CN101589130A - 喷气燃料组合物及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了喷气燃料组合物及其制备和使用方法等。在一些实施方案中，该燃料组合物包含至少一种可至少部分地从微生物容易和有效率地生成的燃料成分。在某些实施方案中，本发明提供的该燃料组合物包含高浓度的至少一种生物工程燃料成分。在进一步的实施方案中，本发明提供的该燃料组合物包含柠檬烷。

Description

喷气燃料组合物及其制备和使用方法

在先相关申请

本申请依据35U.S.C.§119(e)主张2006年11月21日提交的美国临时专利申请60/860,853以及2007年7月23日提交的美国临时专利申请60/951,236的权利，其全文均通过引用完整并入本文。

技术领域

本发明提供了喷气燃料组合物及其制备和使用方法等。在一些实施方案中，该燃料组合物包含至少一种可至少部分地从微生物中容易和有效率地生成的燃料成分。在某些实施方案中，本发明提供的该燃料组合物包含高浓度的至少一种生物工程燃料成分。在进一步的实施方案中，本发明提供的该燃料组合物包含柠檬烷(limonane)。

背景技术

生物燃料一般是来自生物质(即最近存活的生物体或其代谢副产物，例如动物的粪肥)的燃料。生物燃料是理想的，因为生物燃料与其它天然来源如石油、煤炭和核燃料不同，其是可再生能源。然而，适于用作喷气燃料的生物燃料尚待开发。因此，对用于喷气发动机的生物燃料存在需求。本发明提供了这样的生物燃料。

发明综述

本发明提供了包含柠檬烷的燃料组合物及其制备和使用方法等。在一些实施方案中，该燃料组合物进一步包含芳香族化合物。在其它实施方案中，该芳香族化合物为类异戊二烯。在其它实施方案中，该芳香族化合物为对伞花烃。在某些实施方案中，该燃料组合物包含至少部分地从微生物中容易和有效率地生成的燃料成分。

一方面，本发明提供了燃料组合物，其包含(a)基于该燃料组合物的总体积，至少为2％体积的柠檬烷；以及(b)基于该燃料组合物的总体积，至少为5％体积的石油基燃料，其中该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点。在一些实施方案中，本文披露的该燃料组合物进一步包含对伞花烃。

另一方面，本发明提供了燃料组合物，其包含(a)基于该燃料组合物的总体积，至少为40％体积的柠檬烷；(b)基于该燃料组合物的总体积，约1％体积至约10％体积的对伞花烃；以及(b)基于该燃料组合物的总体积，至少为40％体积的石油基燃料，其中该燃料组合物在15℃具有约750kg/m³至约850kg/m³的密度，具有等于或大于38℃的闪点；以及低于-40℃的冻点。

另一方面，本发明提供了制备燃料组合物的方法，其包括如下步骤：(a)将类异戊二烯起始原料与氢在催化剂的存在下相接触，以形成柠檬烷；以及(b)将该柠檬烷与燃料成分相混合，以制备该燃料组合物。在一些实施方案中，该类异戊二烯起始原料为柠檬烯、β-水芹烯、γ-松油烯、异松油烯或其组合。

另一方面，本发明提供了从单糖制备燃料组合物的方法，其包括如下步骤：(a)在适于生成类异戊二烯起始原料的条件下，将能够生成该类异戊二烯起始原料的细胞与该单糖相接触；(b)将该类异戊二烯起始原料转化为柠檬烷；以及(c)将该柠檬烷与燃料成分相混合，以制备该燃料组合物。在某些实施方案中，该类异戊二烯起始原料为柠檬烯、β-水芹烯、γ-松油烯、异松油烯或其组合。

另一方面，本发明提供了交通工具，其包括内燃机、与该内燃机连接的燃料箱、以及在该燃料箱内的本文披露的燃料组合物，其中该燃料组合物被用于向该内燃机提供动力。在一些实施方案中，该内燃机为喷气发动机。

另一方面，本发明提供了向发动机提供动力的方法，其包括燃烧一种或多种本文披露的燃料组合物的步骤。在某些实施方案中，该发动机为喷气发动机。

在一些实施方案中，本文披露的该燃料组合物中的柠檬烷是或者包含

或其组合。

在某些实施方案中，本文披露的燃料组合物中的石油基燃料为煤油、JetA、Jet A-1、Jet B或其组合。在其它实施方案中，此处披露的燃料组合物达到了针对Jet A、Jet A-1或Jet B的ASTM D 1655规范。

附图说明

图1是生成异戊烯焦磷酸(″IPP″)的甲羟戊酸(″MEV″)途径的示意图。

图2是生成异戊烯焦磷酸(″IPP″)和二甲基丙烯焦磷酸脂(″DMAPP″)的1-脱氧-D-木酮糖-5-二磷酸(″DXP″)途径的示意图。Dxs为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(也称为IspC)；IspD为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶；IspE为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶；IspF为2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸合成酶；IspG为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(IspG)；IspH为异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。

图3是将一个IPP分子和一个DMAPP分子转化为香叶基焦磷酸(″GPP″)的示意图。已知催化该步骤的酶是，例如，香叶基二磷酸合成酶。

图4A-B显示了表达质粒pAM408、pAM409和pAM424的图示。

图5A-E显示了载体pAM489、pAM491、pAM493、pAM495和pAM497的插入物的图示。

图6显示了表达质粒pTrc99A-GTS、pTrc99A-TS、pTrc99A-LMS和pTrc99A-PHS的图示。

图7显示了表达质粒pRS425-leu2d-GTS、pRS425-leu2d-TS、pRS425-leu2d-LMS和pRS425-leu2d-PHS的图示。

图8显示了针对本文披露的燃料组合物的某些实施方案的ASTM D 1655测试数据。

图9显示了Jet A以及Jet A、AMJ-300和AMJ-310的某些混合物的蒸馏曲线。

定义

由ASTM International公布的ASTM D 1655规范对Jet A、Jet A-1和JetB设定了一些最低验收要求。

“生物工程化合物”指由宿主细胞(包括任意的古细菌、细菌或真核细胞或微生物)生成的化合物。

“生物燃料”指来自于生物质(即，最近存活的生物体或其代谢副产物，例如牛的粪肥)的任意燃料。与其它天然来源如石油、煤炭和核燃料不同，它是可再生能源。

“密度”指在特定温度下单位体积的质量。测定燃料密度的普遍接受的方法是ASTM标准D4052，通过引用将其并入本文。

“含硫试验”是对石油基燃料(例如喷气燃料和煤油)中硫醇的检测。该试验还可提供存在于燃料中的硫化氢和元素硫的信息。测定燃料冻点的普遍接受的方法是ASTM标准D 4952，通过引用将其并入本文。

“闪点”指在使用点火源时使得易燃液体上方的蒸汽在空气中被点燃的最低温度。通常每种易燃液体具有蒸气压，该蒸气压是该液体的温度的函数。随着温度上升，该液体的蒸气压也上升。随着蒸气压上升，空气中蒸发的液体的浓度也上升。在闪点温度，正好有足量的液体被蒸发，使得该液体上方的蒸气-空气空间达到易燃性下限之上。例如，汽油的闪点为约-43℃，这也是为什么汽油是高度易燃的。出于安全的理由，希望预期用于喷气发动机的燃料具有高得多的闪点。测定燃料闪点的普遍接受的方法是ASTM标准D 56、ASTM标准D 93、ASTM标准D 3828-98，它们均通过引用完整并入本文。

“冻点”指此前已被冷却至蜡状晶体形成的燃料，在进行加温时最后的蜡状晶体熔化时的温度。测定燃料冻点的普遍接受的方法是ASTM标准D 2386，其通过引用并入本文。

“燃料”指一种或多种烃、一种或多种醇、一种或多种脂肪酸酯或其混合物。优选地，使用液体烃。燃料可用于向内燃机提供动力，如往复发动机(例如，汽油发动机和柴油发动机)、Wankel发动机、喷气发动机、一些火箭发动机、导弹发动机以及燃气涡轮发动机。在一些实施方案中，燃料通常包含烃类如烷烃、环烷烃和芳香烃的混合物。在其它实施方案中，燃料包含柠檬烷。

“燃料添加剂”指被加入燃料以改变该燃料的性质(例如，提高发动机性能、燃料处理、燃料稳定性、或污染控制)的化学成分。添加剂的类型包括，但不限于，抗氧化剂、热稳定性改进剂、十六烷值增进剂、稳定剂、低温流动性改进剂、助燃剂、消泡剂、消光雾添加剂、缓蚀剂、润滑性能改进剂、防冰剂、喷射器清洁添加剂、防烟剂、减阻添加剂、金属减活剂、分散剂、去污剂、破乳剂、染料、标记物、防静电剂、杀虫剂及其组合。术语“常规添加剂”指技术人员已知的燃料添加剂，例如上述的添加剂，但不包括柠檬烷。

“燃料成分”指用于配制燃料组合物的任意化合物或化合物的混合物。存在“主要燃料成分”和“次要燃料成分”。主要燃料成分在燃料组合物中至少占50％的体积；而次要燃料成分在燃料组合物中小于50％体积。燃料添加剂为次要燃料成分。柠檬烷可以是主要燃料成分或次要燃料成分，或与其它燃料成分形成混合物。

“燃料组合物”指包含至少两种燃料成分的燃料。

“类异戊二烯”和“类异戊二烯化合物”在此可互换，并指可由异戊烯二磷酸衍生的化合物。

“类异戊二烯起始原料”指可由其生成柠檬烷的类异戊二烯化合物。

“喷气燃料”指适合在喷气发动机中使用的燃料。

“煤油”指石油(也称为”原油”)在大气压下通常在约150℃和约275℃之间的特定分馏馏分。原油主要由石蜡族、环烷族和芳香族烃组成。

“柠檬烷”指如下化合物

“导弹燃料”指适合在导弹发动机中使用的燃料。

“对伞花烃”指如下化合物

“石油基燃料”指包含了石油分馏馏分的燃料。

“烟点”指燃料或燃料组合物被加热直至其分解冒烟的点。测定燃料烟点的普遍接受的方法是ASTM标准D 1322，通过引用将其并入本文。

“粘度”指燃料或燃料组合物在剪切应力下抵御变形的量度。测定燃料粘度的普遍接受的方法是ASTM标准D 445，通过引用将其并入本文。

本文所用的“基本纯的”化合物的组合物基本不含一种或多种其它化合物，即，基于该组合物的总体积，该组合物包含大于80体积％、大于90体积％、大于95体积％、大于96体积％、大于97体积％、大于98体积％、大于99体积％、大于99.5体积％、大于99.6体积％、大于99.7体积％、大于99.8体积％或大于99.9体积％的该化合物；或包含小于20体积％、小于10体积％、小于5体积％、小于3体积％、小于1体积％、小于0.5体积％、小于0.1体积％或小于0.01体积％的一种或多种其它化合物。

本文所用的“基本不含”某种化合物的组合物指基于该组合物的总体积，该组合物包含小于20体积％、小于10体积％、小于5体积％、小于4体积％、小于3体积％、小于2体积％、小于1体积％、小于0.5体积％、小于0.1体积％或小于0.01体积％的该化合物。

本文所用的术语“立体异构纯的”指包含化合物的一种立体异构体而基本不含该化合物的其它立体异构体的组合物。例如，具有一个手性中心的化合物的立体异构纯组合物将基本不含该化合物的相反对映体。具有两个手性中心的化合物的立体异构纯组合物将基本不含该化合物的其它非对映异构体。典型的立体异构纯的化合物包含大于约80％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约20％重量的该化合物其它立体异构体，更优选大于约90％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约10％重量的该化合物其它立体异构体，更优选大于约95％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约5％重量的该化合物的其它立体异构体，最优选大于约97％重量的该化合物的一种立体异构体和少于约3％重量的该化合物的其它立体异构体。

本文所用的术语“对映体纯的”指具有一个手性中心的化合物的立体异构纯的组合物。

本文所用的术语“外消旋的”或“外消旋体”指相对于该分子中所有的手性中心，约50％的一种对映体和约50％的相应对映体。本发明包含了本发明的化合物的所有对映体纯的、对映体富集的、非对映体纯的、非对映体富集的和外消旋的混合物。

除了上述定义外，本文所述的某些化合物具有可以以Z或E异构体存在的一个或多个双键。在某些实施方案中，本文所述的化合物作为基本不含其它异构体的单独异构体存在，或者，作为各种异构体的混合物(例如，立体异构体的外消旋混合物)存在。

在下文的描述中，本文披露的所有数值均为近似值，不论其是否与“大约”或“约”等词共用。它们可具有1％、2％、5％或有时为10-20％的变化。当披露了具有下限RL和上限RU的数值范围时，落入该范围内的任意数值均被特别披露。特别地，在该范围内的如下数值被特别披露：R＝RL+k*(RU-RL)，其中k为1％至100％范围内具有1％增量的变量，即，k为1％、2％、3％、4％、5％、…、50％、51％、52、…、95％、96％、97％、98％、99或100％。此外，还特别披露了由如上定义的两个R值所限定的任意数值范围。

具体实施方案

一方面，本发明提供了燃料组合物，其包含：

(a)基于该燃料组合物的总体积，至少为2％体积的柠檬烷；以及

(b)基于该燃料组合物的总体积，至少为5％体积的石油基燃料，其中该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点。

在特定的实施方案中，基于该燃料组合物的总重量或总体积，柠檬烷的量以重量或体积计为约2％至约95％、约2％至约90％、约2％至约80％、约2％至约70％或约2％至约50％。在某些实施方案中，基于该燃料组合物的总重量或总体积，柠檬烷的量以重量或体积计为至少约3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在某些实施方案中，该量为基于该燃料组合物总重量的重量百分比。在其它实施方案中，该量为基于该燃料组合物总体积的体积百分比。

在其它实施方案中，基于该燃料组合物的总重量或总体积，柠檬烷以至多约5％、至多约10％、至多约15％、至多约20％、至多约25％、至多约30％、至多约35％、至多约40％、至多约45％、至多约50％、至多约60％、至多约70％、至多约80％或至多约90％的量存在。在进一步的实施方案中，基于该燃料组合物的总重量或总体积，柠檬烷以约2％至约99％、约2.5％至约95％、约5％至约90％、约7.5％至约85％、约10％至约80％、约15％至约80％、约20％至约75％、或约25％至约75％的量存在。

在一些实施方案中，本文披露的燃料组合物中的柠檬烷是或者包含

在其它实施方案中，本文披露的燃料组合物中的柠檬烷是或者包含

在其它实施方案中，本文披露的燃料组合物中的柠檬烷为或者包含含有如下化合物的混合物：

在一些实施方案中，柠檬烷来自类异戊二烯起始原料。在某些实施方案中，该类异戊二烯起始原料可通过宿主细胞将碳源转化为类异戊二烯起始原料制备得到。

在其它实施方案中，该碳源为糖，例如单糖、二糖、或其一种或多种组合。在某些实施方案中，该糖为能够支持本文提供的一种或多种细胞生长的单糖。该单糖为本领域技术人员已知的任意单糖。适用单糖的一些非限制性例子包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其组合。适用二糖的一些非限制性例子包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。

在其它实施方案中，该碳源为多糖。适用多糖的一些非限制性例子包括淀粉、糖原、纤维素、几丁质及其组合。

在其它实施方案中，该碳源为不可发酵的碳源。不可发酵碳源的一些非限制性例子包括乙酸盐和甘油。

在一些实施方案中，本文披露的燃料组合物中的石油基燃料的量可以是该燃料组合物总量的约5％至约90％、约5％至约85％、约5％至约80％、约5％至约70％、约5％至约60％、或约5％至约50％。在某些实施方案中，基于该燃料组合物的总量，石油基燃料的量小于约95％、小于约90％、小于约85％、小于约75％、小于约70％、小于约65％、小于约60％、小于约55％、小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％。在其它实施方案中，基于该燃料组合物的总量，石油基燃料的量为至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％。在一些实施方案中，该量为基于燃料组合物总重量的重量百分比。在其它实施方案中，该量为基于燃料组合物总体积的体积百分比。

在一些实施方案中，石油基燃料为煤油。常规的煤油通常是烃的混合物，具有约285°F至约610°F(即，约140℃至约320℃)的沸点。

在其它实施方案中，石油基燃料为喷气燃料。本文可使用技术人员已知的任意喷气燃料。美国检测与材料学会(″ASTM″)和英国国防部(″MOD″)已经率先设定并维持了针对民用航空涡轮燃料或喷气燃料的规范。由这两个组织颁布的相应规范非常相似，但不完全一致。众多其它国家颁布了他们自己针对喷气燃料的国家规范，但与ASTM或MOD规范非常接近或完全一致。ASTMD 1655是针对航空涡轮燃料的标准规范，并包括针对Jet A、Jet A-1以及Jet B燃料的规范。国防部标准91-91是针对Jet A1的MOD规范。

Jet A-1是最常用的喷气燃料，并按照国际标准化的一套规范制备。仅在美国，还采用了已知为Jet A的Jet A-1类型。在民航中常用的另一种喷气燃料被称为Jet B。Jet B是石油脑-煤油(naptha-kerosene)领域的点火机燃料，因其在寒冷天气中增强的性能而被使用。在ASTM规范D 1655中对Jet A、Jet A-1以及Jet B进行了规定。

或者，全世界的军队以不同的JP编号系统对喷气燃料进行了分类。一些分类与其民用对应分类几乎一致，仅在一些添加剂的量上有所区别。例如，JetA-1与JP-8类似，而Jet B与JP-4类似。

在一些实施方案中，本文提供的燃料组合物进一步包含芳香族化合物，例如对伞花烃、间伞花烃或邻伞花烃。在进一步的实施方案中，芳香族化合物是对伞花烃或包含对伞花烃。在特定的实施方案中，基于燃料组合物的总体积，对伞花烃的量为约0.1％至约50％体积、约0.1％至约45％体积、约0.1％至约40％体积、约0.1％至约35％体积。在其它实施方案中，基于该燃料组合物的总体积，对伞花烃的量为约0.5％至约35％体积。在其它实施方案中，基于该燃料组合物的总体积，对伞花烃的量以体积计为约1％至约25％、约5％至约25％、约5％至约20％、或10％至约20％。

