CN101622005B - 亚硝酸根和硝酸根的用途和包含它们的组合物 - Google Patents

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Abstract

影响代谢速率和葡萄糖体内稳态的无机阴离子硝酸根和亚硝酸根。静脉内输注亚硝酸根引起静止时能量消耗(氧消耗)急剧下降，而当口服给予硝酸根时，引起运动过程中氧消耗的下降和在口服葡萄糖耐量试验后观察到血糖的增加被抑制。硝酸根和亚硝酸根的剂量不引起任何可检测的血液高铁血红蛋白水平的变化。而且，硝酸根和亚硝酸根不改变血液中的乳酸水平。该发现通过给药无机亚硝酸根和/或硝酸根提供有用的治疗以调节哺乳动物的能量消耗和葡萄糖体内稳态。

Description

亚硝酸根和硝酸根的用途和包含它们的组合物
技术领域
本发明涉及医学和药学领域，特别是用于在人患者或其它哺乳动物中降低代谢速率(metabolic rate)、氧消耗和/或葡萄糖体内稳态(homeostasis)的药物和治疗方法，本发明基于向所述患者或哺乳动物给予硝酸根(nitrate)和/或亚硝酸根(nitrite)。 
背景技术
硝酸根(NO3-)和亚硝酸根(NO2-)通常被认为是食物链中不希望的残基，具有潜在有害的作用(Joint FAO/WHOExpert Committee on Food Additives(JECFA).Safety Evaluation of Certain Food Additives.WHO，1970.ISBN9241660503；TANNENBAUM，S.R.，等人Nitrite in human saliva.Its possiblerelationship to nitrosamine formation.J cancer Ins.1974，vol.53，p.79-84；BARTSCH，H.，等人，Inhibitors of endogenous nitrosation：mechanisms andimplications in human cancer prevention.Mutation Res.1988，vol.202，p.307-324)。提出的这些阴离子的有害作用包括促进胃癌和其它恶性肿瘤和婴儿中高铁血红蛋白症的发展。因此，硝酸根/亚硝酸根的水平在食品和饮用水中被严格限制。 
最近的研究表明硝酸根和亚硝酸根能够在体内具有显著的生物学作用，且这些作用可为有益的(LUNDBERG，Jon O.，等人Nitrate，becteria andhuman health.Nat Rev Microbiol。2004，no.2，p.593-602)。例如亚硝酸根阴离子当体外测试时(MODIN，A.，等人。Nitrite-derived nitric oxide：a possiblemediator of′acidic-metabolic′vasodilation.Acta Physiol Scand.2001，vol.171，p.9-16)或当动脉内输入人时(COSBY，K.，等人Nitrite reduction to nitricoxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.Nat Med.2003，no.9，p.1498-505)可在接近生理浓度引起血管舒张。硝酸根可在依赖共生细菌的过程中体内转化为亚硝酸根(SPIEGELHALDER，B.，等人，Influence ofdietary nitrate on nitrite content of human saliva：possible relevance to in vivo tormation of N-nitroso compounds.Food Cosmet Toxicol.1976，no.14，p.545-548)。当硝酸根被摄取后其快速吸收进血液，然后在唾液中聚集。在口腔中细菌将部分饮食的硝酸根还原为亚硝酸根，然后亚硝酸根可进入体循环。(LUINDBERG，Jon O.，等人，Inorganic nitrate is a possible source forsystemic generation of nitric oxide.Free Radic Biol Med.2004，vol.37，p.395-400)。 
迄今为止研究者的焦点集中于亚硝酸根在其体内还原为血管舒张剂一氧化氮(NO)后的心血管作用(COSBY等人(上文)；DURANSKI，M.R.，等人Cytoprotective efects of nitrite during in vivo ischemia-reperfusion of theheart and liver.J Clin Invest.2005，vol.115，p.1232-1240；GLADWIN，M.T.，等人The emerging biology of the nitrite anion.Nat Chem Biol.2005，no.1，p.308-14；LARSEN，F.J.，等人Effects of dietary nitrate on blood pressure inhalthy volunteers.N Engl J Med.2006，vol.355，p.2792-3)。 
WO 2005/004884 A(美国政府，等)2005-01-20和WO 2005/007173 A(美国政府，等)2005-01-27描述了特别给药亚硝酸盐以在受试者中得到血管舒张的方法。没有描述低剂量硝酸根/亚硝酸根对能量消耗或葡萄糖体内稳态的作用。 
发明内容
本发明者出人意料地发现通过向所述哺乳动物给药无机亚硝酸根(NO2-)和/或硝酸根(NO3-)可影响哺乳动物中(局部性的在单独组织或器官中或全身性的在整个身体中)的代谢速率和/或氧消耗，该亚硝酸根和/或硝酸根的量足以降低氧消耗。氧消耗被降低且没有引起明显的低血压，且在所述哺乳动物中不引起任何明显的高铁血红蛋白水平的增加。 
本发明还提供了降低哺乳动物中代谢速率的方法，其中向所述哺乳动物给药包含无机亚硝酸根(NO2-)和硝酸根(NO3-)的药物组合物，该亚硝酸根和硝酸根的量足以降低氧消耗。氧消耗被降低且没有引起明显的低血压。 
特别是，本发明提供了降低哺乳动物中代谢速率的方法，其中向所述哺乳动物给药包含无机亚硝酸根(NO2-)的药物组合物，该亚硝酸根的量足以降低氧消耗。降低氧消耗且没有引起明显低血压。该亚硝酸根可口服或肠胃外给药。当肠胃外给药时，所述亚硝酸根可以约0.01至约10000纳摩尔/kg/ 分钟的剂量静脉内给药。 
本发明还提供了降低哺乳动物中代谢速率的方法，其中向所述哺乳动物给药包含无机硝酸根(NO3-)的药物组合物，该硝酸根的量足以降低氧消耗，但该量不增加在所述哺乳动物中的高铁血红蛋白水平，其中所述硝酸根以硝酸盐的形式以约0.01至约100毫摩尔/kg/24小时的剂量口服给药。当口服给药时，硝酸根可看作亚硝酸根的前体。 
本发明还提供了组合物、用途和方法，其中无机亚硝酸根和/或硝酸根与多酚组合。 
对代谢速率和/或氧消耗的影响或调节可在治疗、预防或改善其中代谢性应激为区别特征的病理或生理症状中作为一个步骤。该应激可存在于例如重症监护患者，经历手术的患者，患有营养不良的患者，患有癌症和厌食症的患者，患有烧伤的患者，创伤患者，新生儿和早产儿，患有神经性厌食症的患者，计划实体器官移植的患者或经历了实体器官移植的患者。此外，氧消耗的降低伴随着组织中较低的氧需求，其在特征为低氧利用度的任何病理情况中是理想的，该病理情况包括；慢性阻塞性肺疾病(COPD)、炎性气道疾病如哮喘、肺动脉高压(pulmonary hypertension)、充血性心脏病、间质性肺病(interstitial lung disease)、肺栓塞、缺血性心脏病、外周动脉疾病(peripheralartery disease)；睡眠呼吸暂停综合症。 
本发明的发现也可应用于在治疗、预防或改善紊乱的葡萄糖体内稳态(葡萄糖控制)症状中作为一个步骤调节代谢速率，该紊乱的葡萄糖体内稳态(葡萄糖控制)症状包括：1型和2型糖尿病、前驱糖尿病(prediabetes)、重症监护患者、手术创伤、代谢综合症、肥胖症、烧伤、药物引起的糖尿病。术语“葡萄糖控制(glucose control)”以其最广泛的意义使用，因为已知出于许多原因血糖水平的稳定是重要的，且关系到许多患者群以及健康对象。众所周知糖尿病患者易患以下并发症，如神经病、心肌病、血管疾病、创伤难愈合和失明。甚至患有单纯性低血糖的患者将从葡萄糖控制受益。而且推测许多普通非糖尿病的健康症状具有不足的或紊乱的葡萄糖控制。例如肥胖与葡萄糖和胰岛素密切相关。说明情绪问题如难以专心和心境不稳与较差的葡萄糖控制相关。由于明确记录的高血糖以及低血糖的不利作用，重要的是在糖尿病和非糖尿病患者/对象中都保持适当的葡萄糖控制。 
本发明还提供治疗、减轻和/或预防临床症状的方法，包括向有此需要的 患者给药足以治疗、减轻和/或预防该症状的有效量的硝酸根和/或亚硝酸根。 
由于本发明发现的结果和本发明者获得的结论，本发明也获得了亚硝酸根和/或硝酸根的新用途，其用于制造药物产品、肠内或肠胃外营养液(enteralor parenteral nutritional)、或营养补充剂(nutritional supplements)，将这些给药于健康人群，如运动员，或给药于患有一种或多种说明书所示症状的患者。 
在本领域技术人员研究了附图、说明书和实施例以及所附的权利要求后，其它实施方案将是明显的，这些在此引入作为参考。 
附图简述 
本发明将参考附图在以下说明书、非限制性实施例和权利要求书中更详细描述，其中： 
图1图示阐述多个途径，其中硝酸根和多酚的组合协同作用增加一氧化氮的生物利用度并同时减少有害化合物如氧自由基和亚硝胺的形成。更详细阐述参见文本。 
图2图示以增加的剂量静脉内输注亚硝酸钠后氧消耗(VO2)的变化。经10分钟向不吸烟的健康男性志愿者(30-70岁)输注亚硝酸根。 
图3图示9个健康男性志愿者中静止时和运动后立即测定的用硝酸钠或氯化钠(安慰剂)进行的饮食补充(dietary supplementation)对亚硝酸根的血浆浓度的影响。 
图4为显示用硝酸钠(0.1毫摩尔/kg/分钟，NIT)或等量的氯化钠(CON)进行3-天饮食补充后，在6个不同功率(work rate)测量的氧消耗(VO2)和心率(HR)的柱状图。该研究采用随机双盲交叉设计，且测试之间的清除期至少为10天。*p＜0.05，**p＜0.01。 
图5图示在9个健康男性志愿者中在自行车运动期间80％ VO2峰时的氧消耗。在用硝酸钠(0.1毫摩尔/kg/天)或等量的氯化钠(安慰剂)进行3-天饮食补充后进行测量。硝酸根和安慰剂期间的差异是显著的(p＜0.01)。 
图6为显示用硝酸钠(0.1毫摩尔/kg/天保持3天，实心柱)或等量的氯化钠(安慰剂，空心柱)进行饮食补充后，在6个不同功率测量的血浆乳酸浓度的柱状图。 
图7由三个图组成，其显示在双盲、安慰剂对照的交叉研究中对3个测试者用葡萄糖进行口服激发(challenge)后血糖水平的变化(图7a，7b和7c)。进 行标准口服葡萄糖耐量试验。受试者(健康不吸烟志愿者)的饮食用氯化钠(安慰剂)或硝酸钠(硝酸根)以0.1毫摩尔/kg/天的剂量补充3天。 
图8图示在双盲、安慰剂控制的交叉研究中对8个另外的受试者用葡萄糖进行口服激发后血糖水平的变化。进行标准口服葡萄糖耐量试验。受试者(健康不吸烟志愿者)的饮食用氯化钠(安慰剂)或硝酸钠(硝酸根)以0.1毫摩尔/kg/天的剂量补充3天。数据表示为平均值±SEM. 
