO 3和8分别编码编码该蛋白质的氨基酸序列和基因组DNA序列)；赖氨酰氧化酶ZGY得自Podospora anserina(SEQ_ID NO 4和9分别编码编码该蛋白质的安吉县序列和合成基因)。惊人的是，也生产了与这四种蛋白质高度同源但不含有SEQ_ID NO：11的氨基酸序列基序的多肽，但是所述多肽未显示期望的酶活性，这与含有SEQ_ID NO：11的氨基酸序列基序的四种蛋白质相反。所述胺氧化酶GLO2得自Fusarium graminearum(SEQ_ID NO 5和10分别编码编码该蛋白质的氨基酸序列和基因组DNA序列)。使用氨基酸序列基序SEQ_ID NO：11鉴定的四种赖氨酰氧化酶对赖氨酸底物具有更高的偏好，缺乏SEQ_ID NO：11的赖氨酰氧化酶具有较不优选的活性谱。显然，用氨基酸基序SEQ_ID NO：11搜索特异地鉴定了对赖氨酸底物具有更优选的活性的赖氨酰氧化酶，因此在对有用的赖氨酰氧化酶的鉴定中是重要的新颖工具。
当叠加在Pichia pastoris赖氨酰氧化酶的已知蛋白质结构上时，基序SEQ_ID NO：11位于赖氨酰氧化酶的活性中心(Duff et al.(2003)Biochemistry 42，15148-15157)。该基序中的两个组氨酸对应于Pichiapastoris赖氨酰氧化酶蛋白质的H528和H530。这两个组氨酸涉及该酶活性位点处铜原子的结合。非常容易想象，该氨基酸基序中的差异导致接近或处于酶活性中心处的改变，并因此对酶的活性或底物特异性具有影响。我们认为，本领域技术人员使用该基序能够鉴定适用于食物和饲料应用中的活性真菌赖氨酰氧化酶。
工业应用上对本发明的酶氧化肽中赖氨酰残基的能力感兴趣。进一步更有利地，本发明的酶能够氧化蛋白质中的赖氨酰残基。因此，与低分子量底物如游离赖氨酸或苄胺相比，对蛋白质和肽中的赖氨酰残基具有高度偏好的赖氨酰氧化酶在工业中是优选的。该底物偏好性是选择赖氨酰氧化酶用于工业用途的一个重要的优点和参数。
我们在本发明中显示，使用正确的序列时，事实上可能过表达具有合适的底物特异性的分泌型赖氨酰氧化酶。另外，我们提供了可被用于鉴定和选择来自不同真菌的活性分泌型赖氨酰氧化酶的序列基序。使用该途径，我们能够选择和表达来自Aspergillus nidulans、Fusariumgraminearum、Podospora anserina和Cryptococcus neoformans的赖氨酰氧化酶。
赖氨酰氧化酶催化蛋白质中赖氨酰基的氧化脱氨反应：
R1-(CH2)4-NH2+O2→R1-(CH2)3-CHO+H2O2+NH3。
在该反应中，R1是赖氨酸残基所处的蛋白质链。活性醛可以与第二赖氨酸残基的游离氨基反应：
R1-(CH2)3-CHO+R2-(CH2)4-NH2→R1-(CH2)3-NH-(CH2)4-R2+H2O。
藉此在两个蛋白质分子之间形成共价键。代替与第二赖氨酸残基的反应，活性醛也可以与除了来自蛋白质赖氨酸残基的氨基以外的可用氨基反应形成共价键。蛋白质的交联在食物构造的修饰中特别有用。食物是消费者赞赏的具有复杂结构和构造的多组分材料。现代食物技术的一个主要任务是从有限范围的具有可接受的口味和构造特征的成分产生新改造的结构(Dickinson，Trends Food Sci technol(1997)8，334-339)。蛋白质是食物技师可用于赋予半固体构造属性的主要构建块类别，并且蛋白质分子交联和聚集成为三维网络(凝胶)是用于开发具有期望机械特性的结构的最重要的机制之一。在许多传统的食物构建中，主要基于蛋白质凝胶的是乳酪、酸乳、香肠、豆腐(大豆凝乳)和鱼肉糜(surimi)(鱼肉凝胶)。若干种相互作用在凝胶形成中起作用，例如疏水力、静电相互作用、氢键和共价相互作用。后者在凝胶网络中导致永久的交联。食物凝胶的粘弹性(visco-elastic)和断裂特性以及消费者因此感受的构造取决于凝胶稳定力(包括共价相互作用)之间的平衡。因为赖氨酰氧化酶可被用于形成分子间共价键，因此它们适用于修饰食物构造。我们发现与蛋白质一起孵育时，酶导致蛋白质凝胶构造的修饰。另外，对下述蛋白质交联酶存在工业需要，所述酶在食品工业中常规使用的巴氏消毒期间被失活。我们显示本发明的赖氨酰氧化酶满足了热不稳定性的标准。
具有赖氨酰氧化酶活性的本发明的多肽可以是经分离的形式。如本文所定义的，经分离的多肽是内源生产的或重组的多肽，其基本不含其它非赖氨酰氧化酶的多肽，并且通过SDS-PAGE测定为典型地至少约20％纯净，优选地至少约40％纯净，更优选地至少约60％纯净，进一步更优选地至少约80％纯净，仍然更优选地约90％纯净，最优选地约95％纯净。可以通过离心和色谱方法，或本领域已知的用于从粗制溶液中获得纯净蛋白质的任何其它技术分离多肽。应当理解，多肽可以与不影响多肽预期目的的运载体或稀释剂混合，进而这种形式的多肽仍然会被认为是经分离的。制剂中通常会包含多肽，其中按蛋白质重量计多于20％，例如多于30％、40％、50％、80％、90％、95％或99％是本发明的多肽。
优选地，本发明的多肽可得自具有下述基因的微生物，所述基因编码具有赖氨酰氧化酶活性的酶。更优选地，本发明的多肽由所述微生物分泌。进一步更优选地，所述微生物是真菌，最好是丝状真菌。因此优选的供体微生物是Fusarium属例如Fusarium graminearum种，Aspergillus属例如Aspergillus nidulans种，Cryptococcus属例如Cryptococcus neoformans种，或Podospora属例如Podospora anserina种的那些。
在第一个实施方案中，本发明提供了具有下述氨基酸序列的经分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ_ID NO：1的氨基酸1到817(即所述多肽)具有至少30％，优选地至少40％，优选地至少50％，优选地至少60％，优选地至少70％，更优选地至少80％，进一步更优选地至少90％，仍然更优选地至少95％，最优选地至少97％的氨基酸序列同一性程度，并且具有赖氨酰氧化酶活性。
就本发明的目的而言，通过BLAST P蛋白质数据库搜索程序(Altschulet al.，1997，Nucleic Acids Research 25：3389-3402)，使用矩阵Blosum 62和10的期望阈值测定两条或更多氨基酸序列之间的同一性程度。
本发明的多肽可包含SEQ_ID NO：1中公开的氨基酸序列或基本同源的序列，或具有赖氨酰氧化酶活性的任一序列的片段。通常，SEQ_ID NO：1中所示天然存在的氨基酸序列是优选的。
本发明的多肽也可以包含SEQ_ID NO：1多肽的天然存在的变体或物种同源物。
变体是例如在真菌、细菌、酵母或植物细胞中天然存在的多肽，所述变体具有赖氨酰氧化酶活性和与SEQ_ID NO：1的蛋白质基本相似的序列。术语“变体”是指与SEQ_ID NO：1的赖氨酰氧化酶具有相同的关键特征或基本生物功能的多肽，并且包括等位基因变体。优选地，变体多肽至少具有与SEQ_ID NO：1的多肽相同水平的赖氨酰氧化酶活性。变体包括下述等位基因变体，其来自与SEQ_ID NO：1的多肽相同的菌株，或者来自相同属或种的不同菌株。
类似地，本发明蛋白质的物种同源物是具有相似序列的等同的蛋白质，其为赖氨酰氧化酶并天然存在于其它物种中。SEQ_ID NO：1多肽的物种同源物的例子列于SEQ_ID NO：2、3和4中。
可使用本文所述被用于分离SEQ_ID NO：1的多肽的步骤分离变体和物种同源物，并对合适的细胞来源例如细菌、酵母、真菌或植物细胞进行这类步骤。还可能使用本发明的探针对从酵母、细菌、真菌或植物细胞制成的文库进行探针标记，从而获得表达SEQ_ID NO：1多肽的变体或物种同源物的克隆。可用于分离已知基因变体和物种同源物的方法在文献中广泛描述，并且是本领域技术人员已知的。这些基因可通过常规技术操作，产生本发明的多肽，所述多肽随后可通过本身已知的重组技术或合成技术生产。
也可以修饰SEQ_ID NO：1多肽及其变体和物种同源物的序列，以提供本发明的多肽。可以制造氨基酸取代，例如从1、2或3个到10、20或30个取代。也可以制造相同数量的缺失和插入。可在对多肽功能关键的区域外制造这些改变，这样经修饰的多肽会保留其赖氨酰氧化酶活性。
本发明的多肽包括上述全长多肽或其变体的片段，包括SEQ_ID NO：1中公开的序列的片段。这类片段典型地会保留作为赖氨酰氧化酶的活性。片段可以是至少50、100或200个氨基酸长，或可以是SEQ_ID NO：1中所示全长序列的该氨基酸数量的片段。
如果必须的话，可以通过合成手段生产本发明的多肽，尽管通常会如下文所述重组制造本发明的多肽。可以如下修饰合成的多肽：例如通过添加组氨酸残基或T7标签来帮助其鉴定或纯化，或通过添加信号序列以促进其从细胞的分泌。
因此，变体序列可包括下述序列，所述序列衍生自除从中分离了SEQ_ID NO：1多肽的菌株之外的Aspergillus菌株。可通过寻找赖氨酰氧化酶活性并如本文所述克隆和测序，鉴定来自其它Aspergillus菌株的变体。变体可在蛋白质序列中包含单个氨基酸或氨基酸组的缺失、修饰或添加，制药肽保留SEQ_ID NO：1的赖氨酰氧化酶的基本生物功能性即可。
可制造氨基酸取代，例如从1、2个或3个到10、20或30个取代。经修饰的多肽通常会保留作为赖氨酰氧化酶的活性。可制造保守取代；这类取代是本领域公知的。
更短的多肽序列在本发明的范围内。例如，长度至少50个氨基酸或至多100、150、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸的肽被认为落入本发明的范围内，只要其显示SEQ_ID NO：1的赖氨酰氧化酶的生物学功能性即可。具体而非排他性地，本发明的这一方面包括其中蛋白质是完整蛋白质序列的片段的情况。
本发明还涉及编码具有赖氨酰氧化酶活性的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包括：
(a)编码氨基酸SEQ_ID NO：1的多核苷酸序列，和
(b)编码氨基酸SEQ_ID NO：2的多核苷酸序列，和
(c)编码氨基酸SEQ_ID NO：3的多核苷酸序列，和
(d)编码氨基酸SEQ_ID NO：4的多核苷酸序列。
对本发明而言，含有SEQ_ID NO：11的赖氨酰氧化酶共有序列的多肽属于本发明。对本发明而言，特别相关的是感兴趣的蛋白质被有效分泌进培养基中。分泌型蛋白质通常最初作为前-蛋白质被合成，所述前-序列(信号序列)随后在分泌过程期间被去除。分泌过程在原核生物和真核生物中基本是相似的：被活性分泌的前-蛋白质穿过膜，信号序列被特异的信号肽酶去除，并且成熟的蛋白质被(再)-折叠。还可识别针对信号序列的一般结构。用于分泌的信号序列位于前-蛋白质的氨基端，并且长度一般为15-30个氨基酸。氨基端优选地含有带正电的氨基酸，并优选地不含有酸性氨基酸。认为带正电的该区域与膜磷脂的带负电的首基(head group)相互作用。该区域之后是疏水的、跨膜的核心区。该区域通常长度为10-20个氨基酸，并主要由疏水氨基酸组成。带电的氨基酸通常不存在于该区域中。跨膜区之后是信号肽酶的识别位点。识别位点由对小-X-小具有偏好的氨基酸组成。小氨基酸可以是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或半胱氨酸。X可以是任何氨基酸。使用这类规则写出了下述算法，所述算法能够识别来自真核生物和原核生物的这类信号序列(Bendtsen，Nielsen，von Heijne andBrunak.(2004)J.Mol.Biol.，340：783-795)。计算和识别蛋白质中信号序列的SignalP算法是普遍可获得的(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。
与本发明相关的是可从被测序基因演绎的蛋白质序列中识别信号序列。如果基因编码使用SignalP程序预测其中有信号序列的蛋白质，则该蛋白质是分泌型的可能性较高。优选地，本发明的目的因此是提供下述新方法，所述新方法使用SEQ_ID NO：11的共有基序与通过SignalP程序检测的信号序列的存在相结合，来寻找具有赖氨酰氧化酶活性的新颖蛋白质。
在第二个实施方案中，本发明提供了具有赖氨酰氧化酶活性并由下述多核苷酸编码的经分离的多肽，所述多核苷酸在低严格度条件下，更优选地在中严格度条件下，最优选地在高严格度条件下能够与(i)SEQ_ID NO：6的核酸序列或(ii)包含至少一部分SEQ_ID NO：6的核酸片段，或(iii)具有与SEQ_ID NO：6碱基不同的碱基的核酸片段杂交；或(iv)与SEQ_ID NO：6互补的核酸链杂交。
术语“能够杂交”表示本发明的靶多核苷酸能够与用作探针的核酸(例如，SEQ_ID NO：6中公开的核苷酸序列或其片段，或SEQ_ID NO：6的互补体或其片段)以显著高于背景的水平杂交。本发明还包括编码本发明赖氨酰氧化酶的多核苷酸，以及与其互补的核苷酸序列。核苷酸序列可以是RNA或DNA，包括基因组DNA、合成的DNA或cDNA。优选地，核苷酸序列是DNA，最优选地是合成的DNA序列。典型地，本发明的多核苷酸包含连续的核苷酸序列，所述连续的核苷酸序列能够在选择性条件下与SEQ_ID NO：6的编码序列或编码序列的互补体杂交。这类核苷酸可根据本领域公知的方法合成。
本发明的多核苷酸能够与SEQ_ID NO：6的编码序列或编码序列的互补体在显著高于背景的水平上杂交。背景杂交可例如由于cDNA文库中存在其它cDNA而发生。通过本发明的多核苷酸与SEQ_ID NO：6的编码序列或编码序列的互补体之间相互作用产生的信号水平强度典型地是其它多核苷酸与SEQ_ID NO：6编码序列之间的相互作用的至少10倍，优选地至少20倍，更优选地至少50倍，进一步更优选地至少100倍。相互作用强度例如可以通过放射性标记探针来测量，例如用32P标记。选择性杂交典型地可使用低严格度(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，约40℃下)、中严格度(例如0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，约50℃下)或高严格度(例如0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，约60℃下)条件实现。
本发明的多核苷酸还包括可编码SEQ_ID NO：1、SEQ_ID NO：2、SEQ_ID NO：3或SEQ_ID NO：4多肽或其变体的合成基因。有时优选使基因的密码子选择适应生产宿主中优选的偏好。设计和构建合成基因的技术是一般可获得的(即http://www.dnatwopointo.com/)。
修饰
本发明的多核苷酸可包括DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是下述多核苷酸，其中包含合成的或经修饰的核苷酸，包括肽核酸。本领域已知对多核苷酸的大量不同类型的修饰。这些包括甲基磷酸酯和硫代硫酸酯主链，和在分子的3′和/或5′端加成吖啶或多聚赖氨酸链。就本发明的目的而言，应当理解可以通过本领域中可获得的任何方法修饰本文所述的多核苷酸。
应当理解，技术人员使用常规技术可制造不影响本发明多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，从而反映要表达本发明多肽的任何具体宿主的密码子选择。
可通过核苷酸取代，例如从1、2或3个到10、25，50、100或更多的取代修饰SEQ_ID NO：6的编码序列。可通过一个或多个插入和/或缺失和/或通过在一端或两端延伸，可选或额外地修饰SEQ_ID NO：6的多核苷酸。经修饰的多核苷酸通常编码具有赖氨酰氧化酶活性的多肽。可制造简并取代和/或可制造在经修饰的序列被翻译后导致保守的氨基酸取代的取代，例如在下文中关于多肽所描述的。
同源物
能够与SEQ_ID NO：6的DNA编码序列的互补体选择性杂交的核苷酸序列包括在本发明内，并且通常会在至少60，优选地至少100，更优选地至少200个连续核苷酸或最优选地在SEQ_ID NO：6全长的区域上，与SEQ_ID NO：6的编码序列具有至少50％或60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％的序列同一性。同样，本发明也包括下述核苷酸，所述核苷酸编码活性赖氨酰氧化酶，并且能够与SEQ_ID NO：6的DNA编码序列的互补体片段选择性杂交。可使用上述同一性程度和最小尺寸的任何组合鉴定本发明的多核苷酸，优选更严格的组合(即在更长长度上的更高同一性)。因此，例如在60个，优选地在100个核苷酸上至少80％或90％相同的多核苷酸形成本发明的一个方面，正如同在200个核苷酸上至少90％相同的多核苷酸。
可使用BLASTP和BLAST N算法计算序列同一性或比对序列(例如鉴定等同或相应的序列，例如使用其默认设定)。
公众可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得用于进行BLAST分析的软件。该算法涉及通过鉴定查询序列中长度为W的下述短词来首先鉴定高评分的序列对(HSP)，所述短词与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足一些正值的阈值评分T。T表示相邻词评分阈值(neighborhood word score threshold)。这些最初的相邻词击中(hit)发挥种子的作用，起始搜索以寻找含有它们的HSP。词击中在两个方向上沿着每条序列延伸，直至能够提高累积的比对评分。下述情况下停止每个方向上的词击中延伸：累积比对评分比达到的最大值减少数量X；由于一个或多个负分残基比对的积累，累积评分达到零或以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。来自DNA-DNA比较的BLASTN程序使用11的词长(W)、10的预期(E)和两条链的比较作为默认值。用于蛋白质-蛋白质比较的BLASTP程序使用3的词长(W)、BLOSUM62评分矩阵、11的缺口存在罚分和1的缺口延伸罚分，和10的预期(E)作为默认值。
BLAST算法在两条序列之间进行相似性的统计学分析。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小概率和(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间随机发生匹配的概率的指征。例如，如果在第一序列与第二序列的比较中，最小概率和小于约1、优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01，最优选地小于约0.001，则序列被认为与另一序列相似。
引物和探针
本发明的多核苷酸包括并可被用作引物，例如作为聚合酶链式反应(PCR)的引物，作为可选的扩增反应的引物，或作为用揭示性标签标记的探针(例如通过常规手段使用放射性或非放射性标签)，或多核苷酸可以被克隆进载体中。这类引物、探针和其它片段长度应至少为15，例如至少20、25、30或40个核苷酸。它们长度通常会多达40、50、60、70、100、150、200或300个核苷酸，或甚至多达比SEQ_ID NO：6的编码序列短数个核苷酸(例如5或10个核苷酸)。
通常，引物会通过合成手段生产，所述合成手段涉及一次一个核苷酸分步制造期望的核酸序列。完成所述制造的技术和方案是本领域可容易获得的。更长的多核苷酸通常使用重组手段生产，例如使用PCR克隆技术生产。这会涉及：制造用于扩增要克隆的赖氨酰氧化酶目的区域的一对引物(典型地约15-30个核苷酸)，使引物与得自酵母、细菌、植物、原核细胞或真菌细胞，优选地得自Aspergillus菌株的mRNA、cDNA或基因组DNA接触，在适合扩增目的区域的条件下进行聚合酶链式反应，分离被扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收被扩增的DNA。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点，从而可以将被扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
或者可构建合成的基因，所述合成的基因包含分泌型赖氨酰氧化酶或其变体的编码区。可使用这些技术便利的设计和构建在许多位置上被改变但是仍然编码相同蛋白质的多核苷酸。这具有下述优点：密码子选择可适应优选的表达宿主，从而可改进蛋白质在所述宿主中的生产力。还可改变基因的多核苷酸序列，从而促进mRNA稳定性或降低周转。这可导致目的蛋白质或其变体的改进的表达。另外，可在合成基因中改变多核苷酸序列，从而在蛋白质序列中制造下述突变，所述突变对分泌效率、稳定性、蛋白质分解易损性、温度最适度、比活性或蛋白质工业生产和应用相关的其它特性具有积极影响。提供构建合成基因和优化密码子选择的服务的公司是普遍可获得的。
这类技术可被用于获得所有或部分编码本文所述赖氨酰氧化酶序列的多核苷酸。内含子、启动子和尾区属于本发明的范围，并且也可以从来自真菌、酵母、细菌、植物或原核细胞的基因组DNA开始，以相似的方式(例如通过重组手段、PCR或克隆技术)获得。
多核苷酸或引物可带有揭示性标签。合适的标签包括放射性同位素例如32P或35S、荧光标签、酶标签或其它蛋白质标签例如生物素。这类标签可以被添加至本发明的多核苷酸或引物，并可使用本领域技术人员已知的技术检测。
带有标签或不带有标签的多核苷酸或引物(或其片段)可在基于核酸的测试中被用于检测或测序真菌样品中的赖氨酰氧化酶或其变体。这类检测测试通常将包括，在杂交条件下使怀疑含有感兴趣的DNA的真菌样品与包含本发明多核苷酸或引物的探针接触，并检测探针与样品中核酸之间形成的任何双链体。可使用例如PCR的技术，或通过将探针固定在固体支持物上，去除样品中未与探针杂交的任何核酸，然后检测与探针杂交的任何核酸来达成检测。或者，可将样品核酸固定在固体支持物上，使探针杂交，并在去除任何未结合的探针后检测与这类支持物结合的探针量。
本发明的探针可以以测试试剂盒的形式被便利地包装于合适的容器中。在这类试剂盒中，探针可与固体支持物结合，其中该设计该试剂盒的测定模式需要这类结合。试剂盒也可含有对要进行探针检测的样品进行处理的合适试剂，将探针与样品中核酸杂交的合适试剂，对照试剂，说明书等等。本发明的探针和多核苷酸也可以用于微量测定中。
优选地，本发明的多核苷酸可得自与多肽相同的生物，例如真菌，尤其是Aspergillus属的真菌。
多核苷酸的生产
也可以通过大量方式获得与SEQ_ID NO：6不具有100％同一性但是落入本发明范围内的多核苷酸。因此，可例如通过对从多种生物制备的基因组DNA文库进行探针标记，获得本文所述的赖氨酰氧化酶序列的变体，所述生物例如作为本发明多肽来源被讨论的那些。另外，可获得赖氨酰氧化酶的其它真菌、植物或原核生物同源物，并且这类同源物及其片段通常会能够与SEQ_ID NO：6杂交。这类序列可如下获得：在低、中到高严格度(如前文所述)条件下，用探针检测来自其它物种的cDNA文库或基因组DNA文库，并用包括SEQ_ID NO：6全部或部分的探针检测这类文库。包含SEQ_ID NO：6全部或部分的核酸探针可被用于探针检测来自其它物种的CDNA或基因组文库，所述物种例如作为本发明多肽的来源所描述的那些。
也可以使用简并PCR获得物种同源物，所述简并PCR使用被设计为靶向变体和同源物中编码保守氨基酸序列的序列。引物可含有一个或多个简并位置，并应在下述严格度条件下使用，所述严格度比用于针对已知序列用单序列引物克隆序列所使用的严格度更低。获得赖氨酰氧化酶的物种同源物的一种优选的方式是设计下述引物，所述引物靶向编码SEQ_ID NO：11中所述共有序列的序列。
或者，可通过赖氨酰氧化酶序列或其变体的定点诱变获得这类多核苷酸。当例如针对要表达多核苷酸序列的具体宿主细胞优化密码子偏好需要对序列进行沉默密码子改变时，这可以是有用的。可进行其它序列改变，从而引入限制性酶识别位点，或者改变多核苷酸编码的多肽的特性或功能。
本发明包括包含本发明多核苷酸及其互补体的双链多核苷酸。
本发明还提供了编码上述本发明多肽的多核苷酸。因为这类多核苷酸会适合用作重组生产本发明多肽的序列，因此它们不必须能够与SEQ_IDNO：6的序列杂交，尽管这会是通常所期望的。另外，如果需要，则可以如上文所述标记、使用和制造这类多核苷酸。
重组的多核苷酸