在一些实施方案中，基于燃料组合物的总重量或体积，该燃料组合物中芳香族化合物的总量为约1％至约50％重量或体积。在其它实施方案中，基于燃料组合物的总重量或体积，该燃料组合物中芳香族化合物的总量为约15％至约35％重量或体积。在进一步的实施方案中，基于燃料组合物的总重量或体积，该燃料组合物中芳香族化合物的总量为约15％至约25％重量或体积。在其它实施方案中，基于燃料组合物的总重量或体积，该燃料组合物中芳香族化合物的总量为约5％至约10％重量或体积。在其它实施方案中，基于燃料组合物的总重量或体积，燃料组合物中芳香族化合物的总量少于约25％重量或体积。

在一些实施方案中，燃料组合物进一步包含燃料添加剂。在某些实施方案中，基于燃料组合物的总重量或体积，燃料添加剂为约0.1％至约50％重量或体积。燃料添加剂可以是本领域技术人员已知的任意添加剂。在进一步的实施方案中，燃料添加剂选自氧化剂、抗氧化剂、热稳定性改进剂、稳定剂、低温流动性改进剂、助燃剂、消泡剂、消光雾添加剂、缓蚀剂、润滑性能改进剂、防冰剂、喷射器清洁添加剂、防烟剂、减阻添加剂、金属减活剂、分散剂、去污剂、破乳剂、染料、标记物、防静电剂、杀虫剂及其组合。

本文披露的燃料组合物中的燃料添加剂的量可以是该燃料组合物总量的约0.1％至小于约50％、约0.2％至约40％、约0.3％至约30％、约0.4％至约20％、约0.5％至约15％或约0.5％至约10％。在某些实施方案中，基于燃料组合物的总量，燃料添加剂的量小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％或小于约0.5％。在一些实施方案中，该量是基于燃料组合物总重量的重量百分比。在其它实施方案中，该量为基于燃料组合物总体积的体积百分比。

下文更具体地描述了燃料添加剂的示范性例子。其中一个例子是润滑性能改进剂。在某些添加剂中，燃料中润滑性能改进剂的浓度在约1ppm至约50000ppm、优选约10ppm至约20000ppm、且更优选约25ppm至约10000ppm范围内。润滑性能改进剂的一些非限制性例子包括脂肪酸的酯。

稳定剂提高燃料组合物的贮存稳定性。稳定剂的一些非限制性例子包括叔烷基伯胺。基于燃料组合物的总重量，稳定剂在该燃料组合物中的浓度可为约0.001重量％至约2重量％，且在一个实施方案中为约0.01重量％至约1重量％。

助燃剂可提高燃料组合物的质量燃烧速率。助燃剂的一些非限制性例子包括二茂铁(dicyclopentadienyl iron)、铁基助燃剂(例如，TURBOTECT^TMER-18，来自Turbotect(USA)Inc.，Tomball，Texas)、钡基助燃剂、铈基助燃剂、以及铁和镁基助燃剂(例如，TURBOTECT^TM 703，来自Turbotect(USA)Inc.，Tomball，Texas)。助燃剂在燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重量的约0.001重量％至约1重量％，在一个实施方案中为约0.01重量％至约1重量％。

抗氧化剂阻止燃料在贮存中由氧化引起的燃料系统成分上胶质沉淀物的形成和/或抑制本发明可使用的某些燃料组合物中过氧化物化合物的形成。抗氧化剂在燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重量的约0.001重量％至约5重量％，在一个实施方案中为约0.01重量％至约1重量％。

防静电剂可减少燃料通过高流速燃料传递系统时生成的静电的影响。防静电剂在燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重量的约0.001重量％至约5重量％，在一个实施方案中为约0.01重量％至约1重量％。

缓蚀剂可防止燃料处理系统(例如管道和燃料储罐)中的铁类金属被腐蚀。在需要附加润滑性的情况下，可使用能同时提高该组合物的润滑性能的缓蚀剂。缓蚀剂在燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重量的约0.001重量％至约5重量％，在一个实施方案中为约0.01重量％至约1重量％。

燃料系统防冰剂(也称为抗冰添加剂)可降低由于高海拔下冷却从喷气燃料中沉降的水的冻点，并防止能限制燃料向发动机流动的冰晶的形成。某些燃料系统防冰剂还可用作杀虫剂。燃料系统防冰剂在燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重量的约0.001重量％至约5重量％，在一个实施方案中为约0.01重量％至约1重量％。

杀虫剂用于抵御燃料组合物中的微生物生长。杀虫剂在燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重量的约0.001重量％至约5重量％，在一个实施方案中为约0.01重量％至约1重量％。

金属减活剂抑制某些金属(特别是铜)对燃料氧化的催化作用。金属减活剂在燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重量的约0.001重量％至约5重量％，在一个实施方案中为约0.01重量％至约1重量％。

热稳定性改进剂用于抑制航空器燃料系统的高温区域的沉积物形成。热稳定性改进剂在燃料组合物中的浓度可为该燃料组合物总重量的约0.001重量％至约5重量％，在一个实施方案中为约0.01重量％至约1重量％。

在一些实施方案中，燃料组合物具有大于约32℃的闪点、大于约33℃的闪点、大于约34℃的闪点、大于约35℃的闪点、大于约36℃的闪点、大于约37℃的闪点、大于约38℃的闪点、大于约39℃的闪点、大于约40℃的闪点、大于约41℃的闪点、大于约42℃的闪点、大于约43℃的闪点、或大于约44℃的闪点。在其它实施方案中，该燃料组合物具有大于38℃的闪点。在某些实施方案中，本文披露的燃料组合物的闪点参照ASTM标准D 56测定。在其它实施方案中，本文披露的燃料组合物的闪点参照ASTM标准D 93测定。在进一步的实施方案中，本文披露的燃料组合物的闪点参照ASTM标准D 3828-98测定。在更进一步的实施方案中，本文披露的燃料组合物的闪点参照技术人员已知的用于测定燃料闪点的任意常规方法测定。

在一些实施方案中，燃料组合物在15℃具有约750kg/m³至约850kg/m³、约750kg/m³至约845kg/m³、约750kg/m³至约840kg/m³、约760kg/m³至约845kg/m³、约770kg/m³至约850kg/m³、约770kg/m³至约845kg/m³、约775kg/m³至约850kg/m³、或约775kg/m³至约845kg/m³的密度。在其它实施方案中，燃料组合物在15℃具有约780kg/m³至约845kg/m³的密度。在其它实施方案中，燃料组合物在15℃具有约775kg/m³至约840kg/m³的密度。在其它实施方案中，燃料组合物在15℃具有约750kg/m³至约805kg/m³的密度。在某些实施方案中，本文披露的燃料组合物的密度参照ASTM标准D 4052测定。在进一步的实施方案中，本文披露的燃料组合物的密度参照技术人员已知的用于测定燃料密度的任意常规方法测定。

在一些实施方案中，燃料组合物具有低于-30℃、低于-40℃、低于-50℃、低于-60℃、低于-70℃、或低于-80℃的冻点。在其它实施方案中，燃料组合物具有约-80℃至约-30℃、约-75℃至约-35℃、约-70℃至约-40℃、或约-65℃至约-45℃的冻点。在某些实施方案中，本文披露的燃料组合物的冻点参照ASTM标准D 2386测定。在进一步的实施方案中，本文披露的燃料组合物的冻点参照技术人员已知的用于测定燃料冻点的任意常规方法测定。

在一些实施方案中，燃料组合物在15℃具有约750kg/m³至约850kg/m³的密度，并具有等于或大于38℃的闪点。在某些实施方案中，燃料组合物在15℃具有约750kg/m³至约850kg/m³的密度，并具有等于或大于38℃的闪点以及低于-40℃的冻点。在某些实施方案中，燃料组合物在15℃具有约750kg/m³至约840kg/m³的密度，并具有等于或大于38℃的闪点以及低于-40℃的冻点。

在一些实施方案中，燃料组合物具有约140℃至约170℃的初沸点。在其它实施方案中，燃料组合物具有约180℃至约300℃的终沸点。在其它实施方案中，燃料组合物具有约140℃至约170℃的初沸点和约180℃至约300℃的终沸点。在某些实施方案中，燃料组合物达到了ASTM D 86的蒸馏规范。

在一些实施方案中，燃料组合物具有等于或大于245℃的喷气燃料热氧化测试(JFTOT)温度。在其它实施方案中，燃料组合物具有等于或大于250℃、等于或大于255℃、等于或大于260℃、或等于或大于265℃的JFTOT温度。

在一些实施方案中，燃料组合物在-20℃具有小于6mm²/sec、小于7mm²/sec、小于8mm²/sec、小于9mm²/sec、或小于10mm²/sec的粘度。在某些实施方案中，本文披露的燃料组合物的粘度参照ASTM标准D 445测定。

在一些实施方案中，燃料组合物达到了ASTM D 1655对Jet A-1的规范。在其它实施方案中，燃料组合物达到了ASTM D 1655对Jet A的规范。在其它实施方案中，燃料组合物达到了ASTM D 1655对Jet B的规范。

另一方面，本发明提供了燃料组合物，其包含：

(a)基于该燃料组合物的总体积，至少为约5％体积的柠檬烷；

(b)基于该燃料组合物的总体积，至少为约0.5％体积的对伞花烃；以及

(b)基于该燃料组合物的总体积，至少为40％体积的石油基燃料。

在其它实施方案中，基于该燃料组合物的总体积，柠檬烷存在的量为约5％至约60％体积。在其它实施方案中，基于该燃料组合物的总体积，柠檬烷存在的量为约5％至约25％体积。在其它实施方案中，基于该燃料组合物的总体积，柠檬烷存在的量为约20％至约50％体积。

在某些其它实施方案中，基于该燃料组合物的总体积，对伞花烃存在的量为约0.5％至约25％体积。在其它实施方案中，基于该燃料组合物的总体积，对伞花烃存在的量为约0.5％至约10％体积。

在某些其它实施方案中，该燃料组合物在15℃具有750至840kg/m³的密度，且具有等于或大于38℃的闪点；以及低于-40℃的冻点。在其它实施方案中，石油基燃料为Jet A，且该燃料组合物符合了针对Jet A的ASTM D 1655规范。在其它实施方案中，石油基燃料为Jet A-1，且该燃料组合物符合了针对Jet A-1的ASTM D 1655规范。在其它实施方案中，石油基燃料为Jet B，且该燃料组合物符合了针对Jet B的ASTM D 1655规范。

另一方面，提供了包括含有此处提供的燃料组合物的燃料箱的燃料系统。该燃料系统任选地进一步包括具有再循环发动机冷却液的发动机冷却系统、连接燃料箱和内燃机的燃料管和/或设置在燃料管上的燃料过滤器。内燃机的一些非限制性例子包括往复发动机(例如，汽油发动机和柴油发动机)、Wankel发动机、喷气发动机、一些火箭发动机、以及燃气涡轮发动机。

在一些实施方案中，设置燃料箱与所述冷却系统从而允许自再循环发动机冷却液向燃料箱中的燃料组合物的热传递。在其它实施方案中，该燃料系统进一步包括含有用于喷气发动机的第二燃料的第二燃料箱和连接第二燃料箱和发动机的第二燃料管。任选地，第一和第二燃料管可配备电磁操作阀，该阀可彼此独立地或同步地开启或关闭。在其它实施方案中，该第二燃料为Jet A。

另一方面，提供了发动机装置，其包括内燃机，含有本文披露的燃料组合物的燃料箱，连接该燃料箱和该内燃机的燃料管。任选地，发动机装置进一步包括燃料过滤器和/或含有再循环发动机冷却液的发动机冷却系统。在部分实施方案中，该内燃机为柴油发动机。在其它实施方案中，该内燃机为喷气发动机。

当使用本文披露的燃料组合物时，希望在将燃料组合物注入发动机前除去其中的颗粒状物质。因此，希望选择用于本文披露的燃料系统的合适的燃料过滤器。在内燃机中使用的燃料中的水，即使数量极少，也可对发动机引起极大的危害。因此，希望在将燃料组合物注入发动机前除去其中存在的所有水。在一些实施方案中，可通过使用采用涡轮式离心机的燃料过滤器去除水和颗粒状物质，其中水和颗粒状物质从燃料组合物中分离的程度使得过滤后的燃料组合物可以注入发动机而没有损伤发动机的风险。也可采用其它类型的能够去除水和/或颗粒状物质的燃料过滤器。

另一方面，提供了运输工具，其包括内燃机、含有本文披露的燃料组合物的燃料箱、连接该燃料箱和该内燃机的燃料管。任选地，该交通工具进一步包括燃料过滤器和/或含有再循环发动机冷却液的发动机冷却系统。交通工具的一些非限制性例子包括汽车、摩托车、火车、轮船和航空器。

制备燃料组合物的方法

另一方面，本文提供了制备燃料组合物的方法，其包括如下步骤：

(a)将类异戊二烯起始原料与氢在催化剂的存在下相接触，以形成柠檬烷；以及

(b)将该柠檬烷与燃料成分相混合，以制备燃料组合物。

在一个实施方案中，该类异戊二烯起始原料为柠檬烯

在另一实施方案中，该类异戊二烯起始原料为β-水芹烯

在另一实施方案中，该类异戊二烯起始原料为γ-松油烯

在另一实施方案中，该类异戊二烯起始原料为异松油烯

在某些实施方案中，当该类异戊二烯起始原料与氢在催化剂的存在下相接触时，可同时形成柠檬烷和对伞花烃。在其它实施方案中，该类异戊二烯起始原料被转化为基本不含对伞花烃的柠檬烷。

另一方面，本发明提供了从单糖制备燃料组合物的方法，其包括如下步骤：

(a)在适于生成该类异戊二烯起始原料的条件下，将能够生成类异戊二烯起始原料的细胞与该单糖相接触；

(b)将该类异戊二烯起始原料转化为柠檬烷；以及

(c)将该柠檬烷与燃料成分相混合，以制备所述燃料组合物。

在一些实施方案中，通过将该类异戊二烯起始原料与氢在催化剂的存在下接触，将该类异戊二烯起始原料转化为柠檬烷。在一些实施方案中，通过将该类异戊二烯起始原料与氢在催化剂的存在下接触，将该类异戊二烯起始原料转化为柠檬烷和对伞花烃。在这些实施方案中，柠檬烷和对伞花烃均与燃料成分相混合，以制备步骤(c)所述的燃料组合物。

另一方面，提供了用于生产本发明的燃料、生物工程燃料成分或生物工程燃料添加剂的装置。在某些实施方案中，该装置能够以生物方法生产C₁₀起始原料。在某些实施方案中，该装置进一步能够从该起始原料制备类异戊二烯燃料添加剂或燃料成分。

该装置可包括能够用于使用微生物制备类异戊二烯起始原料的任意结构。在一些实施方案中，该生物装置包含本文披露的一种或多种细胞。在一些实施方案中，该生物装置包含细胞培养物，该细胞培养物包含占其总重量至少约1重量％、至少约5重量％、至少约10重量％、至少约20重量％、或至少约30重量％的至少一种类异戊二烯起始原料。在其它实施方案中，该生物装置包括含有本文所述的一种或多种细胞的发酵罐。

本文可使用能够提供适于细胞或微生物生长或繁殖的稳定和最优化环境的任意发酵罐。在一些实施方案中，发酵罐包含具有本文披露的一种或多种细胞的培养物。在其它实施方案中，发酵罐包含能够以生物学方式生成香叶基焦磷酸(GPP)的细胞培养物。在进一步的实施方案中，发酵罐包含能够以生物学方式生成异戊烯二磷酸(IPP)的细胞培养物。在某些实施方案中，发酵罐包含细胞培养物，该细胞培养物包含占其总重量至少约1重量％、至少约5重量％、至少约10重量％、至少约20重量％、或至少约30重量％的至少一种类异戊二烯起始原料。

该装置可进一步包括能够由类异戊二烯起始原料生产燃料成分或燃料添加剂的任意结构。该结构可包含用于氢化该类异戊二烯起始原料的氢化器。本文可使用能在本领域技术人员已知的条件下将C＝C双键还原为C-C单键的任意氢化器。该氢化器可包含本文披露的氢化催化剂。在一些实施方案中，该结构进一步包括混合器、容器、以及在该容器中的来自氢化步骤的氢化产物和常规燃料添加剂的混合物。

单糖可以是本领域技术人员已知的任意单糖。适用的单糖的一些非限制性例子包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其组合。适用的二糖的一些非限制性例子包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。在某些实施方案中，生物工程燃料成分可从多糖获得。适用的多糖的一些非限制性例子包括淀粉、糖原、纤维素、几丁质及其组合。

适用于制备生物工程四甲基环己烷的单糖、二糖和多糖可从多种农作物或来源中发现。合适的农作物或来源的一些非限制性例子包括甘蔗、甘蔗渣、芒、甜菜、蜀黍、高粱、柳枝稷、大麦、麻、槿麻、土豆、红薯、木薯、向日葵、水果、糖浆、乳清或脱脂牛奶、玉米、秸秆、谷物、小麦、木材、纸、稻草、棉花、多种类型的纤维素废物和其它生物质。在某些实施方案中，合适的农作物或来源包括甘蔗、甜菜和玉米。

制备化合物的方法

本发明的化合物可通过本领域已知的任意方法制备，包括生物学方法、总体化学合成(不使用生物学方式获取的原料)，以及同时采用生物学和化学手段的混合方法。在某些实施方案中，类异戊二烯起始原料分别由宿主细胞将单糖转化为所需产物来进行制备。

宿主细胞

类异戊二烯起始原料还可通过本领域已知的任意方法制备，该方法包括生物学方法、化学合成和混合方法。当类异戊二烯起始原料通过生物学方法制备时，可采用经改良以生成所需产物的宿主细胞。与所有的类异戊二烯类似，类异戊二烯起始原料可由常见的中间体异戊烯二磷酸(″IPP″)经生物化学方法制备。