图9图示在43岁患有高血压的男性中以甜菜根汁(新鲜汁3-4dl/天)进行两周干预对收缩、舒张和平均动脉(MAP)血压的影响。 
图10图示静脉内输注硝酸根后血浆硝酸根和亚硝酸根浓度。a)显示血浆硝酸根浓度，b)显示血浆亚硝酸根浓度，和c)显示在野生型(C57BL/6)、无菌和基因敲除(eNOS)小鼠中的血浆亚硝酸根浓度。 
图11图示硝酸根输注后增强的缺血后血流。 
发明详述 
定义 
在本发明方法和组合物以其实施方案的形式描述前，应理解本发明不限于本文公开的具体形式、方法步骤和材料，因为这些形式、步骤和材料可稍加改变。也应理解在此使用的术语仅是用来描述具体实施方案，而不是用来限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求和其等价物所限定。 
也必须注意，如该说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文清楚地表明是单数。 
术语“约”当在数值环境使用时表示准确度的区间，这对本领域技术人员时熟悉和可接受的。当适用时，所述区间可为给定值的+/-2％，优选+/-5％，且最优选数值的+/-10％。 
术语“哺乳动物”是指包括所有哺乳动物，且特别是人，宠物和农业中重要的动物，以及用于竞技的动物，如马和狗。 
术语“显著低血压”在上下文中是指收缩和/或舒张血压的急剧下降，伴随着如眩晕，恶心，苍白，意识丧失等的低血压临床症状。所述症状可以不同程度发生，且优选它们全都避免、最小化或尽可能的消除，或至少达到临床不显著的程度。 
术语“代谢综合症”在此定义为增加人的心血管疾病和糖尿病的风险的 医学疾病的组合。症状和特征包括空腹高血糖，II型糖尿病或空腹葡萄糖受损，葡萄糖耐量受损或胰岛素抵抗，高血压，向心性肥胖，HDL胆固醇降低，甘油三酯升高和尿酸水平升高。 
术语“胰岛素抵抗”在此定义为一种症状，其中正常量的胰岛素不足以从脂肪、肌肉和肝细胞产生正常的胰岛素响应。 
术语“代谢”用于定义发生在活细胞中的整套化学反应且“代谢速率”用于定义哺乳动物的代谢速度。术语“能量消耗”在此定义为相对于某一代谢速率消耗能量的量。 
术语“氧消耗”定义为哺乳动物消耗的氧(O2)的量且通常表示为消耗的纯氧毫升/分钟。“氧消耗”涉及哺乳动物整体消耗氧的量，但也指单独的组织或器官中的氧消耗，该组织或器官如，但不限于，心脏、肝、脑或暴露于局部缺血的其它组织。 
高铁血红蛋白为血红蛋白的一种形式，其中血红素组中的铁为Fe3+状态，不是正常血红蛋白的Fe2+。高铁血红蛋白不能携带氧。高铁血红蛋白症定义为特征为血液中存在高于正常水平的高铁血红蛋白的血液病。 
术语“分解代谢”定义为将分子分解为更小单元的代谢过程。其由活细胞中的降解化学反应构成。 
术语“功能性食物”涉及除了提供营养素的基本营养功能外还要求具有促进健康和/或预防疾病特性的任何新鲜的或加工的食品。功能性食物有时称为营养制品。通常的种类包括由功能性食物成分制成的，或用促进健康的添加剂(如″富集维生素的″产品)增强的加工食品，还包括具有特殊附属功能的新鲜食品(例如蔬菜)。具有活培养物的发酵食品通常也认为是具有益生(probiotic)优点的功能性食物。 
本发明者出人意料地发现通过向所述哺乳动物给药无机亚硝酸根(NO2-)和/或硝酸根(NO3-)可影响哺乳动物中的代谢速率和/或氧消耗(局部或全身)，该亚硝酸根和/或硝酸根的量足以降低氧消耗。氧消耗被降低且没有引起明显的低血压，且在所述哺乳动物中不引起任何明显的高铁血红蛋白水平的增加。在代谢速率局部减少的情况下，氧消耗在暴露于局部缺血(在身体的部分中血流和氧受限制的症状)的单独的组织或器官(如心脏、肝、脑或其它组织)中减少。在这些情况下亚硝酸根和/或硝酸根与线粒体呼吸链的酶的反应产物(包括NO)和随后的呼吸抑制的相互作用导致需氧量降低，这对于缺血性组 织是有利的。这种作用类似冬眠。因为活性亚硝酸根和/或硝酸根反应产物的产生在缺血性组织中最大化，所以氧消耗的作用在这些位点最明显。在一个具体实施方案中，氧消耗在心脏中被降低。 
该令人惊奇的发现，即亚硝酸根和其前体硝酸根影响这些关键的生理过程如代谢速率和/或氧消耗，可在治疗上使用，例如预防、减轻或治疗多种症状。为了增加全身性亚硝酸根水平，亚硝酸根和/或硝酸根可通过肠内给药(口服，以液体、半固体或固体制剂形式，如香口胶(chewing gum)、片剂、锭剂、薄片(wafer)、饼(cake)、棒(bar)等)或通过肠胃外给药(静脉内、经皮(transdermal)、经皮(transcutaneous)、吸入、直肠、阴道、局部、腹膜内、肌内、皮下、舌下或任何其它肠胃外给药方式)。包含亚硝酸根和/或硝酸根的组合物和本文所述的可能的其它组合可连续给药或以单次推注剂量给药。 
原则上，其它方法也可导致全身或局部亚硝酸根水平增加。最明显的是给药亚硝酸根或其前体硝酸根本身(as such)，但这可以通过增加胃的pH(例如利用酸抑制性药物如质子泵抑制剂或H2受体拮抗剂或抗酸剂)以最大化胃中残存的亚硝酸根从而最大化亚硝酸根的全身递送而补充或增强。或者亚硝酸根或硝酸根的给予可通过干扰口腔微生物群以最大化硝酸根还原物质(reducing species)的数量而补充或增强。这可通过递送“益生的(probiotic)”硝酸根还原细菌或用抗生素选择性治疗以有助于硝酸根还原物质而获得。 
很可能存在最佳剂量范围，意味着低于某一亚硝酸根的血浆水平该作用不足，相应地，超过某一水平该作用降低，且可能伴随副作用。使用静脉内给药，亚硝酸根优选的剂量范围为约0.01至约10000纳摩尔/kg/分钟，优选约0.01至约1000纳摩尔/kg/分钟，更优选约0.1至约100纳摩尔/kg/分钟，最优选约1至约20纳摩尔/kg/分钟。目前预期最优选的剂量为低于约15纳摩尔/kg/分钟。作为比较，应指出用于治疗氰化物中毒的亚硝酸根剂量为约100000纳摩尔/kg，或约300-400mg，作为单一剂量给予。该亚硝酸根还可以一次或多次推注剂量(bolus dose)给药，优选0.01-100umol/kg体重，更优选0.1-10umol/kg体重，还更优选0.1-2umol/kg体重。 
对于口服使用硝酸盐，目前优选约0.01-100毫摩尔/kg/24小时的剂量，或更优选约0.01-10毫摩尔/kg/24小时的剂量，还更优选0.1-1毫摩尔/kg/24小时。 
重要的是，给予的硝酸根或亚硝酸根的剂量应不引起大于约10％高铁 血红蛋白的产生，优选不大于约5％高铁血红蛋白产生，且更优选不大于约2％高铁血红蛋白产生。最优选当根据规定剂量给药或摄取时，硝酸根或亚硝酸根的剂量不引起受试者中任何可测的高铁血红蛋白的变化。 
还可使用硝酸盐(nitrate salt)和亚硝酸盐(nitrite salt)的组合。根据一个实施方案，硝酸根和亚硝酸根以剂量比范围为约5∶1至约100∶1(硝酸根∶亚硝酸根)，如5∶1，10∶1，30∶1，50∶1，70∶1和100∶1口服给药。优选剂量比为约10∶1。这将确保亚硝酸根被吸收后立刻产生急性效果，且然后在其生物转化为亚硝酸根后提供硝酸根的持续作用。 
在一个实施方案中该包含无机亚硝酸根和/或硝酸根的组合物为包含足以降低氧消耗的量的无机亚硝酸根和/或硝酸根的药物组合物，但当以规定剂量给药于所述受试者时该量不增加受试者中的高铁血红蛋白水平。该组合物任选包含其它药物活性化合物。 
或者该包含亚硝酸根和/或硝酸根的组合物为包含足以降低氧消耗的量的无机亚硝酸根和/或硝酸根的营养补充剂、肠内营养液、婴儿配方(infantformula)、小吃产品(snack product)或肠胃外营养液，但当以规定剂量被所述受试者摄取时该量不引起受试者中明显的低血压。 