本发明还提供了包含本发明多核苷酸的载体，包括克隆和表达载体，并在另一方面中提供了例如在本发明的多肽或本发明序列编码的多肽发生表达的条件下，将这类载体喷阳、转化或转染进合适宿主细胞中的方法。还提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞，其中所述多核苷酸对于宿主细胞的基因组而言是异源的。术语“异源的”(通常关于宿主细胞)表示多核苷酸不天然存在于宿主细胞的基因组中，或多肽不天然地由该细胞生产。优选地，宿主细胞是酵母细胞，例如Kluyveromyces、Pichia、Hansenula或Saccharomyces属的酵母或丝状真菌细胞，例如Aspergillus、Trichoderma或Fusarium属。
载体
插入本发明表达盒的载体可以是可便利地进行重组DNA步骤的任何载体，载体的选择通常会取决于要引入所述载体的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒，或者，载体可以是下述载体，其被引入宿主细胞中时被整合进宿主细胞基因组中，并与整合它的染色体一起复制。
优选地，当本发明的多核苷酸在载体中时，其与能够提供宿主细胞对编码序列的表达的调节序列有效连接，即所述载体是表达载体。术语“有效连接的”是指一种并置(juxtaposition)，其中所述组分处于允许它们以期望的方式发挥作用的关系中。与编码序列“有效连接”的调节序列例如启动子、增强子或其它表达调节信号以下述方式放置，所述方式使得在生产条件下达成编码序列的表达。
例如在质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体的情况下，可提供下述载体，所述载体带有复制起点，任选地带有用于表达多核苷酸的启动子和任选地带有启动子的增强子和/或调节子。可存在终止子序列，例如可以是多聚腺苷酸化序列。载体可含有一种或多种可选择标记物基因，例如在细菌质粒的情况下为氨苄西林抗性基因，或对哺乳动物载体而言为新霉素抗性基因。载体可体外使用，例如用于生产RNA，或可被用于转染或转化宿主细胞。
编码多肽的DNA序列优选地作为表达构建体的部分被引入合适的宿主细胞中，其中所述DNA序列与表达信号有效连接，所述表达信号能够指导DNA序列在宿主细胞中的表达。为了用表达构建体转化合适的宿主，可获得本领域技术人员公知的转化步骤。表达构建体可作为带有选择性标记物的载体的部分被用于转化宿主细胞，或表达构建体作为独立的分子与带有可选择标记物的载体一起被共转化。载体可含有一种或多种可选择的标记物基因。
优选的可选择标记物包括但不限于补充宿主细胞中缺陷或赋予药物抗性的那些。它们包括例如能够被用于转化大部分丝状真菌和酵母的通用标记物基因，例如乙酰胺酶基因或cDNA(amdS、niaD、facA基因或来自A.nidulans、A.oryzae或A.niger的cDNA)，或对抗生素提供抗性例如G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、腐草霉素或苯菌灵抗性(benA)的基因。或者，可使用特异的选择标记物，例如需要相应突变体宿主菌株的营养缺陷型标记物：例如URA3(来自S.cerevisiae或来自其它酵母的类似基因)、pyrG或pyrA(来自A.nidulans或A.niger)、argB(来自A.nidulans或A.niger)或trpC。在一个优选的实施方案中，在引入表达构建体后从经转化的宿主细胞中删除选择标记物从而获得下述经转化的宿主细胞，所述经转化的宿主细胞能够生产不含选择标记物基因的多肽。
其它标记物包括ATP合成酶亚基9(oliC)、乳清苷-5’-磷酸-脱羧酶(pvrA)、细菌G418抗性基因(适用于酵母，但是不适用于丝状真菌)、氨苄西林抗性基因(E.coli)、新霉素抗性基因(Bacillus)和编码葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的E.coli uidA基因。载体可体外使用，例如用于生产RNA或转染或转化宿主细胞。
对大部分丝状真菌和酵母而言，表达构建体优选地被整合进宿主细胞的基因组中，从而获得稳定的转化体。然而，对某些酵母而言，也可获得合适的附加型载体，可将表达构建体整合进所述附加型载体中得到稳定和高水平的表达。其例子包括分别衍生自Saccharomyces和Kluyveromyces的2μm、CEN和pKD1质粒，或含有AMA序列的载体(例如来自Aspergillus的AMA1)。当表达构建体被整合进宿主细胞基因组中时，构建体被整合进基因组中的随机基因座上，或者使用同源重组整合进预定的靶基因座上，在这种情况下靶基因座优选地包含高表达基因。高表达基因是例如在诱导的条件下其mRNA可占总细胞mRNA至少0.01％(w/w)的基因，或者是其基因产物可占总细胞蛋白质至少0.2％(w/w)的基因，或者在分泌型基因产物的情况下，可以被分泌至至少0.05g/l的水平。
针对给定的宿主细胞的表达构建体通常会含有以下元件，所述元件以相对于编码第一方面多肽的序列的编码链而言从5’-端到3’-端的连续顺序彼此有效连接：(1)能够指导编码多核苷酸的DNA序列在给定的宿主细胞中转录的启动子序列，(2)优选地，5’-非翻译区(前导区)，(3)任选地，能够指导多肽从给定的宿主细胞分泌进入培养基中的信号序列，(4)编码多肽成熟形式，优选地编码多肽活性形式的DNA序列，和优选地还含有(5)能够在编码多肽的DNA序列下游终止转录的转录终止区(终止子)。
在编码多肽的DNA序列下游，表达构建体优选地含有3′非翻译区，所述3′非翻译区含有一个或多个转录终止位点，也称作终止子。终止子的来源较不重要。终止子可例如对于编码多肽的DNA序列而言是固有的。然而，优选地在细菌宿主细胞中使用细菌终止子，在酵母宿主细胞中使用酵母终止子，在丝状真菌宿主细胞中使用丝状真菌终止子。更优选地，对其中表达编码多肽的DNA序列的宿主细胞而言，终止子是内源的。
也可以通过选择异源调节区达成编码本发明多肽的多核苷酸的增强的表达，所述异源调节区例如启动子、信号序列和终止子区，其发挥提高表达的作用，并且需要时提高感兴趣的蛋白质从选定的宿主细胞分泌的水平，和/或提供对本发明多肽表达的诱导型控制。
除了对编码本发明多肽的基因而言固有的启动子之外，可使用其它启动子指导本发明多肽的表达。可针对启动子指导本发明多肽在期望的表达宿主中表达的效率选择启动子。
可选择启动子/增强子和其它表达调节信号，使其与设计表达载体的宿主细胞相容。例如可使用原核启动子，尤其是适用于E.coli菌株中的那些。在哺乳动物细胞中进行本发明多肽的表达时，可使用哺乳动物启动子。也可以使用组织特异型启动子，例如肝细胞特异型启动子。也可使用病毒启动子，例如Moloney鼠白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)IE启动子、单纯疱疹病毒启动子或腺病毒启动子。
合适的酵母启动子包括S.cerevisiae GAL4和ADH启动子和S.pombenmt1和adh启动子。哺乳动物启动子包括可响应重金属例如镉而被诱导的金属硫蛋白启动子。也可使用病毒启动子例如SV40大T抗原启动子或腺病毒启动子。所有这些启动子是本领域可容易获得的。
可使用哺乳动物启动子例如β-肌动蛋白启动子。组织特异型启动子，尤其是内皮或神经元细胞特异型启动子(例如DDAHI和DDAHII)是特别优选的。也可使用病毒启动子，例如Moloney鼠白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)IE启动子、腺病毒、HSV启动子(例如HSV IE启动子)、或HPV启动子，尤其是HPV上游调节区(URR)。病毒启动子是本领域容易获得的。
可使用能够在本发明的宿主细胞中指导转录的多种启动子。优选地，启动子序列来自于先前定义的高表达基因。优选的高表达基因(启动子优选地来源于其中和/或其包含在用于整合表达构建体的优选的预定靶基因座中)的例子包括但不限于，编码糖酵解酶例如磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脱氢酶(ADH)的基因，以及编码淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白质的基因。合适的高表达基因的特异例子包括例如来自Kluyveromyces物种的LAC4基因，分别来自Hansenula和Pichia的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)，来自A.niger和A.awamori的葡糖淀粉酶(glaA)基因，A.oryzae TAKA-淀粉酶基因，A.nidulans gpdA基因和T.reesei纤维二糖水解酶基因。
优选地用于真菌表达宿主中的强组成型和/或诱导型启动子的例子是可得自以下真菌基因的那些：木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶亚基9(oliC)、磷酸丙糖异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、淀粉酶(amy)、淀粉葡萄糖苷酶(AG-来自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子。
可使用的强酵母启动子的例子包括可得自以下的那些：醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸酯激酶、质膜ATPase(PMA1)和磷酸丙糖异构酶。
可使用的强细菌启动子的例子包括淀粉酶和SPo2启动子，以及来自细胞外蛋白酶基因的启动子。
可使用的适用于植物细胞的启动子包括乌头碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)、甘露碱合酶(mas)、核酮糖小亚基(rubisco ssu)、组蛋白、水稻肌动蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花叶病毒(CMV)35S和19S和环病毒启动子。
在得到RNA的多核苷酸侧翼，载体可进一步包含下述序列，所述序列包括与来自真核基因组序列、优选地来自真菌基因组序列或酵母基因组序列的序列同源的序列。这会允许通过同源重组将本发明的多核苷酸引入真菌或酵母基因组中。具体地，可使用下述质粒载体制备适用于将本发明多核苷酸递送至真菌细胞的载体，所述质粒载体包含侧翼为真菌序列的表达盒。使用这些真菌载体的转化技术是本领域技术人员已知的。
载体可含有朝向反义方向的本发明的多核苷酸，以提供反义RNA的生产。需要时，这可被用于降低多肽的表达水平。
宿主细胞和表达
在又一方面，本发明提供了制备本发明多肽的方法，所述方法包括在适合表达编码多肽的编码序列的载体的条件下，培养用上文所述的表达载体转化或转染的宿主细胞，并回收被表达的多肽。本发明的多核苷酸可被引入重组的可复制载体例如表达载体中。载体可被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在又一实施方案中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在引起载体复制的条件下培养所述宿主细胞。合适的宿主细胞包括细菌例如E.coli，酵母，哺乳动物细胞系和其它真核细胞系，例如昆虫细胞例如Sf9细胞和(例如丝状)真菌细胞。
优选地，多肽作为分泌型蛋白质被生产，在这种情况下，表达构建体中编码成熟形式多肽的DNA序列可与编码信号序列的DNA序列有效连接。在编码分泌型蛋白质的基因在野生型菌株中带有信号序列的情况下，优选地使用的信号序列对编码多肽的DNA序列而言应当是固有(同源)的。或者，信号序列对编码多肽的DNA序列而言是外来(异源)的，在这种情况下信号序列对其中表达DNA序列的宿主细胞而言优选地是内源的。用于酵母宿主细胞的合适的信号序列是来自酵母MFalpha基因的信号序列。类似地，丝状真菌宿主细胞的合适信号序列是例如衍生自丝状真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因例如A.niger glaA基因的信号序列。该信号序列可与淀粉葡萄糖苷酶(所谓的(葡糖)淀粉酶)启动子自身组合使用，以及与其它启动子组合使用。在本发明的上下文中也可以使用杂种信号序列。
优选的异源分泌前导序列是来源于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24个氨基酸的版本，例如来自Aspergillus)、MFalpha基因(酵母，例如Saccharomyces和Kluyveromyces)或α-淀粉酶基因(Bacillus)。
可如上文所述将载体转化或转染进合适的宿主细胞中，提供本发明多肽的表达。该过程可包括在适合表达多肽的条件下培养用如上所述的表达载体转染的宿主细胞，并任选地回收被表达的多肽。
因此本发明的又一方面提供了下述宿主细胞，所述宿主细胞用本发明的多核苷酸或载体转化或转染或含有本发明的多核苷酸或载体。优选地，多核苷酸由载体装载，所述载体允许多核苷酸的复制和表达。应当选择与所述载体相容的细胞，所述细胞可以例如是原核(例如细菌)或真核的真菌、酵母或植物细胞。
本发明包括通过编码多肽的DNA序列的重组表达，生产本发明多肽的方法。为此，本发明的DNA序列可被用于基因扩增和/或表达信号(例如启动子、分泌信号序列)的交换，从而允许多肽在合适的同源或异源宿主细胞中的经济生产。同源宿主细胞在本文中定义为相对于DNA序列来源的物种而言，是相同物种或是相同物种中变体的宿主细胞。
合适的宿主细胞优选地是原核微生物，例如细菌，或更优选地是真核生物，例如真菌，例如酵母或丝状真菌或植物细胞。通常，酵母细胞是超过丝状真菌细胞而被优选的，因为它们更容易操作。然而，一些蛋白质从酵母中分泌较差，或者在一些情况下不被正确加工(例如酵母中的高糖基化)。在这些情况下，应当选择丝状真菌宿主生物。
来自Bacillus属的细菌是非常适合用作异源宿主的，这归因于它们将蛋白质分泌进入培养基中的能力。其它适合用作宿主的细菌是来自Streptomyces和Pseudomonas属的细菌。用于表达编码多肽的DNA序列的一种优选的宿主细胞是Saccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula、Pichia、Yarrowia或Schizosaccharomyces属之一。更优选地，酵母宿主细胞选自由物种Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis(也称作Kluyveromyces marxianus var.lactis)、Hansenula polymorpha、Pichiapastoris、Yarrowia lipolytica和Schizosaccharomyces pombe组成的组。
然而，为了编码多肽的DNA序列的表达，最优选的是丝状真菌宿主细胞。优选的丝状真菌宿主细胞选自由属Aspergillus、Trichoderma、Fusarium、Disporotrichum、Penicillium、Acremonium、Neurospora、Thermoascus、Myceliophtora、Sporotrichum、Thielavia和Talaromyces组成的组。最优选地，丝状真菌宿主细胞是物种Aspergillus oyzae、Aspergillussojae或Aspergillus nidulans，或是来自Aspergillus niger Group(如Raperand Fennell，The Genus Aspergillus，The Williams & Wilkins Company，Baltimore，pp 293-344，1965所定义)的物种。这些包括但不限于Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus tubigensis、Aspergillusaculeatus、Aspergillus foetidus、Aspergillus nidulans、Aspergillusjaponicus、Aspergillus oryzae和Aspergillus ficuum，以及物种Trichodermareesei、Fusarium graminearum、Penicillium chrysogenum、Acremoniumalabamense、Neurospora crassa、Myceliophtora thermophilum、Sporotrichum cellulophilum、Disporotrichum dimorphosporum和Thielaviaterrestris的那些。
本发明范围内优选的表达宿主的例子是真菌例如Aspergillus物种(尤其是EP-A-184,438和EP-A-284,60中所述的那些)和Trichoderma物种；细菌例如Bacillus物种(尤其是EP-A-134,048和EP-A-253,455中所述那些)，特别是Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacillusamyloliquefaciens、Pseudomonas物种；和酵母例如Kluyveromyces物种(尤其是EP-A-096,430中所述那些例如Kluyveromyces lactis和EP-A-301,670中所述那些)和Saccharomyces物种，例如Saccharomycescerevisiae。
根据本发明的宿主细胞包括植物细胞，因此本发明扩展至含有一个或多个本发明细胞的转基因生物，例如植物或其部分。细胞可异源地表达本发明的多肽，或异源地含有一个或多个本发明的多核苷酸。因此转基因(或经遗传修饰的)植物的基因组中可插入编码本发明多肽的序列。可使用已知技术进行植物细胞的转化，例如使用来自Agrobacterium tumefaciens的Ti或Ri质粒进行。因此质粒(或载体)可含有转染植物必需的序列，并蒽醌使用Ti和/或Ri质粒的衍生物。
宿主细胞可过表达多肽，用于改造过表达的技术是公知的，并可在本发明中使用。宿主因此可具有两个或更多个拷贝的多核苷酸。
或者，可进行植物部分例如叶、根或茎的直接感染。在该技术中，例如如下对要被感染的植物造成创伤：用刀片切割植物、用针穿刺植物或用磨蚀剂摩擦植物。然后用Agrbacterium接种伤口。然后可在合适的培养基上培养植物或植物部分，并允许其发育成为成熟的植物。可通过已知技术实现经转化的细胞成为经遗传修饰的植物的再生，例如通过使用抗生素选择经转化的枝条，并将枝条接种在含有适当营养素、植物激素等等的培养基上来实现。
宿主细胞的培养和重组生产
本发明还包括被修饰为表达赖氨酰氧化酶或其变体的细胞。这类细胞包括经瞬时修饰的，或优选地经稳定修饰的高级真核细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，低级真核细胞，例如酵母和丝状真菌细胞，或原核细胞例如细菌细胞。
还可能在细胞系或膜上，例如在杆状病毒表达系统中瞬时表达本发明的多肽。适合表达本发明蛋白质的这类系统也包括在本发明的范围内。
根据本发明，可通过在常规的营养发酵培养基中培养微生物表达宿主实现本发明多肽的生产，所述微生物表达宿主已用一个或多个本发明的多核苷酸转化。
可使用本领域已知的步骤培养根据本发明的重组宿主细胞。对启动子和宿主细胞的每种组合而言，可以获得有助于编码多肽的DNA序列表达的培养条件。达到期望的细胞密度或多肽滴度后，停止培养并使用已知的步骤回收多肽。
发酵培养基可含有已知的培养基，所述培养基含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等等)、氮源(例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等等)、有机氮源(例如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨等等)和无机氮源(例如磷酸镁、磷酸钾、磷酸锌、磷酸铁等等)。任选地，可包含或随后添加诱导剂(取决于使用的表达构建体)。
对合适培养基的选择可基于表达宿主的选择和/或基于表达构建体的调节需求来进行。合适的培养基是本领域技术人员公知的。需要时，培养基可含有额外的组分，所述额外的组分对经转化的表达宿主的偏好优于其它可能的污染微生物。
发酵可在0.5-30天的周期上进行。发酵可以是分批、连续或补料分批的过程，在0℃和45℃之间范围内的合适温度下，和例如在从2到10的pH下。优选地，发酵条件包括20℃和37℃之间范围内的温度和/或3和9之间的pH。适当的条件通常基于表达宿主的选择和要表达的蛋白质来选择。
发酵后，如果必须的话，可通过离心或过滤从发酵液中去除细胞。发酵停止或去除细胞后，可随后回收本发明的多肽，并且需要时通过常规手段纯化和分离。本发明的赖氨酰氧化酶可从真菌菌丝体中分离，或从培养的真菌细胞将赖氨酰氧化酶释放进其中的培养基中分离。
在一个优选的实施方案中，多肽由真菌生产，更优选地由Aspergillus生产，最优选地由Aspergillus niger生产。
修饰
可化学修饰，例如翻译后修饰本发明的多肽。例如，它们可以被糖基化(一次或多次)，或包含经修饰的氨基酸残基。也可以通过添加帮助纯化组氨酸残基，或通过添加促进从细胞中分泌的信号序列，来修饰本发明的多肽。多肽可具有氨基端或羧基端延伸，例如氨基酸甲硫氨酸残基，至多约20-25个残基的小连接子肽，或简化纯化的小延伸，例如多聚组氨酸束、抗原表位或结合结构域。
本发明的多肽可用揭示性标签标记。揭示性标签可以是允许多肽被检测的任何合适标签。合适的标签包括放射性同位素例如125I、35S，酶，抗体，多核苷酸或连接子例如生物素。
多肽可被修饰为包含非天然存在的氨基酸或提高多肽的稳定性。当通过合成手段生产蛋白质或多肽时，可在生产期间引入这类氨基酸。蛋白质或肽也可以在合成或重组生产后被修饰。
也可以使用D-氨基酸生产本发明的多肽。在这类情况下，氨基酸应当以C到N的方向以反转顺序连接。这在生产这类蛋白质或肽的领域中是常规的。
大量侧链修饰是本领域已知的，并可对本发明的蛋白质或肽的侧链进行所述侧链修饰。这类修饰包括例如通过与醛反应然后用NaBH4还原的还原性烷基化修饰氨基酸，使用乙亚氨酸乙酯(methylacetimidate)的amidination或使用乙酸酐的酰化。
本发明提供的序列也可被用作构建“第二代”酶的起始材料。“第二代”赖氨酰氧化酶是通过诱变技术(例如定点诱变或基因改组技术)改变的赖氨酰氧化酶，其特性与野生型赖氨酰氧化酶或例如通过本发明生产的重组赖氨酰氧化酶不同。例如，可改变它们的温度或pH最适度、比活性、底物亲和力或热稳定性，从而更好地适用于具体的工艺。
可根据本领域已知的步骤，例如定点诱变或丙胺酰扫描诱变，鉴定下述氨基酸，所述氨基酸对本发明赖氨酰氧化酶的活性是重要的，并因此优选地进行取代。在后一技术中，在分子中的每个残基上引入突变，并测试得到的突变体分子的生物活性(例如赖氨酰氧化酶活性)，以鉴定对分子活性而言关键的氨基酸残基。也可通过晶体结构分析测定酶-底物相互作用的位点，所述晶体结构通过例如核磁共振、结晶学或光亲和标记法的技术测定。
基因改组技术提供了在多核苷酸序列中引入突变的一种随机方式。表达后，将具有最佳特性的分离物再分离、组合并再次改组，以提高遗传多样性。通过将该步骤重复多次，可分离编码被快速改进的蛋白质的基因。优选地，用编码具有相似功能的蛋白质的一个基因家族开始基因改组步骤。本发明提供的多核苷酸序列家族应当充分适用于基因改组，以改进分泌型赖氨酰氧化酶的特性。
或者，可使用经典的随机诱变技术和选择，例如使用NTG处理的诱变或UV诱变，来改进蛋白质的特性。可直接在分离的DNA上进行诱变，或在用感兴趣的DNA转染的细胞上进行诱变。或者，可通过本领域技术人员已知的大量技术将突变引入经分离的DNA中。这些方法的例子是易错PCR、在重复-缺陷型宿主细胞中扩增质粒DNA等等。
预期使用酵母和丝状真菌宿主细胞提供翻译后修饰(例如蛋白酶解加工、肉豆蔻酸化(myristilation)、糖基化、截短，和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这可能是对本发明的重组表达产物赋予最佳生物活性所需要的。
制备物
本发明的多肽可以是经分离的形式。应当理解，多肽可与不影响多肽预期目的的运载体或稀释剂混合，并仍然被认为是经分离的。本发明的多肽也可以是基本纯净的形式，在这种情况下制备物中通常包含多肽，其中制备物中多于70％，例如多于80％、90％、95％、98％或99％的蛋白质是本发明的多肽。
本发明的多肽可以下述形式提供，所述形式使得它们处于其天然细胞环境外。因此，它们可以是如上所述基本经分离或纯化的，或者处于它们天然不存在于其中的细胞中，例如其它真菌物种、动物、植物或细菌细胞中。
赖氨酰氧化酶活性的去除或恢复
本发明还涉及用于生产亲本细胞的突变细胞的方法，所述方法包括破坏或缺失编码多肽或其控制序列的内源氨基酸序列，这导致突变细胞生产比亲本细胞更少的多肽。
