CN101606948B - 一种小干扰rna在制备治疗大肠癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用，这种小干扰RNA能够抑制大肠癌细胞增殖活力，阻滞大肠癌细胞生长周期，诱导大肠癌细胞凋亡，下调大肠癌mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路的活性，对裸鼠大肠癌移植瘤具有治疗作用，解决了现有技术中采用化疗来治疗中晚期大肠癌，其疗效以及患者预后均较差的技术问题。

Description

一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用

技术领域：

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种治疗肿瘤的药物，特别是一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用。

背景技术：

随着人们生活水平的提高和饮食结构的变化，大肠癌在我国的发病率呈增高趋势，因此，探索有效的大肠癌防治策略是关乎国民健康的重要课题。但由于大肠癌发生发展的机制尚不明确，故缺乏有效的防治靶点及手段。尤其是中晚期大肠癌，其治疗手段只能以化疗为主，疗效以及患者预后均较差。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)介导的信号通路是与细胞增殖和凋亡最密切相关的通路之一，因其处于生长调节的中心环节而倍受关注。新近研究表明，肺癌、肾癌、乳腺癌和白血病等多种肿瘤均存在mTOR信号通路的过度激活；在肝癌、胰腺癌等消化系肿瘤中亦存在mTOR的高表达和持续活化；I期和II期临床研究显示，雷帕霉素的衍生物如CCI-779(Temsirolimus)、RAD001(Everolimus)以及AP23573等对晚期肾细胞癌及乳腺癌具有一定的抑制作用。但是目前关于mTOR信号通路与大肠癌发生发展的关系尚无文献报道，抑制mTOR信号通路是否可以防治大肠癌尚不知晓。

近十年来生物学最重要的进展莫过于RNA干扰(RNAi)现象的发现。已有研究表明，应用RNAi技术能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，产生类似基因敲除的效应。作为HIV相关淋巴瘤、AMD(age relatedmacular degeneration)等人类疾病的可能治疗手段，RNAi相关研究已进入I期和II期临床试验。这无疑也为实体肿瘤的治疗开辟了新途径。目前，肿瘤治疗领域的RNAi研究蓬勃开展，其中为数甚众者将与肿瘤发生发展密切相关的信号转导通路中的各级分子作为静默靶点的候选。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)基因，GeneID 2475，NM_004958，定位于染色体1p36.2，编码蛋白质分子量为289kDa，为不典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于PIKK家族(PtdIns3K-related kinase family)。

RNA干扰技术(RNAi)是把与内源mRNA编码区同源的小片段外源双链RNA导入细胞中，导致特定基因沉默的一种技术。siRNA是RNAi的关键效应分子，是长度为21-23nt的双链RNA。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用，所述的这种小干扰RNA要解决现有技术中采用化疗来治疗中晚期大肠癌，其疗效以及患者预后均较差的技术问题。

本发明提供了一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用，所述的小干扰RNA正义链的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的小干扰RNA反义链的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

本发明还提供了一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用，所述的小干扰RNA的正义链5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，所述的小干扰RNA的反义链5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用，所述的小干扰RNA的正义链5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示，所述的小干扰RNA的反义链5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用，所述的小干扰RNA的正义链5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述的小干扰RNA的反义链5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示。

本发明使用了针对mTOR基因的4对siRNA片段，由美国Dharmacon公司合成(Pre-designed RNAi Reagents，Dharmacon，USA)，碱基序列及分子量如下表所示。经实验证实均为有效序列，均可抑制mTOR基因及蛋白表达，其中以siRNA3的作用最为显著。

mTOR siRNA1-4寡核苷酸序列及分子量

siRNA3分子量为13,373(g/mole)，为冻干粉剂，保存于-20℃，用前以DEPC水溶解。正义链(Nucleotide-3-S)21个碱基是19个碱基的mTOR基因靶序列加上3’端2个碱基的悬头UU，反义链(Nucleotide-3-A)21个碱基完全与mTOR基因靶序列互补。在体内研究部分，上述序列由上海吉玛公司(Shanghai GenePharma Co.，Ltd)进行2’甲氧修饰以增加稳定性，并化学合成(在ISO9000质量标准下生产；HPLC纯化；全长双链siRNA含量＞97％)。

siRNA转染入细胞后，即启动RNAi效应阶段。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)，新合成的dsRNA再由胞质中的核酸内切酶(Dicer)切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明能够抑制大肠癌细胞增殖活力，阻滞大肠癌细胞生长周期，诱导大肠癌细胞凋亡，下调大肠癌mTOR/p70s6K/4EBP1信号通路的活性，对裸鼠大肠癌移植瘤具有治疗作用。