宿主细胞可根据本领域技术人员已知的任何技术进行生长。特别地，宿主细胞可生长于适合该宿主细胞的培养基中。在有益的实施方案中，该培养基包含容易获得的可再生的成分。因此，本发明提供了容易获得的可再生的能源，将其用于生成燃料组合物的方法。在某些实施方案中，宿主细胞通过在适于其生长和生成类异戊二烯起始原料的条件下与单糖接触进行生长或培养。在某些实施方案中，宿主细胞可通过与葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖或其组合相接触进行生长或培养。因此，本发明提供了源自于单糖(例如，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖或其组合)的燃料组合物，以及从单糖生成燃料组合物的方法。

任何合适的宿主细胞可用于本文所述的方法和组合物的运用中。在一个实施方案中，宿主细胞为经遗传修饰的宿主微生物，其中核酸分子被插入、删除或修饰(即，经突变的；例如，通过核苷酸的插入、删除、替换和/或倒位)，从而生成所需的类异戊二烯或类异戊二烯衍生物，或者提高所需的类异戊二烯或类异戊二烯衍生物的产量。在某些实施方案中，宿主细胞能够在液体生长培养基中生长。

适用的宿主细胞的示例包括任何古细菌细胞、细菌细胞和真核细胞。古细菌细胞的例子包括但不限于属于以下菌属的古细菌细胞：气火菌属(Aeropyrum)、古生球菌属(Archaeglobus)、嗜盐杆菌属(Halobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、热球菌属(Pyrococcus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、和嗜热枝原体属(Thermoplasma)。古细菌种的一些非限制性例子包括但不限于：嗜热泉生古细菌(Aeropyrumpernix)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)，超好热菌(Pyrococcus abyssi)、极端嗜热球古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)和Thermoplasma volcanium等。

有用的细菌种的例子包括但不限于属于以下属的细菌：农杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、定氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、产色菌属(Chromatium)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、大肠杆菌属(Escherichia)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、席蓝细菌属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、深红红螺菌(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、Scenedesmun、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphlococcus)、链霉菌属(Strepromyces)、Synnecoccus和发酵单胞菌属(Zymomonas)。

有用的细菌种的例子包括但不限于：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、医学环状杆菌(Bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum、拜氏梭菌(Clostridiumbeigerinckii)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、Pseudomonas mevalonii、Pseudomonas pudica、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)、沙门氏菌伤寒杆菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、志贺氏痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。

一般而言，当使用细菌宿主细胞时，优选非病原性菌株。非病原性菌株的例子包括但不限于：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactibacillusacidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、铜绿假单胞菌、Pseudomonasmevalonii、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)、球形红细菌、荚膜红细菌、深红红螺菌等。

有用的真核细胞的例子包括但不限于真菌细胞。真菌细胞的例子包括但不限于属于以下属的真菌细胞：曲霉属(Aspergillus)、念珠菌属(Candida)、金孢子菌属(Chrysosporium)、隐球酵母属(Cryotococcus)、镰孢菌属(Fusarium)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、内生真菌属(Neotyphodium)、链孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)和木霉菌属(Trichoderma)。

有用的真核种的例子包括但不限于：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、Chrysosporium lucknowense、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、芬兰毕赤酵母(Pichiafinlandica)、库德毕赤酵母(Pichia kodamae)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、奥默酵母(Pichiaopuntiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、毕赤酵母pijperi(Pichia pijperi)、毕赤酵母quercuum(Pichia quercuum)、毕赤酵母salictaria(Pichia salictaria)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、Pichia trehalophila、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、抗菌素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)、链金黄色葡萄球菌(Streptomyces aureus)、贝酵母(Saccaromycesbayanus)、布拉氏酵母(Saccaromyces boulardi)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、产橄榄色链霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)、和里氏木霉(Trichoderma reesei)。

一般而言，当使用真核细胞时，优选非病原性种。非病原性种的例子包括但不限于：禾谷镰孢菌、镰孢霉、巴斯德毕赤氏酵母、布拉氏酵母和酿酒酵母。

此外，一些种已经被食品药品管理局指定为GRAS或通常认为安全。这些菌株包括：枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和酿酒酵母。

IPP途经

存在两种已知的合成IPP及其异构体二甲基丙烯焦磷酸脂(″DMAPP″)的生物合成途径。除了植物以外的真核生物专门使用甲羟戊酸依赖性(″MEV″)类异戊二烯途径将乙酰辅酶A(″乙酰-CoA″)转化为IPP，IPP随后被异构化为DMAPP。原核生物(存在一些例外)使用甲羟戊酸依赖性或脱氧木酮糖5-磷酸(″DXP″)途径通过一个分支点分别生成IPP和DMAPP。一般而言，植物同时使用MEV和DXP途径进行IPP合成。

MEV途径

图1显示了MEV途径的示意图。一般而言，该途径包括六个步骤。

在第一步骤，两个乙酰辅酶A分子经酶催化合并形成乙酰乙酰-CoA。已知催化该步骤的酶是，例如，乙酰-CoA硫解酶。核苷酸序列的示例包括但不限于如下GenBank录入号和从中获得该序列的生物体：(NC_000913区域：2324131..2325315；大肠杆菌)、(D49362；脱氮微球菌(Paracoccus denitrificans))、和(L20428；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。

在MEV途径的第二步骤，乙酰乙酰辅酶A与另一乙酰辅酶A分子经酶催化缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)。已知催化该步骤的酶是，例如，HMG-CoA合成酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(NC_001145.互补19061..20536；酿酒酵母)，(X96617；酿酒酵母)，(X83882；拟南芥)，(AB037907；Kitasatospora griseola)，(BT007302；智人)，以及(NC_002758，基因座标签SAV2546，GeneID 1122571；金黄色葡萄球菌)。

在第三步，HMG辅酶A经酶催化转化为甲羟戊酸。已知催化该步骤的酶是，例如，HMG-CoA还原酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(NM_206548；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、(NC_002758，基因座标签SAV2545，GeneID 1122570；金黄色葡萄球菌)、(NM_204485；红原鸡(Gallus gallus))、(AB015627；链霉菌KO 3988种)、(AF542543；渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata))，(AB037907；Kitasatospora griseola)，(AX 128213，提供编码截短HMGR的序列；酿酒酵母)，以及(NC_001145：互补(115734..118898；酿酒酵母)。

在第四步，甲羟戊酸被酶催化磷酸化形成甲羟戊酸5-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(L77688；拟南芥)和(X55875；酿酒酵母)。

在第五步，向该甲羟戊酸5-磷酸酶催化添加第二个磷酸基团，从而形成甲羟戊酸5-焦磷酸脂。已知催化该步骤的酶是，例如，磷酸甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(AF429385；巴西橡胶树(Heveabrasiliensis))、(NM_006556；智人)、和(NC_001145互补712315..713670；酿酒酵母)。

在第六步，甲羟戊酸5-焦磷酸脂被酶催化转化为IPP。已知催化该步骤的酶是，例如，甲羟戊酸焦磷酸脂脱羧酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(X97557；酿酒酵母)、(AF290095；屎肠球菌(Enterococcus faecium))、和(U49260；智人)。

如通过甲羟戊酸途径将IPP转化为DMAPP，则需要进行第七步。已知催化该步骤的酶是，例如，IPP异构酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(NC_000913，3031087..3031635；大肠杆菌)和(AF082326；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))。

DXP途径

图2显示了DXP途径的示意图。一般而言，DXP途径包括七个步骤。在第一步，将丙酮酸盐与D-甘油醛3-磷酸缩合形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(AF035440；大肠杆菌)、(NC_002947，基因座标签PP0527；恶臭假单胞菌KT2440)、(CP000026，基因座标签SPA2301；肠炎副伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica Paratyphi)，见ATCC 9150)、(NC_007493，基因座标签RSP_0254；球形红细菌2.4.1)、(NC_005296，基因座标签RPA0952；沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009)、(NC_004556，基因座标签PD1293；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)Temecula 1)、和(NC_003076，基因座标签AT5G11380；拟南芥)。

在第二步，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(AB013300；大肠杆菌)、(AF148852；拟南芥)、(NC_002947，基因座标签PP1597；恶臭假单胞菌KT2440)、(AL939124，基因座标签SCO5694；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2))、(NC_007493，基因座标签RSP_2709；球形红细菌2.4.1)、和(NC_007492，基因座标签Pf1_1107；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)PfO-1)。

在第三步，2C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸被转化为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇。已知催化该步骤的酶是，例如，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(AF230736；大肠杆菌)、(NC_007493，基因座标签RSP_2835；球形红细菌2.4.1)、(NC_003071，基因座标签AT2G02500；拟南芥)、和(NC_002947，基因座标签PP1614；恶臭假单胞菌KT2440)。

在第四步，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇被转化为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇激酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(AF216300；大肠杆菌)和(NC_007493，基因座标签RSP_1779；球形红细菌2.4.1)。

在第五步，4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(AF230738；大肠杆菌)、(NC_007493，基因座标签RSP_6071；球形红细菌2.4.1)、以及(NC_002947，基因座标签PP1618；恶臭假单胞菌KT2440)。

在第六步中，2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸被转化为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化该步骤的酶是，例如，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(AY033515；大肠杆菌)、(NC_002947，基因座标签PP0853；恶臭假单胞菌KT2440)、以及(NC_007493，基因座标签RSP_2982；球形红细菌2.4.1)。

在第七步中，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被转化为IPP或其异构体DMAPP。已知催化该步骤的酶是，例如，异戊基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。核苷酸序列的示例包括但不限于：(AY062212；大肠杆菌)和(NC_002947，基因座标签PP0606；恶臭假单胞菌KT2440)。

在一些实施方案中，宿主细胞自身的代谢过程和本文提供的IPP生成中涉及的过程之间的“相互影响(cross talk)”(或干扰)被最小化或完全消除。例如，当该宿主微生物专门依赖DXP途径合成IPP，而MEV途径被引入以提供额外的IPP时，相互影响被最小化或完全消除。该宿主生物体不会改变MEV途径酶的表达或处理与该MEV途径相关的中间体。专门或主要依赖DXP途径的生物体包括，例如，大肠杆菌。

在一些实施方案中，该宿主细胞专门通过MEV途径或通过MEV途径和DXP途径的联合来生成IPP。在其它实施方案中，宿主DXP途径失去功能，从而使宿主细胞专门通过异源引入的MEV途径生成IPP。可通过使一种或多种DXP途径酶停止基因表达或功能失活使DXP途径失去功能。

类异戊二烯起始原料

在一些实施方案中，GPP可参照图3所示的方法进行制备。将一分子的IPP和一分子的DMAPP缩合形成GPP。在一些实施方案中，该反应可被已知催化该步骤的酶(例如，香叶基二磷酸合成酶)所催化。各种类异戊二烯起始原料可由GPP制备。

编码香叶基焦磷酸合成酶的多核苷酸的示例包括但不限于：(AF513111；北美冷杉(Abies grandis))、(AF513112；北美冷杉)、(AF513113；北美冷杉)、(AY534686；金鱼草(Antirrhinum majus))、(AY534687；金鱼草)、(Y17376；拟南芥)、(AE016877，基因座AP11092；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)；ATCC14579)、(AJ243739；甜橙(Citrus sinensis))、(AY534745；仙女扇(Clarkiabreweri))、(AY953508；Ips pini)、(DQ286930；番茄(Lycopersicon esculentum))、(AF182828；胡椒薄荷(Mentha x piperita))、(AF182827；胡椒薄荷)、(MPI249453；胡椒薄荷)、(PZE431697，基因座CAD24425；Paracoccus zeaxanthinifaciens)、(AY866498；胡黄连(Picrorhiza kurrooa))、(AY351862；葡萄(Vitis vinifera))，以及(AF203881，基因座AAF12843；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。

然后可采用一种或多种萜烯合成酶将GPP转化为各种类异戊二烯起始原料。一些非限制性例子包括如下例子及其立体异构体。

柠檬烯

柠檬烯，其结构为

发现于柑橘类水果的果皮和胡椒薄荷中。柠檬烯可通过柠檬烯合成酶由GPP制备。适用的核苷酸序列的示例包括但不限于：(+)-柠檬烯合成酶(AF514287，区域：47..1867；柠檬(Citrus limon))和(AY055214，区域：48..1889；藿香(Agastache rugosa))以及(-)-柠檬烯合成酶(DQ195275，区域：1..1905；北美云杉(Picea sitchensis))、(AF006193，区域：73..1986；北美冷杉)和(MHC4SLSP，区域：29..1828；留兰香(Mentha spicata))。

β-水芹烯

β-水芹烯具有如下结构：

它是灌木柴胡(Buplerum fruticosum)的精油中的成分。从生物化学上说，β-水芹烯可通过β-水芹烯合成酶由GPP制备得到。适用的核苷酸序列的非限制性例子包括GenBank录入号AF139205，区域：34..1926，来自北美冷杉。

γ-松油烯

γ-松油烯具有如下结构：

它是柑橘类水果的精油中的成分。从生物化学上说，γ-松油烯可通过γ-松油烯合成酶由GPP制备得到。适用的核苷酸序列的一些非限制性例子包括GenBank录入号AF514286，区域：30..1832，来自柠檬；以及AB110640，区域1..1803，来自蜜桔(Citrus unshiu)。

异松油烯

异松油烯具有如下结构：

它是数种精油的成分。从生物化学上说，异松油烯可通过并松油烯合成酶由GPP制备得到。适用的核苷酸序列的非限制性例子包括AY906866，区域：10..1887，来自花旗松(Pseudotsuga menziesii)。

在一些实施方案中，类异戊二烯起始原料可从天然存在的萜烯获得或制备得到，该萜烯可由多种植物(例如，香脂苏木(Copaifera langsdorfii)、针叶树和大戟树)、昆虫(例如，燕尾蝶、叶甲、白蚁以及松叶蜂)和海洋生物(例如，海藻、海绵、珊瑚、软体动物和鱼)生成。

香脂苏木或香脂树也称为柴油树和煤油树。它在方言中有多个名称，包括kupa′y、cabismo和copaúva。香脂树可在其木材和叶子中生成大量的萜烯烃。一般而言，一棵香脂树每年可生成约30至约40升的萜烯油。

萜烯油还可从针叶树和大戟树获得。针叶树属于植物中的松柏门(Pinophyta)或松柏科(Coniferae)，且通常为具有维管组织的以松果携带种子的植物。针叶树中大部分是树，但有些针叶树可能是灌木。合适的针叶树的一些非限制性例子包括雪松、柏树、道格拉斯枞树、枞树、杜松、贝壳松、落叶松、松树、红杉、云杉、以及紫杉。大戟属，也称为Euphorbia，是非常多样的世界范围分布的植物，属于大戟科(Euphorbiaceae)。大戟属由约2160个种组成，是植物王国最大的属之一。

所述类异戊二烯起始原料为倍半萜，它是称为萜烯的更大类别化合物的一部分。作为较大和多样的一类烃，萜烯包括半萜、单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜和多萜。因此，可从萜烯油中分离合适的类异戊二烯起始原料用于本发明。

化学转化

在某些实施方案中，本文提供的燃料组合物中的柠檬烷和对伞花烃可通过氢化类异戊二烯起始原料进行制备。适用的类异戊二烯起始原料的示例包括但不限于，柠檬烯、β-水芹烯、γ-松油烯、异松油烯及其任意组合。

在一些实施方案中，可将类异戊二烯起始原料与氢在催化剂(例如，Pd、Pd/C、Pt、PtO₂、Ru(PPh₃)₂Cl₂、兰尼镍及其组合)的存在下反应进行氢化。或者，可使用任何能将C＝C键还原为C-C键的还原剂。该种还原剂的示例为催化剂(例如，5-乙基-3-甲基光黄素高氯酸酯)存在下、在氧气气氛中的肼。该种用肼进行的还原反应披露于Imada等人，J.Am.Chem.Soc.127，14544-14545(2005)，该文献通过引用完整并入本文。

类异戊二烯起始原料的氢化反应的催化剂可以以能够使该反应进行的任何量存在。在一些实施方案中，氢化催化剂的量为每升反应物约1g至约100g、每升反应物约2g至约75g、每升反应物约3g至约50g、每升反应物约4g至约40g、每升反应物约5g至约25g、或每升反应物约5g至约10g。

在一些实施方案中，催化剂为Pd催化剂。在其它实施方案中，催化剂为5％Pd/C。在其它实施方案中，催化剂为10％Pd/C。在一些这样的实施方案中，催化剂载量介于每升反应物约1g至约10g。在其它实施方案中，催化剂载量介于每升反应物约5g至约5g。

在一些实施方案中，氢化反应在室温下进行。然而，由于氢化反应是放热的，反应混合物的温度将随反应进行而升高。当该反应温度保持在室温或接近室温时，基本所有的形成的产物将是柠檬烷。然而，随着温度升高，生成的对伞花烃的量也增加。因此，在需要尽可能减少对伞花烃的量的某些实施方案中，反应温度为约10℃至约75℃、约15℃至约60℃、约20℃至约50℃、或约20℃至约40℃(包括两端温度)。在需要一定量的对伞花烃的其它实施方案中，该反应温度为约75℃至约150℃、约90℃至约130℃、或约100℃至约125℃。

氢化反应中氢的压力可以是使该反应进行的任何压力。在一些实施方案中，氢的压力为约10psi至约1000psi、约50psi至约800psi、约400psi至约600psi、或约450psi至约550psi。在其它实施方案中，氢的压力小于100psi。

在一些实施方案中，类异戊二烯起始原料通过两步转化为柠檬烷。在第一步，一部分的类异戊二烯起始原料在歧化反应中被转化为对伞花烃，在该反应中类异戊二烯起始原料与氢化催化剂在加热状态下接触。在一些实施方案中，第一步的反应温度为约75℃至约150℃、约90℃至约130℃、或约100℃至约125℃。在第二步，类异戊二烯起始原料的剩余部分(未转化为对伞花烃的部分)在氢化反应中被转化为柠檬烷。在一些实施方案中，该第二步的反应温度为约10℃至约75℃、约15℃至约60℃、约20℃至约50℃、或约20℃至约40℃。