可通过修饰或失活细胞中赖氨酰氧化酶表达必需的核酸序列，便利地完成具有降低的赖氨酰氧化酶活性的菌株的构建。要被修饰或失活的核酸序列可以例如是编码显示赖氨酰氧化酶活性必需的多肽或其部分的核酸序列，或所述核酸序列可具有从核酸序列的编码序列表达多肽所需的调节功能。这类调节或控制序列的一个例子可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响多肽表达的部分。用于可能的修饰的其它控制序列包括但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、原肽序列、信号序列和终止序列。
可如下文所述来进行核酸序列的修饰或失活：对细胞进行诱变，并选择其中赖氨酰氧化酶生产能力被降低或消除的细胞。可例如通过使用合适的物理或化学诱变剂，使用合适的寡核苷酸，或对DNA序列进行PCR诱变，进行特异或随机的诱变。另外，可通过使用这些诱变剂的任何组合进行诱变。
适用于该目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
使用这类试剂时，典型地如下进行诱变：在合适的条件下，存在选择的诱变剂时，孵育要被诱变的细胞，并选择显示降低的赖氨酰氧化酶活性或不表达赖氨酰氧化酶活性的细胞。
可通过在编码多肽的核酸序列或其转录或翻译所需的调节元件中引入、取代或去除一个或多个核苷酸，完成本发明多肽生产的修饰或失活。例如，可插入或去除核苷酸，从而导致终止密码子的引入、起始密码子的去除，或开放读码框的改变。可通过定点诱变或PCR诱变，根据本领域已知的方法完成这类修饰或失活。
尽管修饰通常体内进行，即直接在表达待修饰的核酸序列的细胞上进行，但是优选如下文所例证的体外进行所述修饰。
失活或降低选择的宿主细胞对赖氨酰氧化酶的生产的一种便利方式的例子基于基因置换(gene replacement)或基因中断(gene interruption)的技术。例如，在基因中断方法中，体外诱变对应于感兴趣的内源基因或基因片段的核酸序列，生产缺陷的核酸序列，所述缺陷的核酸序列随后被转化进宿主细胞中，产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷核酸序列代替内源基因或基因片段。优选地，缺陷基因或基因片段还编码下述标记物，所述标记物可被用于选择其中编码多肽的基因被修饰或破坏的转化体。
或者，可使用与多肽编码序列互补的核苷酸序列，通过确立的反义技术，实现编码本发明多肽的核酸序列的修饰或失活。更特定地，可通过引入与编码多肽的核酸序列互补的核苷酸序列，降低或消除多肽的生产。反义多核苷酸随后会典型地在细胞中被转录，并且能够与编码赖氨酰氧化酶的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，细胞中生产的赖氨酰氧化酶的量会被降低或消除。
优选要根据本发明的方法被修饰的细胞是微生物来源，例如是适用于生产预期蛋白质产物的真菌菌株，所述预期的蛋白质产物与细胞同源或异源。
本发明还涉及亲本细胞的突变细胞，所述突变细胞包含编码多肽或其控制序列的内源核酸序列的断裂或缺失，这导致突变细胞生产比亲本细胞更少的多肽。
藉此得到的多肽缺陷的突变细胞尤其适合用作表达同源和/或异源多肽的宿主细胞。因此，本发明还涉及用于生产同源或异源多肽的方法，包括(a)在有助于生产多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。在本发明上下文中，术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞而言不是固有的多肽，其中进行修饰改变其天然序列的天然蛋白质，或由于通过重组DNA技术操作宿主细胞而在数量上改变其表达的天然蛋白质。
还在又一方面，本发明提供了通过发酵下述细胞生产基本不含赖氨酰氧化酶活性的蛋白质产物的方法，所述细胞产生本发明的赖氨酰氧化酶多肽以及感兴趣的蛋白质产物。所述方法包括在发酵期间或发酵完成后向发酵液中添加有效量的能够抑制赖氨酰氧化酶活性的试剂，从发酵液中回收感兴趣的产物，并任选地对回收的产物进行进一步纯化。或者，培养后可对得到的培养液进行pH或温度处理，从而大量降低赖氨酰氧化酶活性，并允许从培养液中回收产物。可对从培养液中回收的蛋白质制剂进行组合的pH或温度处理。
在真核多肽的生产中，尤其是在真菌蛋白质例如酶的生产中，对本发明的用于生产基本不含赖氨酰氧化酶的产物的方法尤其感兴趣。赖氨酰氧化酶缺陷型细胞也可被用于表达食品工业或制药学感兴趣的异源蛋白质。
用于鉴定基因的肽基序
可使用一种肽基序鉴定编码含该肽基序的蛋白质的基因。也可使用两种或多种肽基序的组合而不是一种肽基序鉴定编码含有所述肽基序的蛋白质的基因。鉴定一种或若干种编码特异赖氨酰氧化酶的肽基序时，进而可能使用这些肽基序之一或若干的组合来鉴定编码赖氨酰氧化酶的基因。赖氨酰氧化酶被用作如何鉴定这类基因的例子，但是所述方法是普遍适用的。一种可能是使用基序SEQ_ID NO：11的序列，使用程序例如Patscan(http://www-unix.mcs.anl.gov/compbio/PatScan/HTML/)在经翻译的来自DNA数据库的DNA序列中或来自蛋白质序列数据库的蛋白质序列中进行搜索。必需以网站上所述的特定形式输入氨基酸序列。可进行的另一方法是使用SEQ_ID NO：11基序的序列，使用程序如http://myhits.isb- sib.ch/cgi-bin/在经翻译的来自DNA数据库的DNA中或来自蛋白质序列数据库的蛋白质序列中进行搜索。对该程序而言，将基序在搜索视野中输入所谓的Prosite格中，并针对蛋白质序列或经翻译的DNA序列中所述基序的存在搜索数据库。该方法进一步描述于本发明的实施例1中，其使用SEQ_ID NO：11的氨基酸基序，并被用于鉴定编码有用的赖氨酰氧化酶的真菌基因。可使用本领域已知的方法，随后将使用这些方法之一鉴定的基因翻译成蛋白质序列，并且检查其氨基端信号序列的存在。为了检测信号序列，可使用程序如SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。在本发明中，我们发现既含有共有序列又含有预测的信号序列的蛋白质序列可能是分泌型赖氨酰氧化酶。寻找这些组合的特性给出这类酶的工业生产而言巨大的优点。
使用肽基序鉴定赖氨酰氧化酶基因的另一种可能性是：用要鉴定其中赖氨酰氧化酶基因的生物的优选的密码子选择，以SEQ_ID NO：11基序的氨基酸序列成为核苷酸序列的回译(back-translation)为基础，设计寡核苷酸引物，并使用该寡核苷酸与基因文库杂交，或者在PCR引物中与反转录的mRNA库杂交。使用肽序列基序SEQ_ID NO：11，还可能在基因序列未知时分离编码赖氨酰氧化酶的基因。在文献中已描述了设计可用于该目的的简并寡核苷酸引物的方法(Sambrook et al.(1989)Molecular cloning：alaboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press)。还描述了使用简并寡核苷酸作为探针或引物，从生物中分离基因的方法。
编码SEQ_ID NO：11的肽基序的寡核苷酸适用于分离编码赖氨酰氧化酶特性的基因。可通过在核苷酸未知的位置上引入肌苷(I)碱基，来降低这类寡核苷酸的简并性。另外，胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)碱基二者均有可能的位置可被尿嘧啶(U)代替，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)二者均有可能的位置上仅可引入鸟嘌呤，从而降低简并性并且仅小量影响寡核苷酸引物的特异性。另外，为了在已知其中密码子偏好的生物中筛选编码赖氨酰氧化酶的基因的存在，可通过在寡核苷酸的设计中考虑密码子偏好来进一步降低寡核苷酸的简并性。本领域技术人员会知道如何实现。另外，可独立地合成没有简并性的寡核苷酸引物的所有可能组合，并在个别的筛选实验中使用。
首先，在通用载体中从感兴趣的物种构建基因组、cDNA或EST文库。用于文库构建的合适方法描述于文献中(Sambrook et al.(1989)Molecular cloning：a laboratory manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。其次，在对从文库中分离的DNA进行的PCR反应中，与一种通用的寡核苷酸一起使用上述简并寡核苷酸，所述通用的寡核苷酸在载体中重组DNA插入物的边界处引起反应。在文献中已描述了只能获得单个简并寡核苷酸引物时用于分离目的基因的有用策略(例如Minambres et al.(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.272，477-479；PCR technology(1989)Ed.H.A.Erlich pp.99-104，Stockton Press)。第三，对PCR扩增的片段随后进行标记，并用作通过常规手段筛选文库的探针。然后可将全长基因亚克隆进适用于在目的生产宿主生物中过表达赖氨酰氧化酶的表达载体中。
在一种不同的途径中，当不能从下述物种中获得文库时，可用不同的简并引物或用使用单个简并引物的3’-RACE通过PCR扩增基因的部分，所述物种是筛选是否存在编码赖氨酰氧化酶的基因的物种。为此，RNA从感兴趣的物种中分离，并用于使用单个简并引物作为基因特异引物的3’-RACE反应中。先前已描述了使用一种简并的寡核苷酸和一种通用引物，通过3’-RACE对未知cDNA部分的扩增(WO99/38956)。
使用仅来自小肽的信息分离全长基因的传统方法是将经标记的简并寡核苷酸与复制了文库的滤纸杂交。文献中已详尽地描述了使用简并寡核苷酸筛选基因文库的方法，和计算或测定这些寡核苷酸的最适杂交条件的方法(Sambrook et al.(1989))。上述寡核苷酸可被用于该方法中，从不同物种中分离编码赖氨酰氧化酶的基因。
在对该方法的一种变更中，可首先构建部分基因文库。为此，将DNA分级，之后通过与上述经标记的寡核苷酸杂交，检测含有编码赖氨酰氧化酶的基因的DNA片段。这些片段被分离，并用于构建富含编码赖氨酰氧化酶的基因的部分基因文库中。随后可通过常规手段筛选该文库。对这种方法而言，首先用限制性酶消化基因组DNA，之后通过凝胶电泳分离，同时cDNA可被直接分级。
分离编码赖氨酰氧化酶的基因的一种不同的方法是使用针对任何共有序列的肽获得的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。文献中已详尽地描述了对小肽特异的抗体的生产方法(Harlow，E and Lane，D(1988)Antibodies；a laboratory manual，ISBN 0-87969-314.-2)。
可通过将cDNA或基因组DNA克隆进下述载体中构建表达文库，所述载体适合在便利的宿主例如E.coli或酵母中表达插入物。表达载体可基于噬菌体λ或不基于噬菌体λ。已公开了通过表达文库生产的抗原的免疫检测，和纯化表达抗原的特异克隆的方法。使用对任何共有基序的肽特异的抗体，可能使用该方法分离编码含有该基序的赖氨酰氧化酶的基因。
实际上，考虑到本发明中所述信息时，许多不同的方法可被用于分离编码赖氨酰氧化酶的基因。使用肽基序序列信息优于现有技术方法的优点是能够快速并相对容易地鉴定编码活性赖氨酰氧化酶的新颖基因。序列信息的使用表明新颖的赖氨酰氧化酶在乳酪制造或食品工业其它应用中的价值，而不需要在直接应用实验中对所有可能的氧化酶进行费时的测试。
我们会在以下的实施例中阐述本发明。我们会阐述新颖的赖氨酰氧化酶的鉴定、克隆、生产、纯化和生物化学表征。我们会进一步阐述赖氨酰氧化酶在食品制备中的用途。
附图说明
图1：赖氨酰氧化酶表达载体pGBFINZGR-1、pGBFINZGT-1、pGBFINGLO-1、pGBFINZGY-1和pGBFINGLO-2的构建。在该图中感兴趣的基因被标记为Xxx，所述代码可以被表1的任何代码代替。
图2：SDS-PAGE图谱，其显示Aspergillus niger中赖氨酰氧化酶的蛋白质表达。样品取自培养物上清液，并被点在SDS-PAGE(10％NUPAGE，Invitrogen)上。C：对照，不含被转化的质粒的宿主菌株。M：标记物蛋白质(116、66、45、35、25、18和14kDa)、ZGR、ZGT、GLO-1、GLO-2和ZGY：过表达的赖氨酰氧化酶。箭头指出过表达的蛋白质的位置。
图3：85℃下12.5％乳清溶液的粘度发展，其用赖氨酰氧化酶ZGR、ZGT或GLO-1处理或不经处理。
图4：κ-酪蛋白、α-酪蛋白和κ-酪蛋白与α-酪蛋白混合物的SDS-PAGE图谱，以及用赖氨酰氧化酶ZGR孵育后的相同图谱。
序列
SEQ_ID NO 1：Aspergillus nidulans ZGR蛋白质
SEQ_ID NO 2：Cryptococcus neoformans ZGT蛋白质
SEQ_ID NO 3：Fusarium graminearum GLO1蛋白质
SEQ_ID NO 4：Podospora anserina ZGY蛋白质
SEQ_ID NO 5：Fusarium graminearum GLO2蛋白质
SEQ_ID NO 6：Aspergillus nidulans ZGR合成DNA
SEQ_ID NO 7：Cryptococcus neoformans ZGT合成DNA
SEQ_ID NO 8：Fusarium graminearum GLO1基因组DNA
SEQ_ID NO 9：Podospora anserina ZGY合成DNA
SEQ_ID NO 10：Fusarium graminearum GLO2基因组DNA
SEQ_ID NO 11：共有基序：IHD[NS]LSGSMHDHV[IL]NFK
实施例
实施例1
在真菌基因组序列中鉴定推定的赖氨酰氧化酶编码基因
大量生产来自真菌来源的分泌型赖氨酰氧化酶是人们感兴趣的，因为它们能够被用于食品应用。目前，唯一被描述的来自丝状真菌的分泌型赖氨酰氧化酶来自于Aspergillus oryzae，并在EP 1466979 A1的SEQ_ID NO：2中描述。本文中我们尝试在真菌Aspergillus niger中过表达该Aspergillusoryzae酶。令人惊讶的是，在Aspergillus niger中过表达该序列后在培养液中未能测量到赖氨酰氧化酶活性。为了解释这一惊人的结果，我们更详细地检查了EP 1466979 A1中所述的氨基酸序列。令人惊讶的是，推定的Aspergillus oryzae赖氨酰氧化酶的序列在一些方面中与其它赖氨酰氧化酶和铜胺氧化酶的序列在重要的位置上不同。即，EP 1466979 A1的SEQ_IDNO：2中所述Asperillus oryzae基因的经注释的的蛋白质的164位是丙氨酸，而在所有其它所述胺和赖氨酰氧化酶中，该位置高度保守地为脯氨酸。另外，该经注释的的蛋白质是甲硫氨酸，而在胺氧化酶中，该位置上的亮氨酸是高度保守的。另外，与哺乳动物和Pichia赖氨酰氧化酶相比时，EP 1466979A1中所述蛋白质在残基109以后含有2个氨基酸的额外插入。EP 1466979A1中所述蛋白质中的499位是苏氨酸，而在其它胺氧化酶中，该位置始终是疏水残基和残基。蛋白质中保守的位置通常与酶的基本功能相关，并且不能对其作出改变但不改变酶的催化活性。因此值得怀疑，EP 1466979A1中所述的蛋白质序列是否的确正确并且编码功能性赖氨酰氧化酶。因此，在EP 1466979A1中一些转化体中测量的氧化酶活性可能不归因于所述基因的过表达。
因为过表达来自EP 1466979A1的基因的途径是不成功的，所以我们小心地检查了赖氨酰氧化酶的氨基酸序列，并且在本文中提出了下述氨基酸序列基序，所述基序适用于鉴定来自真菌的赖氨酰氧化酶。我们提出：适用于鉴定真正的真菌赖氨酰氧化酶的基序是：
I-H-D-[NS]-L-S-G-S-M-H-D-H-V-[IL]-N-F-K(SEQ_ID NO：11)
在该基序中，每个氨基酸用标准IUPAC单字母代码表示，其中在一个位置上可能是多个氨基酸，可能的氨基酸处于括号中。
我们用基序SEQ_ID NO：11，在http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/上用模式搜索选项搜索了trEMBL(经翻译的EMBL DNA数据库)。该程序能够用确定的基序例如SEQ_ID NO：11搜索经翻译的DNA或蛋白质数据库。为此，将所述基序在模式搜索视野中输入所谓的Prosite格中，如上文所述，并针对蛋白质序列或经翻译的DNA序列中所述基序的存在搜索各个数据库。使用该方法，我们能够鉴定来自真菌来源的6个可能的赖氨酰氧化酶，所述赖氨酰氧化酶之前未被指定为该活性并且均含有基序SEQ_IDNO：11。编码6个新的可能的赖氨酰氧化酶中4个的基因展示于表1中，并且来源于Aspergillus nidulans、Cryptococcus neoformans、Fusariumgraminearum和Podospora anserina。除了这4条序列以外，来自Cryptococcus neoformans的第二基因(Q5KEB2_CRYNE)和来自Neurosporacrassa的基因(Q7S286_NEUCR)也存在基序SEQ_ID NO：11。6条序列均来自真菌，所述真菌来自种系发生上广泛分离的物种，来自两个分离的门担子菌亚门和子囊菌亚门，表示蛋白质基序在进化中是高度保守的，并且编码生物化学上相关的氨基酸残基。有趣的是，所有演绎出的蛋白质序列在蛋白质的氨基端含有推定的信号序列，并因此可能编码分泌型蛋白质。
为了测试序列基序是否的确适用于鉴定具有相关活性的赖氨酰氧化酶，我们克隆并过表达了编码表1中提到的4个新蛋白质的基因。作为对照，我们还包括了来自Fusarium graminearum的第二基因，其与所有4个其它的赖氨酰氧化酶具有明显的同源性，但是缺乏所述氨基酸序列基序。使用该对照实验，我们能够研究所述基序的使用是否的确适用于鉴定和检测来自真菌来源的新颖的相关赖氨酰氧化酶。
表1：被表达的酶的特性列表。
  供体生物   质粒名称   蛋白质   代码   基序   表达   检录号(trEMBL)
  Aspergillusnidulans   pGBFINZGR-1   SEQ_IDNO 1   ZGR   +   +++   Q5B038_EMENI
  Cryptococcusneoformans   pGBFINZGT-1   SEQ_IDNO 2   ZGT   +   +   Q55P44_CRYNE
  Fusariumgraminearum   pGBFINGLO-1   SEQ_IDNO 3   GLO1   +   +++   Q4HWI1_GIBZE
  Podosporaanserina   pGBFINZGY-1   SEQ_IDNO 4   ZGY   +   ++   Q86ZN4_PODAN
  Fusariumgraminearum   pGBFINGLO-2   SEQ_IDNO 5   GLO2 -  +++   Q4HWS1_GIBZE
通过DNA2.0(http://www.dnatwopointo.com/)制造能够编码上述蛋白质的合成基因。可能合成生产任何基因序列并在克隆和表达中使用。使用下述算法设计合成的基因(SEQ_ID NO：6、7和9)，所述算法使编码序列适应在Aspergillus niger中高表达基因的密码子偏好(WO 06/077258)。针对这一点的例外是两个Fusarium基因的序列，从中得到基因组DNA序列(SEQ_ID NO：8和10)。使用的基因序列编码分别在SEQ_ID NO：1-5中提到的蛋白质。将克隆位点PacI和AscI分别引入这些酶编码序列的上游和下游，从而简化克隆步骤。用PacI和AscI消化含有合成的推定的赖氨酰氧化酶基因的片段，分离包含编码序列的PacI/AscI片段，并使用标准分子生物学方法与pGBFIN-5中的PacI/AscI phyA片段交换(WO99/32617)。使用得到的表达质粒在Aspergillus niger中表达不同的基因，并如表1中所述命名。克隆步骤和表达质粒的结构展示于图1中。在合成的基因Xxx的位置，可填入表1中所述基因的代码，得到表1中所述质粒。将感兴趣的基因的编码序列克隆到Aspergillus niger的glaA启动子下游，并且Aspergillus nidulans的amdS基因作为在Aspergillus niger中选择的标记物存在于表达质粒上。
实施例2
通过A.niger转化和过表达推定的真菌赖氨酰氧化酶
通过用NotI消化，将表达载体pGBFINZGR-1、pGBFINZGT-1、pGBFINGLO-1、pGBFINZGY-1和pGBFINGLO-2线性化，所述消化从表达载体中去除所有E.coli衍生的序列。使用苯酚∶氯仿∶异戊醇(24∶23∶1)萃取纯化被消化的DNA，并用乙醇沉淀。使用这些载体转化Aspergillus nigerCBS513.88。Aspergillus niger转化步骤详尽地描述于WO 98/46772中。还描述了如何在含乙酰胺的琼脂平板上选择转化体，和如何选择定向的多拷贝整合体。优选地，选择含多拷贝表达盒的A.niger转化体用于进一步产生样品材料。对赖氨酰氧化酶表达载体而言，如下针对每个被转化的质粒纯化了30个A.niger转化体：首先将个体转化体涂布在选择性培养基平板上，然后将单个菌类涂布在PDA平板上。在30℃生长1周后收集个体转化体的孢子。将孢子冷冻储存并用于接种液体培养基。
使用含多拷贝表达盒的A.niger菌株，通过将所述菌株在摇瓶培养中培养产生样品材料。培养A.niger菌株和从培养液中分离菌丝体的一种有用的方法描述于WO 98/46772中。培养基为CSM-MES(每升培养基中150g麦芽糖、60g Soytone(Difco)、15g(NH4)2SO4、1g NaH2PO4·H2O、1g MgSO4·7H2O、1g L-精氨酸、80mg Tween-80、20g MES pH6.2)。在发酵的第4-8天取样5ml，在Hereaus labofuge RF中于5000rpm下离心10分钟，并将上清液储存于-20℃下直至进一步分析。
图2显示了培养后通过上清液的SDS-PAGE(考马斯染色)测定的蛋白质表达谱。显然，从Aspergillus nidulans、Cryptococcus neoformans、Fusarium graminearum和Podospora anserina克隆的赖氨酰-氧化酶显示极佳的过表达，说明它们被充分地表达和分泌。这是高度惊人和出乎意料的，因为与宿主Aspergillus niger接近得多的Aspergillus oryzae酶不能被过表达，尽管先前已报道(EP1 466 979)该经注释的的Aspergillus oryzae赖氨酰氧化酶能够在异源宿主中表达。下述四种赖氨酰氧化酶基因在该宿主中被有效地表达，所述基因的所有供体生物都与Aspergillus niger更不相关。来自Fusarium graminearum的基因GLO2也有效地被表达并从Aspergillusniger中分泌。
实施例3
从A.niger上清液中纯化过表达的赖氨酰氧化酶
如下对Aspergillus niger中过表达的赖氨酰氧化酶进行更大量的培养，所述赖氨酰氧化酶衍生自Aspergillus nidulans、Cryptococcus neoformans、Fusarium graminearum和Podospora anserina。将表达相关赖氨酰氧化酶的经转化的A.niger菌株在下述培养基中培养，所述培养基每升含有麦芽糖.H2O：40g；Soytone(Difco)：30g；(NH4)2SO4：15g，NaH2PO4·H2O：1g；MgSO4·7H2O：1，L-精氨酸：1g，Tween-80：0.08g，柠檬酸钠：70g。将pH调节至6.2。在30℃下生长5-6天后，通过添加3.5g/l苯甲酸钠并再延长孵育6小时杀死细胞。然后向发酵液中添加10g/l CaCl2和45g/l助滤剂(Dicalite BF；Gent，比利时)。通过最初的编织物过滤，之后经过Z-2000和Z-200滤器(Pall)的过滤去除菌丝体。使用带有10kDa膜的Amicon超滤池进行超滤，直至体积减少2-4倍。如下进行赖氨酰氧化酶的纯化：
赖氨酰氧化酶ZGR(衍生自Aspergillus nidulans)