硝酸根和亚硝酸根的药物可接受的盐包括但不限于钠、钾、钙、锌、精氨酸和铵。钠盐和钾盐目前是最优选的。该亚硝酸盐和硝酸盐可为合成来源，但也可从天然来源分离，该天然来源如天然的包含硝酸根的植物，例如绿叶蔬菜，实例包括，但不限于菠菜、莴苣、茴香、卷心菜、白菜和甜菜根。这些和其它富含硝酸根的蔬菜或水果的浓缩物(如汁或干燥的浓缩物)适用于制备本发明的食品(包括功能性食品)或营养补充剂。 
多酚为植物中发现的一类化学物质，其特征在于每分子存在多于一个的酚基。多酚通常进一步细分为可水解的鞣酸(tannin)，其为葡萄糖和其它糖的没食子酸酯；和苯基丙内酯(phenylpropanoids)，如木质素，黄酮和缩合鞣酸。在本发明一个实施方案中该无机亚硝酸根和/或硝酸根与包含高含量多酚的化合物混合。预期该组合通过增强NO生物利用度将具有协同的促进健康的作用。多酚将通过图1中突出显示的多个单独的机理增加NO产生。第一，该试剂可直接刺激从NO合酶形成的内源性NO(图1中的1)。第二，由于在酚环上存在还原性-OH基，预期这些化合物将促进亚硝酸根还原为生物活性的NO(图1中的2)。第三，通过作为自由基清除剂如超氧化物(superoxide)， 它们防止这些自由基与NO相互作用(并破坏NO)，从而NO变得更持久(图1中的3)。此外，亚硝酸根或其反应产物可与多酚本身相互作用并通过硝化或亚硝化反应将其化学修饰(图1中的4a)。所得化合物可作为长期NO供体(图1中的4b)。另一作用为多酚的存在将转换化学反应使其不形成潜在致癌的亚硝胺(图1中的5)。硝酸根反应产物亚硝酸根可与胺反应形成亚硝胺，但多酚将通过双重机理抑制该反应。第一它们帮助快速将HNO2直接还原为NO，从而最小化亚硝化物质(N2O3，HNO2)的形成。第二，它们可通过本身被亚硝化直接完成与胺的亚硝化。 
在本发明一个实施方案中，无机亚硝酸根和/或硝酸根与富含多酚的化合物或产物组合给药或使用。应选择包含亚硝酸根/硝酸根的组合物：富含多酚的化合物的比例以提供足够的硝酸根。因此包含亚硝酸根/硝酸根的组合物应为至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，还更优选至少约40％且最优选至少约50％或更高。预期亚硝酸根/硝酸根和富含多酚的化合物或产物的组合将协同作用在消耗有害的化合物如亚硝胺的情况下增强体内NO形成。该有益作用包括血压和血小板聚集的降低，降低动脉粥样硬化，降低心肌梗塞的风险，中风和其它心血管障碍，降低任何形式的癌症风险。富含多酚的水果或其汁的实例包括，但不限于，苹果、梨、葡萄、柠檬、橙子、酸柠檬(lime)、桃、石榴、葡萄柚(grapefruit)、猕猴桃(kiwi)、姜和菠萝。也可使用浆果的汁，包括黑莓、黑山莓(black raspberries)、蓝莓、蔓越橘、复盆子、樱桃、笃斯越桔、越橘、黑接骨木果(black elderberry)、黑花楸果(blackchokeberry)、黑加仑、蓝莓、野生黄莓和草莓。多酚的其它天然源包括蔬菜如胡萝卜、辣椒、大黄、洋葱。此外，可可产品(富含黄烷醇)，绿茶或红茶，坚果，巴拉圭茶和咖啡都富含多酚。在一个优选实施方案中，本发明组合物中的硝酸根源自甜菜根(如甜菜根汁)，其与一种或多种富含多酚的化合物或产物混合。甜菜根汁：富含多酚的化合物的比例应加以选择以获得足够供给的硝酸根，因此该甜菜根汁部分应为至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，还更优选至少约40％且最优选至少约50％。 
根据本发明一个实施方案，亚硝酸根和/或硝酸根的剂量或亚硝酸根和/或硝酸根与多酚一起的剂量以以下形式给药或制造：香口胶、锭剂或软锭剂(pastille)、薄片、饼、棒等，这些形式还任选包含活的非病原菌。其也可作为功能性食品或作为功能性食品的一部分给药或制造。 
亚硝酸根和/或硝酸根，或硝酸根和/或亚硝酸根与多酚的组合的使用还可对血压具有有利作用。因此，在一个实施方案中，本发明涉及降低血压的方法，优选降低至正常水平(约140/80mmHg)。亚硝酸根和/或硝酸根来源的实例为硝酸根的天然来源(如上述蔬菜或其汁)或亚硝酸盐和/或硝酸盐。在一个具体实施方案中，给药甜菜根或其汁以降低哺乳动物中的血压。 
与非病原的活细菌组合的目的是进一步增加生物活性的化合物如NO、亚硝基的加合物或化学相关化合物的产生。这种增加将局部地在胃肠道中通过细菌依赖性还原将硝酸根和亚硝酸根还原为NO和其它生物活性的氧化氮而发生。特别是，该组合将有效治疗和预防胃肠疾病如胃、十二指肠、空肠、盲肠和结肠/直肠中的溃疡。同样，预期该组合的产物将有效治疗和预防炎性肠病，包括溃疡性结肠炎、克罗恩病、显微镜下结肠炎(microscopic colitis)和其它形式。过敏性肠疾病(IBS)为可被所述产物治疗的另一症状。此外，形成的化合物可全身吸收并具有持续的生物作用，例如降低血压和预防动脉粥样硬化、癌症或与增加NO释放相关的上述任何其它效果。合适的细菌为所谓的益生细菌，包括但不限于乳酸杆菌(例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，德氏乳杆菌(L.delbrueckii)，瑞士乳杆菌(L.helveticus)，唾液乳杆菌(L.salivarius)，干酪乳杆菌(L.casei)，弯曲乳杆菌(L.curvatus)，植物乳杆菌(L.plantarum)，清酒乳杆菌(L.sakei)，短乳杆菌(L.brevis)，布赫内氏乳杆菌(L.buchneri)，发酵乳杆菌(L.fermentum)，路氏乳杆菌(L.reuteri))和双歧杆菌种类如短双歧杆菌(B.breve)，两歧双歧杆菌(B.bifidum)和B.lactis和益生的酵母菌如鲍氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)。增加硝酸根还原或亚硝酸根还原的其它合适的非病原细菌包括例如韦荣球菌属(Veillonella species)，葡萄球菌属(Staphylococcus species)，放线菌属(Actinomyces species)或罗氏菌属(Rothia species)。也可以“干形式”包含这些微生物，所述“干形式”例如以片剂、胶囊、棒等。 
在一个实施方案中，将低浓度的乙醇添加至无机亚硝酸根和/或硝酸根组合物。在一个实施方案中，乙醇与无机亚硝酸根和/或硝酸根组合物组合使用或与其一起给药。已出人意料地发现即使很低浓度的乙醇在与生理量的亚硝酸根反应后也可产生有效的血管舒张药亚硝酸乙酯。该反应在酸性条件如胃腔中增强。预期硝酸根的摄入将导致亚硝酸根在唾液中积聚，而该亚硝酸根将与乙醇在胃中反应从而形成亚硝酸乙酯。例如，如果本发明的组合物为液 体形式，乙醇含量应低于约5％(v/v)，更优选低于约2％(v/v)，且最优选为约0.5-1.5％(v/v)。 
在本发明一个实施方案中富含黄烷醇的可可产品如黑巧克力与富含硝酸根的天然化合物在饮料或巧克力棒中组合。在该实施方案中一个优选的富含硝酸根的化合物为大黄。再次，如上所述和图1所示，该硝酸根将通过增强NO形成增强黄烷醇的作用。 
由于硝酸根还原细菌酶，含硝酸根的食物或饮料被不希望的细菌污染会导致大量亚硝酸根积聚。摄入高含量的亚硝酸根会引起潜在严重的高铁血红蛋白症。在一个实施方案中，富含硝酸根的组合物与抑制不希望的细菌生长的化合物混合。应选择该化合物以使其对产品的味道不产生消极影响。理想地，其应改善味道同时增加产品的生物活性。一种选择是酸化本发明的组合物以使最终pH低于约5，且最优选为约pH 2-4。这将抑制和/或消除细菌生长。合适的酸化剂可为降低pH的任何试剂，且包括人造化合物以及天然汁，例如，但不限于，柠檬或酸柠檬，抗坏血酸，乙酸或醋(源自苹果、葡萄或其它水果)。预期使用天然产物可得到双重作用。除了具有抗菌作用，它们富含多酚，这增强了在蔬菜饮料中从硝酸根/亚硝酸根产生生物活性的NO。在一个具体实施方案中，富含硝酸根的蔬菜汁(例如甜菜根汁)与抑制不希望的细菌生长的化合物混合。 
