CN101598734A - 纳米颗粒修饰寡核苷酸适配子检测蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测蛋白质标志物的新方法，具体方法是，以纳米金(NP，nanoparticle)修饰的寡核苷酸适配子(Aptamer)与靶蛋白质结合，同时另一个生物素化的寡核苷酸适配子也结合于靶蛋白质，构成一个三明治形式的复合物，接着三明治复合物通过亲和素结合于酶标板上，然后以银染增强法来放大三明治复合物上的靶蛋白质浓度信息，最后用比色法对蛋白质浓度信息进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测蛋白质标志物的方法，具体地说是一种利用纳米金修饰的Aptamer分子建立一种灵敏度高、操作简便的蛋白质检测新方法。
背景技术
在人类基因组计划完成后，生命科学面临的最重要任务之一就是对人类基因调节与功能的注释与确认，即进入所谓的“后基因组时代”。由于基因的功能主要通过其编码的蛋白质来实现，蛋白质是生命活动真正的执行者，蛋白质组学被认为是后基因组研究中的最主要部分。研究疾病有关的蛋白质是蛋白质组学的重要范畴之一。通过蛋白质组研究，大量与疾病有关的蛋白质标志物被发现并用于医疗实践。如一批肿瘤早期标志蛋白分子(Biomarker)被鉴定出来，为肿瘤的早期诊断、药靶的发现、疗效和预后的判断提供了重要依据。由于与疾病早期发病有关的蛋白质标志物往往浓度非常低，因此研究蛋白质超灵敏检测与定量方法，对于与疾病有关蛋白质的发现以及将其用于疾病的诊断与治疗，都显得非常重要。但是由于在发病的早期这些标志物在体液中浓度太低，而不能用通常的的ELISA或免疫印迹方法进行检测。目前，蛋白质的检测通常是采用基于抗体的免疫学方法，寡核苷酸适配子(Aptamer)的发现，为蛋白质的检测提供了一个强有力的工具。Aptamer是通过指数富集配基的系统(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选出来的寡核苷酸序列，其具有独特的生物特性，如与一定的蛋白质具有与抗体一样的高亲和力，有时甚至比抗体的亲和力还强，它还易于修饰，对核酸酶降解有抵抗力。这些特性使Aptamer在分析化学领域成为抗体的强大的竞争对手。当前利用Aptamer的蛋白质检测方法，有的灵敏度不是很高，有的虽有较高灵敏度，但需要昂贵的仪器。
发明内容
本发明的任务是提供一种基于纳米金修饰的Aptamer技术进行蛋白质标志物检测的新方法，使其具有灵敏度高，检测费用低，快速简便，适于基层单位推广等特点。
实现本发明的技术方案是：
以纳米金(NP，nanoparticle)修饰的Aptamer与靶蛋白质结合，同时另一个生物素化的寡核苷酸适配子也结合于靶蛋白质，构成一个三明治形式的复合物，接着三明治复合物通过亲和素结合于酶标板上，然后以银染增强法来放大三明治复合物上的靶蛋白质浓度信息，强化信号的强弱与靶蛋白质浓度有关，靶蛋白质浓度越高，相同强化时间下所得的银染信号越高，最后用比色法建立标准曲线对样本中蛋白质浓度信息进行检测。(见图1)。
本发明蛋白质标志物检测方法包括以下步骤：
(1)纳米金修饰的寡核苷酸适配子Aptamer制备；
(2)亲和素包被于酶标板上；
(3)靶蛋白质分子与生物素标记的适配子探针及NP修饰的适配子探针孵育构建成三明治形式的复合物；
(4)三明治复合物固定于固相载体酶标板上，洗涤去除未结合的适配子；
(5)利用银染增强技术使因复合物结合而保留下的探针的纳米金标记信号得以放大，并实时读取吸光度值，根据保留下的纳米金标记探针的量与靶蛋白的量成正比例关系的特点，采用已知浓度梯度的靶蛋白分子制定标准曲线，从而计算得出待测样本中靶蛋白分子的含量。
本发明的具体步骤及操作方法是：
1.寡核苷酸适配子的制备
带有巯基及生物素修饰的Aptamer由中国上海Invitrogen生物技术公司合成，序列如下：
Biotin-modified Aptamer：(生物素修饰Aptamer)
5’-Bio-GCAGTTACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT-3’)
Thiol-modified Aptamer：(巯基修饰Aptamer)
5’-SH-(CH2)6-AGTTCTTACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT-3’
两个Aptamer适配子(下划线部分)是通过指数级富集的配体系统进化(systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术(Lee JF et al.Aptamerdatabase.Nucleic Acids Res.2004；32 Database issue：D95-100)得到，能与靶蛋白有高度亲和力、高特异性结合的的寡核苷酸序列。将两个适配子的5’延伸5个碱基后(所延长的碱基不能与Aptamer序列构成配对)，进行巯基化和生物素修饰。实验前将生物素标记探针溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝7.4)，巯基修饰探针直接溶于超纯水。
2.纳米金修饰的寡核苷酸适配子的制备
(1)取500μL纳米金溶液以14,000rpm离心10min；