在Amicon超滤池中，在20mM Tris.HCl(pH7.5；缓冲液A1)中将含赖氨酰氧化酶ZGR的浓缩培养上清液平衡至1.8mS/cm的电导率。随后使用5ml/min的流速将样品上样在Q-Sepharose柱(5ml Q-FF Hitrap，Pharmacia)上。用3倍体积(cv)缓冲液A1洗涤后，使用从缓冲液A1到B1(B1＝缓冲液A1+1M NaCl)的20cv线性梯度洗脱赖氨酰氧化酶。通过SDS-PAGE鉴定在340mM NaCl左右洗脱的赖氨酰氧化酶，将其合并并转移至带有10kDa膜的Amicon浓缩池中，从而将缓冲液改变为25mM磷酸钠(pH6.6；缓冲液A2)。然后将样品应用在Q-Sepharose柱(5mlQ-FF Hitrap，Pharmacia，5ml/min)上，在缓冲液A2中平衡。用3cv缓冲液A2洗涤后，在从缓冲液A2到缓冲液B2(B2＝缓冲液A2+1M NaCl)的20cv线性梯度中洗脱赖氨酰氧化酶。将含有赖氨酰氧化酶的级分合并。通过SDS-PAGE(考马斯染色)测定所述酶至少为95％纯净。
赖氨酰氧化酶ZGT(衍生自Crvptococcus neoformans)
基本如针对ZGR所述纯化赖氨酰氧化酶ZGT，使用以下的改动：缓冲液A1和B1为pH 7.1而不是pH 7.5。赖氨酰氧化酶在第一步骤中在330mM NaCl处被洗脱，在第二柱中在470mM NaCl处被洗脱。通过SDS-PAGE(考马斯染色)测定所述蛋白质至少为95％纯净。
赖氨酰氧化酶GLO-1(衍生自Fusarium graminearum)。
基本如针对ZGR所述纯化赖氨酰氧化酶GLO-1，使用以下的改动：缓冲液A1和B1为pH 7.0而不是pH 7.5；缓冲液A2含有20mM Tris.HCl(pH7.7)，缓冲液B2含有20mM Tris.HCl(pH7.7)+1M NaCl。GLO-l在第一步中在90mM NaCl处被洗脱，在第二纯化步骤中其不与柱结合并且存在于流出液中。通过SDS-PAGE(考马斯染色)测定所述蛋白质至少为95％纯净。
赖氨酰氧化酶GLO-2(衍生自Fusarium graminearum)
基本如针对ZGR所述纯化赖氨酰氧化酶GLO-2，使用以下的改动：缓冲液A1和B1为pH 7.0而不是pH 7.5；缓冲液A2含有20mm Tris.HCl(pH7.9)，缓冲液B2含有20mM Tris.HCl(pH7.9)+1M NaCl。GLO-2在第一纯化步骤中在分别为80和200mM的两个峰中被洗脱，表明存在一些蛋白质异质性。未对此进行进一步检查。将两峰合并并用于第二纯化步骤中，其中所述酶分别在180和400mM的两个级分中再次洗脱，其中大部分蛋白质(～80％)在180mM处洗脱。将该级分合并并用于进一步的分析。
赖氨酰氧化酶ZGY(衍生自Podospora anserina)
基本如ZGR所述纯化赖氨酰氧化酶ZGY，使用以下的改动：缓冲液A1含有50mM乙酸钠(pH5.0)，缓冲液B 1含有50mM乙酸钠(pH5.0)+1M NaCl。在第二纯化步骤中，使用羟磷灰石柱(XK16/20，30ml，Pharmacia，2ml/min)。缓冲液A2含有10mM磷酸钠(pH6.8)，缓冲液B2含有500mM磷酸钠(pH6.8)。通过SDS-PAGE(考马斯染色)测定所述蛋白质至少为95％纯净。
使用Bradford试剂测定蛋白质浓度。
实施例4
赖氨酰氧化酶的活性测定
赖氨酰氧化酶对胺底物的酶活性导致H2O2和NH3的形成。两种反应产物均可被用于监测酶活性。
赖氨酰氧化酶活性监测H2O2的形成。
使用可得自Invitrogen的Amplex Red单胺氧化酶测定试剂盒，监测赖氨酰氧化酶活性。反应根据制造商的说明进行。除非另有说明，测定溶液中的底物浓度为1mM。除非另有说明，反应在30℃下进行，并且使用Genios微量滴定板读数器(TECAN)按时监测反应。为了测定酶的pH最适度，使用以下的缓冲液：25mM柠檬酸钠(pH3.0，pH6.0)、25mM乙酸钠(pH4.0，pH5.0)、25mM Tris.HCl(pH7.0，pH8.0)和Tris.Glycine(pH9.0，pH10.0)。
赖氨酰氧化酶活性监测NH 3 的形成
在37℃下开放的Eppendorff管中，通过将酶在含10mM Ac-Gly-Lys-OMe(得自Bachem，德国)和25mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)的溶液中轻柔摇动(500rpm)孵育4小时，测定赖氨酰氧化酶活性。用氨检测试纸(得自Hach，德国)检测NH3的形成。在空白实验中，添加水代替酶溶液。墨绿色的形成是NH3存在的信号；没有氨时得到黄色。
使用以下的底物(测试溶液中10.0mM)在Amplex Red测试中测试赖氨酰氧化酶ZGR、ZGT、GLO-1、GLO-2和ZGY的赖氨酰-氧化酶活性：Ac-Gly-Lys-OMe、Ac-Lys-OMe(均得自Bachem，德国)、苄胺和对酪胺(Invitrogen)。在含赖氨酸底物的情况下，唯一游离的氨基是赖氨酸侧链中的氨基，因为α-氨基被封闭。因此，对这些底物的任何活性明确地发出赖氨酰-氧化酶活性的信号。结果在下文中给出；活性表示为用显示最大活性的底物获得的活性的％。Pichia酶的数据从Kuchar & Dooley(J InorgBiochem(2001)83，193-204)公开的kcat/Km值计算。
  酶代码   Ac-Gly-Lys-OMe   Ac-Lys-OMe   p-酪胺   苄胺
  ZGR   182   157   122   100
  ZGT   208   162   174   100
  GLO-1   204   167   96   100
  GLO-2   32   87   213   100
  ZGY   385   262   239   100
  Pichia pastoris   95   未测定   未测定   100
表1：赖氨酰氧化酶对若干底物的活性。酶对苄胺的活性被设定为100％；其它活性被表述为该活性的％。
如针对赖氨酰氧化酶所预期的，酶均对Ac-Gly-Lys-OMe显示明显的偏好。显然ZGR、ZGT、GLO-1和ZGY对赖氨酰基具有惊人的高度偏好，并且当肽底物更大时活性更高(Ac-Gly-Lys-OMe与Ac-LysOMe相比)。惊人的是，它们对赖氨酸底物的偏好甚至比Pichia赖氨酰氧化酶更强。其中与Ac-Gly-Lys-OMe相比，Pichia衍生的赖氨酰氧化酶对苄胺具有稍微更多的活性，而ZGR、ZGT、GLO-1和ZGY对赖氨酰-底物具有明显的偏好。另外，如Pichia酶一样，GLO-2蛋白质对小底物如苄胺和酪胺具有明显的偏好。令人惊讶的是，使用氨基酸序列基序鉴定的四种赖氨酰氧化酶对赖氨酸底物具有更高的偏好，缺乏基序之一的赖氨酰氧化酶具有较不优选的活性谱。显然，使用氨基酸基序的搜索特异地鉴定对赖氨酸底物具有更优选的活性的赖氨酰氧化酶，并因此是有用的赖氨酰氧化酶鉴定中的一个重要的新工具。应当注意，使用BLASTP测定使用基序SEQ_IDNO：11发现的赖氨酰氧化酶彼此仅40-60％相同，但是显然所有这些酶共有的是这些酶的特异性更加朝向对赖氨酸底物的更高偏好。使用BLASTP测定具有相似同源核心但是缺乏基序SEQ_ID NO：11的酶(如GLO2)以及来自Pichia pastoris和Aspergillus oryzae的赖氨酰氧化酶不显示该底物特异性。
还使用Ac-Gly-Lys-OMe作为底物，针对氨释放酶测试了酶ZGR、ZGT和GLO-1。在所有情况下，氨的释放均被明确证明。这些结果进一步证实所鉴定的酶是赖氨酰氧化酶。
实施例5
赖氨酰氧化酶对多种蛋白质底物的活性
在pH 6下针对以下蛋白质底物测试赖氨酰氧化酶ZGR、ZGT和GLO-1的活性：乳清(来自的BiPro)、酪蛋白(得自DMV，荷兰)、谷蛋白水解产物(在55℃，pH 4.1下用Fromase 750TL(得自DSM，荷兰)将致命谷蛋白(得自Protinax)水解1小时。通过在85℃下热处理15分钟使酶失活，并喷雾干燥)。为了参照的目的，在如前所述的条件下使用Ac-Gly-Lys-OMe。结果在下文中给出。多种赖氨酰氧化酶的活性被定量为形式++++(非常有活性，可与Ac-Gly-Lys-OMe相比)、+++(很有活性)、++(中度活性)、+较少活性、-无活性。
  酶   乳清   酪蛋白   谷蛋白   Ac-Gly-Lys-OMe
  ZGR   +   ++++   ++++-   ++++
  ZGT   +   ++++   ++   ++++
 GLO-1   -   +/-   +   ++++
 GLO-2   -   -   -   +
表2：ZGR、ZGT和GLO-1对乳清、酪蛋白和谷蛋白的活性。
显然，赖氨酰氧化酶彼此间活性不同，而且对多种蛋白质的活性也不同。乳清蛋白质最难以被赖氨酰氧化酶修饰，而酪蛋白是最易受ZGR和ZGT影响的底物。ZGR对谷蛋白也非常有活性，其中ZGT仅有中度活性。GLO-1在三种赖氨酰氧化酶中具有最少活性，其对乳清蛋白显示没有可检测的活性，对酪蛋白几乎没有活性，对谷蛋白有少量活性。然而，结果明显证明酶对蛋白质中赖氨酸残基有活性，如针对赖氨酰氧化酶所预期的。如根据实施例4的结果所预期的，GLO-2对任何蛋白质底物均不显示活性。
实施例6
赖氨酰氧化酶的pH和T谱的测定
使用实施例4中所示缓冲液，在pH范围3-8中测定赖氨酰氧化酶的pH谱。测定在两步中进行。首先在固定的时间周期中在适当的pH下进行反应。然后将溶液在标准缓冲液中稀释用于Amplex Red测定法(H2O2)，并测定初始速率。pH谱的记录在30℃下使用苄胺作为底物进行。结果在表3中给出。
  酶   pH最适度 ＞80％最大活性的pH范围   T-最适度(℃)
  ZGR   4.0   3.5-7.0   30
  ZGT   5.0   4.5-5.5   ＜20
  GLO-1   6.0   5.5-6.5   50
  ZGY   9.0   8.0-10.0   40
表3.最适pH和其中赖氨酰氧化酶显示＞80％最大活性的pH范围。
表格显示赖氨酰氧化酶具有不同的pH最适度，范围从pH 4到pH 9。具有最广泛pH范围的赖氨酰氧化酶为ZGR(3.5个pH单位)。
这些酶的温度最适度在其pH最适度下测定并在表3中给出。GLO-1酶显示最高的T-最适度(50℃)。ZGR、ZGT和ZGY具有相对低的T-最适度，但是其温度范围与许多食品引用充分相容。ZGT的T-最适度相当低，甚至低于20℃。
实施例7
证明赖氨酰氧化酶中的醌结构
已知赖氨酰氧化酶在活性位点中含有醌结构。因此，我们使用以下的步骤验证了鉴定的赖氨酰氧化酶中这类辅因子的存在。将赖氨酰氧化酶ZGR、ZGT和GLO-1上样在SDS-PAGE(10％bis-Tris NuPage，Invitrogen)上，然后Western印迹在硝酸纤维素纸上。通过用NBT(硝基-四唑蓝氯化物)(2M甘氨酸钠中0.24mM，pH10)染色印迹使醌显影。醌结构的存在导致蛋白质所述位置上出现紫色。ZGR、ZGT和GLO-1清楚地显示该紫色的形成。作为对照，包括内切蛋白酶(Maxiren600，得自DSM，荷兰)和羧肽酶(Accelerzyme CPG，得自DSM，荷兰)。已知这些酶不具有醌基，并且在用NBT染色后不显示紫色。该实验显示赖氨酰氧化酶ZGR、ZGT和GLO-1含有醌结构，如针对赖氨酰氧化酶所预期的那样。从该实验不能推测醌的精确性质。
实施例8
加热时赖氨酰氧化酶用于修饰浓缩的乳清溶液构造的用途
在该方法的第一步中，将WPI(BiPro，Davisco)在MilliQ水中溶解至10.5％并在室温下与ZGR、ZGT或GLO-1(10mg酶/25ml溶液)孵育过夜。用赖氨酰氧化酶处理未显示蛋白质溶液粘度的任何显著改变，表明不存在或低水平(＜1％)的蛋白质交联。在对照实验中，添加水代替酶溶液。然后将溶液转移至Rapid Visco分析仪(RVA-4NewPort Scientific，澳大利亚)的测量池中，在85℃下平衡。在该方法的第二步中，允许所述方法第一步中形成的反应性中间产物在共价键的形成下反应。将溶液缓慢搅拌(50rpm)并监测粘度的改变。图5清楚地显示在空白中未发生粘度改变，表明无凝胶形成。相反，赖氨酰氧化酶的添加导致粘度的显著提高。这对ZGR而言是特别显著的。用赖氨酰氧化酶处理导致凝胶形成清楚地发生，意味着在所述方法第一步中制备的反应性蛋白质底物的反应性。令人惊讶的是，甚至GLO-1也具有作用，尽管在实施例4中未观察到该赖氨酰氧化酶对乳清蛋白的活性。实施例4中的反应仅在数分钟内被监测，而在本实施例中，允许酶与蛋白质过夜反应。酶对乳清蛋白具有显然低的活性，但是仍然足以影响加热后的粘度发展，如在该实施例中所证明的。显然，赖氨酰氧化酶能够产生反应性蛋白质中间产物，所述中间产物可在第二步骤中通过加热被用于修饰浓缩的乳清溶液的构造。乳清蛋白作为膨胀剂(texturizing agent)存在于许多食品中；其具有能够用赖氨酰氧化酶修饰乳清蛋白质膨胀特性的工业利益，并且具有能够制备反应性中间产物的特殊利益，所述中间产物可随后被用于修饰食物构造。
实施例9
赖氨酰氧化酶ZGR改进米面包体积的用途
将480克米粉(BL-250，van Sillevoldt，荷兰)和20克米蛋白质(Remy Industries，0400061)在Hobart混合机(第一速度：2分钟，第二速度：3分钟)中与475克水、22.5克Koningsgist(Gilde，荷兰)、10克NaCl、5克蔗糖、50克biskien(脂肪，UniPro，荷兰)、20克黄胞胶和12ppm Bakezyme P500(DSM，荷兰)。用手使生面团成形，首先在38℃下醒发20分钟，最后在38℃下醒发40分钟(均在85％相对湿度下)。在一个实验中混合之前添加赖氨酰氧化酶ZGR(100ppm)，在对照实验中不添加赖氨酰氧化酶。含有赖氨酰氧化酶的生面团被判断为更加醒发。使用MIWE Combo烤箱(Amstein，德国，闭合的阀门(closed valve))烘焙面包(240℃，20分钟)。烘焙后，含有赖氨酰氧化酶的面包在结构上更稳定并且体积更大。
实施例10
乳蛋白质的交联
在水中制备κ-酪蛋白、α-酪蛋白和κ-酪蛋白与α-酪蛋白混合物(均0.3％w/v)的3％(w/v)溶液，并在37℃下与赖氨酰氧化酶ZGR(0.1mg/ml)孵育过夜。随后将样品在85℃下加热(30分钟)。制备对照样品，其中不添加赖氨酰氧化酶ZGR。在SDS-PAGE上分析样品(见图4)。明显地，赖氨酰氧化酶的添加导致下述蛋白质的形成，所述蛋白质与其中未添加赖氨酰氧化酶的对照相比具有提高的分子量。用赖氨酰氧化酶ZGR处理导致共价的蛋白质交联，导致更高分子量的聚集物。
序列表
<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120>新颖的赖氨酰氧化酶
<130>25977WO
<160>11
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>817
<212>PRT
<213>Aspergillus nidulans ZGR
<400>1
Met Lys Leu Pro Leu Ser Phe Ser Gly Gly Ile Ala Leu Leu Leu Ile
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Ala Gly Asp Val Val Ala Thr Lys Leu Asp Pro Ser Arg
            20                  25                  30
Asp Leu Val Arg Gln Lys Ser Arg Gly Arg Lys Asn Gln Met Arg Ser
        35                  40                  45
Leu Val Gly Arg Ser Asn Gln His Ile Thr His Gln Ser Arg Pro Tyr
    50                  55                  60
Thr Asn Glu Tyr Ala Ser Pro Cys Gln Ile Thr Pro Pro Gln Glu Ile
65                  70                  75                  80
Lys Ala Pro Lys Glu Asn Val Trp Tyr Gly Leu Thr Asp Asp Glu Thr
                85                  90                  95
Ala Asp Val Ala Lys Trp Leu Phe Gly Arg Pro Glu Leu Asn Leu Thr
            100                 105                 110
Thr Thr Glu Asn Ala Gly Glu Trp Asp Asn Thr Ile Ala Leu Ile Glu
        115                 120                 125
Leu His Arg Pro Asn Lys Ser Glu Ala Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Ser
    130                 135                 140
Gly Pro Ala Pro Thr Arg His Ala His Val Arg Leu Asn Asn Arg Ala
145                 150                 155                 160
Thr Thr Asp Pro Tyr Phe Ala Asp Ile Leu Val Gly Pro Leu Pro Val
                165                 170                 175
Ser Asn Ala Thr Thr Trp Glu Pro Leu Glu Phe Pro Tyr Thr Arg Lys
            180                 185                 190
Thr Gln Gly Gln Val Arg Asn Val Glu Pro Asp Gly Glu Thr Val Tyr
        195                 200                 205
Ser Glu Trp Leu Phe Lys Ile Ser Ala Ser Ile Ala Asp Ile Thr Leu
    210                 215                 220
Asp Leu Trp Asn Gly Thr Ala Leu Gly Leu Glu Asn Asp Thr Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ile Trp Gly Ile Asp Pro Leu Trp Gln Asp Asp Gly Arg Ile Ile Arg
                245                 250                 255
Trp Asp Met Phe Trp Asn Met Ala Asp Asp Glu Phe Asp Ser Glu Thr
            260                 265                 270
Leu Leu Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Lys Ser Asp Val Thr Gly Arg Asp
        275                 280                 285
Pro Ser Gln Trp Lys Leu Leu Gly Trp Met Tyr Asn Asp Ile Phe Tyr
    290                 295                 300
Glu Thr Thr Glu Glu Phe Arg Lys Ala Tyr Trp Ser Pro Gly Phe Val
305                 310                 315                 320
Lys Leu Lys Pro Asn Val Asp Gly Ala Trp Ala His Thr Glu Gln Arg
                325                 330                 335
Gly Pro Val Pro Pro Gln Asp Arg Lys Gln Pro Pro Val Met Ile Ala
            340                 345                 350
Pro Asp Gly Ala Arg Tyr Ser Val Asp Ala Glu Arg Lys Tyr Val Thr
        355                 360                 365
Trp Met Asp Phe Ser Phe Tyr Ile Ala Phe Asn Arg Asp Thr Gly Leu
    370                 375                 380
Ser Leu Phe Asp Ile Lys Tyr Lys Gly Gln Arg Val Leu Tyr Glu Leu
385                 390                 395                 400
Gly Leu Gln Glu Ala Leu Ala His Tyr Ala Ala Asn Asp Pro Val Gln
                405                 410                 415
Ser Ser Val Ala Tyr Leu Asp Ser Tyr Tyr Gly Phe Gly Pro Tyr Ala
            420                 425                 430
Phe Glu Leu Leu Lys Gly Tyr Asp Cys Pro Ser Tyr Ala Ser Tyr Leu
        435                 440                 445
Asn Thr Ser Phe Tyr Lys Asp Glu Glu Thr His Thr His Val Asp Ser
    450                 455                 460
Leu Cys Leu Phe Glu Phe Asp Ala Asp Tyr Pro Met Ala Arg His Ser
465                 470                 475                 480
Thr Ser Glu Phe Val Ser Val Thr Lys Asn Val Tyr Phe Thr Leu Arg
                485                 490                 495
Ser Val Ser Thr Ile Gly Asn Tyr Asp Tyr Met Phe Ser Tyr Asn Phe
            500                 505                 510
His Met Asp Gly Thr Ile Gly Val Glu Val Arg Ala Ser Gly Tyr Ile
        515                 520                 525
Gln Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Asn Gln Asp Phe Gly Tyr Gln Ile His
    530                 535                 540
Asp Ser Leu Ser Gly Ser Met His Asp His Val Leu Asn Phe Lys Ala