商业方法

本发明的一个方面涉及商业方法，其包括：(a)通过糖与重组宿主细胞的发酵反应获得包含源自类异戊二烯起始原料的柠檬烷的生物燃料，其中该重组宿主细胞生成类异戊二烯起始原料；和(b)营销和/或销售所述生物燃料。

在其它实施方案中，本发明提供了向燃料的经销商、承办商和/或使用者经销或分销本文披露的生物燃料的方法，该方法包括对本文披露的生物燃料进行广告和/或许诺销售。在进一步的实施方案中，本文披露的生物燃料可相对于天然燃料或相对应的含有乙醇的生物燃料具有改良的物理或市场特征。

在某些实施方案中，本发明提供了与已成立的石油炼油商合伙或合作或许可其将本文公开的生物燃料混入石油基燃料(例如汽油、喷气燃料、煤油、柴油燃料或其组合)的方法。在另一实施方案中，本发明提供了与已成立的石油炼油商合伙或合作或许可其加工(例如，氢化、加氢裂化、裂化、进一步纯化)本文披露的生物燃料，从而使其经修饰具有有益属性的方法。已成立的石油炼油商可将本文披露的生物燃料作为原料进行进一步的化学修饰，该终产品可用作燃料或燃料组合物的混合成分。

在进一步的实施方案中，本发明提供了与从可再生来源(例如，玉米、甘蔗、甘蔗渣或木质纤维材料)获得糖的生产商合伙或合作或许可其利用这些可再生糖来源生产本文披露的生物燃料的方法。在一些实施方案中，可使用糖的传统来源，玉米和甘蔗。在其它实施方案中，可将廉价的木质纤维材料(农业废物、玉米秸秆或生物质农作物如柳枝草和蒲苇)作为糖的来源。根据本发明披露的方法，可将来自于这些廉价来源的糖投入本文披露的生物燃料的生产中。

在某些实施方案中，本发明提供了与从可再生来源(例如，玉米、甘蔗、甘蔗渣或木质纤维材料)生产糖或使用来自于该来源的糖的化工生产商合伙或合作或许可其利用该种来自可再生来源的糖生产本文披露的生物燃料的方法。

实施例

以下实施例仅作阐述之用，不以任何方式限制本发明的范围。

除非另行指明，本发明的实施可采用生物合成工业等的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。对于本文未完全描述的该种技术，人们可在科技文献中找到有关于此的充分参考。

在以下实施例中，我们努力确保所用数字(例如，数量、温度等)的精确性，但应容许变化和偏差，且当本文存在该种数值的书写错误时，本发明所述领域的普通技术人员应能根据本文其余部分的披露推导出正确的量。除非另行指明，温度报道为摄氏度，压力等于或接近海平面的大气压。除非另行指明，所有的试剂均可购买得到。如下实施例仅作阐述之用，不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

本实施例描述了编码排列在操纵子中的酶的表达质粒的制备方法，所述酶包括来自酿酒酵母的MEV途径的酶。

可通过将MevT操纵子插入pBAD33载体来生成表达质粒pMevT。该MevT操纵子编码MEV途径的一组酶，这些酶可共同将普遍存在的前体乙酰辅酶A转化为(R)-甲羟戊酸，这些酶是乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG辅酶A合成酶、以及HMG-辅酶A还原酶。通过从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增atoB基因的编码序列(GenBank录入号NC_000913区域：2324131..2325315)(编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶)、从酿酒酵基因组DNA中PCR扩增ERG13基因的编码序列(GenBank录入号X96617，区域：220..1695)(编码HMG-辅酶A合成酶)、以及从酿酒酵母基因组DNA中PCR扩增HMG1基因的编码区域的片段(GenBank录入号M22002，区域：1660..3165)(编码截短HMG-辅酶A还原酶(tHMGR))来生成MevT操纵子。用于HMG1基因片段扩增的上游PCR引物包括人工起始密码子。通过重叠延伸(SOEing)将扩增的片段剪切在一起，在该过程中，核糖体结合位点被引入atoB和ERG13编码序列之后。在添加3’A突出末端后，将MevT操纵子连接至TA克隆载体pCR4(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。随后，将MevT操纵子连接至载体pBAD33的XmaI PstI限制性位点(Guzman等人(1995)J.Bacteriol.177(14)：4121-4130)。为使该操纵子受到P_Lac启动子的控制，用pBBR1MCS的NsiI-XmaI片段替换pBAD33的araC-P_BADNsil-XmaI片段，以得到表达载体pMevT(参见美国专利7,192,751)。

表达质粒pAM36-MevT66可通过将MevT66操纵子插入pAM36载体生成。pAM36载体可通过将含有AscI-SfiI-AsiSI-XhoI-PacI-FsIl-PmeI限制性位点的寡聚核苷酸盒插入pACYC184载体(GenBank录入号XO6403)，并除去pACYC184中提供四霉素耐受性的基因后获得。该MevT66操纵子可通过以SEQ ID NO：1为模板合成得到，该SEQ ID NO：1包含了来自大肠杆菌的atoB基因(GenBank录入号NC_000913区域：2324131..2325315)、来自酿酒酵母的ERG13基因(GenBank录入号X96617，区域：220..1695)、以及来自酿酒酵母的截短型HMG1基因(GenBank录入号M22002，区域：1777..3285)，所有三种序列被密码子优化以在大肠杆菌内表达。该合成生成的MevT66操纵子侧翼连接5′EcoRI限制性位点和3′Hind III限制性位点，因此可被克隆进入克隆载体(例如标准pUC或pACYC来源载体)的相容限制性位点。从该构建体PCR扩增该MevT66操纵子及其侧翼的SfiI和AsiSI限制性位点，使用SfiI和AsiSI限制性内切酶将扩增的DNA片段消化完全，通过凝胶电泳解析反应混合物，通过凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)凝胶提取约4.2kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接至pAM36载体的SfiI AsiSI限制性位点，获得表达质粒pAM36-MevT66。

表达质粒pAM25可通过将MevT66操纵子插入pAM29载体生成。该pAM29载体可通过将来自pZS24-MCS1的p15A复制原点和提供卡那霉素耐受性的基因(Lutz和Bujard(1997)Nucl Acids Res.25：1203-1210)与寡聚核苷酸生成的lacUV5启动子装配后生成。使用EcoRI和Hind III限制性内切酶将包含MevT66操纵子(参见上述pAM36-MevT66的描述)的DNA合成构建体消化完全，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约4.2kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接至pAM296的EcoRI HindIII限制性位点，获得表达质粒pAM25。

表达质粒pMevB-Cm可通过将MevB操纵子插入pBBR1MCS-1载体后生成。该MevB操纵子编码一组酶，这些酶能共同将(R)-甲羟戊酸转化为IPP，这些酶是甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶以及甲羟戊酸焦磷酸脂羧化酶。该MevB操纵子可通过从酿酒酵母基因组DNA中PCR扩增ERG12基因(GenBank录入号X55875，区域：580..1911)(编码甲羟戊酸激酶)、ERG8基因(GenBank录入号Z49939，区域：3363..4718)(编码磷酸甲羟戊酸激酶)、以及MVD1基因(GenBank录入号X97557，区域：544..1734)(编码甲羟戊酸焦磷酸脂羧化酶)的编码序列，并通过重叠延伸(SOEing)将PCT片段剪接在一起后获得。通过选择适当的引物序列，在扩增过程中将ERG12和ERG8的终止密码子由TAA变为TAG，以引入核糖体结合位点。添加3′A突出末端后，将MevB操纵子连接至TA克隆载体pCR4(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。通过以PstI限制性内切酶完全消化该克隆构建体以切除该MevB操纵子，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约4.2kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接至pBBR1MCS-1载体的PstI限制性位点(Kovach等人，Gene 166(1)：175-176(1995))，获得表达质粒pMevB-Cm。

表达质粒pMBI可通过将MBI操纵子插入pBBR1MCS-3载体生成。除了该MevB操纵子的酶外，该MBI操纵子还编码异戊烯基焦磷酸酶异构酶，其将IPP催化转化为DMAPP。该MBI操纵子可通过如下方式获得：以在其5′端包含XmaI限制性位点的引物从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增idi基因(GenBank录入号AF119715)的编码序列，使用XmaI限制性内切酶将扩增的DNA片段消化完全，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约0.5kb片段，并将分离的DNA片段连接至pMevB-Cm表达质粒的XmaI限制性位点，从而将idi置于MevB操纵子的3′端。将该MBI操纵子亚克隆进入载体pBBR1MCS-3的SaiI SacI限制性位点(Kovach等人，Gene 166(1)：175-176(1995))，获得表达载体pMBI(参见美国专利7,192,751)。

通过将ispA基因插入pMBI生成表达质粒pMBIS。该ispA基因编码法呢基二磷酸合成酶，该酶将两分子IPP与一分子DMAPP催化缩合生成法呢基焦磷酸(FPP)。采用具有SacII限制性位点的正向引物和具有SacI限制性位点的反向引物从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增该ispA基因(GenBank录入号D00694，区域：484..1383)的编码序列。使用SacII和SacI限制性内切酶将扩增的DNA产物消化完全，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约0.9kb片段，并将分离的DNA片段连接至pMBI的SacII SacI限制性位点，从而将该ispA基因置于idi和MevB操纵子的3′端，并获得表达质粒pMBIS(参见美国专利7,192,751)。

通过将ispA编码序列替换为编码香叶基二磷酸合成酶(″gpps″)的核苷酸序列，由表达质粒pMBIS获得表达质粒pMBIS-gpps。包含编码香叶基二磷酸合成酶的核苷酸序列的DNA片段可采用经过针对大肠杆菌表达进行密码子优化的拟南芥gpps基因(GenBank录入号Y17376，区域：52..1320)编码序列作为模板合成得到。该核苷酸序列侧翼连接前导SacII限制性位点和末端SacI限制性位点，因此可被克隆进入克隆载体(例如标准pUC或pACYC来源载体)的相容限制性位点。合成生成的香叶基二磷酸合成酶序列可通过如下方式分离：使用SacII和SacI限制性内切酶将该DNA产物消化完全，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约1.3kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接至pMBIS表达质粒的SacII SacI限制性位点，获得表达质粒pMBIS-gpps。

实施例2

本实施例描述了编码排列在操纵子中的酶的表达载体的制备方法，所述酶包括来自金黄色葡萄球菌的MEV途径的酶。

可通过将编码酿酒酵母HMG-辅酶A还原酶的HMG1基因编码序列替换为编码金黄色葡萄球菌HMG-辅酶A还原酶mvaA基因(GenBank录入号BA000017，区域：2688925..2687648)的编码序列，从表达质粒pAM25获得表达质粒pAM41。使用引物4-49mvaA SpeI(SEQ ID NO：13)和4-49mvaAR XbaI(SEQ ID NO：14)从金黄色葡萄球菌(ATCC 70069)基因组DNA中PCR扩增mvaA基因的编码序列，使用SpeI限制性内切酶将扩增的DNA片段消化完全，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约1.3kb DNA片段。通过使用HindIII限制性内切酶将质粒消化完全，从而从pAM25中去除HMG1编码序列。采用T4 DNA聚合酶将所得线性DNA片段的末端突出平端化。然后采用SpeI限制性内切酶部分消化该DNA片段，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取4.8kb DNA片段就分离的DNA片段连接至SpeI-消化的mvaA PCR产物，获得表达质粒pAM41。

可通过将编码酿酒酵母HMG-辅酶A合成酶的ERG 13基因的编码序列替换为编码金黄色葡萄球菌HMG-辅酶A合成酶mvaS基因(GenBank录入号BA000017，区域：2689180..2690346)的编码序列，从表达质粒pAM41获得表达质粒pAM52。通过引物HMGS 5′Sa mvaS-S(SEQ ID NO：15)和HMGS 3′SamvaS-AS(SEQ ID NO：16)从金黄色葡萄球菌(ATCC 70069)基因组DNA中PCR扩增mvaS基因的编码序列，并将该扩增的DNA片段作为PCR引物，以根据Geiser等人(BioTechniques 31：88-92(2001))的方法替换pAM41中的HMG1基因的编码序列，获得表达质粒pAM52。

实施例3

本实施例描述了编码排列在操纵子中的酶的表达质粒的制备方法，所述酶包括大肠杆菌的DXP途径的酶。

通过将编码“顶端(top)”DXP途径的酶的基因插入pAM29载体后生成表达质粒pAM408。“顶端”DXP途径的酶包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(由大肠杆菌的dxs基因编码)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(由大肠杆菌的dxr基因编码)、4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(由大肠杆菌的ispD基因编码)、以及4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(由大肠杆菌的ispE基因编码)，这些酶共同将丙酮酸盐和D-甘油醛-3-磷酸转化为4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸。包含编码“顶端”DXP途径的酶的核苷酸序列的DNA片段可如下生成：使用SEQ ID NO：17至24所示的PCR引物，从大肠杆菌菌株DH1(ATCC#33849)中PCR扩增dxs(GenBank录入号U00096区域：437539..439401)、dxr(GenBank录入号U00096区域：193521..194717)、ispD(GenBank录入号U00096区域：2869803..2870512)、以及ispE(GenBank录入号U00096区域1261249..1262100)基因的编码序列，并带有附加的最优Shine Dalgarno序列以及5′和3′限制性位点。通过凝胶电泳解析PCR产物，凝胶提取，使用适当的限制性内切酶(XhoI和KpnI用于包含dxs基因的PCR产物；KpnI和ApaI用于包含dxr基因的PCR产物；ApaI和NdeI用于包含ispD基因的PCR产物；NdeI和MluI用于包含ispE基因的PCR产物)消化至完全，并采用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。然后将大约等摩尔的各PCR产物添加至连接反应，以将单个基因组装进操纵子。从该连接反应，将1μl反应混合物用于PCR扩增两个单独的基因盒，即dxs-dxr和ispD-ispE基因盒。使用引物67-1A-C(SEQ ID NO：17)和67-1D-C(SEQ ID NO：20)PCR扩增dxs-dxr基因盒，并使用引物67-1E-C(SEQ ID NO：21)和67-1H-C(SEQ ID NO：24)PCR扩增ispD-ispE基因盒。通过凝胶电泳解析两种PCR产物，并凝胶提取。使用XhoI和ApaI限制性内切酶将包含该dxs-dxr基因盒的PCR产物消化完全，使用ApaI和MluI限制性内切酶将包含该ispD-ispE基因盒的PCR产物消化完全。纯化该两种PCR产物，并将纯化的DNA片段连接至pAM29载体的SalI MluI限制性位点，获得表达质粒pAM408(参见图4的质粒图谱)。

表达质粒pAM409可通过将编码“底部(bottom)”DXP途径的酶的基因插入pAM369载体后生成。“底部”DXP途径的酶包括2C-甲基-D-赤藻糖醇2，4-环二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispF基因编码)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispG基因编码)、以及异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶(由大肠杆菌的ispH基因编码)，这些酶共同将4-二磷酸胞啶基-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸转化为IPP和DMAPP。IPP还可通过异戊基二磷酸异构酶(由大肠杆菌的idi基因编码)的活性转化为DMAPP。DMAPP还可通过法呢基二磷酸合成酶(例如由大肠杆菌的ispA基因编码)的活性进一步转化为FPP。编码“底部”DXP途径的酶以及异戊基二磷酸异构酶和法呢基二磷酸合成酶的操纵子可如下生成：采用SEQ ID NO：25至34所示的PCR引物，从大肠杆菌菌株DH1(ATCC#33849)中PCR扩增ispF(GenBank录入号U00096区域：2869323..2869802)、ispG(GenBank录入号U00096区域：2638708..2639826)、ispH(GenBank录入号U00096区域：26277..27227)、idi(GenBank录入号AF119715)、以及ispA(GenBank录入号D00694区域：484..1383)基因，并带有附加的最优Shine Dalgarno序列以及5′和3′限制性位点。通过凝胶电泳解析PCR产物，凝胶提取，使用适当的限制性内切酶(BamHI和ApaI用于包含ispF基因的PCR产物；KpnI和ApaI用于包含ispG基因的PCR产物；SaiI和KpnI用于包含ispH基因的PCR产物；SaiI和HindIII用于包含idi基因的PCR产物；HindIII和NcoI用于包含ispA基因的PCR产物)消化，并纯化。然后将大约等摩尔量的各PCR产物添加至连接反应中，以将单个基因组装进入操纵子。从该连接反应物，将1μl的反应混合物用于PCR扩增两个单独的基因盒，即ispF-ispG和ispH-idi-ispA基因盒。使用引物67-2A-C(SEQ ID NO：25)和67-2D-C(SEQ ID NO：28)PCR扩增该ispF-ispG基因盒，并使用引物67-2E-C(SEQ ID NO：29)和67-2J-C(SEQ ID NO：34)PCR扩增该ispH-idi-ispA基因盒。通过凝胶电泳解析两种PCR产物，并凝胶提取。使用BamHI和KpnI限制性内切酶将包含该ispF-ispG基因盒的PCR产物消化完全，使用KpnI和NcoI限制性内切酶将包含该ispH-idi-ispA基因盒的PCR产物消化完全。纯化两种PCR产物。通过将来自pAM29的p15A复制原点，来自pZE12-luc的用于氨比西林耐受的β内酰胺酶基因(Lutz和Bujard(1997)Nucl Acids Res.25：1203-1210)与寡聚核苷酸生成的lacUV5启动子装配后生成。将包含“底部”DXP途径操纵子的两种分离PCR产物连接至pAM369载体的BamHI NcoI限制性位点，获得表达质粒pAM409(参见图4B的质粒图谱)。