根据本发明的实施方案，该硝酸盐和亚硝酸盐与其它药物组合，该药物包括，但不限于：抗糖尿病药(胰岛素和口服抗糖尿病药)，心血管药物(他汀类药物(statins)，ACE抑制剂，β-受体拮抗剂，利尿剂，血管紧张素2受体拮抗剂，有机硝酸酯(organic nitrates)，钙通道阻滞剂)，酸分泌-抑制剂(质子泵抑制剂，组胺-2受体阻滞剂)，口服抗糖尿病药包括双胍，磺酰脲(sulphonureides)，α-葡萄糖苷酶抑制剂，噻唑烷二酮，glinides；治疗肺动脉高压的药物包括前列腺环素类似物、内皮缩血管肽受体拮抗剂和昔多芬. 
根据一个实施方案，该亚硝酸根通过与有机硝酸酯(包括硝化甘油或异山梨醇单/二硝酸酯)经口服治疗全身递送。硝化甘油临床用于治疗心绞痛，且其通过全身释放血管舒张性一氧化氮而起作用。然而，该药物必须肠胃外给予，因为肝中的首过代谢非常大。有趣的是，已发现硝化甘油的肝代谢主要产生亚硝酸根。考虑到在此描述的亚硝酸根的新的生物作用，硝化甘油可因此用作亚硝酸根的“前药”。优选该药物应通过肠内途径(利用肝代谢)给 药以最大化亚硝酸根的产生，同时避免与静脉内或舌下给药硝化甘油相关的急性血管舒张全身血压的下降。口服给药硝化甘油时的合适剂量为约0.001至10mol/kg/24小时，优选约0.001至1mol/kg/24小时，更优选0.01至约0.1毫摩尔/kg/24小时。片剂应优选被包衣以避免在口腔中吸收。 
根据一个实施方案，将亚硝酸根和/或硝酸根添加至待用于成人、儿童、新生儿和早产儿的肠胃外和肠内给予的食物(feeding)/营养液中。目前根据本发明者进行的测量观察到，这些溶液的硝酸根和亚硝酸根含量通常非常低(未示出)。利用肠胃外营养的插管的机械换气患者尤其缺少硝酸根/亚硝酸根。第一，这些患者不会恰当的产生和吞咽唾液，因此一个主要的硝酸根/亚硝酸根来源被切断。第二如上所述，他们接受的进食几乎不含硝酸根/亚硝酸根。许多重症监护患者患有代谢紊乱，特别是由于应激和创伤的分解代谢，他们的代谢速率通常增加。而且，胰岛素抵抗是普遍的且葡萄糖体内稳态紊乱。在这些患者中提倡通过给药胰岛素严格控制血浆葡萄糖。健康对象，如婴儿或由于其它原因摄取肠内溶液的对象也可受益于本发明的组合物和方法。因此肠内营养物还包括婴儿配方和其它肠内产品。 
在一个实施方案中，本文提供亚硝酸根和/或硝酸根在制备药物产品、肠内或肠胃外营养液、手术前组合物、营养补充剂、或功能性食品中的用途，将这些物质给予健康人员(如运动员)，或给予患有一种或多种本文所示症状的患者。在该实施方案中还包含上述亚硝酸根和/或硝酸根与其它化合物的可能的组合。 
在一个实施方案中，本文提供治疗、减轻和/或预防临床症状的方法，包括向需要的患者给药有效量的足以治疗、减轻和/或预防该症状的硝酸根和/或亚硝酸根。 
有许多可能的临床症状，在这些症状中使用根据本发明的硝酸根和/或亚硝酸根进行治疗、减轻和/或预防： 
-糖尿病/前驱糖尿病中的葡萄糖控制 
-代谢综合症 
根据本发明的方法和组合物也在代谢性应激下的患者中具有一般的治疗、减轻和/或预防效果。实例包括但不限于： 
-重症监护患者 
-经历手术的患者 
-患有不同起源的营养不良的患者 
-伴随厌食症的癌症 
-烧伤 
-创伤(trauma) 
-新生儿/早产儿 
-神经性厌食症 
-甲状腺疾病(例如甲状腺机能亢进) 
-心肌梗塞，心脏停搏 
-具有分解代谢状态的重大全身疾病 
-应激性溃疡(胃) 
-肠线吻合不足(surgical gut anastomosis insufficiency) 
-发热 
-心肌梗塞和心脏停搏 
-局部缺血-再灌注损伤(MI，中风，动脉供血不足(arterial insufficiency)或任何其它器官局部缺血) 
-睡眠呼吸暂停综合症(sleep apnoea syndrome) 
-感染性休克(septic shock) 
-肠灌注不足(insufficient perfusion of the intestines) 
ICU(重症监护病房)中治疗的患者常常由于创伤、感染、疼痛和其它病理过程经受严重代谢性应激。这些患者因多种原因被治疗，这些原因包括，但不限于手术后观察、创伤、出血、烧伤、脑损伤、中风、糖尿病、脓毒症、感染性休克、心肌梗塞、心脏停搏、动脉不足或任何其它器官局部缺血、慢性阻塞性肺疾病、哮喘和其它严重的炎性疾病、肺动脉高压、充血性心力衰竭、肺栓塞。这导致不同程度的分解代谢和胰岛素抵抗，并伴随紊乱的葡萄糖处理。他们经常患有血管内皮功能障碍导致的微循环障碍。如上所述，这些患者在肠内和肠胃外进食中仅给予小量的硝酸根/亚硝酸根，且由于多种原因(镇静作用，插管)，相比于健康人他们具有紊乱的硝酸根/亚硝酸根的肠唾液循环。 
预期在肠胃外和/或肠内进食中向重症监护室治疗的患者添加足够量的亚硝酸根和/或硝酸根，可通过降低代谢速率、增强血液葡萄糖体内稳态和微循环改善而减轻或预防上述代谢和循环紊乱。 
经历手术的患者经受不同程度的手术创伤。这触发分解代谢激素如氢化考的松、高血糖素和肾上腺素，且这些患者可产生暂时胰岛素抵抗。普通临床方法包括禁食以减少胃内含物，如果患者在麻醉时呕吐或反胃该内含物会意外吸至气道。该禁食消除硝酸根/亚硝酸根的摄取，且已显示禁食后全身的硝酸根和亚硝酸根水平减少。预期手术前、手术中或手术后给药亚硝酸根和/或硝酸根将改善手术患者的代谢情形(降低代谢速率，增强血液葡萄糖体内稳态)。而且，在整个手术期间，患者由于低血压、缺氧和微循环紊乱而处于缺血性事件的高风险。这些事件将引发局部缺血-再灌注过程，这将损伤体内多个器官系统。预期预防给药亚硝酸根和/或硝酸根，以包含硝酸根和/或亚硝酸根阴离子的手术前饮料(合适的蔬菜汁如但不限于甜菜根汁)，或通过肠胃外途径给药硝酸根和/或亚硝酸根，将降低手术过程中在多个器官(包括，但不限于脑、心脏、肺、肝、肾和骨骼肌)的局部缺血-再灌注事件的副作用。 
在心肌梗塞过程中的局部缺血-再灌注损伤是临床护理的主要问题。现有技术中，治疗心肌梗塞包括通过以血栓溶解剂和/或经皮冠状动脉干涉的药理手段而重新打开闭塞的冠状血管。认为根据本发明的方法和组合物将通过增加血流和改变线粒体功能而降低局部缺血-再灌注损伤。从本文的实验中，也考虑在局部缺血-再灌注过程中，硝酸根和亚硝酸根可能通过对线粒体的“冬眠”作用降低氧消耗。硝酸根和亚硝酸根可改善局部缺血-再灌注损伤的另一机理是通过减少氧自由基形成和细胞色素C从线粒体的释放。硝酸根和亚硝酸根对线粒体功能的作用最可能通过一氧化氮(NO)与线粒体呼吸链中蛋白质复合物的氧化磷酸化和/或s-亚硝基化的相互作用而介导。认为关于心肌梗塞诱导的局部缺血-再灌注损伤而给予硝酸根和/或亚硝酸根的时间点在损伤前、损伤过程中或损伤后都是有效的。硝酸根和/或亚硝酸根的之前或之后的调节作用都是被考虑的，这意味着患者可在他去医院的救护车上接受治疗、冠状动脉循环再灌注之前和之后在医院接受治疗和在病房中接受治疗。认为处于发展为心肌梗塞高风险的(例如心绞痛，充血性心力衰竭)患者可使用根据本发明的方法和组合物预防性治疗。心脏停搏和复苏后，全身局部缺血-再灌注损伤的发展涉及多个主要器官系统，包括脑。预期硝酸根和/或亚硝酸根在向具有高风险心脏停搏的患者预防性给予和在复苏过程中给予都是有利的。 
根据优选的实施方案，该硝酸根和/或亚硝酸根或在此所述的任何组合也在手术前给药于计划进行手术或实质的、侵入式(invasive)检查过程的患者。在一个具体实施方案中，无机亚硝酸根和/或硝酸根与碳水化合物组合。因此，这些组合包括，但不限于单独的硝酸根；硝酸根和亚硝酸根；硝酸根、亚硝酸根和碳水化合物；硝酸根和碳水化合物；单独的亚硝酸根，以及亚硝酸根和碳水化合物。此外，多酚可添加至上述组合的任一种中。任意该组合可作为(以单一或重复剂量的)手术前饮料等在手术前给予或在手术前或手术中静脉内给予。给予该手术前饮料的合适时间为手术前72至2小时。亚硝酸根和/或硝酸根与碳水化合物的组合可改善手术前和手术后期间常见的胰岛素抵抗和局部缺血/再灌注损伤。碳水化合物的实例包括但不限于葡萄糖、果糖、麦芽糖糊精、蔗糖、乳糖、半乳糖和甘露糖。当手术前给予时，碳水化合物在饮料中的量将向患者提供优选约200kcal，更优选约100kcal，且最优选约50kcal。对于口服使用硝酸盐，约0.01-100毫摩尔/kg/24小时的剂量是目前优选的，或更优选约0.01-10毫摩尔/kg/24小时的剂量，还更优选0.1-1毫摩尔/kg/24小时。 