附图说明：

图1显示了应用RNAi静默mTOR基因及蛋白表达的图，其中，图1A是应用脂质体法瞬时转染人大肠癌HCT116细胞系，转染48h后应用Taqmen Real-Time PCR检测mTOR基因表达的图，图1B是应用脂质体法瞬时转染人大肠癌HCT116细胞系，转染48h后应用Western blot技术检测mTOR蛋白表达的图，图1C是以GAPDH蛋白条带密度为标准，进行Pan-mTOR及P-mTOR蛋白密度半定量的图。

图2显示了mTOR基因沉默抑制下游p70S6K及4EBP1蛋白磷酸化的图；其中，图2A是以mTOR siRNA3(100nM)及阴性对照siRNA(100nM)转染HCT116细胞，48h后抽提细胞总蛋白，以Western blot检测pan-p70s6K，pho-p70s6K(Thr389)，pan-4EBP1，pho-4EBP1(Thr37/46)，以GAPDH作为内参照；图2B是以相应总蛋白(pan-)条带密度为标准，进行pho-p70S6K及pho-4EBP1蛋白半定量。

图3显示了mTOR siRNA3转染抑制HCT116细胞活力的图。

图4显示了mTOR siRNA3转染阻滞HCT116细胞周期的图。

图5显示了mTOR siRNA3转染诱导HCT116细胞凋亡的形态学检测及定量的图；其中，图5A是吖啶橙染色(Acridine Orange Staining)的结果，显示正常活细胞DNA呈绿色，RNA呈红色，凋亡细胞呈现致密浓染的黄色增强荧光(箭头所示)；图5B是AnnexinV/PI双染色的结果，显示早期凋亡细胞呈现绿色荧光，晚期凋亡细胞膜呈绿色荧光，核呈红色荧光；图5C是流式细胞术检测结果，早期凋亡细胞位于第4象限(右下)。

图6显示了mTOR siRNA3转染诱导HCT116细胞PARP蛋白剪切体(89kDa)形成的图。

图7显示了瘤内注射mTOR siRNA3抑制裸鼠大肠癌移植瘤生长的图；其中，图7A是首次瘤内注射当天及注射后第10天各组荷瘤裸鼠图片；图7B是以游标卡尺测算肿瘤体积，每15天一次，数据以x±SD表示(n＝6)。

图8显示了mTOR siRNA3转染抑制裸鼠大肠癌移植瘤mTOR蛋白表达以及mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路活性的图，其中，图8A是三组裸鼠大肠癌移植瘤(siRNA3组、阴性对照组、转染试剂对照组)mTOR蛋白以及mTOR信号通路活性的Western blot检测结果；图8B是mTOR蛋白以及pho-p70S6K和pho-4EBP1的标准化半定量结果；图8C是转染试剂对照组(VC)mTOR信号通路活性的SABC法检测结果；图8D是siRNA3转染组mTOR信号通路活性的SABC法检测结果。

图9显示了瘤内注射mTOR siRNA3诱导裸鼠大肠癌移植瘤细胞凋亡的图，其中，图9A是SiRNA3作用组TUNEL法检测结果；图9B是阴性对照组(NC)及转染试剂对照组(VC)的TUNEL法检测结果；图9C是各组凋亡细胞计数结果(％)，数据以x±SD表示。

具体实施方式：

实施例1 体外研究

本实施例的实验材料人大肠癌细胞系HCT116购自中科院细胞生化所、McCOY’S5A培养基购自美国Sigma公司；针对mTOR基因4个潜在靶位点的SiRNA片段及阴性对照由美国Dharmacon公司合成(Pre-designed RNAi Reagents，Dharmacon，USA)；转染试剂：DharmaFECT^TM 4 siRNA Transfection Reagent(T-2004-03)；5×SiRNA Buffer：Dharmacon，USA；TRIzol Reagent：Invitrogen；MTT，Triton X-100，碘化丙啶(PI)：Sigma；RNase A：Roche公司；试验所用SiRNA、引物、探针序列见表1；试验所用抗体见表2；化学发光检测用试剂盒：Super Signal