包含广泛宿主范围RK2复制原点的表达质粒pAM409的衍生物--表达质粒pAM424可通过将pAM409的lacUV5启动子和ispFGH-idi-ispA操纵子转移至pAM257载体后生成。载体pAM257可按如下方式生成：采用引物9-156A(SEQ ID NO：35)和9-156B(SEQ ID NO：36)从RK2质粒DNA PCR扩增RK2par基因座(Meyer等人(1975)Science 190：1226-1228)，采用AatII和XhoI限制性内切酶将2.6kb PCR产物消化至完全，并将DNA片段连接至含有来自载体pZA31-luc的p15复制原点和提供氯霉素耐受性的基因的质粒(Lutz和Bujard(1997)Nucl Acids Res.25：1203-1210)，获得质粒pAM37-par；采用SacI和HindIII限制性内切酶将pAM37-par消化至完全，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取含有RK2par基因座和氯霉素耐受性基因的DNA片段，并将分离的DNA片段连接至mini-RK2复制子pRR10的SacI HindIII位点(Roberts等人.(1990)J Bacteriol.172：6204-6216)，获得载体pAM133；采用BglII和HindIII限制性内切酶将pAM133消化至完全，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取缺失氨比西林耐受性基因和oriT结合起始区的约6.4kb DNA片段，并将该分离的DNA片段与合成生成的包含多个克隆位点(包含PciI和XhoI限制性位点)的DNA片段相连接，获得载体pAM257。使用XhoI和PciI限制性内切酶完全消化所得的表达质粒pAM409，通过凝胶电泳分离该反应混合物，凝胶提取约4.4kb DNA片段，将分离的DNA片段连接至pAM257载体的XhoIPciI限制性位点，获得表达质粒pAM424(参见图4C的质粒图谱)。

实施例4

本实施例描述了制备载体以将编码酶(包括MEV途径的酶)的核酸定向整合至酿酒酵母的特定染色体位点的方法。

基因组DNA分离自酿酒酵母菌株Y002(CEN.PK2背景；MATA；ura3-52；trp1-289；leu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)、Y007(S288C背景MATAtrp1Δ63)、Y051(S288C  背景；MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0P_GAL1-HMG1^1586-3323P_GAL1-upc2-1 erg9::P_MET3-ERG9::HIS3 P_GAL1-ERG20P_GAL1-HMG1^1586-3323)以及EG123(MATA ura3；trp1；leu2；his4 can1)。该菌株在含有1％酵母提取物、2％细菌蛋白胨和2％右旋糖的液体培养基(YPD培养基)中生长过夜。通过以3,100rpm离心、以10mL超纯水洗涤细胞团、再次离心而从10mL液体培养物中分离细胞。使用Y-DER酵母DNA抽提试剂盒(Pierce Biotechnologies，Rockford，IL)根据生产商的建议方案抽提基因组DNA。将抽提的基因组DNA重悬于100μL 10mM Tris-C1，pH 8.5中，在ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)上读取OD_260/280读数，以确定基因组DNA浓度和纯度。

在Applied Biosystems 2720 Thermocycler(Applied Biosystems Inc，FosterCity，CA)中，采用Phusion高保真DNA聚合酶系统(Finnzymes OY，Espoo，Finland)，并参照生产商的建议方案，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA。在完成对待插入TOPO TA pCR2.1克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DNA片段的PCR扩增后，如下生成核苷酸的突出末端：向反应混合物中添加1μL的Qiagen Taq聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)，额外运行10分钟，72℃PCR延伸步骤，然后冷却至4℃。在PCR扩增完成后，将8μL的50％甘油溶液添加至反应混合物，并将完整的混合物加至含有0.5μg/mL溴化乙啡啶的1％TBE(0.89M Tris，0.89M硼酸，0.02M EDTA钠盐)琼脂糖凝胶。

在120V，400mA下进行琼脂糖凝胶电泳30分钟，并采用紫外线显示DNA条带。使用无菌刀片从凝胶中切除DNA条带，并采用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)参照生产商的建议方案对切除的DNA进行凝胶纯化。将纯化的DNA洗脱进10μL超纯水中，在ND-1000分光光度计上读取OD_260/280读数，以确定DNA浓度和纯度。

使用100-500μg的纯化PCR产物和高浓度的T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)，参照生产商的建议方案进行连接。为进行质粒增殖，将连接的构建体参照生产商的建议方案转化进入大肠杆菌DH5α化学感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在含有1.5％Bacto琼脂、1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、以及50μg/mL适当抗生素的固体培养基上选择阳性转化体。使分离的转化体在含有50μg/mL羧苄青霉素或卡那霉素的液体LB培养基中于37℃下生长16小时，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)参照生产商的建议方案分离和纯化质粒。如下验证构建体：进行诊断性限制性内切酶消化，在琼脂糖凝胶上解析DNA片段，并采用紫外光显示条带。还可通过DNA测序验证选择的构建体，DNA测序由Elim Biopharmaceuticals Inc.(Hayward，CA)完成。

通过将载体pAM471的ERG20-P_GAL-tHMGR插入物插入载体pAM466生成质粒pAM489。通过将DNA片段ERG20-P_GAL-tHMGR插入TOPO Zero BluntII克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)生成载体pAM471，该DNA片段ERG20-P_GAL-tHMGR包含ERG20的开放阅读框架(ORF)(ERG20核苷酸位点1至1208；ATG起始密码子的A为核苷酸1)(ERG20)、包含异向GAL1和GAL10启动子的基因座(GAL1核苷酸位点-1至-668)(P_GAL)、以及HMG1的截短ORF(HMG1核苷酸位点1586至3323)(tHMGR)。通过将DNA片段TRP1^{-856至 +548}插入TOPO TA pCR2.1克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)生成载体pAM466，该DNA片段TRP1^-856至+548包含从核苷酸位点-856延伸至位点548的酿酒酵母野生型TRP1基因座片段并在碱基-226和-225之间带有非天然内部XmaI限制性位点。参照表1的概述通过PCR扩增生成DNA片段ERG20-P_GAL-tHMGR和TRP1^-856至+548。为构建pAM489，使用XmaI限制性内切酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)将400ng的pAM471和100ng的pAM466消化完全，将对应于ERG20-P_GAL-tHMGR插入物和线性化的pAM466载体的DNA片段凝胶纯化，并将4摩尔当量的经纯化的插入物和1摩尔当量的经纯化的线性化载体相连接，获得pAM489(参见图5A的图谱，以及ERG20-P_GAL-tHMGR插入物的核苷酸序列SEQ ID NO：3)。

通过将载体pAM472的ERG13-P_GAL-tHMGR插入物插入载体pAM467生成质粒pAM491。通过将DNA片段ERG13-P_GAL-tHMGR插入TOPO Zero BluntII克隆载体的XmaI限制性位点生成载体pAM472，该DNA片段ERG13-P_GAL-tHMGR包含ERG13的ORF(ERG13核苷酸位点1至1626)(ERG13)、包含异向GAL1和GAL10启动子的基因座(GAL1核苷酸位点-1至-668)(P_GAL)、以及HMG1的截短ORF(HMG1核苷酸位点1586至3323)(tHMGR)。通过将DNA片段URA3^-723至701插入TOPO TA pCR2.1克隆载体生成载体pAM467，该DNA片段URA3^-723至701包含从核苷酸位点-723延伸至位点-224的酿酒酵母野生型URA3基因座片段且在碱基-224和-223之间带有非天然内部XmaI限制性位点。参照表2的概述通过PCR扩增生成DNA片段ERG13-P_GAL-tHMGR和URA3^-723至701。为构建pAM491，使用XmaI限制性内切酶将400ng的pAM472和100ng的pAM467消化完全，将对应于ERG13-P_GAL-tHMGR插入物和线性化的pAM467载体的DNA片段凝胶纯化，并将4摩尔当量的经纯化的插入物和1摩尔当量的经纯化的线性化载体相连接，获得pAM491(参见图5B的图谱，以及ERG13-P_GAL-tHMGR插入物的核苷酸序列SEQ ID NO：4)。

通过将载体pAM473的IDI1-P_GAL-tHMGR插入物插入载体pAM468生成质粒pAM493。通过将DNA片段IDI1-P_GAL-tHMGR插入TOPO Zero Blunt II克隆载体生成载体pAM473，该DNA片段IDI1-P_GAL-tHMGR包含IDI1的ORF(IDI1核苷酸位点1至1017)(IDI1)、包含异向GAL1和GAL10启动子的基因座(GAL1核苷酸位点-1至-668)(P_GAL)、以及HMG1的截短ORF(HMG1核苷酸位点1586至3323)(tHMGR)。通过将DNA片段ADE1^-825至653插入TOPOTA pCR2.1克隆载体生成载体pAM468，该DNA片段ADE1^-825至653包含从核苷酸位点-225延伸至位点653的酿酒酵母野生型ADE1基因座片段且在碱基-226和-225之间带有非天然内部XmaI限制性位点。参照表3的概述通过PCR扩增生成DNA片段IDI1-P_GAL-tHMGR和ADE1^-825至653。为构建pAM493，使用XmaI限制性内切酶将400ng的pAM473和100ng的pAM468消化完全，将对应于IDI1-P_GAL-tHMGR插入物和线性化的pAM468载体的DNA片段凝胶纯化，并将4摩尔当量的经纯化的插入物和1摩尔当量的经纯化的线性化载体相连接，获得pAM493(参见图5C的图谱，以及IDI1-P_GAL-tHMGR插入物的核苷酸序列SEQ ID NO：5)。

通过将载体pAM474的ERG10-P_GAL-ERG12插入物插入载体pAM469生成质粒pAM495。通过将DNA片段ERG10-P_GAL-ERG12插入TOPO Zero BluntII克隆载体生成载体pAM474，该DNA片段ERG8-P_GAL-ERG12包含ERG10的ORF(ERG10核苷酸位点1至1347)(ERG10)、包含异向GAL1和GAL10启动子的基因座(GAL1核苷酸位点-1至-668)(P_GAL)、以及ERG12的ORF(ERG12核苷酸位点1至1482)(ERG12)。通过将DNA片段HIS3^{-32至 -1000}-HISMX-HIS3^504至-1103插入TOPO TA pCR2.1克隆载体生成载体pAM469，该DNA片段HIS3^-32至-1000-HISMX-HIS3^504至-1103包含从核苷酸位点-32延伸至位点-1000以及从核苷酸位点504延伸至位点1103的两个酿酒酵母野生型HIS基因座片段、HISMX标记、以及在HIS3^504至-1103序列和HISMX标记之间的非天然XmaI限制性位点。参照表4的概述通过PCR扩增生成DNA片段ERG10-P_GAL-ERG12和HIS3^-32至-1000-HISMX-HIS3^504至-1103。为构建pAM495，使用XmaI限制性内切酶将400ng的pAM474和100ng的pAM469消化完全，将对应于ERG10-P_GAL-ERG12插入物和线性化的pAM469载体的DNA片段凝胶纯化，并将4摩尔当量的经纯化的插入物和1摩尔当量的经纯化的线性化载体相连接，获得pAM495(参见图5D的图谱，以及ERG10-P_GAL-ERG12插入物的核苷酸序列SEQ ID NO：6)。

通过将载体pAM475的ERG8-P_GAL-ERG19插入物插入载体pAM470生成质粒pAM497。通过将DNA片段ERG8-P_GAL-ERG19插入TOPO Zero Blunt II克隆载体生成载体pAM475，该DNA片段ERG8-P_GAL-ERG19包含ERG8的ORF(ERG8核苷酸位点1至1512)(ERG8)、包含异向GAL1和GAL10启动子的基因座(GAL1核苷酸位点-1至-668)(P_GAL)、以及ERG19的ORF(ERG19核苷酸位点1至1341)(ERG19)。通过将DNA片段LEU2^-100至450-HISMX-LEU2^{1096 至1770}插入TOPO TA pCR2.1克隆载体生成载体pAM470，该DNA片段LEU2^{-100 至450}-HISMX-LEU2^1096至1770包含从核苷酸位点-100延伸至位点450和从核苷酸位点1096延伸至位点1770的两个酿酒酵母野生型LEU2基因座片段、HISMX标记、以及在LEU2^1096至1770序列和HISMX标记之间的非天然XmaI限制性位点。参照表5的概述通过PCR扩增生成DNA片段ERG8-P_GAL-ERG19和LEU2^-100至450-HISMX-LEU2^1096至1770。为构建pAM497，使用XmaI限制性内切酶将400ng的pAM475和100ng的pAM4709消化完全，将对应于ERG8-P_GAL-ERG19插入物和线性化的pAM470载体的DNA片段凝胶纯化，并将4摩尔当量的经纯化的插入物和1摩尔当量的经纯化的线性化载体相连接，获得pAM497(参见图5E的图谱，以及ERG8-P_GAL-ERG19插入物的核苷酸序列SEQ ID NO：7)。

实施例5

本实施例描述了编码转化GPP的酶的表达质粒的制备方法。

分别通过将编码γ-松油烯合成酶(″GTS″)或异松油烯合成酶(″TS″)的核苷酸序列插入pTrc99A载体生成表达质粒pTrc99 A-GTS和pTrc99 A-TS。该核苷酸序列插入物可使用柠檬的γ-松油烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AF514286区域：30..1832)或者罗勒(Ocimum basilicum)的异松油烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AY693650)或花旗松的异松油烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AY906866区域：10..1887)(分别为SEQ ID No：8至10)作为模板合成生成，所有核苷酸序列均针对大肠杆菌表达进行密码子优化。编码序列侧翼连接前导XmaI限制性位点和末端XbaI限制性位点。合成的核酸被克隆进入克隆载体(例如标准pUC或pACYC来源载体)的相容限制性位点，使用XbaI和XmaI限制性内切酶将该DNA合成构建体消化完全以再次从该载体中释放该核酸序列，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约1.7至1.8kb萜烯合成酶编码DNA片段。将分离的DNA片段连接至载体pTrc99A的XmaI XbaI限制性位点(Amman等人，Gene 40：183-190(1985))，以获得表达质粒pTrc99A-GTS或pTrc99A-TS(参见图6的质粒图谱)。

分别通过将编码柠檬烯合成酶(″LMS″)或β-水芹烯合成酶(″PHS″)的核苷酸序列插入pTrc99A载体生成表达质粒pTrc99A-LMS和pTrc99A-PHS。该核苷酸序列插入物可采用例如北美冷杉的柠檬烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AF006193区域：73..1986)或者北美冷杉的β-水芹烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AF139205区域：34..1926)作为模板合成生成。编码柠檬烯合成酶的核苷酸序列侧翼连接前导NcoI限制性位点和末端PstI限制性酶切位点，而编码β-水芹烯合成酶的核苷酸序列侧翼连接前导XmaI限制性位点和末端XbaI限制性酶切位点。采用NcoI和PstI限制性内切酶将该柠檬烯合成酶DNA合成构建体消化完全，并采用XmaI和XbaI限制性内切酶将该β-水芹烯合成酶DNA合成构建体消化完全。通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约1.9kb DNA片段，然后将分离的DNA片段连接至pTrc99A载体的NcoI PstI限制性位点(对于柠檬烯合成酶插入物)或XmaI XbaI限制性位点(对于β-水芹烯合成酶插入物)，获得表达质粒pTrc99A-LMS或pTrc99A-PHS(参见图6的质粒图谱)。

可通过将连接异向GAL1和GAL10启动子(GAL1核苷酸位点-1至-668)(P_GAL)的编码γ-松油烯合成酶(″GTS″)、异松油烯合成酶(″TS″)、柠檬烯合成酶(″LMS″)或β-水芹烯合成酶(″PHS″)的核苷酸序列分别插入载体pRS425-leu2d以得到表达质粒pRS425-leu2d-GTS、pRS425-leu2d-TS、pRS425-leu2d-LMS以及pRS425-leu2d-PHS。载体可通过如下方式生成：采用引物PW-91-079-CPK373-G(SEQ ID NO：89)和PW-79-079-CPK374-G(SEQ IDNO：90)PCR扩增pAM178的leu2基因(SEQ ID NO：12)，采用引物PW-91-079-CPK376-G(SEQ ID NO：91)和PW-79-079-CPK375-G(SEQ IDNO：92)PCR扩增载体pRS425的骨架(GenBank录入号U03452)，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约1.6kb leu2基因片段和约4.6kb pRS425载体骨架，以T4激酶处理该DNA片段以添加末端磷酸基团，并连接这两个DNA片段。该核苷酸序列插入物可使用，例如柠檬的γ-松油烯合成酶的编码序列(GenBank录入号AF514286区域：30..1832)、罗勒的异松油烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AY693650)或花旗松的异松油烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AY906866区域：10..1887)、北美冷杉的柠檬烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AF006193区域：73..1986)或是北美冷杉的β-水芹烯合成酶基因的编码序列(GenBank录入号AF 139205区域：34..1926)作为模板合成生成，上述每一个编码序列均连接异向GAL1和GAL10启动子(GAL1核苷酸位点-1至-668)(P_GAL)。核苷酸序列具有平头末端，因此可被克隆进入克隆载体(例如标准pUC或pACYC来源载体)的相容限制性位点。合成生成的P_GAL-萜烯合成酶序列可通过如下方式分离，使用SmaI限制性内切酶消化该DNA合成构建体(部分消化β-水芹烯合成酶构建体，完全消化所有其它的构建体)，通过凝胶电泳解析反应混合物，凝胶提取约2.5kb至2.6kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接至载体pRS425-leu2d的SmaI限制性位点，获得表达质粒pRS425-leu2d-GTS、pRS425-leu2d-TS、pRS425-leu2d-LMS或pRS425-leu2d-PHS(见图7的质粒图谱)。

实施例6

本实施例描述了可用于本发明的大肠杆菌宿主菌株的生成。

如表6所述，通过实施例1至3和实施例5的一种或多种表达质粒转化化学感受态大肠杆菌亲代细胞来生成宿主菌株。

在含有抗生素的Luria Bertoni(LB)琼脂上选择宿主细胞转化体。将单克隆从LB琼脂转移至含有5mL的LB液体培养基和抗生素的培养管中。在250rpm的旋转振荡器上于37℃下孵育培养物，直至生长至指数后期。通过将细胞在含有0.8％葡萄糖和抗生素的M9-MOPS培养基(M9-MOPS培养基的成分可参见表7)中连续传代4至5代，使细胞适应基础培养基。将细胞储存在-80℃的冷冻小瓶中的由400uL无菌50％甘油和600uL液体培养基组成的1mL储存液等分中。