使用手术前和/或手术中静脉内给药，该亚硝酸根优选的给药剂量为约0.01至约10000纳摩尔/kg/分钟的范围，优选约0.01至约1000纳摩尔/kg/分钟，更优选约0.1至约100纳摩尔/kg/分钟，最优选约1至约20纳摩尔/kg/分钟。目前预期最优选的剂量为低于约15纳摩尔/kg/分钟。 
在患有动脉供血不足(包括，但不限于间歇性跛行)的患者中，药理治疗目的是改善在受影响的肢体中的血流和刺激血管发生以促进新的血管形成。磷酸二酯酶抑制剂和生长因子已在临床试验中研究，但结果是多样的。同样，对传统NO供体如有机硝酸酯的研究也较少成功。预期根据本发明的方法和组合物将积极刺激血流和血管发生，从而改善这些患者的症状。用硝酸根/亚硝酸根的治疗是有吸引力的，因为其将优先增加缺血性区域的血流而不引起麻烦的全身效应如低血压，其是使用有机硝酸酯时的风险，有机硝酸酯非选择性的在大多数血管床中膨胀。此外，亚硝酸根将如上所述影响线粒体功能，导致在缺血性组织中较少的需氧量。 
在患有营养不良(包括但不限于伴随厌食症的癌症、神经性厌食症、胃肠疾病)的患者中，预期根据本发明的方法和组合物将具有合成作用(anaboliceffect)且将降低氧消耗。预期该作用通过改善线粒体功效和减弱线粒体解偶 联而获得。 
根据本发明的方法和组合物在患有勃起机能障碍的患者中也具有普遍的治疗效果。在该症状中内源性NO系统失效。给药亚硝酸根和/或硝酸根(和上述可能的组合)将增加海绵体中的局部NO形成，从而增强勃起。 
预期根据本发明的方法和组合物在患有胃炎和胃溃疡的患者中具有普遍的治疗、减轻和/或预防效果，该胃炎和胃溃疡是由于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染、应激或药理治疗(如使用非甾抗炎药(NSAID))的副作用。通过改善胃粘膜的血流、粘液产生和通过抗菌和抗炎特性，该方法和组合物在这些患者中将具有有利的作用。此外，所述方法和组合物预防了用乙酰基水杨酸、NSAID或任何其它溃疡性药物在胃肠道其它部分(十二指肠，小肠和大肠)治疗的不希望的副作用。 
手术中担心的问题是肠吻合(anastomosis)不足和肠灌注不足。不断在研究改善吻合中微循环的新方法。预期根据本发明的方法和组合物将改善吻合中的微循环，这将促进愈合过程。也认为本发明将改善具有肠灌注不足的情形中的循环。 
患有睡眠呼吸暂停综合症的患者具有发生高血压和其它心血管疾病的更高的风险。而且，他们在睡眠中经受缺氧时期。预期根据本发明的方法和组合物将通过改善循环和可能对线粒体的“冬眠”作用降低氧消耗而防止缺氧-诱导的损伤。所述方法和组合物具有保护作用的其它机理是通过减少氧自由基形成和细胞色素C从线粒体的释放。硝酸根和亚硝酸根对线粒体功能的作用最可能由一氧化氮(NO)与在线粒体呼吸链中复合物的氧化磷酸化和/或s-亚硝基化的相互作用而介导。 
根据本发明的方法和组合物还在患有特征为低氧利用度的病理症状的患者中具有普遍的治疗、减轻和/或预防效果，该病理症状包括，但不限于慢性呼吸道阻塞疾病(COPD)，炎性气道疾病如哮喘，肺动脉高压，充血性心脏病，间质性肺病，肺栓塞，缺血性心脏病，外周动脉疾病，睡眠呼吸暂停综合症，心肌梗塞和全身炎性疾病。在这些症状中添加氧迅速促进动脉氧合作用和全身的氧递送。出于技术和安全原因，在医院设施外难以给予氧。改善这些患者的情形的另一方式是减少氧的需求。根据本发明的方法和组合物对于进行的体力活动导致减少的氧消耗。该高度出人意料的发现尤其在患有上述症状的患者中相关，因为氧利用度为体力活动的限制因素。认为根据本发 明的方法和组合物将在这些患者群中促进体力活动。 
在一个优选实施方案中，将硝酸根和/或亚硝酸根给予患有特征为低氧利用度的病理症状的患者。在该情形中理想的是减少需要氧的组织以预防缺氧相关的后遗症和症状。实例包括患有COPD的患者(其肺的氧摄入可被严重损害)和患有外周动脉疾病的患者(其中输送至组织的氧被减少)。 
本发明的方法和组合物也可用于健康对象，例如运动员。本发明的方法和组合物在某一工作负荷提供较少的需氧量和改善合成代谢。该方法和组合物也在以下环境中用于高度节约氧，例如在低氧环境中进行的工作和运动，如但不限于援救活动、消防、军事作业、潜水、登山、高空飞行和宇宙探索。 
本发明方法和组合物也用于实体器官或组织移植，以在移植前最小化捐赠的器官的代谢需求，并促进移植后移植的器官或组织的存活。亚硝酸根和/或硝酸根或本文所述的任何组合可在移植前通过灌注、局部给予器官或组织和/或全身给予供体而进入器官或组织，或在移植后通过灌注或局部给予器官或组织和/或全身给予接受者而进入器官或组织。 
在一个优选实施方案中，将硝酸根和/或亚硝酸根或任何本文所述的组合给予处于发展为显著代谢性应激的风险中的患者。这些情形包括上述症状中的许多种，包括手术应激和创伤。需氧量和消耗在应激时显著增加。因此，通过在这些患者中降低需氧量获得改善的情形。根据一个优选实施方案，将硝酸根和/或亚硝酸根给予患者以预防生理或创伤性应激相关的后遗症。实例包括创伤后进入急诊室的患者或经历大手术的患者。 
据本发明者所知，这是首次研究检测饮食硝酸根对于运动的心肺和代谢响应的作用。主要发现为用无机硝酸根的饮食补充(其量不引起显著低血压且高铁血红蛋白和血浆乳酸没有任何明显增加)，导致次最大功(submaxinalwork)过程中VO2降低和肌肉功效明显增加。这些作用发生的同时没有任何VO2峰值或最大可达功率的变化。 
不希望被理论限制，本发明者认为有理由相信所观察到的作用涉及硝酸根至亚硝酸根的初始还原。硝酸根本身被认为是生物惰性的且不能被哺乳动物细胞代谢。然而，在摄入的硝酸根通过唾液腺再进入口腔并通过共生细菌有效还原，从而形成亚硝酸根。与硝酸根相反，最近亚硝酸根离子显示具有广泛的生物学活性。在本研究中，本发明者确实观察到在硝酸根治疗期后血浆亚硝酸根增加，从而证实如上所述的硝酸根的体内还原。另一个支持亚硝 酸根为生物学活性的发现为其在运动过程有效的消耗，这与不变的血浆硝酸根水平不同。归根结底亚硝酸根的生物活性很可能涉及其进一步还原为NO和可能的其它密切相关的氮中间体。此外，最近表明，亚硝酸根本身可直接影响细胞信号通路。尽管可能未必是这样，但目前硝酸根离子本身的作用不能被排除。存在使氧化氮的生物作用传播的多个主要方式，包括cGMP的活化、通过亚硝基化(nitro(syl)ation)/硝化或直接结合至多种蛋白质的蛋白质血红素-部分(如在通过NO原型活化鸟苷酸环化酶中)而改变蛋白质功能。此外，亚硝酸根本身也可直接影响细胞信号通路。 
如果该作用通过硝酸根还原为亚硝酸根然后形成NO而进行，那么如何解释本发明的结果？使用NOS抑制剂阻止内源性NO产生的早期研究给出一些提示。已显示NOS-抑制增加运动中狗的次最大VO2，其独立于血流的减少。这种在NOS-阻断过程中VO2的增加与以下事实相关，即NO通过可逆的抑制呼吸酶细胞色素c氧化酶而体外影响组织呼吸。其它研究将NOS-阻断过程中增加的VO2与NO通过线粒体渗透性转变孔(mitochondrialpermeability transition pore，mPTP)对质子渗漏的抑制作用相关联，相当大量的质子经线粒体内膜渗漏。如果硝酸根的作用仅是由于抑制细胞色素c氧化酶(从而抑制氧化磷酸化)，人们将预期在体育运动中无氧代谢的增加和更多的乳酸(lactate)的积聚。然而，从该结果判断并非如此，因为与安慰剂相比在补充硝酸根后血浆乳酸浓度几乎相同。 