West Femto Maximum SensitivitySubstrate(34095)；Super Signal

West Pico Chemilu-minescent Substrae(34077)，均为Pierce公司产品；细胞培养耗材：Greiner，Germany；Real-Time quantitative PCR试剂盒：TOYOBO，Japan；PVDF膜：Milipore，Bedford，MA；8％SDS PAGE、12％SDS PAGE：PIERCE，USA；酶标仪：Microplate Reader，Model 550，Bio Rad，USA；流式细胞仪：EPICS-XL，Beckman Coulter，Germany；荧光定量PCR仪：FTC2000(Canada)；蛋白电泳系统：Mini Protein II BIO-RAD，USA；超净工作台(YJ-875)：苏州净化设备公司；二氧化碳培养箱：Sheldon Manufacturing Inc，SHELLABMODEL2300；低温超速离心机：Eppendorf Centrifuge，5417R；紫外/可见分光光度计：Ultraspec 2000型，Pharmacia Biotech公司。

1. 体外mTOR siRNA瞬时转染及mTOR基因沉默效果的测定细胞培养

HCT116细胞的培养基为McCOY’S 5A MEDIUM完全培养液(10％胎牛血清，100U/ml青/链霉素)，培养条件为95％空气、5％CO₂、95％湿度、37℃恒温。

siRNA瞬时转染

[1]分别设置空白对照组，转染试剂对照组(Vehicle Control，VC)，阴性对照组(Negative Control)，mTOR siRNA干扰组。

[2]以0.125％胰蛋白酶消化HCT116细胞成单细胞悬液，接种于直径6cm的细胞培养皿，培养20h，使细胞融合度达到50％。

[3]取20uM siRNA 80μl，加入720μl 1×siRNA Buffer，800μl无血清培养基，共1600μl，混匀。室温放置5分钟。

[4]以同上方法溶解阴性对照(NC)序列。

[5]取DharmaFECT^TM 4 192μl(16×12)，加入4608μl(384×8)无血清培养基，共4800μl，混匀。室温放置5分钟。

[6]将DharmaFECT^TM 4与siRNA等体积混合，室温放置20分钟。

[7]弃培养皿内的液体，以PBS洗涤后加入3.2ml含血清的完全培养液，800μlDharmaFECT^TM 4与siRNA的混合物，使siRNA终浓度为100nM。转染试剂对照组只加DharmaFECT^TM 4，终浓度与RNA干扰组相同(4μl/ml)。

[8]按常规条件继续培养48h后检测RNA及蛋白。

[9]试验所用siRNA、引物、探针序列见表1

表1 siRNA寡核苷酸、Taqmen Real-Time PCR引物及探针序列

细胞RNA抽提

[1]六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，以1ml移液枪头吹打。

[2]将各孔裂解液吸到1.5ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。15-30℃孵育2-3min，离心(4℃，12,000g，15min)。

[3]离心后液体分为三层，小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。

[4]加入等体积异丙醇，0.4-0.5ml，混匀，15-30℃孵育10-30min，离心(4℃，12,000g，10min)。

[5]去上清，加入75％乙醇1ml，漩涡振荡30s，离心(4℃，7,500g，5min)。

[6]尽量除去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。

[7]加入20μl DEPC水溶解，分装5μl/管，-70℃冰箱保存。

[8]细胞总RNA的鉴定：0.9-1.2％琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA，观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计分别测定RNA样品在260nm和280nm处的光密度值(OD)，并计算RNA的含量和纯度。

RT反应体系(30μl)：

2×RT buffer 15μl，随机引物(100pmol/ul)1.5μl，逆转录酶1.5μl，RNA模板5μl，DEPC水7μl

反应条件：25℃，10min；40℃，60min；70℃，10min

Taqmen Real-Time PCR反应体系(50μl)：

2×Hotstart Fluo-PCR mix 25μl，引物(25pmol/μl)0.8μl×2，探针(25pmol/μl)0.3μl，cDNA模板1μl，DEPC水22.1μl