(2)加入50μL含300nmol/L巯基修饰探针的Tris-EDTA(pH 7.4，10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA)于沉淀的纳米金中，4℃保存12h；
(3)加入50μL TE缓冲液(pH＝7.4，0.2mol/L NaCl)，4℃保存24h；
(4)离心，13 600g，10min，弃上清，以双蒸水洗涤，以除去多余的探针；
(5)再离心，沉淀中加入100μL TE缓冲液，混匀。
3.酶标板表面处理
用碳酸盐缓冲液(0.16g Na2CO3，0.29g NaHCO3，溶于100mL水，pH 9.6)溶解亲和素，该包被浓度为5μg/mL，然后酶标板以每孔100μL进行包被，在4℃孵育过夜。
4.检测水溶液中PDGF-BB
(1)取10μl不同浓度的PDGF-BB溶液(1amol/L～10nmol/L，含137mM NaCl，10.1mMNa2HPO4，pH 7.4，2.7mM KCl，1mM MgCl2，和10g/L BSA)，加入20μl生物素标记的探针(10nM)和20μl纳米金修饰的探针(8nM)，在室温下孵育20min；
(2)将混合液转移到亲和素-酶标板上，在37℃孵育30min；
(3)以1×PBS(0.2mol/L NaCl，20mM Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0)洗涤5min，再以2×PBN(0.3mol/L NaNO3and 10mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0)洗两次，每次5min；
(4)纳米金标记信号银染增强：
取银染增强液(0.5gAgNO3/2ml H2O，12ul，1.7g hydroquinone/30ml H2O，300ul，2.55g citric acid/2.35g trisodium citrate/10ml H2O)，现配现用，混匀后迅速加入各个酶标板孔内，每孔100ul，用酶标仪实时检测银染增强的OD值(630nm)，反应一定时间，置入超纯水中，终止反应。银染增强反应最好在避光或弱光下反应，以减少银自身成核反应，增强特异性。银染增强信号的强弱与靶蛋白质浓度有关，靶蛋白质浓度越高，相同强化时间下所得的银染信号越高。(图2)
(5)以酶标仪测定波长为630nm时的吸光度。通过测量不同浓度PDGF-BB标准品，检测吸光度值实时变化情况，绘制标准曲线，结果显示该方法剂量效应相关性良好(y＝0.1943x+3.1019，R2＝0.9896)。(图3)
5.纳米金修饰NP-Aptamer法与ELISA法检测不同浓度PDGF-BB进行比较。(图4)
6.NP-Aptame法检测生物样本中的PDGF-BB
检测Eagel’s培养液(Eagle’s minimal essential medium，EMEM)，胎牛血清(fetal calfserum，FCS)及脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)样品中的PDGF-BB。FCS在使用前，先加热至65℃，20min，将能与PDGF-BB结合，从而影响探针结合的α2-小球蛋白灭活。
将已知数量的PDGF-BB加入到胎牛血清(fetal calf serum，FCS)，脑脊液(cerebrospinalfluid，CSF)，和Eagel’s培养液(Eagle’s minimal essential medium，EMEM)中，然后进行测定，来模拟检验本方法检测生物样品中PDGF-BB浓度的能力。同时用前述样品进行了检测并作为对照。结果，生物样品与对照有较一致的结果，说明该方法可以用于检测生物样品中的PDGF-BB。(图5)
附图说明
图1为纳米金修饰Aptamer方法检测靶蛋白质的流程图，靶蛋白与纳米金修饰的Aptamer及巯基化的Aptamer分子共同孵育形成三明治结构复合物，该复合物经酶标板上的亲和素捕获后，进行银染强化过程实现信号的放大。
图2为纳米金标记信号经银染增强显色示意图，图中显示：A银染灰度随时间变化而增强；B银染信号背景值在20-80s范围内较低，选择60-80s时间段终止银染可获得良好的梯度剂量效应值。
图3为不同浓度PDGF-BB银染增强吸光度值的剂量效应曲线图，图中显示：不同浓度PDGF-BB在80s银染时间下的信号值，显示PDGF-BB浓度越高，银染增强信号强度越高。PDGF-BB在1fmol/L～100pmol/L浓度范围内与银染信号呈良好线性关系。
图4为纳米金修饰NP-Aptamer法与ELISA法检测PDGF-BB的比较，结果显示NP-Aptamer法比ELISA法的灵敏度提高了3个数量级，且线性范围更宽。
图5为生物体液和细胞培养液中PDGF-BB的检测结果图，图示1：脑脊液(cerebrospinalfluid，CSF)，2：Eagel’s培养液(Eagle’s minimal essential medium，EMEM)，3：胎牛血清(fetal calf serum，FCS)，4：阳性对照
具体实施方式
纳米颗粒修饰寡核苷酸适配子检测蛋白质的方法实施例
1.寡核苷酸适配子的制备
带有巯基及生物素修饰的Aptamer由中国上海Invitrogen生物技术公司合成，序列如下：