545                 550                 555                 560
Asp Phe Asp Ile Leu Gly Pro Asn Asn Thr Ile Glu Leu Val Ser Val
                565                 570                 575
Val Pro Val Thr Lys Gln Phe Ser Trp Ser Gly Asn Lys Thr Arg Asn
            580                 585                 590
Thr Met Gln Leu Gly Arg Ser Phe Ile His Ser Glu Asp Glu Ala Arg
        595                 600                 605
Leu Asn Trp Gly Phe Asn Gly Gln Thr Gln Leu His Val Val Asn Gln
    610                 615                 620
Asp Lys Pro Asn Lys Phe Gly Glu Pro Arg Gly Tyr Arg Ile Leu Pro
625                 630                 635                 640
Ser Ala Gly Thr Ala His Leu Thr Val Leu Asn Ser Ser Asn Leu Val
                645                 650                 655
His Ala Ala His Trp Ala Glu Tyr Asp Val Gln Val Thr Arg Gln His
            660                 665                 670
Asp Phe Glu Pro Thr Ser Ala His Pro Tyr Asn Ser Gln Asp Ile His
        675                 680                 685
Asn Pro Pro Val Asp Phe Ser Thr Phe Phe Asn Gly Glu Ser Leu Asn
    690                 695                 700
Gln Thr Asp Leu Val Val Trp Leu Asn Leu Gly Met His His Val Pro
705                 710                 715                 720
His Thr Gly Asp Leu Pro Asn Thr Val Phe Thr Thr Ala His Ser Gly
                725                 730                 735
Val Ala Phe Thr Pro Leu Asn Tyr Leu Pro Gly Asp Pro Ser Arg Glu
            740                 745                 750
Thr Val Asn Met Val Arg Val Asp Tyr Ser Asp Gly Ala Ala Thr Ala
        755                 760                 765
Val Arg Thr Phe Gly Gln Ser Asn Glu Thr Cys Ser Val Val Leu Gln
    770                 775                 780
Pro Val Glu Asn Glu Leu Trp Ser Tyr Gln Gly Asp Val Val Val Arg
785                 790                 795                 800
Lys Phe Pro Tyr Asp Pro Asn Asp Pro Phe Tyr Glu Thr Asp Ser Asp
                805                 810                 815
Ala
<210>2
<211>801
<212>PRT
<213>Cryptococcus neoformans ZGT
<400>2
Met Arg Ala Ile Ala Leu Leu Tyr Leu Leu Gly Thr Ala Phe Ala Val
1               5                   10                  15
Pro Ser Pro Lys Ile Ser Asn Val Lys Lys Pro Gly His Tyr His His
            20                  25                  30
Pro His Arg Arg Asp Ile Val Thr Asn Glu Val Asp Ala Ser Ala Ser
        35                  40                  45
Ser Pro Thr Thr Ser Ala Pro Lys Asp Asn Ile Trp Asn Phe Leu Ser
    50                  55                  60
Asn Asp Glu Ala Ala Gly Ile Ile Ala Phe Leu His Ser Gln Thr Glu
65                  70                  75                  80
Leu Asn Leu Thr Ala Val Asn Asp Ala Gly Asp Trp Asp Asn Thr Ile
                85                  90                  95
Thr Val Val Asp Leu Leu Pro Pro Asn Lys Thr Glu Ala Leu Ser Tyr
            100                 105                 110
Met Asp Gly Asn Gly Thr Lys Pro Glu Arg Trp Gly Ile Ala Ser Leu
        115                 120                 125
Leu Cys Gly Ala Thr Glu Glu Pro Tyr Ala Gln Asp Leu Val Val Gly
    130                 135                 140
Pro Leu Pro Val Ser Glu Val Thr Ile Tyr Tyr Pro Tyr Thr Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Thr His Ala Pro Asp Ala Lys Ile Arg Val Tyr Asp Met Asp Asp Asn
                165                 170                 175
Ser Glu Phe Leu Ser Asp Ile Ala Met Ser Met Lys Asp Ile Ile Ser
            180                 185                 190
Asp Ile Leu Asn Ala Thr Ile Asp Thr Ala Asp Asp Leu Ala Asp Thr
        195                 200                 205
Phe Asp Ile Trp Gly Ile Asp Pro Leu Trp His Gln Pro Asp Glu Asn
    210                 215                 220
Gly Asn Asp Arg Val Ile Tyr Trp Ala Gly Phe Trp Arg Tyr Pro Asp
225                 230                 235                 240
Ser Leu Gln Met Glu Asn Ser Thr Ile Asn Phe Asp Gly Glu Thr Leu
                245                 250                 255
Leu Pro Gln Gly Leu Tyr Ile Gln Thr Asp Ile Thr Gly Arg Asp Arg
            260                 265                 270
Ser Lys Trp Ala Leu Met Gly Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Tyr Tyr Thr
        275                 280                 285
Ser Val Asp Glu Phe Arg Ala Ala Trp Arg Lys Pro Gly Phe Lys Lys
    290                 295                 300
Phe Thr Pro Asn Tyr Ser Gly Asp Trp Ile Gly Thr Asp Gln Thr Gly
305                 310                 315                 320
Asp Val Met Pro Phe Glu Thr Glu Ala Pro Pro Met Asn Val Gln Pro
                325                 330                 335
Gly Gly Gln Arg Phe Lys Val Asp Glu Asp Asn Lys Tyr Val Glu Trp
            340                 345                 350
Met Asp Phe Ser Phe Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Asp Thr Gly Met Arg
        355                 360                 365
Leu Tyr Asp Val Lys Phe Lys Gly Glu Arg Ile Ile Tyr Glu Leu Gly
    370                 375                 380
Leu Gln Glu Ala Ile Ala His Tyr Ala Gly Asn Asp Pro Val Gln Ser
385                 390                 395                 400
Gly Thr Ala Tyr Leu Asp Thr Tyr Tyr Gly Phe Gly Pro Tyr Ala Phe
                405                 410                 415
Ser Gln Val Pro Gly Phe Asp Met Pro Leu Tyr Ala Tyr Cys Met Asn
            420                 425                 430
Thr Ser Phe His Ala Ala Glu Leu Ser Thr Ser His Arg Cys Gly Ile
       435                 440                 445
Ser Ile Phe Glu Ala Asp Gln Asn Tyr Pro Ile Gln Arg His Ser Asn
    450                 455                 460
Met Asn Tyr Val Ser Ala Thr Lys Asn Ile Ala Leu Thr Leu Arg Ser
465                 470                 475                 480
Ile Ser Thr Val Gly Asn Tyr Asp Tyr Asn Phe Asp Tyr Asn Phe Tyr
                485                 490                 495
Leu Asp Gly Thr Ile Glu Thr Val Val Arg Ala Ser Gly Tyr Ile Gln
            500                 505                 510
Ser Ala Phe Tyr Ala Asn Asn Thr Glu Tyr Gly Tyr Gln Ile His Asp
        515                 520                 525
Ser Leu Ser Gly Ser Met His Asp His Val Leu Asn Phe Lys Val Asp
    530                 535                 540
Phe Asp Ile Ala Gly Val Glu Asn Thr Leu Val Lys His Ile Val Glu
545                 550                 555                 560
Pro Lys Glu Ile Lys Tyr Lys Trp Asn Asn Leu Thr Arg Ser Thr Met
                565                 570                 575
His Leu Val Arg Lys Glu Ile Thr Asn Glu Asp Glu Gly Lys Met Asn
            580                 585                 590
Trp Ser His Asn Gly Gln Glu Gln Val Val Ile Val Asn Lys Asp Ala
        595                 600                 605
Pro Asn Lys Tyr Gly Glu Pro Lys Gly Tyr Lys Ile Met Pro Ser Arg
    610                 615                 620
Gly Gly Ser Gly Met His Leu ThrIle Thr Asn Ser Ser Asn Leu Phe
625                 630                 635                 640
Asn Ser Gln Gly Phe Ala Thr His Gln Tyr Tyr Val Leu Lys Arg Lys
                645                 650                 655
Asp Ser Glu Leu Arg Ala Ser Asn Ala Trp Asn Asp Tyr Asp Thr Gln
            660                 665                 670
His Pro Met Ile Asp Phe Ser Lys Tyr Phe Asp Gly Glu Asp Ile Glu
        675                 680                 685
Gln Glu Asp Ile Val Met Tyr Phe Asn Leu Gly Met His His Val Pro
    690                 695                 700
His Thr Gly Asp Leu Pro Asn Thr Val Phe Ser Thr Ala Gln Ser Gly
705                 710                 715                 720
Met Met Ile Leu Pro His Asn Tyr Leu Leu Ser Asp Pro Ser Arg Gln
                725                 730                 735
Ala Thr Gln Gln Ile Arg Ile Asp Tyr Asn Val Asn Ser Thr Thr Asp
            740                 745                 750
Val Tyr Ser Trp Ala Ser Gln Ala Ala Thr Gly Glu Leu Asp Phe Ser
        755                 760                 765
Gln Ile Thr Trp Asp Pro Tyr Thr Tyr Asp Gly Asp Val Ser Val Arg
    770                 775                 780
Lys Phe Pro Tyr Asp Pro Gln Asn Pro Phe Asn Asn Thr Glu Ser Ile
785                 790                 795                 800
Val
<210>3
<211>797
<212>PRT
<213>Fusarium graminearum GLO1
<400>3
Met Gly Lys Glu Lys Thr Glu Leu Thr Met Arg Leu Ile Val Cys Leu
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Ser Leu Ile Phe Asp Arg Arg Val Leu Ala Arg Ser Thr
            20                  25                  30
Ser Asp Gly Pro Ala Ala Arg Tyr Asn Ser Leu Asn Arg His Lys Val
        35                  40                  45
Glu Thr Ser Gln Cys Asp Ser Asn Lys Glu Val Gly Val Lys Ala Pro
    50                  55                  60
Trp Lys Asn Val Phe Gln Ser Leu Thr Asp Gln Glu Tyr Ala Asp Val
65                  70                  75                  80
Thr Ala Tyr Leu His Lys Gln Glu Glu Leu Asn Leu Thr Ala Ile Val
                85                  90                  95
Asn Ser Thr Ser Trp Asp Asn Val Ile Val Ser Met Asp Leu Leu Gln
            100                 105                 110
Pro Asn Lys Thr Asp Ala Leu Thr Tyr Leu Glu Gly Asn Gly Pro Ala
        115                 120                 125
Pro Ala Arg Tyr Ala Arg Ala Thr Leu Gln Phe Asn Ser Gln Leu Gln
    130                 135                 140
Pro Tyr Ile Gln Glu Tyr Met Val Gly Pro Leu Pro Val Gln Glu Gly
145                 150                 155                 160
Ser Thr Arg Tyr Glu Glu Leu Asn Tyr Met Phe Ser Ser Gly Arg Gly
                165                 170                 175
Arg Ile Asn Val Tyr Asn Ala Asp Thr Glu Ala Ile Ala Glu Phe Asn
            180                 185                 190
Leu Ala Val Gly Thr Glu Ile Gln Asn Ile Thr Lys Gln Leu Leu Asn
        195                 200                 205
Gly Thr Ala Thr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Leu Leu Ile Ala Gly Ser
    210                 215                 220
Asp Pro Leu Ile His Asn Asp Asp Arg Val Tyr Gln Trp Asn Glu Phe
225                 230                 235                 240
Tyr Thr Ala His Thr Gly Gln Phe Phe Ser Glu Thr Ile Leu Pro Thr
                245                 250                 255
Ser Leu Gln Phe Lys Val Asp Ile Thr Gly Arg Asp Pro Ser Lys Trp
            260                 265                 270
Lys Val Val Gly Trp Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Trp Ser Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Glu Phe Lys Glu Gly Ser Lys Thr Leu Lys Arg Lys Pro Gly Pro Asn
    290                 295                 300
Val Asp Gly Leu Trp Thr Ser Thr Asp Gln Gln Gly Asp Lys Leu Pro
305                 310                 315                 320
Leu Asp His Leu Gln Pro Pro Thr Ala Val Gln Pro Asp Gly Pro Arg
                325                 330                 335