反应条件：93℃，4min；93℃，20s；60℃，30s；40循环

细胞总蛋白的抽提

[1]配制细胞裂解缓冲液(RIPA缓冲液)：150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，50mM Tris-HCl(PH8.0)。用前加入PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸化酶抑制剂。

[2]以RIPA裂解缓冲液悬浮冻存的细胞团，0.1ml/(1×10⁶～1×10⁷)细胞。

[3]涡旋30s，冰上静置5min，重复3次。

[4]14,000rpm，4℃，离心10min，吸取上清。

[5]应用考马斯亮兰法(Bradford法)蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。

Western blot

[1]配制HEPES电泳缓冲液：HEPES 23.8g，Tris 12.1g，SDS 1.0g，加入去离子水溶解，定容至1000ml。

[2]配制Tris-甘氨酸电转移缓冲液(PH8.3)：Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，加入去离子水溶解，定容至1000ml。

[3]配制封闭液：小牛血清与TBS溶液(Tris 12.1g，NaCl 9g，去离子水定容至1000ml，调节pH至7.5)以1∶9比例配成含10％小牛血清的封闭液。

[4]将定量后的蛋白样品与5×loading buffer混合，于100℃加热变性3-5min，简单离心后顺序加入加样孔中。以150V电压电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部。

[5]取出凝胶，其中一块用于考马斯亮蓝染色以观察样品的加样量及电泳情况，另一块用于转膜，于甘氨酸电转移缓冲液中平衡10-15min。剪裁大小与凝胶相同的6张滤纸和1张PVDF膜。PVDF膜浸以甲醇预处理15s，与滤纸共同浸泡于Tris-甘氨酸电转移缓冲液。将凝胶的一面与滤膜相接触，夹于6张滤纸之间，整齐叠放于电转移装置中，PVDF膜靠近阳极一侧。加入Tris-甘氨酸电转移缓冲液，于冰上以0.65mA/cm²的电流强度恒流电转移2～3h。

[6]PVDF膜于封闭液中4℃过夜。弃去封闭液，TTBS(999ml TBS，Tween-20 1ml)振荡洗膜5分钟，与一抗室温孵育2-3h。TTBS震荡洗膜3次，每次15min。与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1-2h。TTBS震荡洗膜3次，每次15min。

[7]以ECL试剂盒进行化学发光，暗室内将A、B发光液等比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液上，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1～2min，清水漂洗后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

本实施例应用脂质体法瞬时转染人大肠癌HCT116细胞系，转染48h后应用Taqmen Real-Time PCR(图1A)及Western blot(图1B)方法检测mTOR基因及蛋白表达，(图1C)以GAPDH蛋白条带密度为标准，进行Pan-mTOR及P-mTOR蛋白条带密度半定量。由图1可知，mTOR基因的扩增标准曲线为[Y＝-3.4172X+46.4226](R＝0.99973)。针对4个mTOR基因靶位点的siRNA片段(siRNA1、2、3、4)均可显著抑制mTOR基因及蛋白表达，以siRNA3的作用最为明显。与转染试剂对照组(VC)相比较，siRNA3作用组mTOR mRNA表达量减少82.65％，mTOR蛋白表达量减少90.10％，磷酸化mTOR蛋白(pho-mTOR)表达减少89.52％。据此，选择siRNA3作为靶序列进行后续实验。

2.mTOR基因沉默对mTOR下游p70S6K及4EBP1蛋白活性的影响

应用Western blot方法检测mTOR信号通路下游p70s6K及4EBP1蛋白活性的变化。具体操作步骤同前。

以mTOR siRNA3(100nM)及阴性对照siRNA(100nM)转染HCT116细胞，48h后抽提细胞总蛋白，以Western blot检测pan-p70S6K，pho-p70S6K(Thr389)，pan-4EBP1，pho-4EBP1(Thr37/46)，以GAPDH作为内参照(图2A)。以相应总蛋白(pan-)条带密度为标准，进行pho-p70S6K及pho-4EBP1蛋白半定量(图2B)。图2中所示数据代表三次实验结果。