Biotin-modified Aptamer：(生物素修饰Aptamer)
5’-Bio-GCAGTTACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT-3’)
Thiol-modified Aptamer：(巯基修饰Aptamer)
5’-SH-(CH2)6-AGTTCTTACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT-3’
两个Aptamer适配子(下划线部分)是通过指数级富集的配体系统进化(systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术(Lee JF et al.Aptamer database.Nucleic Acids Res.2004；32Database issue：D95-100)得到，能与靶蛋白有高度亲和力、高特异性结合的的寡核苷酸序列。将两个适配子的5’延伸5个碱基后(所延长的碱基不能与Aptamer序列构成配对)，进行巯基化和生物素修饰。实验前将生物素标记探针溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝7.4)，巯基修饰探针直接溶于超纯水。
2.纳米金修饰的寡核苷酸适配子的制备
(1)取500μL纳米金溶液以14,000rpm离心10min；
(2)加入50μL含300nmol/L巯基修饰探针的Tris-EDTA(pH 7.4，10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA)于沉淀的纳米金中，4℃保存12h；
(3)加入50μL TE缓冲液(pH＝7.4，0.2mol/L NaCl)，4℃保存24h；
(4)离心，13 600g，10min，弃上清，以双蒸水洗涤，以除去多余的探针；
(5)再离心，沉淀中加入100μL TE缓冲液，混匀。
3.酶标板表面处理
用碳酸盐缓冲液(0.16g Na2CO3，0.29g NaHCO3，溶于100mL水，pH 9.6)溶解亲和素，该包被浓度为5μg/mL，然后酶标板以每孔100μL进行包被，在4℃孵育过夜。
4.检测水溶液中PDGF-BB
(1)取10μl不同浓度的PDGF-BB溶液(1amol/L～10nmol/L，含137mM NaCl，10.1mMNa2HPO4，pH 7.4，2.7mM KCl，1mM MgCl2，和10g/L BSA)，加入20μl生物素标记的探针(10nM)和20μl纳米金修饰的探针(8nM)，在室温下孵育20min；
(2)将混合液转移到亲和素-酶标板上，在37℃孵育30min；
(3)以1×PBS(0.2mol/L NaCl，20mM Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0)洗涤5min，再以2×PBN(0.3mol/L NaNO3and 10mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0)洗两次，每次5min；
(4)纳米金标记信号银染增强：
取银染增强液(0.5gAgNO3/2ml H2O，12ul，1.7g hydroquinone/30ml H2O，300ul，2.55g citric acid/2.35g trisodium citrate/10ml H2O)，现配现用，混匀后迅速加入各个酶标板孔内，每孔100ul，用酶标仪实时检测银染增强的OD值(630nm)，反应一定时间，置入超纯水中，终止反应。银染增强反应最好在避光或弱光下反应，以减少银自身成核反应，增强特异性。银染增强信号的强弱与靶蛋白质浓度有关，靶蛋白质浓度越高，相同强化时间下所得的银染信号越高。
(5)以酶标仪测定波长为630nm时的吸光度，通过测量不同浓度PDGF-BB标准品，检测吸光度值实时变化情况，绘制标准曲线。
Claims (5)
1.一种蛋白质标志物检测方法，包括以下步骤：
(1)制备纳米金修饰的寡核苷酸适配子Aptamer；
(2)将亲和素包被于酶标板上；
(3)将靶蛋白质分子与生物素标记的适配子探针及NP修饰的适配子探针孵育构建成三明治形式的复合物；
(4)将三明治复合物固定于固相载体酶标板上，洗涤去除未结合的适配子；
(5)利用银染增强技术使因复合物结合而保留下的探针的纳米金标记信号得以放大，并实时读取吸光度值，根据保留下的纳米金标记探针的量与靶蛋白的量成正比例关系的特点，采用已知浓度梯度的靶蛋白分子制定标准曲线，从而计算得出待测样本中靶蛋白分子的含量。
2.根据权利要求1所述的蛋白质标志物检测方法，其特征在于，以纳米金修饰的寡核苷酸适配子Aptamer，即纳米金通过共价键合作用标记在烷巯基修饰的Aptamer探针上具体方法是：通过指数富集配基的系统进化systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX技术筛选并合成得到两个与靶蛋白有高度亲和力、高特异性结合的Aptamer适配子，将两个适配子的5’端延伸5个碱基后，进行巯基化和生物素修饰，取500μL纳米金溶液以14,000rpm离心10min；加入50μL含300nmol/L巯基修饰探针的Tris-EDTA(pH 7.4，10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA)于沉淀的纳米金中，4℃保存12h；加入50μLTE缓冲液(pH＝7.4，0.2mol/L NaCl)，4℃保存24h；离心，13600g，10min，弃上清，以双蒸水洗涤，以除去多余的探针；再离心，沉淀中加入100μLTE缓冲液，混匀。
