CN101619317A - 小麦抗病相关基因TaEDR2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种可用于筛选抗白粉病小麦的引物。所提供的用于筛选抗白粉病小麦的引物，名称为TaEDR2，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。序列表中的序列1由18个碱基组成，序列表中的序列2由20个碱基组成。第二个目的是提供一种筛选抗白粉病小麦的方法。所提供的筛选抗白粉病小麦的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有197bp和193bp大小的条带。

Description

小麦抗病相关基因TaEDR2及其应用

技术领域

本发明涉及小麦抗病相关基因TaEDR2及其应用。

背景技术

小麦白粉病是由小麦白粉菌.Blumcria graminis f.sp.triaticij引起的真菌性病害，已成为影响世界小麦生产的重要病害。在20世纪70年代以前，我国小麦白粉病仅在云、贵、川和山东沿海等湿润多雨地区流行，但近三十年，由于水肥条件的改善和矮杆品种的应用，其发生范围和面积不断扩大，危害程度明显加重，成为影响我国小麦生产的主要病害，几乎所有小麦产区都有发生，每年均对生产造成较大损失，流行年份损失更重。如1990和1991年白粉病在全国大流行，两年发生面积均超过1.8亿亩，年损失小麦32亿公斤，发生范围遍及全国各主要麦区。

利用抗病品种是防治小麦白粉病最经济、有效、安全易行的途径，选育和推广抗病品种是控制病害流行的首选措施。国内外在小麦白粉病抗病育种方面做了大量工作，育成的抗病品种对减轻病害损失发挥了一定作用。但由于病原菌小种的快速变化以及抗病育种过程中过分强调免疫或高抗类型的选择，品种抗性频繁丧失，抗病育种始终处于被动应付状态。在欧洲，抗白粉病品种在生产中推广后，快则2-3年，慢则4-5年就丧失了抗病能力。在我国，花费多年培育的抗病品种应用不久，有的甚至还未应用，就由于病菌群体的变化而丧失抗性。“七五”期间，含Pm8的品种在全国丧失抗性；“八五”和“九五”期间，Pm4a在北京、贵州、河北、河南、山东、湖北和江苏7省市的毒性频率呈上升趋势(33.3％-100％)，Pm6在上述7省市的抗性已接近丧失，其毒性频率为91.3％-100％；还发现了对我国自己转育成功并定名的抗病基因Pm21有毒性的菌株。目前国内推广的品种大多高感或中感白粉病，生产上迫切需要抗性好且持久的品种。

实践表明，累加多个有效抗病基因是提高品种抗病广谱性和延长品种抗性寿命的有效手段之一。但是，在育种实践中通过常规手段难以鉴定出多个基因在一起的材料。利用分子标记辅助选择(makcr-assistcd sclcction，MAS)，可快速、准确地鉴定出具体的抗性基因，从而实现抗病基因的聚合。

自从90年代以来，已找到了小麦锈病、赤霉病、白粉病等病害的不少抗病基因的分子标记。SSR(simplc scqucncc rcpcat，即简单重复序列)标记又称作微卫星(Microsatcllitc)标记，由于具有多态性高、染色体专化性强，重复性好、操作简单等优点，而被广泛应用于小麦、水稻、玉米、大豆等作物的分子标记、遗传作图等项研究。

目前国际上已发现的小麦主效抗白粉病基因有42个，分别位于32个基因位点，在这些基因当中，仅Pm2，Pm4b，Pml2，Pml3，Pml6，Pm20，Pm21，Pm30，Pm31在我国大部分麦区抗性是有效的，特别是Pml6基因在我国抗谱广、抗性强。然而，到目前为止还未发现Pml6基因的分子标记。因此，发掘Pml6基因的分子标记，对于培育多基因聚合体材料，培育持久抗性品种和进一步的基因克隆具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于筛选抗白粉病小麦的引物。

本发明所提供的用于筛选抗白粉病小麦的引物，名称为TaEDR2，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。

序列表中的序列1由18个碱基组成，序列表中的序列2由20个碱基组成。

本发明的第二个目的是提供一种筛选抗白粉病小麦的方法。

本发明所提供的筛选抗白粉病小麦的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有197bp和193bp大小的条带。

如扩增产物中有197bp和193bp大小的条带，待测小麦为抗白粉病小麦。

其中，以25μl总体积为例，PCR扩增的反应体系包括：模板DNA(20ng/μl)5μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，弓}物对(2μM)3μl，dNTPs(2.5mM)0.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，无菌蒸馏水13.8μl。10×PCR缓冲液的组成是Tris-HCl(pH8.3)100mM，KCl500mM，MgCl。15mM。反应程序是94。C预变性5min，随后进行35个循环：94℃40s，60℃30s，72℃40s；最后72℃延伸10min，4℃保存。