由图2可知，mTOR SiRNA3瞬时转染可显著降低mTOR下游p70s6K及4EBP1蛋白的磷酸化水平(pho-p70S6K_SiRNA3/pho-p70S6K_VC＝0.0729；pho-4EBP1_SiRNA3/pho-4EBP1_VC＝0.0521)，提示mTOR基因沉默可抑制下游p70S6K及4EBP1蛋白的磷酸化，即mTOR信号通路的活性被抑制。

3.MTT比色实验检测细胞活力变化

[1]细胞接种：细胞培养至生长成单层，以0.125％胰蛋白酶消化，以含10％胎牛血清的McCOY’S 5A培养基调成单细胞悬液，浓度为2×10⁴个/ml，按100μl/孔接种到96孔培养板中。

[2]转染：接种24小时后吸去培养液，加入200μl完全培养液，其中SiRNA浓度100nM，DharmaFECT^TM 4浓度4μl/ml，溶剂对照组(Vehicle Control)只加入DharmaFECT^TM4，空白对照组加入完全培养液。置于原条件分别继续培养24h、48h、72h。每组设5个副孔。每组实验重复三次。

[3]显色：每孔加入5mg/ml的MTT(methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide，(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenytetra-zolium，Calbiochem，San Diego，CA，USA)溶液20μl，置于37℃继续培养4h，小心吸去上清液，加入100ul/孔DMSO，避光室温下摇床振荡30min。

[4]比色：酶标仪双波长(570nm、630nm)测定各孔光吸收值并记录结果。以表示细胞活力。试验重复三次，数据以x±SD显示。与阴性

对照组(NC)相比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由图3可知，瞬时转染mTOR siRNA3 48h即可显著抑制HCT116细胞活力(81.99±1.1277vs.97.5±0.6186，P＜0.05)，至转染后72h，其作用更为明显(56.42±1.4226vs.85.83±3.635，P＜0.01)。

4.流式细胞术检测细胞周期

[1]对数生长期细胞以无血清培养基培养24h使之同步化。

[2]SiRNA瞬时转染，终浓度为100nM。设阴性序列对照、空白对照。于完全培养基中继续培养48h。

[3]以0.125％胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤，4℃无水乙醇固定后，制成约10⁶个/ml的单细胞悬液。

[4]与含1％RNA酶的Tris-HCL缓冲液(pH7.4)共同孵育10min。

[5]以碘化丙啶(PI)染色后，进行流式细胞仪检测。

[6]根据相对不同DNA含量的细胞分布图，拟合各周期细胞的百分率。每组复测3个样品，试验重复三次。数据以x±SD显示。与阴性对照组(Negative Control，NC)相比较，^*P＜0.01。

由图4可知，siRNA3转染后48h，S期细胞数量显著减少，G0/G1期细胞数量显著增多，mTOR siRNA3可将HCT116细胞周期阻滞于G0/G1期(78.667±0.2887vs.94.79±0.1，P＜0.01)。

5.mTOR基因沉默诱发细胞凋亡

以mTOR siRNA3(100nM)及阴性对照序列(100nM)转染HCT116细胞，转染后48h进行吖啶橙染色，AnnexinV/PI双染色，以流式细胞术进行凋亡细胞定量。

吖啶橙(Acridine Orange，AO)染色

1000rpm/min离心5分钟收集细胞，以PBS悬浮细胞团。取95μl细胞悬液与5μl吖啶橙染色液(pH6.8)混匀，点于洁净载玻片上，盖玻片封固后立即镜检。正常活细胞DNA呈绿色，RNA呈红色，凋亡细胞呈现致密浓染的黄色增强荧光(图5A箭头所示)。

Annexin-V/PI双染色

于4℃以1300rpm/min离心5分钟收集细胞；1ml预冷的PBS洗涤细胞；加入200μlBinding buffer悬浮细胞，加入10μl FITC-Annexin-V和5μl PI，避光室温温育15～30分钟；取细胞沉淀涂片，盖玻片封固，立即镜检。或加入300μl binding buffer，使终体积为500μl，进行流式细胞仪检测。早期凋亡细胞呈现绿色荧光，晚期凋亡细胞膜呈绿色荧光，核呈红色荧光(图5B)。在流式细胞术检测图谱，早期凋亡细胞位于第4象限(右下)。凋亡细胞的比例(％)以x±SD显示，代表三次试验结果。与阴性对照组(negative control，NC)比较，^*P＜0.01(图5C)。