Phe Arg Val Asp Arg Glu Glu Asn Tyr Ile Glu Trp Met Asp Phe Ser
            340                 345                 350
Phe Phe Ile Ser Asn His Lys Glu Thr Gly Leu Gln Leu His Asp Val
        355                 360                 365
Arg Tyr Arg Gly Glu Arg Ile Ile Tyr Glu Leu Gly Leu Gln Glu Ala
    370                 375                 380
Met Ala His Tyr Ala Ser Gln Asp Pro Leu His Ala Ser Ser Ala Tyr
385                 390                 395                 400
Leu Asp Thr Ser Tyr Gly Ile Gly Thr Ser Gln Trp Asn Leu Val Asp
                405                 410                 415
Gly Phe Asp Cys Pro Ser His Ser Thr Tyr Leu Asn Thr Ser Phe Tyr
            420                 425                 430
Ile Ser Glu Met Thr His Ile His Pro Asn Ser Leu Cys Leu Phe Glu
        435                 440                 445
His Asp Thr Gly Tyr Pro Ile Gln Arg His Leu Thr Gly Thr Tyr Val
    450                 455                 460
Ser Ala Thr Lys Asn Ile Val Phe Thr Val Arg Ser Val Ser Thr Val
465                 470                 475                 480
Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Phe Glu Tyr Thr Phe His Tyr Asp Gly Ser
                485                 490                 495
Ile Ser Val Thr Val Arg Ala Ser Gly Tyr Ile Gln Gly Ala Phe Trp
            500                 505                 510
Ser Gly Asp Gly Asp Tyr Gly Phe His Ile His Asp Asn Leu Ser Gly
        515                 520                 525
Ser Met His Asp His Val Ile Asn Phe Lys Leu Asp Leu Asp Ile Lys
    530                 535                 540
Gly Arg Lys Asn Ser Val Leu Lys Thr Glu Phe Val Pro Val Ser Val
545                 550                 555                 560
Val Tyr Pro Trp Ser Glu Gly Gln Ser Ile Asn Thr Met Lys Ala Asn
                565                 570                 575
Arg Ser Tyr Ile Ala Ser Glu Asp Glu Gly Lys Ile Thr Trp Ala Lys
            580                 585                 590
Asn Gly Ala Ala Ala Tyr Ala Val Val Asn Lys Asp Ala Leu Asn Asp
        595                 600                 605
Phe Gly Glu Ala Pro Gly Tyr Ala Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ser Thr
    610                 615                 620
Gly His Leu Thr Val Gln Ser Ser Thr Ala Leu Gly Gln Ser Ala Asn
625                 630                 635                 640
Trp Ala Asn His Asn Ile Phe Ala Leu Gln Gln His Asp Thr Glu Pro
                645                 650                 655
Lys Ser Ala Tyr Ala Phe Asn Ser Tyr Asp Pro His His Pro Ala Val
            660                 665                 670
Asp Phe Asn Lys Phe Phe Asn Gly Glu Ser Leu Asp Gln Glu Asp Ile
        675                 680                 685
Val Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Met His His Leu Pro Asn Thr Ala Asp
    690                 695                 700
Leu Pro Asn Thr Val Thr Thr Lys Ala Val Ser Ser Met Met Ile Ser
705                 710                 715                 720
Pro Gln Asn Tyr Phe Ser Gly Asp Ile Ser Arg Arg Thr Met His Gln
                725                 730                 735
Val Arg Val Ser Phe Asp Asp Lys Ser Asn Val Thr Ala Val Asn Met
            740                 745                 750
Phe Gly Thr Lys Gln Pro Thr Cys Ala Phe Asp Met Ala Lys Ala Ala
        755                 760                 765
Pro Lys Leu Asp Thr Phe Val Gly Glu Leu Gln Ile Pro Lys Phe Pro
    770                 775                 780
Phe Asn Pro Ser Gly Ser Leu Gln Thr Asn Pro Gly Gly
785                 790                 795
<210>4
<211>821
<212>PRT
<213>Podospora anserina ZGY
<400>4
Met Gly Phe Phe Asp Ser Leu Ser Pro Arg Ala Val Ala Thr Ser Ala
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Thr Ser Phe Ala Gln Asp Ala Leu Ala Arg Pro Asn Pro
            20                  25                  30
Asp Pro Lys Ala Pro Trp Val Lys Asn Thr Gly Leu Gly Lys Lys Lys
        35                  40                  45
Met Ala Asn His Leu Lys Arg Ala Ile Met Gly Asp Arg Arg Ala Val
    50                  55                  60
Glu Thr Pro Phe Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr Glu Ile Lys Ala Pro
65                  70                  75                  80
Lys Pro Asn Val Trp Gly Pro Leu Val Asp Val Glu Val Ala Ser Val
                85                  90                  95
Val Glu Trp Leu Phe Ala Gln Ala Asp Leu Asn Leu Thr Val Thr Glu
            100                 105                 110
Glu Ala Gly Gly Trp Asp Asn Thr Ile Gln Leu Val Glu Ala Met Trp
        115                 120                 125
Pro Asn Lys Thr Asp Val Leu Ala Phe Val Asp Gly Asp Gly Pro Ala
    130                 135                 140
Pro Thr Lys Tyr Ala His Val Val Leu Asn Asn Arg Ala Thr Glu Thr
145                 150                 155                 160
Pro His Tyr Ala Asp Ile Ile Val Gly Pro Leu Pro Leu Asp Asn Ala
                165                 170                 175
Thr Ala Lys Trp Glu Pro Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Lys Gln Asn Gly
            180                 185                 190
Gly Lys Val Arg Asn Leu Asp Ala Asp Ser Asp Arg Leu Tyr Ser Glu
        195                 200                 205
Trp Leu Phe Lys Ile Gly Ala Ser Val Ala Asp Ile Thr Leu Asp Leu
    210                 215                 220
Trp Asn Gly Thr Ala Met Gly Leu Glu Asn Asp Thr Leu Ser Ile Trp
225                 230                 235                 240
Gly Ile Asp Pro Leu Trp Gln Asp Asp Gly Glu Ile Ile Arg Trp Asp
                245                 250                 255
Thr Phe Trp Asn Ile Pro Thr Gly Asp Phe Asp Asp Met Thr Leu Phe
            260                 265                 270
Pro Leu Gly Leu Tyr Phe Ser Ser Glu Val Ser Gly Arg Asp Pro Ser
        275                 280                 285
Lys Trp Glu Leu Arg Gly Trp Leu Tyr Asn Ser Val Phe Tyr Ala Thr
    290                 295                 300
Thr Glu Glu Phe Arg Ala Ala Tyr Trp Ser Glu Asp Phe Val Lys Asn
305                 310                 315                 320
Gly Pro Asn Val Asp Gly Asp Trp Ala Arg Thr Asp Lys Asn Gly Glu
                325                 330                 335
Thr Pro Glu Met Asp Lys Ala Gln Gly Pro Val Ile Val Ala Pro Ala
            340                 345                 350
Gly Ala Arg Phe Ala Val Asp His Lys Glu Lys Tyr Val Glu Trp Met
        355                 360                 365
Asp Trp Ser Phe Tyr Val Gly Phe Asn Arg Asp Thr Gly Pro Gly Leu
    370                 375                 380
Phe Asp Ile Arg Tyr Lys Gly Glu Arg Leu Val Tyr Glu Leu Ser Leu
385                 390                 395                 400
Gln Glu Ala Leu Ala His Tyr Ala Gly Asn Asp Pro Met Asn Ser Gly
                405                 410                 415
Thr Ala Tyr Leu Asp Ser Phe Tyr Gly Phe Gly Pro Tyr Thr Phe Glu
            420                 425                 430
Leu Val Lys Gly Tyr Asp Cys Pro Ala Tyr Ala Thr Tyr Met Asn Thr
        435                 440                 445
Ser Phe Tyr Val Asn Glu Glu Thr Arg Thr His Ile Asp Ser Leu Cys
    450                 455                 460
Leu Phe Glu Tyr Val Ala Asp Tyr Pro Met Gln Arg His Thr Thr Ser
465                 470                 475                 480
Asp Tyr Val Ser Val Thr Lys Asn Thr Tyr Phe Val Ile Arg Ser Ile
                485                 490                 495
Ala Thr Ile Gly Asn Tyr Asp Tyr Gln Gln Ser Phe Ser Phe Phe Met
            500                 505                 510
Asp Gly Ser Phe Ala Val Glu Val Arg Ala Ser Gly Tyr Ile Gln Ser
        515                 520                 525
Ala Tyr Phe Ala Gly Asn Glu Asp Tyr Gly Phe Lys Ile His Asp Asn
    530                 535                 540
Leu Ser Gly Ser Met His Asp His Val Leu Asn Phe Lys Ala Asp Phe
545                 550                 555                 560
Asp Val Leu Gly Thr Asn Asn Ser Ile Glu Leu Met Ser Met Val Pro
                565                 570                 575
Val Ser Arg Ser Tyr Pro Trp Ser Ala Gly Lys Val Arg Asn Thr Met
            580                 585                 590
Ala Leu Glu Arg Lys Phe Ile Glu Thr Glu Asp Glu Ser Arg Phe Asn
        595                 600                 605
Trp Gly Pro Asn Ser Ala Thr Gln Val Leu Ile Val Asn Glu Asn Glu
    610                 615                 620
Arg Asn Lys His Gly Glu Met Arg Gly Tyr Arg Val Leu Pro Tyr Met
625                 630                 635                 640
Gly Thr Ala His Leu Thr Val Gln Asn Ser Thr Asn Leu Gly Val Ala
                645                 650                 655
Ala Gln Trp Ala Asn His Asp Val Gln Ile Thr Lys Tyr Lys Asp Ser
            660                 665                 670
Glu Gln Lys Ala Tyr His Ala Phe Asn Thr Gln Asp Val His Asp Pro
        675                 680                 685
Pro Val Asn Phe Asp Lys Tyr Phe Asp Gly Glu Ser Val Arg Asn Glu
    690                 695                 700
Asp Ile Val Leu Trp Leu Asn Leu Gly Met His His Val Pro His Thr
705                 710                 715                 720
Gly Asp Leu Pro Asn Thr Val Gln Thr Thr Ala His Ser Gly Ile Gln
                725                 730                 735
Phe Met Pro Ser Asn Tyr Phe Asp Ile Asp Gln Ser Arg Arg Thr Val
            740                 745                 750
Asn Gln Val Arg Ile Asn Tyr Phe Asn Gly Ser Ala Glu Val Glu Glu
        755                 760                 765
Phe Gly Gln Phe Lys Val Gly Ser Ser Glu Gly Thr Cys Ser Thr Cys
    770                 775                 780
Lys Leu Asn Tyr Thr Pro Leu Glu Pro Glu His Gln Gly Tyr Lys Gly
785                 790                 795                 800
Asp Val Val Ile Arg Lys Phe Pro Phe Asp Pro Asn Asn Pro Phe Tyr
                805                 810                 815
Ala Thr Ser Gly Ile
            820
<210>5
<211>770
<212>PRT
<213>Fusarium graminearum GLO2
<400>5
Met Arg Pro Ser Gly Leu Leu Val Ser Leu Ser Leu Val Pro Leu Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Arg Ala Phe Pro Pro Ala Arg Leu Glu Ser Arg Lys Glu Asp
            20                  25                  30
Ser Cys Ser Ser Val Gln Pro Ser Ala Ser Ala Pro His Lys Asn Phe
        35                  40                  45
Trp Gly Ser Leu Thr Lys Lys Glu Thr Ala Asp Val Leu Ala Phe Leu
    50                  55                  60
His Arg Asp Thr Thr Gly Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Asn Ala Thr
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Asn Lys Ile Met Ser Val Glu Leu Met Met Pro Asn Lys
                85                  90                  95
Ser Asp Thr Leu Pro Phe Leu Ser Asp Lys Ala Gly Ser Pro Thr Arg
            100                 105                 110