氧脉搏(oxygen pulse)在给定功率通过补充硝酸根而降低的发现是在该功率需氧量降低的直接效果。然而，在给定的绝对氧摄入氧脉搏没有差异。硝酸根对VE/VO2或氧脉搏的作用的缺乏表明该改善的功效源自肌肉或线粒体适应(adaptations)，而不是心脏或肺中的中心适应。 
实施例
本发明者已经研究了硝酸根和亚硝酸根对多种生理功能(包括血压，葡萄糖代谢和体内能量消耗)的作用。在以下实施例中硝酸根口服给药而亚硝酸根静脉内给药(iv)。氧消耗使用间接量热法测量。术语“间接量热法”在此定义为计算热的方法，即从活体产生的二氧化碳和氮气废气和从其氧消耗得到，其为相关领域的技术人员所熟知的。 
1.静脉内亚硝酸钠和静止时能量消耗 
静止时能量消耗(通过间接量热法测量)在静脉内输注亚硝酸钠10分钟后减少10-25％(n＝4，图3)。在试验前受试者进食低硝酸根含量的食物一天且禁食至少8小时。当以浓度为10纳摩尔/kg/分钟的亚硝酸根输注10分钟时观察到较大的能量消耗下降。以1nmol/kg/分钟在10分钟观察期没有观察到明显的作用，且在100nmol/kg/分钟后与10nmol剂量相比没有观察到氧消耗进一步降低。在单独的实验(n＝2)中，本发明者观察到在以10nmol/kg/分钟输注(输注10分钟)后，血浆亚硝酸根从140-165nM增加至370-480nM。高铁血红蛋白的基础水平为1.1-1.3毫摩尔/l且在输注亚硝酸根(1.1-1.4毫摩尔/l)后没有明显变化，参见图2。 
2.口服硝酸钠和运动时的氧消耗 
方法 
受试者：9个健康的良好培训的(VO2峰55+/-3.7mlxkg-1xmin-1)志愿参加该研究的男性(28+/-6岁)。所有受试者为训练过的自行车运动员或三项全能运动员，并熟悉测试程序。选择使用良好培训的受试者以避免测试得到的熟悉训练过程产生的结果，如在次最大运动中提高的VO2峰或更好的机械功效。该方案被Stockholm的地区伦理委员会批准且所有受试者在参与前递交了书面同意。 
用硝酸根进行饮食补充：本研究的目的是研究两种不同饮食模型的效果，一种具有高于正常硝酸根摄取的量，一种具有低于正常硝酸根摄取的量。该研究具有双盲安慰剂控制的交叉设计。在两个三天的期间(其中清除间隔为10天)使该受试者避免所有具有适中或高硝酸根含量的食物(所有蔬菜，所有腌肉(cured meats)，草莓，葡萄和茶)。此外，限制他们远离酒精和烟草产品。但是，他们在限制膳食的三天中随意吃他们喜欢的任何食物。将受试者随机分组，以摄入溶于水中的0.1毫摩尔硝酸钠/kg体重/天或等量的氯化钠(安慰剂)而开始。分割日剂量且每日摄入三次。通过味道或外观不能辨别不同的溶液。每日的硝酸根剂量相当于150-250克富含硝酸根的植物(如菠菜，莴苣或甜菜根)中的常见量。最后剂量的硝酸根或安慰剂在测量那天的早晨摄入(参见以下主要测试)。在硝酸根补充期间(NIT)和安慰剂期间(CON)之间的顺序是平衡的。在清除期过程中受试者不使用任何特别的饮食方案。 
实验方案：测量在电力制动的踏车测功计(Monark 839E，Varberg，Sweden)上进行，该踏车测功计用赛车车座改造，且受试者通过训练熟悉踏板系统。该自行车测功计是计算机控制的，不论受试者选择踏板的节奏，保持恒定功率。踏板节奏按个人选择，范围在70-90rpm，但在测试过程中保持恒定以最小化由于肌肉复原模式的变化导致的功的输出的差异。 
肺换气(VE)、氧摄入(VO2)、CO2排出量(VCO2)和呼吸换气率(RER)通过连接至流量计的计算机气体分析计(AMIS 2001，Odense，Denmark)以10秒间隔测量，受试者通过口罩和塑料管呼吸通过该流量计。心率(HR)在测试过程用便携心率监测器(Polar S610，Polar，Kempele，Finland)连续记录。从指尖收集毛细血管血样品(20μl)并使用Biosen C-Line Sport Analyser(EKFdiagnostics，Magdeburg，Germany)分析乳酸([Hla])。用从指尖取得的毛细血管血检测静止时的血红蛋白浓度([Hb])并用Hb-测量设备(Hemocue， 
Figure G2008800062797D00201
Sweden)分析。红细胞比容(Hct)通过以12000rpm离心毛细血管血3分钟而测定。 
预测试：在首次主要测试前各个受试者在两周的期间内去实验室两次。首次预测试是为了使受试者熟悉自行车测功计和测试程序。受试者在5个次最大水平进行预测试，且每个水平持续5分钟。在不同的次最大水平之间没有休息。VO2使用AMIS 2001连续测量。在每个次最大水平结束时，从指尖取出毛细血管血并之后分析[Hla]。在每个功率受试者在Borg’s RPE-scale(BORG，G.Perceived exertion as an indicator of somatic stress.Scand J RehabilMed.1970，vol.2，no.2，p.92-8)上评价其自感用力度，对中心和肌肉用力都进行评价。恢复8分钟后，受试者以相应于其计算的最大氧摄入的功率尽可能长时间的骑自行车( P-O，等人.Textbook in work physiology.McGraw-Hill，1970.ISBN 0070024065.p.619)。在该测试中测量受试者实际VO2峰，如果受试者能骑超过7分钟，则每分钟添加额外功率20-30瓦特直到筋疲力尽。在最大测试后的1分钟和3分钟，从指尖取样毛细血管血用于[Hla]分析。 
在第二次预测试前，调节次最大水平以使它们相应于VO2峰的45，60，70，80和85％。如果需要，还调节最大功率，以使筋疲力尽的时间保持在4至7分钟。 
主要测试：在主要测试前受试者避免剧烈运动3天，且测试前一天避免 所有运动。他们也被告知在测试开始前至少3小时以前食用他们最后的便餐。当受试者来到实验室他们接受最后剂量的安慰剂或硝酸根，并在测试开始前使其以仰卧位休息60分钟。 
所有受试者使用标准化的热身程序，即以100瓦特骑5分钟自行车然后休息5分钟。次最大和最大测试按与第二次预测试相同的方式进行，且5个次最大功率每个持续5分钟，在不同水平间没有休息。在两个主要测试间使用相同功率。静脉血(9ml)在最后的硝酸根/安慰剂-剂量摄入后静止45分钟时抽取并在VO2峰-测试后再次立即抽取。将血液置于冰浴中并在5分钟内以1300rpm和4℃离心。分离血浆并保持在-80℃直到通过上述化学发光测试用于分析其硝酸根和亚硝酸根浓度(LUNDBERG，J O，等人.Inorganic nitrate isa possible source for systemic generation of nitric oxide.Free Rad Bio Med.2004，vol.37，no.3，p.395-400)。 
统计和计算：结果表示为平均值+/-标准偏差(平均值+/-SD)。使用配对t-检验以评价硝酸根和安慰剂试验间的差异。显著性水平设定为p＝＜0.05。 
总效率(GE)定义为功率除以实际能量消耗(EE)。然后该EE用Brouwer方程计算(BROUWER，E.On simple formulae for calculating the heatexpenditure and the quantities of carbohydrate and fat oxidized in metabolism ofmen and animals，from gaseous exchange(Oxygen intake and carbonic acidoutput)and urine-N.Acta Physiol Pharmacol Neerl.1957，no.6，p.795-802)。δ功效(DE)定义为功率的增加除以EE的增加(GAESSER，GA，等人。Muscularefficacy during steady-rate exrcise：effect of speed and work rate.J Appl Physiol.1975，no.38，p.1132-1139)。DE基于四个最低功率且使用线性回归分析。该氧脉搏(oxygen pulse)定义为VO2/HR。 