多聚ADP-核糖聚合酶PARP的检测

PARP(polyADP-ribose polymerase)是第一个被鉴定的在细胞凋亡中由Caspase-3和其他半胱氨酸蛋白酶降解、且最富特征性的蛋白酶解底物。PARP的蛋白酶解作为半胱氨酸蛋白酶激活的分子事件，被认为是细胞凋亡的一个早期分子标志。将转染后48h的HCT116细胞收集，并抽提细胞总蛋白，应用Western blot方法检测PARP蛋白剪切体(89kD)，具体操作步骤同前文，所用抗体如表2所示。PARP蛋白免疫印迹图片及蛋白条带密度半定量结果(89KDa/116KDa)如图6所示。

由图5可知，与VC及NC对照组相比较，转染mTOR siRNA3 48h可诱导HCT116细胞发生显著的凋亡的形态学改变(图5A，B)；24h及48h的平均凋亡率分别为8.94％和36.5％，均显著高于VC及NC对照组(P＜0.01，P＜0.01)(图5C)。由图6可知，在mTOR siRNA3作用48h及72h，PARP蛋白剪切体(89kD)的比例显著增加，提示116kD的PARP被Caspase-3剪切生成89kD的片段，是细胞凋亡的重要特征。

表2 实验所用抗体及稀释度

注：CST，Cell Signaling Tech；WB，Western blot；IHC，Immunohistochemistry

实施例2 体内研究

本实施例的实验材料 实验动物：BALB/c裸鼠，雄性，4周龄，近交系，购自中科院松江动物实验基地(SCXK(沪)2003-0003)，饲养于上海交通大学医学院IVC动物实验室(SYXK(沪)2003-0007)；SiRNA：应用表1所示siRNA3及阴性对照(NegativeControl)序列，由上海吉玛公司(Shanghai GenePharma Co.，Ltd)进行甲氧修饰，并化学合成；转染试剂：in vivo-jetPEI^TM(201-50G，Polyplus Transfection，Illkirch，France)；试验所用抗体见表2；TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒：Roche，1684809a；50μl微量注射器：上海天呈科技有限公司；游标卡尺：上海精密仪器仪表有限公司；超声波细胞粉碎机(JY92-II)：宁波新芝生物科技股份有限公司；石蜡切片机(RM21459)、包埋机(EG1140H)、自动染色机：Leica公司。

1.mTOR siRNA3瞬时转染抑制人大肠癌裸鼠移植瘤模型的生长

建立人大肠癌裸鼠移植瘤模型

复苏人大肠癌细胞株HCT116，传代培养至第三代，以0.125％胰蛋白酶消化细胞，离心收集，以PBS洗涤两次，悬浮为单细胞悬液，密度为1.5×10⁸个/ml。以微量注射器接种于裸鼠左侧腋部皮下，100μl/只。接种后1w形成肉眼可见的癌结节。接种后第10天开始RNAi实验。实验动物分3组，每组6只，如下：

[1]溶剂对照组(Vehicle control group，VC)：瘤内注射in vivo-jetPEI

[2]阴性序列对照组(Negative control group，NC)：瘤内注射Negative Control siRNA

[3]siRNA3干扰组(siRNA3 group)：瘤内注射mTOR siRNA3

siRNA瞬时转染

[1]以5％GS分别溶解in vivo-jetPEI及SiRNA。

[2]将溶解后的in vivo-jetPEI加入SiRNA，in vivo-jetPEI与SiRNA的比例为1.6μl/10μg，总体积为30μl。涡旋混匀后室温静置15min。

[3]在层流超净工作台内，以无菌微量注射器于肿瘤局部分3点注射，10μl/点。3组裸鼠分别瘤内注射in vivo-jetPEI(1.6μl/30μl/只，VC组)、siRNA_NC(10μg/30μl/只，NC组)、mTOR siRNA3(10μg/30μl/只，RNAi组)。

[4]隔天重复上述操作一次，共转染6次，末次转染后第2天处死实验动物。图7A为首次瘤内注射当天及注射后第10天各组荷瘤裸鼠图片。

肿瘤体积测算

应用游标卡尺于RNAi实验的第1、5、10天测量肿瘤最大直径(a)与最小直径(b)，根据公式 $V=\frac{1}{2}a{b}^2$ 计算肿瘤体积。数据以x±SD表示(n＝6)。与VC组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01(图7B)。