实施例7

本实施例描述了可用于本发明的酿酒酵母菌株的生成。

可通过以酿酒酵母MET3启动子替换ERG9启动子，并以光滑念珠菌(Candida glabrata)LEU2基因(CgLEU2)替换ADE1 ORF来制备用于引入可诱导MEV途径基因的酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C(Y002)(MATA；ura3-52；trp1-289；leu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)和CEN.PK2-1D(Y003)(MATalpha；ura3-52；trp1-289；leu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)(van Dijken等人(2000)Enzyme Microb.Technol.26(9-10)：706-714)。该制备可如下完成：以引物50-56-pw100-G(SEQ ID NO：87)和50-56-pw101-G(SEQ ID NO：88)PCR扩增载体pAM328的KanMX-PMET3区(SEQ ID NO：11)(其包含与天然ERG9启动子同源的45个碱基对)，使用40％w/w聚乙二醇3350(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、100mM醋酸锂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)以及10μg鲑鱼精子DNA(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)将10μg所得的PCR产物转化进入指数生长的Y002和Y003细胞中，将细胞在30℃下孵育30分钟后在42℃下热冲击30分钟(Schiestl和Gietz.(1989)Curr.Genet.16，339-346)。阳性重组体可通过其在含有0.5μg/mL遗传霉素(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)的丰富培养基上生长的能力进行鉴定，并可通过诊断性PCR对所选的克隆进行确认。所得克隆命名为Y93(MAT A)和Y94(MAT alpha)。然后使用引物61-67-CPK066-G(SEQ ID NO：85)和61-67-CPK067-G(SEQ ID NO：86)从光滑念珠菌基因组DNA(ATCC，Manassas，VA)扩增该3.5kb CgLEU2基因座(其包含与ADE1 ORF同源的50个碱基对)，将10μg所得的PCR产物转化进入指数生长的Y93和Y94细胞，选择在没有亮氨酸添加物下生长的阳性重组体，并通过诊断PCR确认所选的克隆。所得克隆命名为Y176(MAT A)和Y177(MAT alpha)。

然后通过使用PmeI限制性内切酶(New England Biolabs，Beverly，MA)完全消化2μg的pAM491和pAM495质粒DNA，并将纯化的DNA插入物插入指数生长的Y176细胞得到菌株Y188。选择可在缺乏尿嘧啶和组氨酸的培养基上生长的阳性重组体，并通过诊断性PCR确认整合进入正确的基因座。

然后通过使用PmeI限制性内切酶完全消化2μg的pAM489和pAM497质粒DNA，并将经纯化的DNA插入物插入指数生长的Y177细胞得到菌株Y189。选择可在缺乏色氨酸和组氨酸的培养基上生长的阳性重组体，并通过诊断性PCR确认整合进入正确的基因座。

将来自菌株Y188和Y189的约1×10⁷细胞在YPD培养板上室温下混合6小时以允许接合。将混合的细胞培养物在缺乏组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培养基上铺板以选择二倍体细胞的生长。以被PmeI限制性内切酶完全消化的2μg的pAM493质粒DNA转化该二倍体细胞，并将纯化的DNA插入物插入指数生长的二倍体细胞，从而生成菌株Y238。选择可在缺乏腺嘌呤的培养基上生长的阳性重组体，并通过诊断性PCR确认整合进入正确的基因座。

单倍体菌株Y211(MAT alpha)可通过如下方式生成：在2％醋酸钾和0.02％棉子糖液体培养基中使菌株Y238形成孢子，采用Singer Instruments MSM300系列显微操作仪(Singer Instrument LTD，Somerset，UK)分离约200个遗传四分体，通过在缺乏腺嘌呤、组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培养基中生长的能力鉴定包含所引入的遗传物质的合适补体的独立遗传分离物，并通过诊断性PCR确认所有诱导的DNA的整合。

最后，以表达质粒pRS425-leu2d-GTS、pRS425-leu2d-TS、pRS425-leu2d-LMS或pRS425-leu2d-PHS转化菌株Y211生成宿主菌株9至12。在含有2％葡萄糖和除亮氨酸外所有氨基酸的合成的确定成分培养基(SM-glu)上选择宿主细胞转化体。将单个集落转移至含有5mL缺乏亮氨酸的液体SM-glu的培养瓶中，并在30℃下振荡孵育该培养物直至达到静止期。将细胞储存在-80℃的冷冻小瓶中的由400uL无菌50％甘油和600uL液体培养基组成的1mL储存液等分中。

实施例8

本实施例描述了在大肠杆菌宿主菌株中通过MEV途径生成γ-松油烯、异松油烯、柠檬烯以及β-水芹烯。

将宿主菌株1至4各菌株的等分储备液添加至单独的含有25mLM9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物以及表6中所述的抗生素的125mL烧瓶中，并生长过夜，以形成各菌株的接种培养物。该接种培养物可用于以约0.05的初始OD₆₀₀接种单独的250mL烧瓶，所述烧瓶含有40mL M9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物以及抗生素。在250rpm的旋转振荡器上于30℃下孵育培养物直至其OD₆₀₀达到约0.2，此时通过向培养基添加40μL的1MIPTG诱导宿主细胞中目标化合物的生成。该目标化合物可通过溶剂-溶剂萃取从该培养基中分离，或者当该目标化合物的滴定浓度大到足以在培养基中饱和并形成第二相时，可通过沉降和倾析进行分离。

实施例9

本实施例描述了在大肠杆菌宿主菌株中通过DXP途径生成γ-松油烯、异松油烯、柠檬烯以及β-水芹烯。

将宿主菌株5至8的等分储备液添加至单独的含有25mL M9-MOPS、0.8％葡萄糖、0.5％酵母提取物以及表6中所述的抗生素的125mL烧瓶中，并生长过夜，以形成各菌株的接种培养物。该接种培养物可用于以约0.05的初始OD₆₀₀接种单独的250mL烧瓶，所述烧瓶含有40mL M9-MOPS、45μg/mL的硫胺、微量营养素、1.00E-05mol/L的FeSO₄、0.1M MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物以及抗生素。在250rpm的湿润旋转振荡器上于30℃下孵育培养物直至其OD₆₀₀达到约0.2至0.3，此时通过向培养基添加40μL的1MIPTG诱导宿主细胞中目标化合物的生成。该目标化合物可通过溶剂-溶剂萃取从该培养基中分离，或者当该目标化合物的滴定浓度大到足以在培养基中饱和并形成第二相时，可通过沉降和倾析进行分离。

实施例10

本实施例描述了在酿酒酵母宿主菌株中γ-松油烯、异松油烯、柠檬烯以及β-水芹烯的生成。

将宿主菌株9至12的等分储备液添加至单独的含有25mL缺乏亮氨酸的SM-glu的125mL烧瓶中，并分别生长过夜，以形成各菌株的接种培养物。该接种培养物可用于以约0.05的初始OD₆₀₀接种250mL带挡板烧瓶，所述烧瓶含有40mL含有0.2％葡萄糖和1.8％半乳糖且缺乏亮氨酸的合成的成分明确培养基。在200rpm的旋转振荡器上于30℃下孵育培养物。该目标化合物可通过溶剂-溶剂萃取从该培养基中分离，或者当该目标化合物的滴定浓度大到足以在培养基中饱和并形成第二相时，可通过沉降和倾析进行分离。

实施例11

本实施例描述了将柠檬烯基本氢化为柠檬烷。

以6g/L的量向反应容器添加柠檬烯和10％Pd/C催化剂[在活性炭上具有10重量％钯，Aldrich#205699]。将容器密封，以氮气清洗，然后在真空下排空。为启动反应，在搅拌该容器的同时以80psig添加压缩氢气。在室温下进行温和放热的反应。最终的转化率为100％，这可以氢消耗结束为标志，并通过气相色谱及火焰离子化检测进行验证。该产物-催化剂混合物可经

硅胶通过重力过滤进行分离。该终产物浓度预期主要为柠檬烷，带有少于5％的对伞花烃。

实施例12

本实施例描述了将柠檬烯主要氢化为柠檬烷并具有一些对伞花烃。

以6g/L的量向反应容器添加柠檬烯和10％Pd/C催化剂[在活性炭上具有10重量％钯，Aldrich#205699]。将容器密封，以氮气清洗，然后在真空下排空。搅拌该容器，同时将温度升高至105℃。以80psig添加初始量的压缩氢气，总计添加量为每摩尔柠檬烯约0.05摩尔氢。由于氢的消耗，压力将下降为零。12小时的反应时间后，温度下降至75℃，并以80psig连续添加压缩氢气。最终的转化率为100％，这可以氢消耗结束为标志，并通过气相色谱及火焰离子化检测进行验证。该产物-催化剂混合物可经

硅胶通过重力过滤进行分离。该最终产物浓度预期为约80％至约90％的柠檬烷，以及约10％至约20％的对伞花烃。

实施例13

本实施例描述将柠檬烯氢化为柠檬烷和对伞花烃。

以6g/L的量向反应容器添加柠檬烯和10％Pd/C催化剂[在活性炭上具有10重量％钯，Aldrich#205699]。将容器密封，以氮气清洗，然后在真空下排空。搅拌该容器，同时将温度升高至120℃。以80psig添加初始量的压缩氢气，总计添加量为每摩尔柠檬烯约0.05摩尔氢。由于氢的消耗，压力将下降为零。氢的初始添加量允许形成4-异丙基-1-甲基环己-1-烯，后者可容易地转化为对伞花烃。12小时的反应时间后，温度下降至75℃，并以80psig连续添加压缩氢气。最终转化率为100％，这可以氢消耗结束为标志，并通过气相色谱及火焰离子化检测进行验证。该产物-催化剂混合物可经硅胶通过重力过滤进行分离。该最终产物浓度预期为约70％至约80％的柠檬烷，以及约20％至约30％的对伞花烃。

实施例14

将包含97.1％柠檬烷和1.6％对伞花烃的燃料组合物(称为AMJ-300)与不同量的Jet A混合。AMJ-300的成分可通过气相色谱/火焰离子化检测器(GC/FID)进行鉴定。AMJ-300包含1.3％未鉴别的化合物，其中0.9％被认为是2，6-二甲基辛烷。

各种混合物符合ASTM D 1655的能力的结果显示于表8：Jet A、100％AMJ-300、50％AMJ-300和50％Jet A、以及20％AMJ-300和80％Jet A。

实施例15

将包含81.0％柠檬烷和17.5％对伞花烃的燃料组合物(称为AMJ-310)与不同量的Jet A混合。AMJ-310的成分可通过气相色谱/火焰离子化检测器(GC/FID)进行鉴定。AMJ-310包含1.5％未鉴别的化合物，其中0.9％被认为是2，6-二甲基辛烷。

各种混合物符合ASTM D 1655的能力的结果显示于表8：Jet A、100％AMJ-310、50％AMJ-310和50％Jet A、以及20％AMJ-310和80％Jet A。图9显示了Jet A以及Jet A、AMJ-300与AMJ-310的某些混合物的蒸馏曲线。

本文描述的燃料组合物可通过具有成本效益的和环境友好的方式制备。有利的是，用于本文的燃料组合物的类异戊二烯化合物可通过一种或多种微生物生成。这些类异戊二烯化合物从而可以提供可用于柴油或喷气燃料、特别是本文提供的燃料组合物的可再生能源。此外，这些类异戊二烯化合物可降低对不可再生的燃料、燃料成分和/或燃料添加剂的来源的依赖性。在某些实施方案中，本文提供的燃料组合物包含生物工程柠檬烷。

尽管本发明已通过有限量的实施方案进行了描述，一个实施方案的具体特征不应归于本发明的其它实施方案。没有一个单独的实施方案可代表所主张的主题的所有方面。在一些实施方案中，该组合物或方法可包括多种本文未提及的化合物或步骤。在其它实施方案中，该组合物或方法不包括、或基本不包括本文未列举的任何化合物或步骤。存在对本文所述的实施方案的变化和改动。应注意，本文披露的喷气燃料组合物的应用不限于喷气发动机；它可用于任何需要喷气燃料的装备。尽管对于大多数喷气燃料存在规范，并非本文披露的所有喷气燃料组合物需要满足这些规范的所有要求。应注意，本文披露的制备和使用该喷气燃料组合物的方法涉及多个步骤。这些步骤可以任何顺序实施。可省略或合并一个或多个步骤，但依然实现基本相同的结果。所附权利要求书意在覆盖所有落入本发明范围的该种变化和改动。

本说明书中所涉及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其引用程度如同每一个单独的公开物或专利申请均被特别且单独地指明通过引用并入本文一样。尽管为了清楚理解的目的，前述发明已通过图示和例子进行详细描述，本领域的普通技术人员根据本发明的教导应当能够容易理解可在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行一定的更改和调整。

序列表

SEQ ID NO：1

MevT操纵子(5’至3’)

GAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTGCGGTC

CGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACGGCTCTTTAGCGAGCACCTCTGCAATCGA

TCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGCCATTGAACGCGCCAAAATCGACAGC

CAGCACGTTGATGAGGTGATCATGGGCAATGTGTTACAAGCCGGCCTGGGTC

AAAACCCAGCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCTGGTCTGGCCGAGACCGTGTG

TGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGG

CAGCACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCATCGTTGCGGGTGGCAT

GGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCCCGCAGCGGT

TATCGCCTGGGCGATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAAT

GTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTATTACGGCCGAAAACGTGGCGAAA

GAATACGGCATTACGCGCGAGATGCAGGATGAATTAGCACTGCACTCTCAGC

GCAAAGCAGCAGCCGCGATCGAGTCTGGTGCGTTTACGGCGGAAATCGTGCC

AGTTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTC

CCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCTTAGGTGCCTTACGCCCAGCCTTTG

ACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCATCAATGATGGTGC

AGCGGCACTGGTCATCATGGAAGAGAGCGCCGCATTAGCAGCGGGTCTGACC

CCATTAGCGCGCATTAAATCTTATGCCAGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGAT

GGGCATGGGTCCGGTCCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGCAATTAGCGGGCCTG

CAACTGGCCGACATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGT

TCCTGGCGGTGGGTAAGAATCTGGGCTTCGACAGCGAGAAAGTCAATGTGAA

CGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGCGCACGCATC

TTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACGCGACAAGACCTTAGGCCTGG

CGACCTTATGTATTGGTGGCGGTCAAGGTATCGCCATGGTGATCGAACGCCTG

AACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGAAACTGAGCACCAAGCTGTGCT

GGTGTGGCATCAAGGGTCGCCTGCGCCCACAAAAGCAGCAACAGCTGCACAA

CACGAACCTGCAAATGACCGAGCTGAAAAAGCAGAAGACGGCCGAGCAAAA

GACCCGCCCGCAGAACGTTGGCATCAAGGGCATCCAGATTTATATCCCGACG

CAGTGTGTCAACCAATCTGAGCTGGAGAAATTCGATGGCGTCAGCCAGGGTA

AGTACACCATCGGCCTGGGCCAGACCAACATGAGCTTCGTGAACGACCGTGA

GGACATCTATTCTATGAGCCTGACGGTGCTGTCTAAGCTGATCAAGAGCTACA

ACATCGACACGAATAAGATCGGTCGTCTGGAGGTGGGTACGGAGACGCTGAT

TGACAAGAGCAAAAGCGTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAAC

ACGGATGTCGAGGGTATCGACACCCTGAACGCGTGTTACGGCGGCACCAACG

CACTGTTCAATAGCCTGAACTGGATTGAGAGCAACGCCTGGGATGGCCGCGA

TGCGATCGTCGTGTGCGGCGATATCGCCATCTATGACAAGGGTGCGGCACGT

CCGACCGGCGGTGCAGGCACCGTTGCGATGTGGATTGGCCCGGACGCACCAA

TTGTCTTCGATTCTGTCCGCGCGTCTTACATGGAGCACGCCTACGACTTTTACA

AGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTGGACGGCCACTTCTCTCTGACC

TGCTATGTGAAGGCGCTGGACCAGGTTTATAAGTCTTATAGCAAAAAGGCGA

TTTCTAAGGGCCTGGTCAGCGACCCGGCAGGCAGCGACGCCCTGAACGTGCT

GAAGTATTTCGACTACAACGTGTTCCATGTCCCGACCTGCAAATTAGTGACCA

AATCTTATGGCCGCCTGTTATATAATGATTTCCGTGCCAACCCGCAGCTGTTC

CCGGAGGTTGACGCCGAGCTGGCGACGCGTGATTACGACGAGAGCCTGACCG

ACAAGAACATCGAGAAGACCTTCGTCAACGTCGCGAAGCCGTTCCACAAAGA

GCGTGTGGCCCAAAGCCTGATCGTCCCGACCAACACGGGCAACATGTATACC

GCGTCTGTCTACGCGGCATTCGCGAGCCTGCTGAATTACGTCGGTTCTGACGA

CCTGCAGGGCAAGCGCGTTGGCCTGTTCAGCTACGGTAGCGGCTTAGCGGCC

AGCCTGTATAGCTGCAAAATTGTCGGCGACGTCCAGCACATCATCAAGGAGC

TGGACATCACCAACAAGCTGGCGAAGCGCATCACCGAGACGCCGAAAGATTA

CGAGGCAGCGATCGAGTTACGCGAGAATGCGCATCTGAAGAAGAACTTCAAG

CCGCAAGGTAGCATCGAGCACCTGCAGAGCGGCGTCTACTACCTGACGAACA

TTGACGACAAGTTCCGCCGTTCTTATGACGTCAAAAAGTAACTAGTAGGAGG

AAAACATCATGGTGCTGACGAACAAAACCGTCATTAGCGGCAGCAAGGTGAA

GTCTCTGAGCAGCGCCCAAAGCTCTAGCAGCGGCCCGTCTAGCAGCAGCGAG

GAGGACGACAGCCGTGACATTGAGTCTCTGGACAAGAAGATCCGCCCGCTGG

AGGAGTTAGAGGCCCTGCTGAGCAGCGGCAACACCAAGCAGCTGAAGAACA

AGGAAGTTGCAGCGCTGGTGATCCACGGTAAGCTGCCACTGTATGCGCTGGA

AAAGAAACTGGGCGATACGACGCGTGCGGTCGCGGTGCGTCGCAAAGCCTTA

AGCATCTTAGCGGAGGCCCCGGTGTTAGCCAGCGACCGCCTGCCGTACAAGA

ACTACGACTACGACCGCGTGTTTGGCGCGTGCTGCGAGAATGTCATTGGCTAC

ATGCCGTTACCGGTTGGTGTGATCGGCCCGCTGGTCATTGATGGCACGAGCTA

TCACATTCCAATGGCGACCACGGAAGGTTGCTTAGTCGCCAGCGCCATGCGT

GGCTGTAAGGCGATTAACGCCGGCGGTGGCGCGACGACCGTGTTAACCAAGG

ATGGTATGACGCGCGGTCCGGTCGTCCGCTTCCCAACGCTGAAGCGCAGCGG

CGCGTGTAAGATTTGGCTGGATTCTGAGGAGGGCCAAAACGCGATCAAGAAA

GCCTTCAACTCTACGAGCCGTTTCGCGCGTTTACAGCATATCCAGACCTGCCT

GGCCGGCGACCTGCTGTTCATGCGCTTCCGCACCACCACGGGCGATGCGATG

GGCATGAACATGATCAGCAAGGGCGTCGAATATAGCCTGAAACAAATGGTGG

AAGAATATGGCTGGGAGGACATGGAGGTTGTCTCTGTGAGCGGCAACTATTG

CACCGACAAGAAGCCGGCAGCCATTAACTGGATTGAGGGTCGCGGCAAAAGC

GTCGTGGCAGAAGCGACCATCCCAGGCGACGTGGTCCGTAAGGTTCTGAAGA

GCGACGTCAGCGCCCTGGTTGAGTTAAATATCGCGAAAAACCTGGTCGGCAG

CGCGATGGCGGGCAGCGTGGGTGGCTTTAACGCACATGCAGCGAATCTGGTT

ACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCGAGAGCA

GCAACTGCATTACCTTAATGAAAGAGGTTGACGGTGACCTGCGCATCAGCGT

TTCTATGCCGTCTATCGAGGTCGGCACGATCGGCGGCGGCACCGTTTTAGAAC

CGCAAGGTGCGATGCTGGATCTGCTGGGCGTGCGCGGCCCACATGCAACGGC

CCCAGGCACCAATGCCCGCCAACTGGCCCGTATCGTGGCCTGCGCGGTTCTGG

CGGGTGAGCTGAGCCTGTGCGCCGCATTAGCCGCGGGCCATTTAGTTCAATCT

CACATGACCCACAACCGCAAGCCGGCAGAACCAACCAAGCCAAATAACCTGG

ACGCAACCGACATTAACCGTCTGAAGGATGGCAGCGTCACGTGCATTAAAAG

CTGAGCATGCTACTAAGCTT

SEQ ID NO：2

拟南芥的香叶基焦磷酸合成酶，针对大肠杆菌中的表达进行了密码子优化，且其侧翼连接NotI和SacI限制性酶切位点(5’至3’)

GCGGCCGCGGAAAAGGAGGCCGGCCGGCATGCTGCTGTCTAATAAACTGCGT

GAAATGGTTCTGGCTGAAGTACCTAAACTGGCCTCCGCAGCAGAATATTTCTT

CAAGCGTGGCGTTCAGGGCAAACAGTTCCGTAGCACCATCCTGCTGCTGATG

GCTACCGCCCTGGACGTGCGTGTCCCGGAAGCCCTGATCGGCGAATCCACCG

ACATCGTGACCTCTGAACTGCGTGTTCGTCAGCGTGGTATCGCGGAAATCACC

GAAATGATCCACGTTGCGTCTCTGCTGCACGACGATGTGCTGGACGATGCAG

ACACCCGTCGTGGTGTTGGTTCCCTGAACGTGGTGATGGGTAACAAAATGAG

CGTGCTGGCAGGCGACTTTCTGCTGTCTCGCGCCTGTGGTGCTCTGGCTGCGC

TGAAGAACACCGAGGTAGTGGCACTGCTGGCGACTGCCGTAGAGCACCTGGT

TACCGGCGAAACGATGGAAATTACTTCTTCCACCGAACAGCGTTACTCCATGG

ACTACTACATGCAGAAGACTTACTATAAAACCGCGTCCCTGATTAGCAACTCT

TGTAAAGCAGTAGCAGTACTGACTGGCCAAACTGCAGAAGTAGCGGTGCTGG

CTTTCGAGTACGGTCGTAACCTGGGTCTGGCTTTCCAGCTGATCGATGACATC

CTGGACTTTACTGGTACCAGCGCAAGCCTGGGTAAAGGTTCCCTGTCTGACAT

TCGTCACGGCGTTATCACCGCTCCGATTCTGTTCGCGATGGAAGAATTCCCGC

AGCTGCGTGAAGTTGTTGACCAGGTTGAAAAAGACCCGCGTAACGTCGATAT

CGCACTGGAATACCTGGGCAAATCCAAAGGTATCCAACGCGCGCGTGAACTG

GCTATGGAGCACGCCAACCTGGCAGCAGCAGCAATTGGCTCTCTGCCGGAAA

CCGACAACGAAGATGTTAAACGCAGCCGTCGTGCACTGATCGACCTGACTCA

TCGTGTAATCACCCGCAACAAATAAGATTGAGTGATGTTCCTGAGCATCCACC

AGAACATTCCGCACTTTATCTGTCGTATTCTGCTGGTGCAATTCGTAAGCCGC

TGATAATAGGAGCTC

SEQ ID NO：3

pAM489的ERG20-P_GAL-tHMGR插入物(5’至3’)

GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCGTTGTTAGTGGCGTTAG

TGCTTGCTTTCAAAGACATGGAGGGCGTTATTACGCCGGAGCTCCTCGACAG

CAGATCTGATGACTGGTCAATATATTTTTGCATTGAGGCTCTGTTTGGAATTA

TATTTTGAGATGACCCATCTAATGTACTGGTATCACCAGATTTCATGTCGTTTT

TTAAAGCGGCTGCTTGAGTCTTAGCAATAGCGTCACCATCTGGTGAATCCTTT

GAAGGAACCACTGACGAAGGTTTGGACAGTGACGAAGAGGATCTTTCCTGCT

TTGAATTAGTCGCGCTGGGAGCAGATGACGAGTTGGTGGAGCTGGGGGCAGG

ATTGCTGGCCGTCGTGGGTCCTGAATGGGTCCTTGGCTGGTCCATCTCTATTCT

GAAAACGGAAGAGGAGTAGGGAATATTACTGGCTGAAAATAAGTCTTGAATG

AACGTATACGCGTATATTTCTACCAATCTCTCAACACTGAGTAATGGTAGTTA

TAAGAAAGAGACCGAGTTAGGGACAGTTAGAGGCGGTGGAGATATTCCTTAT

GGCATGTCTGGCGATGATAAAACTTTTCAAACGGCAGCCCCGATCTAAAAGA

GCTGACACCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATG

CACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATA

TTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGA

CGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGA

TTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTCCTG

TTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATA

AGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGT

GCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCA

ACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCG

ATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAA

TGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCA

AGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGA

CCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATG

CGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCT

TCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTT

TTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGC

CATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATAT

TCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCT

CCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTT

AAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACA

GGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATAC

CATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAG

CCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATG

ATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGC

ATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATA

ATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTG

AAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTC

TCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTT

TGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAA

AGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACT

AGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTT

TCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGT

ACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGC

AGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAAT

TTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAAT

GTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTA

ATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAA

AAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAG

GTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTA

GTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGT

TTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTC

GGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATG

AGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAA

GATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGAT

ATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCAT

CCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAA

AGAAATTAGGAGAGAGAGATTTCTTGAACGTTTTCCCTAAATTAGTAGAGGAA

TTGAACGCATCGCTTTTGGCTTACGGTATGCCTAAGGAAGCATGTGACTGGTA

TGCCCACTCATTGAACTACAACACTCCAGGCGGTAAGCTAAATAGAGGTTTGT

CCGTTGTGGACACGTATGCTATTCTCTCCAACAAGACCGTTGAACAATTGGGG

CAAGAAGAATACGAAAAGGTTGCCATTCTAGGTTGGTGCATTGAGTTGTTGC

AGGCTTACTTCTTGGTCGCCGATGATATGATGGACAAGTCCATTACCAGAAGA

GGCCAACCATGTTGGTACAAGGTTCCTGAAGTTGGGGAAATTGCCATCAATG

ACGCATTCATGTTAGAGGCTGCTATCTACAAGCTTTTGAAATCTCACTTCAGA

AACGAAAAATACTACATAGATATCACCGAATTGTTCCATGAGGTCACCTTCCA

AACCGAATTGGGCCAATTGATGGACTTAATCACTGCACCTGAAGACAAAGTC

GACTTGAGTAAGTTCTCCCTAAAGAAGCACTCCTTCATAGTTACTTTCAAGAC

TGCTTACTATTCTTTCTACTTGCCTGTCGCATTGGCCATGTACGTTGCCGGTAT

CACGGATGAAAAGGATTTGAAACAAGCCAGAGATGTCTTGATTCCATTGGGT

GAATACTTCCAAATTCAAGATGACTACTTAGACTGCTTCGGTACCCCAGAACA

GATCGGTAAGATCGGTACAGATATCCAAGATAACAAATGTTCTTGGGTAATC

AACAAGGCATTGGAACTTGCTTCCGCAGAACAAAGAAAGACTTTAGACGAAA

ATTACGGTAAGAAGGACTCAGTCGCAGAAGCCAAATGCAAAAAGATTTTCAA

TGACTTGAAAATTGAACAGCTATACCACGAATATGAAGAGTCTATTGCCAAG

GATTTGAAGGCCAAAATTTCTCAGGTCGATGAGTCTCGTGGCTTCAAAGCTGA

TGTCTTAACTGCGTTCTTGAACAAAGTTTACAAGAGAAGCAAATAGAACTAA

CGCTAATCGATAAAACATTAGATTTCAAACTAGATAAGGACCATGTATAAGA

ACTATATACTTCCAATATAATATAGTATAAGCTTTAAGATAGTATCTCTCGAT

CTACCGTTCCACGTGACTAGTCCAAGGATTTTTTTTAACCCGGGATATATGTG

TACTTTGCAGTTATGACGCCAGATGGCAGTAGTGGAAGATATTCTTTATTGAA

AAATAGCTTGTCACCTTACGTACAATCTTGATCCGGAGCTTTTCTTTTTTTGCC

GATTAAGAATTCGGTCGAAAAAAGAAAAGGAGAGGGCCAAGAGGGAGGGCA

TTGGTGACTATTGAGCACGTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCT

TGGAGTATGTCTGTTATTAATTTCACAGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGT

TTGCGGCTTGCAGAGCACAGAGGCCGCAGAATGTGCTCTAGATTCCGATGCT

GACTTGCTGGGTATTATATGTGTGCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACCCGG

TTATTGCAAGGAAAATTTCAAGTCTTGTAAAAGCATATAAAAATAGTTCAGG

CACTCCGAAATACTTGGTTGGCGTGTTTCGTAATCAACCTAAGGAGGATGTTT

TGGCTCTGGTCAATGATTACGGCATTGATATCGTCCAACTGCATGGAGATGAG

TCGTGGCAAGAATACCAAGAGTTCCTCGGTTTGCCAGTTATTAAAAGACTCGT

ATTTCCAAAAGACTGCAACATACTACTCAGTGCAGCTTCACAGAAACCTCATT

CGTTTATTCCCTTGTTTGATTCAGAAGCAGGTGGGACAGGTGAACTTTTGGAT

TGGAACTCGATTTCTGACTGGGTTGGAAGGCAAGAGAGCCCCGAAAGCTTAC

ATTTTATGTTAGCTGGTGGACTGACGCCGTTTAAAC

SEQ ID NO：4

pAM491的ERG13-P_GAL-tHMGR插入物(5’至3’)

GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACACAGGAAGACCAGAAAATCCTCAT

TTCATCCATATTAACAATAATTTCAAATGTTTATTTGCATTATTTGAAACTAGG

GAAGACAAGCAACGAAACGTTTTTGAAAATTTTGAGTATTTTCAATAAATTTG

TAGAGGACTCAGATATTGAAAAAAAGCTACAGCAATTAATACTTGATAAGAA

GAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAA

ACACCAGAGTCAAACGACGTTGAAATTGAGGCTACTGCGCCAATTGATGACA

ATACAGACGATGATAACAAACCGAAGTTATCTGATGTAGAAAAGGATTAAAG

ATGCTAAGAGATAGTGATGATATTTCATAAATAATGTAATTCTATATATGTTA

ATTACCTTTTTTGCGAGGCATATTTATGGTGAAGGATAAGTTTTGACCATCAA

AGAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAGTTATGACAA

TTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAA

TTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTG

TGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAAT

GCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGT

TAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCA

AATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGC

ACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCAT

GTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACA

GTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCT

CAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATT

TTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTG

CATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATT

CTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTC

TGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCT

TCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAAC

GGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATG

AGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTT

GTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTG

CAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTAATTGCGTTTTGTC

CCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGG

AAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGC

ACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAA

CAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAA

GGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAA

CAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAG

ATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGC

AACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACT

TACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTC

CACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGC

TTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAG

CTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTT

ATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCT

TGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTT

GACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACA

TTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTG

GTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTC

GCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCT

ATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGC

CAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTC

GGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAG

ACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGC

GGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAA

AGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTC

CACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATG

TAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTT

TGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTA

AAGGAAGACTTAGGCCGCAAAAGCAACAACAATTACACAATACAAACTTGCA

AATGACTGAACTAAAAAAACAAAAGACCGCTGAACAAAAAACCAGACCTCA

AAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATTTACATCCCAACTCAATGTGTCAACC

AATCTGAGCTAGAGAAATTTGATGGCGTTTCTCAAGGTAAATACACAATTGGT

CTGGGCCAAACCAACATGTCTTTTGTCAATGACAGAGAAGATATCTACTCGAT

GTCCCTAACTGTTTTGTCTAAGTTGATCAAGAGTTACAACATCGACACCAACA

AAATTGGTAGATTAGAAGTCGGTACTGAAACTCTGATTGACAAGTCCAAGTC

TGTCAAGTCTGTCTTGATGCAATTGTTTGGTGAAAACACTGACGTCGAAGGTA

TTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCAACGCGTTGTTCAACTCTTTG

AACTGGATTGAATCTAACGCATGGGATGGTAGAGACGCCATTGTAGTTTGCG

GTGATATTGCCATCTACGATAAGGGTGCCGCAAGACCAACCGGTGGTGCCGG

TACTGTTGCTATGTGGATCGGTCCTGATGCTCCAATTGTATTTGACTCTGTAAG

AGCTTCTTACATGGAACACGCCTACGATTTTTACAAGCCAGATTTCACCAGCG

AATATCCTTACGTCGATGGTCATTTTTCATTAACTTGTTACGTCAAGGCTCTTG

ATCAAGTTTACAAGAGTTATTCCAAGAAGGCTATTTCTAAAGGGTTGGTTAGC

GATCCCGCTGGTTCGGATGCTTTGAACGTTTTGAAATATTTCGACTACAACGT

TTTCCATGTTCCAACCTGTAAATTGGTCACAAAATCATACGGTAGATTACTAT

ATAACGATTTCAGAGCCAATCCTCAATTGTTCCCAGAAGTTGACGCCGAATTA

GCTACTCGCGATTATGACGAATCTTTTAACCGATAAGAACATTGAAAAAACTTT

TGTTAATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTTGATTG

TTCCAACAAACACAGGTAACATGTACACCGCATCTGTTTATGCCGCCTTTGCA

TCTCTATTAAACTATGTTGGATCTGACGACTTACAAGGCAAGCGTGTTGGTTT

ATTTTCTTACGGTTCCGGTTTAGCTGCATCTCTATATTCTTGCAAAATTGTTGG

TGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAG

AGAATCACCGAAACTCCAAAGGATTACGAAGCTGCCATCGAATTGAGAGAAA

ATGCCCATTTGAAGAAGAACTTCAAACCTCAAGGTTCCATTGAGCATTTGCAA

AGTGGTGTTTACTACTTGACCAACATCGATGACAAATTTAGAAGATCTTACGA

TGTTAAAAAATAATCTTCCCCCATCGATTGCATCTTGCTGAACCCCCTTCATA

AATGCTTTATTTTTTTGGCAGCCTGCTTTTTTTAGCTCTCATTTAATAGAGTAG

TTTTTTAATCTATATACTAGGAAAACTCTTTATTTAATAACAATGATATATATA

TACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTTTTTTTTTTTGTTCTTTTTTTTGATTCC

GGTTTCTTTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAGCAGAAGGAAGAACGA

AGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTGGTGTTGAAG

AAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTG

CAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCT

ACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGCTATTTAATATCATGCACGAAAAGCA

AACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCGTACCACCAAGGAATTACTGGAGT

TAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAACACATGTGGATATC

TTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTAAAGGCATTATCCGC

CAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAATA

CAGTCAAATTGCAGTACTCTGCGGGTGTATACAGAATAGCAGAATGGGCAGA

CATTACGAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCGGTTTGAAG

CAGGCGGCGGAAGAAGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGTTAGCAG

AATTGTCATGCAAGGGCTCCCTAGCTACTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTT

GACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTTTGTTATCGGCTTTATTGCTCAAAGAG

ACATGGGTGGAAGAGATGAAGGTTACGATTGGTTGATTATGACACCCGGTGT

GGGTTTAGATGACAAGGGAGACGCATTGGGTCAACAGTATAGAACCGTGGAT

GATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGGTTTAAAC

SEQ ID NO：5

pAM493的IDI1-P_GAL-tHMGR插入物(5’至3’)