结果 
静止时的血压：相比于安慰剂(120+/-5.9，p＜0.01)，平均静止收缩血压在补充硝酸根后降低(112+/-8mmHg)。相比于安慰剂(74+/-6.8mmHg，p＜0.01)，舒张血压在给予硝酸根后也降低(68+/-5.5mmHg)。这些发现的一部分已作为单独信息出版(Larsen等人，2006)。 
血液值：静止时(NIT 152+/-11，CON 153+/-11gxl-1，p＝0.87)或紧接VO2峰-测试后(NIT 163+/-13，CON 161+/-13gxl-1，p＝0.27)没有观察到[Hb] 变化。在静止时(NIT 42+/-4，CON 43+/-3％，p＝0.19)或VO2峰-测试后(NIT 46+/-4，CON 47+/-4％，p＝0.6)红细胞比容值也没有任何变化。 
静止时硝酸根的血浆水平为27+/-6.9μM(CON)和182+/-55(NIT)(p＝＜0.01)。紧接最大功(work)测试后的硝酸根水平为29+/-6.1(CON)和175+/-61μM(NIT)(p＝＜0.01)。在NIT或CON中的运动过程中血浆硝酸根没有变化(p＝0.8)。静止时亚硝酸根水平为124+/-28(CON)和226+/-87nM(NIT)(p＝＜0.01)。紧接最大功测试后的亚硝酸根水平为111+/-29(CON)和137+/-48(NIT)(p＝0.17)。 
运动过程中的亚硝酸根浓度降低在NIT中比在CON中更明显(图6)。与静止时相比，最大功后c-GMP浓度的增加倾向于在NIT中比在CON中更高(p＝0.08)。 
血压：平均静止收缩血压从NIT后的120+/-5.9降至CON后的112+/-8mmHg(p＝0.003)。舒张血压在CON和NIT-组分别从74+/-6.8降至68+/-5.5mmHg(p＝0.005)。这些发现的一部分以作为单独信息出版(LARSEN，F J，等人，Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.N Engl JMed.2006，vol.355，no.26，p.2792-3)。 
次最大功参数：与安慰剂期相比，给予硝酸根后在相应于45-80％ VO2峰的四个功率过程中VO2明显降低(图5)。最明显差异在VO2峰的80％处观察到(NIT 3.44+/-0.31lxmin-1对CON 3.61+/-0.31lxmin-1，p＝0.003，图5)。经过4个次最大功率在NIT-试验中VO2平均低0.15lxmin-1。在NIT和CON试验间心率(HR)没有差异(参见图6)。氧脉搏倾向于从在CON过程中的21.0+/-2.0降低至20.3+/-1.9mlx搏动-1(p＝0.08)。在任一次最大功率过程中在NIT和CON之间[Hla](图6)、VE、VE/VO2或呼吸换气率(RER)没有明显差异变化。平均总效率(GE)定义为功率除以实际能量消耗(EE)。然后EE用Brouwer方程计算(Brouwer，见上文)。GE总效率从CON过程中的19.7％增加至NIT过程中的21.1％(p＝0.02)。δ功效(DE)为工作负荷(workload)中的增加除以EE的增加(Gaesser & Brooks，见上文)。在该情况下DE基于四个最低功率，其使用线性回归分析。该DEδ功效(DE)明显增加，从CON中的22.1+/-1.6％增加至NIT中的22.9+/-1.9％，(p＝0.04)。 
最大工作能力(work capacity)：在NIT和CON试验之间VO2峰没有明显差异(分别为4.49+/-0.44和4.61+/-0.28lxmin-1，p＝0.29)。这些值与预测试 中得到的VO2峰(4.54+/-0.32lxmin-1)也没有显著差异。同样，在VE最大(NIT182+/-21.4对CON 186+/-21.7lxmin-1，p＝0.5)、HR最大(NIT 189.8+/-7.0vsCON 190.3+/-7.5搏动xmin-1，p＝0.94)或最大功率(NIT 360.6+/-32.8对CON 358.9+/-32.3瓦，p＝0.35)中也没有观察到明显差异。在NIT和CON之间，在以任何工作负荷(次最大或最大)评估自感用力度(rating of perceivedexertion)(Borg RPE-scale)中没有差异。 
结果的评论：在目前研究中，在四个最低工作负荷观察到给予硝酸根后在次最大工作负荷的需氧量明显降低。第五功率，在约85％VO2峰，在多个受试者中高于乳酸阈值，从而无氧能量的产生变得更明显。这导致副肌肉组的牵连和运动模式的明显改变。在该功率，VO2没有达到稳定平稳的状态水平，因此不适于计算肌肉功效。在方案中包含该第五功率的原因是得到高于乳酸阈值的乳酸值，从而在乳酸盐曲线的上部得到变化的指示。 
3.口服硝酸钠和葡萄糖体内稳态 
当硝酸根预治疗(1毫摩尔/kg NaNO3)后测量时，与安慰剂(NaCl)相比，在标准口服葡萄糖耐量试验(75g葡萄糖于250ml水中)后血浆葡萄糖的增加降低。该研究以3个健康测试者双盲研究进行。葡萄糖摄入在硝酸根摄入60分钟后开始。血糖水平在葡萄糖负载后在120分钟期间测量(n＝3)。在30分钟时给予安慰剂组的平均血浆葡萄糖为8.2毫摩尔/l，而在同样受试者中硝酸根补充后为6.5毫摩尔/l。结果示于图7a，b和c。 
在进一步的研究中证实了硝酸根预治疗后血浆葡萄糖的增加被降低，其中在以等摩尔量(0.1毫摩尔/kg/天)补充氯化钠或硝酸钠3天后，在8个健康非吸烟者中进行标准口服葡萄糖耐量试验(75g葡萄糖)。该研究具有双盲、安慰剂对照的交叉设计。血糖水平在葡萄糖摄取前的两个时间点(-10和0分钟)在葡萄糖摄取后的15，30，45，60，75，90，105和120分钟时测量(n＝8)。当受试者摄取硝酸根时，与摄取安慰剂时相比血糖的曲线下面积较小。结果以平均值±SEM示于图8。 
4.摄入甜菜根对血压的影响 
一个患有高血压的43岁不吸烟受试者摄入新鲜甜菜根汁(300-400ml/天)14天。血压一天测量两次，测量14天，然后在第20天测量两次(从治 疗的第1天开始计数)。实验开始时那天的基础血压为142/99。 
摄入甜菜根汁的结果示于图9。两个每日测量的平均值示于柱中。摄入甜菜根汁(介于1-14天)时，观察到收缩压的平均减少为≈15mmHg且舒张压的平均减少为≈16mmHg。当在停止甜菜根汁治疗6天后(第20天)再次测量时，血压增加至基础水平(140/100)。脉搏率在整个实验期间没有改变。MAP＝平均动脉压。 
5.静脉内输注硝酸根后血浆亚硝酸根的浓度 
方法 
麻醉的大鼠(n＝11)给予推注剂量(bolus dose)(10mg/kg体重)的NaNO3(空心方形)，在指定的时间点收集血液样品。7只另外的大鼠用30mg/kg体重的别嘌醇预处理，该别嘌醇在NaNO3输注(实心三角形)前60分钟腹膜内给予，且在指定的时间点收集血液样品。别嘌醇抑制黄嘌呤氧化酶(xanthionoxidase)，黄嘌呤氧化酶为在哺乳动物细胞中将硝酸根还原为亚硝酸根中涉及的酶。提取血浆且分析硝酸根和亚硝酸根。 
将三种不同品系的小鼠-野生型(n＝5安慰剂，n＝5硝酸根)，无菌(n＝5安慰剂，n＝5硝酸根)和eNOS敲除小鼠(n＝2安慰剂，n＝3硝酸根)腹膜内注射10mg/kg硝酸根或安慰剂(NaCl)，且1小时后测量亚硝酸根的血浆水平。 
结果 
静脉内输注硝酸根的结果示于图10a-c。图10a显示血浆硝酸根浓度而图10b显示血浆亚硝酸根浓度。输注硝酸根后血浆硝酸根的浓度在接受硝酸根的大鼠和接受硝酸根+别嘌醇的大鼠中都明显增加(a)。血浆亚硝酸根浓度在接受硝酸根的大鼠和接受硝酸根+别嘌醇的大鼠中增加，(b)，然而在仅接受硝酸根的大鼠中的增加明显更高，*p＜0.05。 