由图7可知，mTOR siRNA3可显著抑制裸鼠大肠癌移植瘤生长，siRNA3转染组肿瘤的生长速度显著低于转染试剂对照组(VC)以及阴性序列对照组(NC)。转染后第10天，siRNA3转染组的肿瘤体积(746.99±171.525)显著小于VC对照组(1333.765±220.427，P＜0.01)以及NC对照组(1489.37±449.684)(P＜0.01)，VC及NC对照组间无明显差异。

2.mTOR基因沉默对肿瘤组织mTOR信号通路活性的影响

抽提肿瘤组织总蛋白

[1]观察期结束后采用颈椎脱臼法处死并解剖实验动物，获得肿瘤组织，去除坏死组织，在液氮中将其碾碎成粉。

[2]将粉末转移到冰上预冷的RIPA裂解缓冲液中，每300mg样品加入1ml裂解液，匀浆器内最大转速匀浆30秒。

[3]将匀浆液置冰上，摇床上摇20min，150g离心5min，转移上清到新的离心管。

[4]18,000rpm 4℃再次离心30min，取上清测定蛋白质浓度。

Western blot

按照前文描述的Western blot步骤检测肿瘤组织Pan-mTOR、Pan-p70s6K、Pho-p70s6K(Thr389)、Pan-4EBP1和Pho-4EBP1(Thr37/46)蛋白水平的变化，以GAPDH作为内参照(图8A)。所用抗体如表2所示。以GAPDH条带密度为标准，进行Pan-mTOR标准化定量，以各自的总蛋白条带密度为标准，进行Pho-p70s6K和Pho-4EBP1的标准化定量(图8B)。与VC组比较，^*P＜0.01。图中所示数据代表三次实验结果。

SABC法检测肿瘤组织mTOR、p70s6K、4EBP1蛋白磷酸化水平

[1]至实验观察终点，以颈椎脱臼法处死实验动物，解剖剥离肿瘤，以PBS缓冲液洗净，去除坏死组织，以中性甲醛固定过夜

[2]按照常规方法取材、脱水、石蜡包埋，4μm连续切片，70℃烘烤2h

[3]石蜡切片以二甲苯脱蜡，2次，10min/次。

[4]梯度酒精水化(100％，95％，75％，50％)，5min/次，蒸馏水漂洗5min。

[5]含0.1％Tween-20的0.01M PBS(pH7.4)漂洗2次，5min/次

[6]滴加过氧化氢甲醇液以消除内源性过氧化物酶活性，室温孵育20min

[7]蒸馏水洗，PBS浸泡2次，5min/次

[8]0.01mol/L pH6.0柠檬酸缓冲液(CB)微波修复10min，冷却至室温，蒸馏水洗2次，PBS洗2次，3min/次

[9]滴加封闭用二抗宿主血清，室温孵育20min

[10]倾去血清，不洗，滴加一抗工作液，37℃温箱孵育1h。

[11]PBS冲洗3次，5min/次

[12]滴加生物素标记二抗，37℃温箱孵育30min

[13]PBS冲洗3次，5min/次

[14]滴加ABC复合物.37℃温箱30min

[15]PBS冲洗3次，5min/次

[16]滴加新鲜配制的BCIP/NBT液避光显色5～30min，显微镜下观察至出现阳性着色

[17]蒸馏水充分水洗终止染色

[18]核固红复染胞核

[19]蒸馏水充分水洗

[20]梯度乙醇(50％，75％，95％，100％)脱水，5min/次

[21]二甲苯透明2次，10min/次

[22]晾干后中性树胶封片

[23]应用OLYMPUS 1X51倒置显微镜观察并拍照。认为细胞浆着色为阳性表达。(图8C)VC组SABC法检测结果，(图8D)SiRNA3转染组SABC法检测结果。(a)Pho-mTOR(Ser2448)，(b)Pho-p70S6K1(Thr389)，(c)Pho-4EBP1(Thr37/46)。原始图片放大倍数：400×。