3.根据权利要求1所述的蛋白质标志物检测方法，其特征在于，将靶蛋白质分子与生物素标记的适配子探针及纳米金修饰的适配子探针孵育构建成三明治形式的复合物上的具体方法是：取10μl不同浓度的靶蛋白PDGF-BB(platelet-derived growth factor B-chainhomodimer)溶液(1amol/L～10 nmol/L，含137mM NaCl，10.1mM Na2HPO4，pH 7.4，2.7mMKCl，1mM MgCl2，和10g/L BSA)，加入20μl生物素标记的探针(10nM)和20μl纳米金修饰的探针(8nM)，在室温下孵育20min，即得适配子-蛋白质-适配子三明治复合物；
4.根据权利要求1所述的蛋白质标志物检测方法，其特征在于，将三明治复合物固定于固相载体上并洗涤去除未结合的适配子的具体方法是：将复合物混合液转移到亲和素包被的酶标板上，在37℃孵育30min；以1×PBS(0.2mol/L NaCl，20mM Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0)洗涤5min，再以2×PBN(0.3mol/L NaNO3 and 10mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH7.0)洗两次，每次5min；
5.根据权利要求1所述的蛋白质标志物检测方法，其特征在于，利用银染增强技术使纳米金标记信号得以放大的具体方法是：取银染增强液(0.5g AgNO3/2ml H2O，12ul，1.7g hydroquinone/30ml H2O，300ul，2.55g citric acid/2.35g trisodium citrate/10ml H2O)，现配现用，混匀后迅速加入各个酶标板孔内，每孔100ul，用酶标仪实时检测银染增强的OD值(630nm)，反应一定时间，置入超纯水中，终止反应，该银增强反应在避光或弱光下进行。
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|---|---|---|---|
| CNA2007100518788A CN101598734A (zh) | 2007-04-13 | 2007-04-13 | 纳米颗粒修饰寡核苷酸适配子检测蛋白质的方法 |
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| CN101598734A true CN101598734A (zh) | 2009-12-09 |
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| CN (1) | CN101598734A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102645430A (zh) * | 2011-02-17 | 2012-08-22 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种检测目标微生物的方法及生物传感器 |
| CN102928586A (zh) * | 2012-10-22 | 2013-02-13 | 山西大学 | 基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法 |
| CN102980888A (zh) * | 2012-12-18 | 2013-03-20 | 合肥工业大学 | 基于核酸适配体探针的一步法非标记型双酚a的快速比色检测法 |
-
2007
- 2007-04-13 CN CNA2007100518788A patent/CN101598734A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102645430A (zh) * | 2011-02-17 | 2012-08-22 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种检测目标微生物的方法及生物传感器 |
| CN102645430B (zh) * | 2011-02-17 | 2014-10-15 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种检测目标微生物的方法及生物传感器 |
| CN102928586A (zh) * | 2012-10-22 | 2013-02-13 | 山西大学 | 基于核酸适配体检测人中性粒细胞弹性蛋白酶的方法 |
| CN102980888A (zh) * | 2012-12-18 | 2013-03-20 | 合肥工业大学 | 基于核酸适配体探针的一步法非标记型双酚a的快速比色检测法 |
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