图10c显示，在野生型(n＝5安慰剂，n＝5硝酸根)，无菌(n＝5安慰剂，n＝5硝酸根)和eNOS敲除小鼠(n＝2安慰剂，n＝3硝酸根)中硝酸根-诱导的血浆亚硝酸根的增加相等，p＝.05*。 
之前已表明仅有细菌细胞(而非哺乳动物细胞)可将硝酸根还原为亚硝酸根。这些结果意外的显示哺乳动物细胞也可将硝酸根代谢为亚硝酸根。而且，它们表明在硝酸根至亚硝酸根的还原中涉及黄嘌呤氧化酶。 
6.缺血后血流的增加 
大鼠接受静脉内推注剂量的在PBS(pH 7.4)中稀释的10mg/kg硝酸根(NaNO3，n＝4)或安慰剂(NaCl，n＝4))，然后连续输注3mg/kg/小时。添加硝酸根(空心方形)或安慰剂(实心圆形)60分钟后，给予L-NAME(50mg/kg)，且10分钟后在肾上方夹紧腹主动脉。局部缺血30分钟后，去除夹钳且监测腹主动脉血流60分钟。 
结果表明在早期(0-10分钟)和晚期(10-60分钟)缺血后阶段，相比于安慰剂处理的大鼠，硝酸根-处理的大鼠保持较高的血流(图11)。显著地，60分钟再灌注后，在对照大鼠中血流降至仅有缺血前的值的20％，而在硝酸根-处理的大鼠中，血流保持在对照值的几乎75％。这证明了在缺血性事件中硝酸根-亚硝酸根-NO通路的极大增强。 
尽管本发明根据其优选实施方案进行了描述，该优选实施方案构成本发明者目前已知的最佳实施方式，但应理解对本领域技术人员来说可进行各种显而易见的变化和修改，而不偏离本发明所附权利要求的范围。 
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Claims (36)

1.无机亚硝酸根(NO2 -)和/或硝酸根(NO3 -)在制备用于降低整个身体代谢速率的药物组合物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述无机亚硝酸根(NO2 -)和/或硝酸根(NO3 -)与多酚组合使用。
3.根据权利要求1的用途，其中所述无机亚硝酸根(NO2 -)和/或硝酸根(NO3 -)与乙醇组合使用，该乙醇的浓度为5％(v/v)或更少。
4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述亚硝酸根以亚硝酸钠或亚硝酸钾的形式给药。
5.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述硝酸根以硝酸钠或硝酸钾的形式给药。
6.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述亚硝酸根以硝酸盐形式作为前体口服给药，该硝酸盐选自硝酸钠和硝酸钾。
7.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述药物组合物用于治疗、预防或改善其中代谢性应激为区别特征的病理或生理症状。
8.根据权利要求7的用途，其中所述症状为存在于以下患者中的症状：重症监护患者、经历手术的患者、患有营养不良的患者、患有癌症和厌食症的患者、患有烧伤的患者、创伤患者、新生儿和早产儿、患有神经性厌食症的患者、计划实体器官移植的患者或经历了实体器官移植的患者。
9.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述药物组合物用于治疗、预防或改善特征为低氧利用度的病理情形，该病理情形选自慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、肺动脉高压、充血性心脏病、间质性肺病、肺栓塞、缺血性心脏病、外周动脉疾病；和睡眠呼吸暂停综合症。
10.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述药物组合物用于治疗、预防或改善紊乱的葡萄糖体内稳态的症状，该症状选自：I型和II型糖尿病、前驱糖尿病、重症监护患者、手术创伤、代谢综合症、肥胖症、烧伤、药物引起的糖尿病和胰岛素抵抗。
11.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述亚硝酸根以0.01至10000纳摩尔/kg/分钟的剂量静脉内给药。
12.根据权利要求8的用途，其中所述亚硝酸根以0.01至10000纳摩尔/kg/分钟的剂量静脉内给药。
13.根据权利要求9的用途，其中所述亚硝酸根以0.01至10000纳摩尔/kg/分钟的剂量静脉内给药。
14.根据权利要求10的用途，其中所述亚硝酸根以0.01至10000纳摩尔/kg/分钟的剂量静脉内给药。
15.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述硝酸根以0.01至100毫摩尔/kg/24小时的剂量以硝酸盐的形式口服给药。
16.根据权利要求8的用途，其中所述硝酸根以0.01至100毫摩尔/kg/24小时的剂量以硝酸盐的形式口服给药。
17.根据权利要求9的用途，其中所述硝酸根以0.01至100毫摩尔/kg/24小时的剂量以硝酸盐的形式口服给药。
18.根据权利要求10的用途，其中所述硝酸根以0.01至100毫摩尔/kg/24小时的剂量以硝酸盐的形式口服给药。
19.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述无机亚硝酸根(NO2 -)和/或硝酸根(NO3 -)与增强硝酸根还原或亚硝酸根还原的合适的益生细菌或合适的非病原细菌一起给药。
20.根据权利要求19的用途，其中所述益生细菌为乳酸杆菌或双歧杆菌。
21.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述药物组合物配制为营养补充剂、肠内营养液、婴儿配方、适于糖尿病患者的小吃产品、肠胃外营养液、手术前组合物。
22.根据权利要求21的用途，其中当配制为手术前组合物时，所述药物组合物还包含碳水化合物。
23.无机亚硝酸根(NO2 -)和/或硝酸根(NO3 -)在制备用于降低健康人的氧消耗的组合物中的用途，其中当健康人以规定剂量摄取所述组合物时，该组合物在某一工作负荷提供较少的需氧量。
24.根据权利要求23的用途，其中所摄取的无机亚硝酸根(NO2 -)和/或硝酸根(NO3 -)进一步改善肌肉功效。
25.根据权利要求23的用途，其中所述无机亚硝酸根(NO2 -)和/或硝酸根(NO3 -)与多酚组合使用。
26.根据权利要求23的用途，其中所述无机亚硝酸根(NO2 -)和/或硝酸根(NO3 -)与乙醇组合使用，该乙醇的浓度为5％(v/v)或更少。
27.根据权利要求23-26的用途，其中所述健康人为运动员。
28.根据权利要求23-26中任一项的用途，其中所述亚硝酸根以亚硝酸钠或亚硝酸钾的形式给药。
29.根据权利要求23-26中任一项的用途，其中所述硝酸根以硝酸钠或硝酸钾的形式给药。
30.根据权利要求23-26中任一项的用途，其中所述亚硝酸根以0.01至10000纳摩尔/kg/分钟的剂量静脉内给药。
31.根据权利要求23-26中任一项的用途，其中所述硝酸根以0.01至100毫摩尔/kg/24小时的剂量以硝酸盐的形式口服给药。
32.根据权利要求23-26中任一项的用途，其中组合物中的所述无机亚硝酸根(NO2 -)和/或硝酸根(NO3 -)从选自含硝酸根的植物、蔬菜或水果的天然来源分离。
33.根据权利要求32的用途，其中所述组合物配制为汁浓缩物或干燥的浓缩物。
34.根据权利要求32的用途，其中所述含硝酸根的植物选自菠菜、莴苣、茴香、卷心菜、白菜和甜菜根。
35.根据权利要求34的用途，其中所述含硝酸根的植物为甜菜根。
36.根据权利要求35的用途，其中所述组合物配制为汁浓缩物或干燥的浓缩物。
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