由图8可知，与对照组相比，mTOR siRNA3转染可显著降低裸鼠大肠癌移植瘤组织中mTOR蛋白的表达量(mTOR_SiRNA3/mTOR_VC＝0.2301，P＜0.01)，以及p70s6K、4EBP1蛋白的磷酸化水平(Pho-p70s6K_siRNA3/Pho-p70s6K_VC＝0.0845，P＜0.01；Pho-4EBP1_siRNA3/Pho-4EBP1_VC＝0.0602，P＜0.01)(图8A，B)。SABC法检测结果显示，siRNA3转染组肿瘤组织Pho-mTOR、Pho-p70s6K及Pho-4EBP1的表达量明显低于VC对照组。各对照组间无明显差异(图8C，D)。提示mTOR siRNA3转染可显著抑制裸鼠大肠癌移植瘤组织中mTOR蛋白表达以及mTOR/p70s6K/4EBP1信号通路活性。

3.TUNEL法原位检测细胞凋亡

[1]将石蜡组织切片置于染色缸中，二甲苯浸洗2次，每次5min

[2]100％的乙醇浸洗2次，依次用95％、85％、70％和50％的乙醇各浸洗一次，每次3min，PBS浸洗5min

[3]置于4％多聚甲醛溶液或含10％福尔马林的PBS溶液(见备注1和2)中固定15min，PBS浸洗二次，每次5min

[4]将载玻片取出置于一水平表面，用滤纸小心吸去载玻片上的多余液体，滴加100μL新配制的蛋白酶K工作溶液(见备注3)覆盖在样本区域上，室温下放置10～30min，然后PBS浸洗5min

[5]再置于4％多聚甲醛溶液或含10％福尔马林的PBS溶液中固定5min，用PBS浸洗二次，每次5min

[6]用滤纸小心吸去载玻片上的多余液体，滴加100μL的Equilibration Buffer于样本区域上，室温平衡5-10min

[7]载玻片平衡时，将Biotin-11-dUTP置冰上解冻，同时配制TdT酶反应液，于冰上保存待用

[8]用滤纸小心吸去样本区域周围的多余液体，滴加50μL的TdT酶反应液于样本区域上

[9]在反应区域盖上盖玻片以确保反应液分布均匀，于37℃、潮湿环境中反应60-90min

[10]去除盖玻片，加入50μL 2×SSC溶液终止反应，室温放置15min，PBS浸洗三次，每次5min

[11]用0.3％的H2O2浸洗3～5min，然后PBS浸洗三次，每次5min

[12]滴加100μL稀释的Streptavidin-AKP溶液于样本区域上，室温反应3-5min

[13]PBS浸洗三次，每次5min

[14]于载玻片的样本区域滴加100μL BCIP/NBT工作液(见备注10)，直到呈现浅蓝色背景

[15]去离子水漂洗2次，用核固红复染

[16]去离子水漂洗2～3次；依次用70％、90％、100％乙醇浸洗、每次3min，100％乙醇浸洗两次

[17]二甲苯浸洗固定，树脂封片，光学显微镜下进行观察并拍照。蓝色为凋亡细胞。

[18]每张切片取5个视野，应用Image Pro Plus 5.0 software计算阳性细胞率，结果以x±SD表示。(图9A)mTOR siRNA3作用组；(图9B)VC及NC对照组；(图9C)各组凋亡细胞计数结果(％)。原始图片放大倍数：400×。

由图9可知，与对照组相比较，mTOR siRNA3转染组细胞凋亡率显著增高(23.7±7.496vs.2.1±0.4，P＜0.01)。提示mTOR siRNA3转染可诱导裸鼠大肠癌移植瘤组织发生显著的凋亡。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属仁济医院

     房，静远

     张，燕捷

<120>一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>1

gagaagaaau ggaagaaauu u    21

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>2

auuucuucca uuucuucucu u    21

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>3

ccaaagugcu gcaguacuau u    21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>4

uaguacugca gcacuuuggu u    21

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>5

gagcaugccg ucaauaauau  u    21

<210>6

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>6

uauuauugac ggcaugcucu u    21

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>7

ggucugaacu gaaugaagau u    21

<210>8

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>8

ucuucauuca guucagaccu u    21

Claims (1)

1.一种小干扰RNA在制备治疗大肠癌的药物中的应用，所述的小干扰RNA的正义链5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的小干扰RNA的反义链5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。

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