所述检测扩增产物的方法可为对扩增产物进行6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。具体可为：每份扩增产物中加入8μl变性的载样指示剂(98％甲酰胺，10mM CDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝和0.25％二甲苯青)，95。C变性5-10mins。每份变性的扩增样品7 11 1在浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。检测扩增产物中是否有197bp和193bp大小的条带。

由于Pml6基因以前已被定位在小麦4A染色体上(Rca，dcr，S.M.，andT.C.Millcr，1991：The introduction into broad whcat of a major genefor rcsistance to powdcry miidew from wild cmmcr whcat.Cuphytica 53，57-60.)，发明人选用定位在4A染色体上的16对SSR引物，以及与小麦4A染色体有部分同源关系的水稻第3染色体上的15对SSR引物对小麦材料70281(含抗病基因Pml6)、Chanccllcr(感病)、抗病池、感病池进行扩增。结果表明所有引物在抗病池和感病池间的扩增产物均无多态性，仅有4对引物在亲本间有多态性，与预期的结果不符。因为Naranjo等(Naranjo，T.，A.Roca，P.G.Goicocchca，and R.Giraldcz，1987：Arm homocology of whcat andryc chromosomcs.Gcnomc 29，873-882)发现在小麦进化过程中第4、5和7同源染色体组发生了交换，后来得到了Nclson等人(Nclson，J.C.，M.C.Sorrclls，A.C.V.Dcynzc，Y.H.Lu，M.Atkinson，M.Bcrnard，

P.Lcroy，J.D.Faris and J.A.Andcrson，1995：Molccular mappingof whcat：Major gcncs and rcarrangmcnts in homocologous groups 4，5，and 7.Gcnctics141，721-731.)的证实。所以进一步选用小麦4B、5A、5B、7A和7B染色体上的34对SSR引物对感病品种Chanccllcr、含有Pml6的抗病品系70281(PM16，京837。)

以及以这两个亲本杂交组合的F。代分离群体进行分子标记筛选和遗传连锁分析，结果表明引物TaEDR2在抗、感亲本和抗、感池间均存在明显的多态性，抗病亲本和抗病池均具有197bp和193bp两条带，感病亲本和感病池均具有193bp和191bp两条带，其中197bp的特征带为抗病病亲本和抗病池所特有，且与抗白粉病基因Pml6紧密连锁，其遗传距离为5.3cM。经中国春缺体一四体分析，证明了Pml6基因位于小麦5B染色体短臂(5BS)，并非4A染色体。并用7个感病小麦品种和16个含有已知抗病基因的抗病品种(系)进行了验证，结果表明SSR分子标记TaEDR2是小麦抗白粉病基因Pml6的很好标记。

本发明提供了小麦抗白粉病基因Pml6的SSR分子标记TaEDR2，该标记与Pml6基因紧密连锁(5.3cM)，Pml6基因在我国抗谱广、抗性强，利用该标记可以对抗病基因Pml6进行分子标记辅助选择，从而实现与其它有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明的方法及其专用引物将在小麦抗白粉病基因Pml6的筛选和小麦抗病育种中发挥重要作用。

实施例一：

选用矮早做母本，西安8号做父本，进行有性杂交。该品种在进行有性杂交前，对母本和父本进行过有意的破坏，例如经过了水沁、火烤，后经过种籽复原法得到了初始的F代；即得到本发明的最初F代的小麦种籽。

用F代栽种，小麦种在盆中，14天后，取出，在2.0％NaCI溶液中浸泡3.5小时。25 cDNA文库构建按Sambrook(1987)方法进行。收集新鲜全株叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/[，硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，之后，溶于水。经mRNA纯化试剂盒处理得到吗mRNA。取2ug mRNA进行逆转录反应，然后再进行二链合成。双链cDNlA与EcoR.1接头连接后磷酸化，经制备离心柱(Sephacryl。400)去除多余接头，然后与酶切的脱磷pExcell，载体(Pharmacia)连接，取5μl连接产物加入包装蛋白，建成cDNA文库。以拟南芥DREB cDNA为探针筛选了4.5X10’未扩增斑得到3个阳性斑，其扦入片段为1.29kb。该片段包括834bp的开放读码框架，编码由278个氨基酸组成的多肽，其5’端为25 1 bp，3’端为173bp。小麦TaDREB cDNA全序列及氨基酸序列见图1。将剪枝后4-6天的植株倒置于含转化缓冲液的玻璃瓶中，抽真空，维持0.05Mpa压力5.10分钟。取出种植盆，侧放24小时。然后将种植盆直立，按往常的方法培育植株至结实，收获成熟种子。

序列表

＜160)1

<210>1

<211>2460

<212>DNA

＜213)小麦属小麦(Triticum acstivum L.)