Tyr Ala Leu Ala Ala Val Met Phe Gly Val Pro Glu Lys Ala Tyr Leu
        115                 120                 125
Gln Glu Phe Lys Val Gly Pro Leu Pro Ile Thr Asn Ala Ser Ser Val
    130                 135                 140
Thr Pro Phe Thr Phe Ala Asn Thr Lys Lys Gly Asp Gly Lys Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Val Asn Pro Asp Ala Glu Asp Tyr Gly Asn Phe Asn Leu Lys Ile
                165                 170                 175
Met Lys Glu Ala Glu Asp Val Thr Lys Leu Leu Trp Asn Leu Thr Val
            180                 185                 190
Asp Asp Gly Leu Gln Ile Pro Leu Ala Phe Ala Ala Pro Ile Asn Val
        195                 200                 205
Thr Asp Gly Lys Val Ile Met Trp Gln Gly Phe Asn Ala Pro Val Thr
    210                 215                 220
Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ser Leu Leu Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Arg
225                 230                 235                 240
Thr Asp Ile Thr Gly Arg Asp Pro Ser Gln Trp Lys Val Thr Gly Trp
                245                 250                 255
Val Tyr Gly Asn Glu Phe Tyr Lys Asp Leu Asp Gly Leu Arg Ala Ala
            260                 265                 270
Val Ala Lys Pro Asp Phe Lys Pro Leu Gly Met Asn Leu Asp Gln Pro
        275                 280                 285
Trp Ala His Thr Asn Lys His Gly Asp Asp Leu Pro Leu Asp Asp Glu
    290                 295                 300
Ala Pro Pro Ala Asn Val Gln Ser Gly Lys Ser Arg Phe Ala Val Asp
305                 310                 315                 320
Glu Asp Glu Ser Tyr Val Thr Trp Met Asp Phe Ser Phe Tyr Thr Ser
                325                 330                 335
Ile Thr Arg Asp Asn Gly Leu Arg Leu Tyr Asp Val Lys Tyr Lys Gly
            340                 345                 350
Lys Arg Ile Leu Tyr Glu Leu Gly Leu Asp Glu Ala Ile Ala His Tyr
        355                 360                 365
Ala Gly Ile Asp Pro Val Gln Ser Gly Ile Cys Tyr Phe Asp Ser Met
    370                 375                 380
Ser Gly Phe Gly Pro Ala Met Ile Ser Leu Val Lys Gly Tyr Asp Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Tyr Ser His Tyr Ser Asn Val Thr Gln Thr Thr Gly Glu Thr
                405                 410                 415
Thr Phe Thr Gln Lys Asp Ala Leu Cys Met Phe Glu Ile Asp Lys Gly
            420                 425                 430
Phe Pro Ile Gln Arg His Ser Trp Ala Gly His Thr Thr Val Thr Lys
        435                 440                 445
Asn Ile Ala Phe Asn Ile Arg Ala Ile Tyr Thr Ile Gly Asn Tyr Asp
    450                 455                 460
Tyr Met Met Thr Tyr Gln Phe His Leu Asp Gly Ser Ile Glu Ile Asp
465                 470                 475                 480
Val Arg Ala Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Ala Phe Tyr Ala Glu Asn Glu
                485                 490                 495
Asp Tyr Gly Phe Lys Ile His Asp Ser Leu Ser Gly Ser Leu His Asp
            500                 505                 510
His Val Ile Thr Phe Lys Ala Asp Phe Asp Ile Leu Gly Glu Lys Asn
        515                 520                 525
Ser Leu Gln Lys Ile Asp Ile Lys Pro Ser Thr Glu Lys Tyr Lys Trp
    530                 535                 540
Ser Asp Gln Thr Arg Asn Thr Met Lys Ala Val Lys Ser Phe Ile Asp
545                 550                 555                 560
Asn Glu Asp Asp Ala Lys Ile Asn Trp Ser Pro Asn Gly Ala Thr Met
                565                 570                 575
Tyr Ala Val Val Asn Lys Asp Glu Lys Asn Pro Tyr Gly Glu Ser Pro
            580                 585                 590
Gly Tyr Arg Val Ala Pro Ala Ser Gly Val Ala Tyr Leu Thr Val Gln
        595                 600                 605
Asp Ser Ser Val Met Gln Asn Ala Gly His His Thr Thr His His Leu
    610                 615                 620
Tyr Ala Thr Arg Gln Lys Asp Asn Glu Leu Tyr Ala Val Gly Ala Tyr
625                 630                 635                 640
Asn Ser Leu Thr Pro Glu Asp Pro Gln Val Asp Phe Asn Glu Tyr Phe
                645                 650                 655
Asn Ser Glu Ser Leu Asp Gln Glu Asp Ile Val Leu Trp Phe Asn Leu
            660                 665                 670
Gly Met His His Met Pro His Thr Gly Asp Leu Pro Asn Thr Val Phe
        675                 680                 685
Ser Thr Ala His Ser Ala Met Leu Ile Glu Pro Phe Asn Tyr Leu Met
    690                 695                 700
Gly Asp Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gln Gln Val Leu Ile Lys Thr Lys
705                 710                 715                 720
Lys Asp Gly Lys Pro Glu Ile Val Thr Tyr Gly Ala Lys Asn Ala Thr
                725                 730                 735
Cys Ala Ile Asp Met Ala Gln Leu Asn Pro Asp Leu Ser Asn Tyr Ser
            740                 745                 750
Asn Ser Ile Ser Val Leu Lys Tyr Pro Phe Asp Gly Ser Lys Pro Asp
        755                 760                 765
Arg Leu
770
<210>6
<211>2481
<212>DNA
<213>Aspergillus nidulans ZGR合成的DNA
<400>6
ttaattaaca ccgtcaaaat gaagctccct ctgtcgttct ccggtggtat tgcgttgctc    60
ctgattggat cgcttgctgg agatgtggtg gccaccaagt tggatcctag ccgtgatctc    120
gttcgccaga agtcccgcgg ccgtaagaac cagatgcgct cgctggtcgg ccgtagcaac    180
cagcacatca ctcaccagtc tcgcccctac accaacgaat acgcttctcc ctgccagatc    240
acccctcccc aggagattaa ggcgcctaag gaaaacgtct ggtacggtct cactgacgac    300
gaaaccgctg acgtggccaa gtggcttttc ggccgtcccg agcttaacct caccaccacc    360
gagaacgctg gcgaatggga taacaccatc gctcttatcg agctgcaccg ccctaacaag    420
agcgaggcca tcccttactt ggatggcagc ggtcccgcgc ccacccgtca cgcccacgtt    480
cgtctcaaca accgcgccac caccgatccc tacttcgccg acattctcgt gggtcccctg    540
cccgtctcca acgctactac ttgggagcct ctggaattcc cttacactcg taagactcag    600
ggtcaggtcc gcaacgtcga acccgacgga gagaccgtct actcggagtg gcttttcaag    660
atctctgcct ctatcgcgga catcaccctg gacctttgga acggtaccgc ccttggtctg    720
gagaacgaca ctctcgacat ctggggaatc gatcccttgt ggcaggatga cggacgcatc    780
attcgctggg acatgttctg gaacatggcc gatgacgagt tcgactcgga gaccttgctg    840
cctctcggcc tctacctcaa gtccgacgtc actggccgcg atcctagcca gtggaagttg    900
ctgggttgga tgtacaacga cattttctac gagactactg aggaattccg taaggcctac    960
tggtcccccg gtttcgttaa gctgaagccc aacgttgacg gcgcttgggc ccacaccgag    1020
cagcgcggtc ccgtgccccc ccaggaccgt aagcagcccc ccgtcatgat cgctcctgac    1080
ggcgctcgtt actctgtcga cgccgagcgt aagtacgtta cctggatgga tttctccttc    1140
tacatcgctt tcaaccgcga taccggtctg tccctcttcg acatcaagta caagggtcag    1200
cgtgtgctct acgaactcgg tcttcaggag gctctggccc actacgctgc caacgatccc    1260
gtccagtcct ccgttgcgta cctcgattcc tactacggtt tcggccccta cgccttcgag    1320
cttctcaagg gctacgactg cccctcgtac gcgtcctacc tcaacacttc cttctacaag    1380
gacgaagaga cccacaccca cgttgactct ctctgcctgt tcgagttcga tgccgattac    1440
cctatggccc gccacagcac ctccgagttc gtcagcgtca ccaagaacgt ctacttcacc    1500
ctgcgtagcg tttcgaccat cggaaactac gactacatgt tctcctacaa cttccacatg    1560
gacggtacta ttggcgtcga ggtccgcgcc tctggctaca tccagagcgc ctactacgcc    1620
aacaaccagg acttcggcta ccagatccac gattccctgt ctggttccat gcacgaccac    1680
gtcttgaact tcaaggctga cttcgacatc cttggtccta acaacactat tgagctcgtc    1740
tccgtcgttc ccgtcaccaa gcagttctcc tggtcgggta acaagacccg caacaccatg    1800
cagctgggac gttctttcat ccactccgag gatgaggccc gcctcaactg gggtttcaac    1860
ggccagaccc agctccacgt cgtgaaccag gacaagccca acaagttcgg cgagcctcgt    1920
ggttaccgca tcctcccctc cgccggtacc gctcacttga ccgttctgaa ctccagcaac    1980
cttgttcacg ctgcccactg ggcggagtac gacgtgcagg ttacccgcca gcacgatttc    2040
gagcctactt ccgctcaccc ctacaactct caggatatcc acaacccccc cgtcgacttc    2100
tccaccttct tcaacggtga atccctgaac cagactgacc tcgtcgtctg gctgaacctc    2160
ggtatgcacc acgttcctca caccggagac ttgcccaaca ctgtcttcac caccgctcac    2220
agcggcgtcg ccttcacccc tcttaactac ctccccggtg acccctctcg tgagaccgtc    2280
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ggtgatgtcg tcgtccgtaa gttcccttac gaccccaacg atcccttcta cgagaccgac    2460
tccgacgctt aaaggcgcgc c                                              2481
<210>7
<211>2433
<212>DNA
<213>Cryptococcus neoformans ZGT合成的DNA
<400>7
ttaattaaca ccgtcaaaat gcgcgctatt gccctccttt acttgctggg caccgccttc    60
gctgttccta gccctaagat ttcgaacgtg aagaagcccg gccactacca ccacccccac    120
cgtcgtgaca tcgtcactaa cgaggtcgat gcgtccgctt cctctcccac cacttcggcc    180
cccaaggata acatctggaa cttcctctcc aacgatgaag cggctggaat tatcgcgttc    240
ctccactctc agaccgagct gaacctcact gccgtgaacg acgctggaga ttgggacaac    300
accattaccg ttgtcgacct gcttccccct aacaagaccg aagccctttc ttacatggac    360
ggcaacggaa ctaagcccga gcgctggggc atcgcctctc tcctttgcgg tgccaccgag    420
gagccctacg ctcaggattt ggtggtggga cctctgcctg ttagcgaggt taccatctac    480
tacccctaca cttacggtac ccacgctccc gacgccaaga tccgcgtgta cgacatggac    540
gataactcgg aattccttag cgatatcgcc atgagcatga aggacatcat ctccgatatc    600
ctgaacgcta ccattgacac tgccgacgac ctcgccgaca ccttcgacat ttggggtatt    660
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cacaacggac aggagcaggt cgtgatcgtc aacaaggacg cccctaacaa gtacggtgag  1860
cccaagggct acaagattat gccctctcgc ggtggttctg gtatgcactt gaccatcact  1920
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tccaccgccc agtccggaat gatgatcctt cctcacaact acctgctgag cgacccctct  2220
cgccaggcca ctcagcagat ccgtattgat tacaacgtca actccaccac cgacgtttac  2280
tcctgggcct cgcaggctgc cactggcgag ctcgatttct ctcagatcac ctgggaccct  2340
tacacctacg atggtgacgt cagcgttcgc aagttcccct acgaccctca gaaccccttc  2400
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<210>8
<211>2762
<212>DNA
<213>Fusarium graminearum GLO1基因组DNA
<400>8
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tgaaccgtca caaagtcgaa acgtcacaat gtgattccaa caaggaagtt ggtgtcaagg    180
ccccatggaa aaatgttttc cagagcctga cagatcaaga gtatgctgat gttactgcat    240
atcttcacaa gcaggaagaa ctcaacctga ccgctattgt gaactcgaca tcgtgagtct    300
tgaacttttt actttctcca tcctactgat tttttcgaaa atcctttgct ctgctgtcta    360
cctttgcaca tcaacaagtc ttggctgact ttataaagtt gggataatgt catcgtgtct    420
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caagagtaca tggttggccc attacctgtt caggaagggt ccactcgata cgaagagctc    600
aattacatgt tctcatctgg acgtggtcgc attaacgtgt acaacgctga tactgaggcc    660
attgctgagt tcaaccttgc tgttggaacg gaaatacaga acataaccaa gcagcttctc    720
aatggcgtaa gtaaccgatg tccggattcg ttttcgatgc tccatgctaa tgacgccaac    780
agactgctac aggtgctaaa gacgacagtc ttctaatcgc aggcagtgat cctctgatcc    840
acaacgatga cagggtctat cagtggaacg agttctacac tgctcacacg ggtcaattct    900
tttcagagac gatcctccct accagtctgc agttcaaagt cgatatcacc ggtcgagatc    960
cttccaaatg gaaggtggtc ggttggtatt acgacggcag ctattggtcg acgaccgccg    1020