＜400)1

cttgaacctg ggacatcact cgtttgtgtc gtgtactatg ataggttttt tcttgatgtc

atatcgcagg ctatctttca ctaagcttcc ctttggcatg gaattcaaag taagtgaaca

ttgctttact ctactctccc aaataagtat gaagtgatat tttctcttag ctcttttgaa

aaatgtatag atatctcacc atcttctttg atagaaatgc tattctttct tttacaccca

tttacttttt catgaaaata agcaaggtct ctaattcttt atacaagtca ctctactgtt

cacctcctct tttatgctca cactctttca tttcacaaat ttgggtcagt aaaggatgca

agtgttatcc aaaatgaatg aatgtaaatt gtttgtaggt ggcttttcaa gtcagcagtc

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cattttacaa gttctgaact aaaacatcac attcggtgca agtttgtgga tctgaggtgc

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tactttctcg ctacgtggcg gccatgtacg agcaccgacg tgctacgtgt cccgttgcat

ctgcctataa atgccgcctg ctccaatctc ctttccaaca caagcagtcg attcatccaa

gcgagttgag caatagcggt gagatttaca gtgatttcag ttcgtgtttg ttggtgaga

<210>2

<211>35 6

<212>PRt

<213>小麦

<400>2

met GlY Ser Ile Ala hla GlY hla AsP Glu AsP Ala Cys Met ryr Ala

Leu Gln Leu VaI Ser Ser Ser Ile Leu Pro Met rhr Leu Lys Asn Ala

Ile Glu Leu Gly Leu Leu Glu rhr Leu met Ala Ala GlY Gly Lys Phe

Leu rhr Pro lla Glu Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser hla Ala Asn Pro

Glu Ala Pro Asp met Val Asp Arg met Leu Arg Leu Leu Ala Ser ryr

Asn Val Val Ser Cys Arg rhr Glu Glu Gly Lys Asp Gly Arg Leu Ser

Arg Arg ryr Gly Ala Ala Pro gal Cys Lys ryr Leu rhr Pro Ash Glu

Asp Gly Val Ser met Ser Ala Leu Ala Leu met Asn Gln Asp Lys Val

Leu met Glu Ser rrp ryr ryr Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp GlY GlY

lle Pro Phe Asn Lys Ala ryr GlY met Ser Ala Phe Glu ryr HiS GlY

rhr Asp Pro Arg Phe Ash Arg Val Phe Ash Glu Gly met Lys ASh HiS

Ser Ile Ile Ile rhr Lys Lys Leu Leu Glu Ser ryr Lys GlY Phe Glu

GlY Leu GlY rhr Leu Val Asp gal GlY GlY Gly Val GlY Ala qhr Val

Ala Ala Ile rhr Ala HiS ryr Pro rhr Ile Lys Gly Ile Asn Phe Asp

Leu Pro HiS Val lle Ser Glu Ala Pro Pro Phe Pro GlY Val rhr HiS

Val Gly Gly Asp met Phe Gin Lys Val Pro Ser Ala Asp Ala Ile Leu

met Lys rrp Ile Leu His AsP rrp Ser Asp Glu His Cys Ala rhr Leu

Leu Lys Asn Cys ryr Asp Ala Leu Pro Ala HiS Gly Lys Val Val Leu

Val GlU Cys lle Leu Pro Val Asn Pro Glu Ala rhr Pro Lys Ala Gin

GlY Val Phe HiS Val Asp met Ile met Leu Ala His Asn Pro GlY Gly

krg Glu Arg ryr Glu Arg Glu Phe Glu Ala Leu Ala Lys GlY Ala GlY

Phe Ala Ala met Lys rhr rhr ryr Ile ryr ala asn Ala rrp Ala lle

Glu Phe rhr Lys

Claims (5)

1、一种小麦抗病相关基因TaEDR2，其碱基序列如：SEQ ID NO：1所示。

2、一种权利要求1所述的小麦抗病相关基因TaEDR2所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3、小麦抗病相关基因TaEDR2在植物抗病改良种的应用。

4、小麦抗病相关基因TaEDR2在合成新的抗病相关基因中的应用。

5、小麦抗病相关基因TaEDR2在小麦基因芯片中的应用。

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