agtttaaaga gggatctaag acgctcaaga gaaagccagg gcccaacgtt gatgggcttt    1080
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tacatcagcg agatgactca catccacccc aacagcttgt gtcttttcga acatgatact    1560
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tttactgttc gcagcgtctc tacagttggc aactatgact atttgttcga gtataccttt    1680
cattacgacg ggtccattag cgtcactgtt agagcgtctg gctatatcca gggagcgttt    1740
tggtccggag atggcgatta tggctttcat atccatgata acctgtcagg ttctatgcat    1800
gaccatgtca ttaactttaa gctcgatctg gatatcaaag gcaggaagaa tagtgtgtta    1860
aagactgagt ttgtgcccgt ctcagtagtg tacgttgttt tccatccatt atactaccat    1920
gtactaactt gaacagatac ccctggtctg agggacaatc aatcaatact atgaaggcca    1980
accggtcgta tatcgccagt gaggacgagg gcaagattac atgggcgaag aatggagcag    2040
ctgcatatgc agttgtcaac aaggatgctc tgaatgattt cggagaggca cctggctacg    2100
cgatttctcc aagtaagtat cccctacatg gatacaaacc tggacgacac taaccggctt    2160
cgcagacagc ggtagcacag ggcacttgac ggtgcagtca tctacagctc ttggacagtc    2220
cgcaaactgg gccaatcaca acattttcgc cctgcagcaa cacgacaccg agccgaaaag    2280
cgcttacgct ttcaatagtt atgatccgca ccacccagct gtagacttca ataaattctt    2340
caatggggag agtctcgatc aagaagacat cgttttgtaa gtaaccctta ctgagcatta    2400
ctattacccg agactaacag ttacgcaaga tacttcaacc tcggcatgca ccacctacct    2460
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cctcagaatt acttttcagg cgatatctca cgacggacca tgcatcaagt gcgtgtctcc    2580
ttcgatgaca agtcaaatgt cactgctgtc aacatgtttg gaacgaagca gcctacttgc    2640
gcgtttgata tggccaaggc cgcacccaag ttggatacct tcgttgggga gcttcagatt    2700
cctaaatttc ctttcaaccc aagtggaagt cttcagacaa accccggtgg ttaaggcgcg    2760
cc                                                                   2762
<210>9
<211>2493
<212>DNA
<213>Podospora anserina ZGY合成的DNA
<400>9
ttaattaaca ccgtcaaaat gggcttcttc gactctctgt cccctcgcgc ggtggctact    60
tcggctctcc ttttgacctc cttcgcccag gacgctctcg cgcgtcccaa ccccgatcct    120
aaggccccct gggtcaagaa caccggtctg ggaaagaaga agatggccaa ccaccttaag    180
cgcgccatca tgggtgaccg tcgcgctgtt gaaaccccct tctgcagcga aactttggcc    240
accgagatca aggcccccaa gcctaacgtt tggggtcctc tcgtcgatgt cgaggtcgct    300
tccgttgtcg aatggctctt cgcccaggct gatctgaacc tgaccgtgac tgaggaggct    360
ggaggctggg ataacaccat ccagcttgtc gaggctatgt ggcctaacaa gaccgatgtc    420
ctcgccttcg tggacggtga cggacccgcg cccactaagt acgctcacgt tgttctcaac    480
aaccgtgcta ccgagactcc ccactacgcc gacattatcg tgggtcccct ccccttggac    540
aacgccactg ccaagtggga gcctcttgag tacccctaca ctaagcagaa cggtggcaag    600
gttcgcaacc tggacgctga ctccgatcgt ctgtacagcg agtggctgtt caagattgga    660
gcctctgtcg ccgacatcac ccttgacctc tggaacggta ccgccatggg cctcgagaac    720
gacaccctgt ccatttgggg catcgaccct ctctggcagg atgacggcga gattatccgt    780
tgggatacct tctggaacat ccctaccggt gatttcgacg acatgaccct gttccccttg    840
ggcctctact tctcgtccga agtctctggt cgtgacccct ccaagtggga gcttcgcggc    900
tggctgtaca acagcgtctt ctacgcgacc accgaggagt tccgcgctgc ctactggagc    960
gaagatttcg tgaagaacgg tcccaacgtc gatggtgact gggctcgcac tgacaagaac    1020
ggtgagaccc ccgaaatgga caaggcccag ggccctgtta ttgtcgctcc tgccggagct    1080
cgtttcgctg tcgatcacaa ggaaaagtac gttgaatgga tggattggtc gttctacgtc    1140
ggtttcaacc gcgacaccgg tcccggcctc ttcgatatcc gttacaaggg tgagcgtttg    1200
gtctacgagc tttctctcca ggaggccctg gcgcactacg ccggcaacga ccctatgaac    1260
tccggtaccg cctacctgga cagcttctac ggtttcggcc cctacacttt cgagctcgtt    1320
aagggttacg actgccccgc ctacgccacc tacatgaaca cctccttcta cgtgaacgag    1380
gaaacccgca ctcacatcga ttccctctgc ctcttcgagt acgtcgctga ctaccccatg    1440
cagcgccaca ccacctctga ttacgtgagc gtcaccaaga acacttactt cgtcatccgt    1500
tcgatcgcta ccatcggcaa ctacgactac cagcagagct tctctttctt catggacggt    1560
tccttcgcgg tcgaggttcg cgcctccgga tacattcagt ccgcttactt cgccggtaac    1620
gaggactacg gcttcaagat ccacgataac cttagcggat cgatgcacga ccacgtcctg    1680
aacttcaagg ccgacttcga cgtgttgggc accaacaact ccattgagct tatgtctatg    1740
gtccccgtct cccgctccta cccctggtct gctggtaagg tccgtaacac catggccctg    1800
gagcgcaagt tcatcgagac tgaagatgag tcgcgtttca actggggtcc taactccgct    1860
acccaggttc tcatcgttaa cgagaacgag cgtaacaagc acggcgaaat gcgcggctac    1920
cgtgtgctcc cttacatggg caccgcccac ctgactgtcc agaacagcac caacttgggt    1980
gtcgctgcgc agtgggccaa ccacgacgtt cagatcacca agtacaagga ttccgagcag    2040
aaggcttacc acgccttcaa cactcaggac gtccacgatc cccccgttaa cttcgacaag    2100
tacttcgacg gagaatctgt ccgcaacgag gatattgtcc tctggctgaa ccttggtatg    2160
caccacgtgc ctcacaccgg tgacctcccc aacactgttc agaccaccgc ccacagcggc    2220
atccagttca tgccctccaa ctacttcgac atcgatcagt cgcgccgtac cgtcaaccag    2280
gtgcgtatta actacttcaa cggttccgct gaggtcgagg aattcggaca gttcaaggtc    2340
ggtagctctg agggcacctg ctccacttgc aagctgaact acacccctct cgagcccgag    2400
caccagggtt acaagggcga cgttgtcatc cgcaagttcc ccttcgaccc taacaacccc    2460
ttctacgcca cctccggtat ctaaaggcgc gcc                                 2493
<210>10
<211>2965
<212>DNA
<213>Fusarium graminearum GLO2基因组DNA
<400>10
ttaattaact cataggcatc atgcgtccct caggtctcct ggtctcgctt tcgctggtgc    60
ctctggctct agccagagct tttcctcccg caaggttgga aagtcgcaag gaggactctt    120
gttcgtcggt ccagccgtct gcgagtgctc ctcacaagaa cttctggggt tctctgacca    180
agaaagagac tgctgatgtt ctcgcatttt tgcatcgcga tacaacaggt ttcaatctga    240
ccgttgcaga gaatgctact aggtatttat tggatcctat gtgattttga aaccactaac    300
agttcattat agtcgcgata acaagatgtg agtcttgtac tatgaaccat gattttaacc    360
tcaactcaca aggttttagc atgtccgttg agctcatgat gcccaacaag agtgatactc    420
tcccattctt gtcagacaaa gcgggtagcc caacacgata cgccctagct gcggtcatgt    480
ttggcgtacc tgaaaaggct tatctccagg aattcaaagt tggtccgttg cccatcacta    540
atgcatcaag tgttacacct tttacttttg caaatacgaa gaagggcgac ggtaagatcg    600
cagtcgtcaa ccctgacgca gaggattatg gcaacttcaa cctcaagatt atgaaggagg    660
cagaggatgt gaccaagctt ctctggaatt tggtgagtta tgtgttttga attccatgtt    720
tctttatcta acatattcaa gacggtcgat gatggactcc aaatcccgtt agcctttgca    780
gcccctatca atgtcaccga tggaaaggtc atcatgtggc aaggcttcaa cgcgccagtt    840
accagcatct acgacacaat ctcactgctt ccactgggtc tgtatttgcg aacagacatc    900
accggccgcg atcctagtca atggaaagtc actggttggg tatacggtaa tgaattctac    960
aaggatctcg atggtttgcg tgcagctgtc gccaagcccg atttcaaacc cctgggaatg    1020
aacttggacc agccttgggc ccacacaaac aaacacggcg atgatctgcc cctggacgat    1080
gaagctccac cagccaatgt tcaatccgga aagtcgagat ttgctgttga tgaagatgag    1140
agctatgtga cttggagtga gtagcttctg attttgacta actgttacac tttactaatt    1200
cgatacgtca gtggactttt ctttctacac tagcattact cgagacaatg gactacgact    1260
gtatgatgtt aagtacaagg gcaagaggat tctctacgag gtatgcatga attgcaaaat    1320
gactacgtct taaactaaca tttctagctt gggctggacg aggcgattgc acattatgcg    1380
taagttgtga aagtaccctg gcctcacgcc actgttattg acaccatttg cagcggtatc    1440
gatcctgtac aatccggaat ttgttatttc gacagcatgt ctggattcgg acccgcaatg    1500
atctctctcg tgaaaggtaa gaattaaaaa tgactcgaga attgttttat cacattgcta    1560
acacgataca ggttacgact gccccgccta ctcgcactac agcaatgtca ctcagactac    1620
aggtgaaacg acgttcactc agaaggacgc tctttgtagg ttgagatctc atgtcaagca    1680
attccacgct aatgaataat caaggcatgt ttgagatcga caagggcttc cccatccaac    1740
gacactcttg ggccggccac accaccgtga caaagaacat tgccttcaac atccgtgcca    1800
tctacacaat cggaaactac gactacatga tgacctacca gtttcacctc gacggttcta    1860
tcgaaatcga tgtcagagca tcaggctaca tctcgtcggc cttctacgct gagaacgaag    1920
actacggttt caagatccac gacagGcttt ccggatctct tcatgatcat gtcatcacat    1980
tcaaagccga ctttgacatc ttgggcgaga agaactcttt gcaaaagatt gatatcaagc    2040
catcaactga gaagtgagta tccattttgt aacagggttt cttttacatc ttactaatct    2100
ggaatagata caagtggtct gatcagacac gcaacactat gaaggcagtc aagagcttca    2160
tcgacaacga agatgacgcc aagatcaact ggtctcccaa tggcgcaaca atgtatgctg    2220
tggtaaacaa agacgagaag aacccctatg gagaaagccc cgggtacagg gttgcaccag    2280
gttagtctca accgaacagg tgaaaaatac gacatcccga ctaacatcca aagcttctgg    2340
tgtggcatat ctcacagtcc aggattcctc ggttatgcaa aacgccggtc accacacaac    2400
gcatcatctc tacgccactc gacaaaagga caacgagctc tacgctgttg gagcgtataa    2460
ttcgcttact cccgaggacc ctcaggttga ctttaatgag tatttcaaca gcgagtcgct    2520
tgaccaagag gatatgtaag tattgtattt cccaccatgg catagacctg ggctgacttg    2580
tgatacagtg ttctttggtt caacctggga atgcaccaca tgcctcacac aggtgatctt    2640
cccaacaccg ttttctcaac cgcccactcc gctatgctca ttgagccatt caactatctt    2700
atgggtgatc cttcgcaggc cagctctcag caagtcttaa tcaagactaa gaaggatggc    2760
aagcctgaga ttgttactta tggcgctaag aatgcgacat gtgcgattga tatggtatgt    2820
accttgatgt ctgtggtttt ttaccatgct aacatgactg attttaggca caactgaacc    2880
ctgatctttc gaactattct aacagtatta gtgttctcaa gtaccccttc gatgggtcaa    2940
agccagaccg tctttgaggc gcgcc                                            2965
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>共有基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以是Asn或Ser
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>Xaa可以是Ile或Leu
<400>11
Ile His Asp Xaa Leu Ser Gly Ser Met His Asp His Val Xaa Asn Phe
1               5                   10                  15
Lys

Claims (14)

1.下述赖氨酰氧化酶催化蛋白质或肽中赖氨酰基成为相应醛的氧化脱氨反应随后将O2还原为H2O2的用途，所述赖氨酰氧化酶
(a)显示出：针对Ac-Gly-Lys-OMe的赖氨酰氧化酶活性和针对苄胺的赖氨酰氧化酶活性之间的比例至少为1.1，优选地至少为1.3，更优选地至少为1.4，其中所述活性在37℃和7.0的pH下测定；和
(b)在0和60℃之间的温度下具有最适活性。
2.下述多肽催化蛋白质或肽中赖氨酰基成为相应醛的氧化脱氨反应随后将O2还原为H2O2的用途，所述多肽具有赖氨酰氧化酶活性并包含以下氨基酸基序(括号中的残基指出该点处允许的简并，氨基酸用单字母代码表示)：
-I H D[N S]L S G S M H D H V[IL]N F K。
3.根据权利要求2的多肽的用途，其中所述多肽具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1到4中任一的整条氨基酸序列具有至少60％的氨基酸序列同一性。
4.根据权利要求3的多肽的用途，所述多肽具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1到4中任一的整条氨基酸序列具有至少60％，优选地至少70％，更优选地至少80％，进一步更优选地至少90％，最优选地至少95％，进一步最优选地至少约97％的同一性。
5.根据权利要求3的多肽的用途，所述多肽包含SEQ ID NO：1到4的氨基酸序列中的任一条。
6.根据权利要求3的多肽的用途或根据权利要求1或2的赖氨酰氧化酶的用途，其中所述多肽或赖氨酰氧化酶得自真菌，优选地得自Aspergillus，更优选地得自Aspergillus nidulans、Cryptococcusneoformans、Podospora anserine和Fusarium graminearum。
7.根据权利要求3的多肽或根据权利要求1或2的赖氨酰氧化酶用于制备食物或饲料或营养药物或用于制备下述中间产物的用途，所述中间产物用于制备食物或饲料或营养药物。
8.用于生产赖氨酰氧化酶的方法，所述方法包括：在适合生产赖氨酰氧化酶的条件下培养包含下述核酸构建体的宿主细胞，以及回收赖氨酰氧化酶，所述核酸构建体包含编码赖氨酰氧化酶的多核苷酸，所述赖氨酰氧化酶包含下述氨基酸序列：
-I H D[N S]L S G S M H D H V[IL]N F K。
9.用于鉴定新的赖氨酰氧化酶的方法，包括针对下述氨基酸序列的存在筛选氨基酸序列：
-I H D[N S]L S G S M H D H V[IL]N F K。
10.修饰含有蛋白质的食物或饲料制品的工艺，所述工艺包括通过将食物或饲料制品与赖氨酰氧化酶接触来修饰所述食物或饲料制品，所述赖氨酰氧化酶选自由以下组成的组：
I.赖氨酰氧化酶，所述酶
(a)显示出：针对Ac-Gly-Lys-OMe的赖氨酰氧化酶活性和针对苄胺的赖氨酰氧化酶活性之间的比例至少为1.1，优选地至少为1.3，更优选地至少为1.4，其中所述活性在37℃和7.0的pH下测定；和
(b)在0和60℃之间的温度下具有最适活性；和
II.赖氨酰氧化酶，其包含以下的氨基酸基序(括号中的残基指出该点处允许的简并，氨基酸用单字母代码表示)：
-I H D[N S]L S G S M H D H V[IL]N F K。
11.用于在蛋白质或肽中制备活性醛的工艺，所述工艺包括通过赖氨酰氧化酶对所述蛋白质或肽的赖氨酰胺进行氧化脱氨反应，并优选地浓缩和/或干燥含有活性醛的蛋白质或肽。
12.用于制备交联的蛋白质或肽的工艺，所述工艺包括对包含活性醛并且根据权利要求11的方法制备的蛋白质或肽加热，从而交联所述蛋白质。
13.包含活性醛的蛋白质或肽，并优选地为其干燥形式，所述活性醛通过所述蛋白质或肽的赖氨酰胺的氧化脱氨反应形成。
14.包含根据权利要求13的蛋白质或肽的食物、饲料、营养药物或食物、饲料或营养药物的中间产物。
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