GTTTAAACTACTCAGTATATTAAGTTTCGAATTGAAGGGCGAACTCTTATTCG

AAGTCGGAGTCACCACAACACTTCCGCCCATACTCTCCGAATCCTCGTTTCCT

AAAGTAAGTTTACTTCCACTTGTAGGCCTATTATTAATGATATCTGAATAATC

CTCTATTAGGGTTGGATCATTCAGTAGCGCGTGCGATTGAAAGGAGTCCATGC

CCGACGTCGACGTGATTAGCGAAGGCGCGTAACCATTGTCATGTCTAGCAGC

TATAGAACTAACCTCCTTGACACCACTTGCGGAAGTCTCATCAACATGCTCTT

CCTTATTACTCATTCTCTTACCAAGCAGAGAATGTTATCTAAAAACTACGTGT

ATTTCACCTCTTTCTCGACTTGAACACGTCCAACTCCTTAAGTACTACCACAG

CCAGGAAAGAATGGATCCAGTTCTACACGATAGCAAAGCAGAAAACACAAC

CAGCGTACCCCTGTAGAAGCTTCTTTGTTTACAGCACTTGATCCATGTAGCCA

TACTCGAAATTTCAACTCATCTGAAACTTTTCCTGAAGGTTGAAAAAGAATGC

CATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTTATGACAATTACAAC

AACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGAC

GTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCT

TTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTG

ACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTT

TGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGC

CGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGC

AACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGC

CTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCA

CCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATC

ACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGC

AGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTG

CGTTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGC

AATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAA

CATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATC

CAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGAC

AACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTC

GACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAA

ATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGT

GCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCT

GAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGA

CTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCG

CCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCT

CTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCT

ATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGC

CAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAAT

ACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGCAACCGCTCT

CGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAA

TAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTA

ATAATGCTTCTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATAT

CGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGC

GCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAA

AACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTT

CAGTTTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAA

GTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAA

GAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAG

CTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAA

TTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTT

AATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCC

TCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTG

CGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACG

CACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAA

TCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAA

GAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATA

TAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGAT

TATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTC

AATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGCCCCATGGTGCAGTATCTAGTT

ACGCCAAATTAGTGCAAAACCAAACACCTGAAGACATTTTGGAAGAGTTTCC

TGAAATTATTCCATTACAACAAAGACCTAATACCCGATCTAGTGAGACGTCA

AATGACGAAAGCGGAGAAACATGTTTTTCTGGTCATGATGAGGAGCAAATTA

AGTTAATGAATGAAAATTGTATTGTTTTGGATTGGGACGATAATGCTATTGGT

GCCGGTACCAAGAAAGTTTGTCATTTAATGGAAAATATTGAAAAGGGTTTAC

TACATCGTGCATTCTCCGTCTTTATTTTCAATGAACAAGGTGAATTACTTTTAC

AACAAAGAGCCACTGAAAAAATAACTTTCCCTGATCTTTGGACTAACACATG

CTGCTCTCATCCACTATGTATTGATGACGAATTAGGTTTGAAGGGTAAGCTAG

ACGATAAGATTAAGGGCGCTATTACTGCGGCGGTGAGAAAACTAGATCATGA

ATTAGGTATTCCAGAAGATGAAACTAAGACAAGGGGTAAGTTTCACTTTTTA

AACAGAATCCATTACATGGCACCAAGCAATGAACCATGGGGTGAACATGAAA

TTGATTACATCCTATTTTATAAGATCAACGCTAAAGAAAACTTGACTGTCAAC

CCAAACGTCAATGAAGTTAGAGACTTCAAATGGGTTTCACCAAATGATTTGA

AAACTATGTTTGCTGACCCAAGTTACAAGTTTACGCCTTGGTTTAAGATTATT

TGCGAGAATTACTTATTCAACTGGTGGGAGCAATTAGATGACCTTTCTGAAGT

GGAAAATGACAGGCAAATTCATAGAATGCTATAACAACGCGTCAATAATATA

GGCTACATAAAAATCATAATAACTTTGTTATCATAGCAAAATGTGATATAAA

ACGTTTCATTTCACCTGAAAAATAGTAAAAATAGGCGACAAAAATCCTTAGT

AATATGTAAACTTTATTTTCTTTATTTACCCGGGAGTCAGTCTGACTCTTGCGA

GAGATGAGGATGTAATAATACTAATCTCGAAGATGCCATCTAATACATATAG

ACATACATATATATATATATACATTCTATATATTCTTACCCAGATTCTTTGAGG

TAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCGAAT

CATAAGCATTGCTTACAAAGAATACACATACGAAATATTAACGATAATGTCA

ATTACGAAGACTGAACTGGACGGTATATTGCCATTGGTGGCCAGAGGTAAAG

TTAGAGACATATATGAGGTAGACGCTGGTACGTTGCTGTTTGTTGCTACGGAT

CGTATCTCTGCATATGACGTTATTATGGAAAACAGCATTCCTGAAAAGGGGAT

CCTATTGACCAAACTGTCAGAGTTCTGGTTCAAGTTCCTGTCCAACGATGTTC

GTAATCATTTGGTCGACATCGCCCCAGGTAAGACTATTTTCGATTATCTACCT

GCAAAATTGAGCGAACCAAAGTACAAAACGCAACTAGAAGACCGCTCTCTAT

TGGTTCACAAACATAAACTAATTCCATTGGAAGTAATTGTCAGAGGCTACATC

ACCGGATCTGCTTGGAAAGAGTACGTAAAAACAGGTACTGTGCATGGTTTGA

AACAACCTCAAGGACTTAAAGAATCTCAAGAGTTCCCAGAACCAATCTTCAC

CCCATCGACCAAGGCTGAACAAGGTGAACATGACGAAAACATCTCTCCTGCC

CAGGCCGCTGAGCTGGTGGGTGAAGATTTGTCACGTAGAGTGGCAGAACTGG

CTGTAAAACTGTACTCCAAGTGCAAAGATTATGCTAAGGAGAAGGGCATCAT

CATCGCAGACACTAAATTGTTTAAAC

SEQ ID NO：6

pAM495的ERG10-P_GAL-ERG12插入物(5’至3’)

GTTTAAACTATTGTGAGGGTCAGTTATTTCATCCAGATATAACCCGAGAGGAA

ACTTCTTAGCGTCTGTTTTCGTACCATAAGGCAGTTCATGAGGTATATTTTCGT

TATTGAAGCCCAGCTCGTGAATGCTTAATGCTGCTGAACTGGTGTCCATGTCG

CCTAGGTACGCAATCTCCACAGGCTGCAAAGGTTTTGTCTCAAGAGCAATGTT

ATTGTGCACCCCGTAATTGGTCAACAAGTTTAATCTGTGCTTGTCCACCAGCT

CTGTCGTAACCTTCAGTTCATCGACTATCTGAAGAAATTTACTAGGAATAGTG

CCATGGTACAGCAACCGAGAATGGCAATTTCTACTCGGGTTCAGCAACGCTG

CATAAACGCTGTTGGTGCCGTAGACATATTCGAAGATAGGATTATCATTCATA

AGTTTCAGAGCAATGTCCTTATTCTGGAACTTGGATTTATGGCTCTTTTGGTTT

AATTTCGCCTGATTCTTGATCTCCTTTAGCTTCTCGACGTGGGCCTTTTTCTTG

CCATATGGATCCGCTGCACGGTCCTGTTCCCTAGCATGTACGTGAGCGTATTT

CCTTTTAAACCACGACGCTTTGTCTTCATTCAACGTTTCCCATTGTTTTTTTCTA

CTATTGCTTTGCTGTGGGAAAAACTTATCGAAAGATGACGACTTTTTCTTAAT

TCTCGTTTTAAGAGCTTGGTGAGCGCTAGGAGTCACTGCCAGGTATCGTTTGA

ACACGGCATTAGTCAGGGAAGTCATAACACAGTCCTTTCCCGCAATTTTCTTT

TTCTATTACTCTTGGCCTCCTCTAGTACACTCTATATTTTTTTATGCCTCGGTA

ATGATTTTCATTTTTTTTTTTTCCACCTAGCGGATGACTCTTTTTTTTTTCTTAGC

GATTGGCATTATCACATAATGAATTATACATTATATAAAGTAATGTGATTTCT

TCGAAGAATATACTAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCC

AGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCT

CAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTA

TAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTA

CGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCG

TTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTT

GCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAG

TTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACCAGCCCAAAAAA

AGCAAAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCCCGTATCACTAA

TGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTATATTCAAATAA

AAGATTCGATTCTTCCTGCAAAGAAGGATGACGATGTAGCTTCCCAAGCTACT

CAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGTGTTGGCTTTTTGGATCATATGAT

CCATGCGTTGGCAAAACACTCTGGTTGGTCTCTTATTGTTGAATGTATTGGTG

ACCTGCACATTGACGATCACCATACTACCGAAGATTGCGGTATCGCATTAGG

GCAAGCGTTCAAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAAAAGATTCGGT

ACTGGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTAGTCGATTTATC

TAGTAGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGAGATGATTGGT

GATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAAAGTTTCGCGGAGGCGGC

CAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAGAGGTTTCAACGATCACCACAGAA

GTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTGGCTGTTGCCATAAGAGAAGCTATTTCTAGC

AATGGCACCAATGACGTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATGTGAAGTACTGA

CAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATAT

TGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTC

GACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCG

TCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGC

CGCCATCCACCCGGGATGGTCTGCTTAAATTTCATTCTGTCTTCGAAAGCTGA

ATTGATACTACGAAAAATTTTTTTTTGTTTCTCTTTCTATCTTTATTACATAAA

ACTTCATACACAGTTAAGATTAAAAACAACTAATAAATAATGCCTATCGCAA

ATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTGTTTCCTGGCAATAATAGATCGT

CAATTTGTTGCTTTGTGGTAGTTTTATTTTCAAATAATTGGAATACTAGGGATT

TGATTTTAAGATCTTTATTCAAATTTTTTGCGCTTAACAAACAGCAGCCAGTC

CCACCCAAGTCTGTTTCAAATGTCTCGTAACTAAAATCATCTTGCAATTTCTTT

TTGAAACTGTCAATTTGCTCTTGAGTAATGTCTCTTCGTAACAAAGTCAAAGA

GCAACCGCCGCCACCAGCACCGGTAAGTTTTGTGGAGCCAATTCTCAAATCAT

CGCTCAGATTTTTAATAAGTTCTAATCCAGGATGAGAAACACCGATTGAGAC

AAGCAGTCCATGATTTATTCTTATCAATTCCAATAGTTGTTCATACAGTTCATT

ATTAGTTTCTACAGCCTCGTCATCGGTGCCTTTACATTTACTTAACTTAGTCAT

GATCTCTAAGCCTTGTAGGGCACATTCACCCATGGCATCTAGAATTGGCTTCA

TAACTTCAGGAAATTTCTCGGTGACCAACACACGAACGCGAGCAACAAGATC

TTTTGTAGACCTTGGAATTCTAGTATAGGTTAGGATCATTGGAATGGCTGGGA

AATCATCTAAGAACTTAAAATTGTTTGTGTTTATTGTTCCATTATGTGAGTCTT

TTTCAAATAGCAGGGCATTACCATAAGTGGCCACAGCGTTATCTATTCCTGAA

GGGGTACCGTGAATACACTTTTCACCTATGAAGGCCCATTGATTCACTATATG

CTTATCGTTTTCTGACAGCTTTTCCAAGTCATTAGATCCTATTAACCCCCCCAA

GTAGGCCATAGCTAAGGCCAGTGATACAGAAATAGAGGCGCTTGAGCCCAAC

CCAGCACCGATGGGTAAAGTAGACTTTAAAGAAAACTTAATATTCTTGGCAT

GGGGGCATAGGCAAACAAACATATACAGGAAACAAAACGCTGCATGGTAGT

GGAAGGATTCGGATAGTTGAGCTAACAACGGATCCAAAAGACTAACGAGTTC

CTGAGACAAGCCATCGGTGGCTTGTTGAGCCTTGGCCAATTTTTGGGAGTTTA

CTTGATCCTCGGTGATGGCATTGAAATCATTGATGGACCACTTATGATTAAAG

CTAATGTCCGGGAAGTCCAATTCAATAGTATCTGGTGCAGATGACTCGCTTAT

TAGCAGGTAGGTTCTCAACGCAGACACACTAGCAGCGACGGCAGGCTTGTTG

TACACAGCAGAGTGTTCACCAAAAATAATAACCTTTCCCGGTGCAGAAGTTA

AGAACGGTAATGACATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTA

TATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACA

AACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTA

TATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAA

ATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCG

TTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACC

ATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGG

CACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAG

AGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCA

ATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTT

TTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGAT

TAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTT

CTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATG

TCTCAGAACGTTTACATTGTATCGACTGCCAGAACCCCAATTGGTTCATTCCA

GGGTTCTCTATCCTCCAAGACAGCAGTGGAATTGGGTGCTGTTGCTTTAAAAG

GCGCCTTGGCTAAGGTTCCAGAATTGGATGCATCCAAGGATTTTGACGAAATT

ATTTTTGGTAACGTTCTTTCTGCCAATTTGGGCCAAGCTCCGGCCAGACAAGT

TGCTTTGGCTGCCGGTTTGAGTAATCATATCGTTGCAAGCACAGTTAACAAGG

TCTGTGCATCCGCTATGAAGGCAATCATTTTGGGTGCTCAATCCATCAAATGT

GGTAATGCTGATGTTGTCGTAGCTGGTGGTTGTGAATCTATGACTAACGCACC

ATACTACATGCCAGCAGCCCGTGCGGGTGCCAAATTTGGCCAAACTGTTCTTG

TTGATGGTGTCGAAAGAGATGGGTTGAACGATGCGTACGATGGTCTAGCCAT

GGGTGTACACGCAGAAAAGTGTGCCCGTGATTGGGATATTACTAGAGAACAA

CAAGACAATTTTGCCATCGAATCCTACCAAAAATCTCAAAAATCTCAAAAGG

AAGGTAAATTCGACAATGAAATTGTACCTGTTACCATTAAGGGATTTAGAGG

TAAGCCTGATACTCAAGTCACGAAGGACGAGGAACCTGCTAGATTACACGTT

GAAAAATTGAGATCTGCAAGGACTGTTTTCCAAAAAGAAAACGGTACTGTTA

CTGCCGCTAACGCTTCTCCAATCAACGATGGTGCTGCAGCCGTCATCTTGGTT

TCCGAAAAAGTTTTGAAGGAAAAGAATTTGAAGCCTTTGGCTATTATCAAAG

GTTGGGGTGAGGCCGCTCATCAACCAGCTGATTTTACATGGGCTCCATCTCTT

GCAGTTCCAAAGGCTTTGAAACATGCTGGCATCGAAGACATCAATTCTGTTGA

TTACTTTGAATTCAATGAAGCCTTTTCGGTTGTCGGTTTGGTGAACACTAAGA

TTTTGAAGCTAGACCCATCTAAGGTTAATGTATATGGTGGTGCTGTTGCTCTA

GGTCACCCATTGGGTTGTTCTGGTGCTAGAGTGGTTGTTACACTGCTATCCAT

CTTACAGCAAGAAGGAGGTAAGATCGGTGTTGCCGCCATTTGTAATGGTGGT

GGTGGTGCTTCCTCTATTGTCATTGAAAAGATATGATTACGTTCTGCGATTTTC

TCATGATCTTTTTCATAAAATACATAAATATATAAATGGCTTTATGTATAACA

GGCATAATTTAAAGTTTTATTTGCGATTCATCGTTTTTCAGGTACTCAAACGCT

GAGGTGTGCCTTTTGACTTACTTTTCCCGGGAGAGGCTAGCAGAATTACCCTC

CACGTTGATTGTCTGCGAGGCAAGAATGATCATCACCGTAGTGAGAGTGCGT

TCAAGGCTCTTGCGGTTGCCATAAGAGAAGCCACCTCGCCCAATGGTACCAA

CGATGTTCCCTCCACCAAAGGTGTTCTTATGTAGTGACACCGATTATTTAAAG

CTGCAGCATACGATATATATACATGTGTATATATGTATACCTATGAATGTCAG

TAAGTATGTATACGAACAGTATGATACTGAAGATGACAAGGTAATGCATCAT

TCTATACGTGTCATTCTGAACGAGGCGCGCTTTCCTTTTTTCTTTTTGCTTTTTC

TTTTTTTTTCTCTTGAACTCGAGAAAAAAAATATAAAAGAGATGGAGGAACG

GGAAAAAGTTAGTTGTGGTGATAGGTGGCAAGTGGTATTCCGTAAGAACAAC

AAGAAAAGCATTTCATATTATGGCTGAACTGAGCGAACAAGTGCAAAATTTA

AGCATCAACGACAACAACGAGAATGGTTATGTTCCTCCTCACTTAAGAGGAA

AACCAAGAAGTGCCAGAAATAACAGTAGCAACTACAATAACAACAACGGCG

GCGTTTAAAC

SEQ ID NO：7

pAM497的ERG8-P_GAL-ERG19插入物(5’至3’)

GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAATCGTCTTACTTTCTAACTTTTCTT

ACCTTTTACATTTCAGCAATATATATATATATATTTCAAGGATATACCATTCTA

ATGTCTGCCCCTAAGAAGATCGTCGTTTTGCCAGGTGACCACGTTGGTCAAGA

AATCACAGCCGAAGCCATTAAGGTTCTTAAAGCTATTTCTGATGTTCGTTCCA

ATGTCAAGTTCGATTTCGAAAATCATTTAATTGGTGGTGCTGCTATCGATGCT

ACAGGTGTTCCACTTCCAGATGAGGCGCTGGAAGCCTCCAAGAAGGCTGATG

CCGTTTTGTTAGGTGCTGTGGGTGGTCCTAAATGGGGTACCGGTAGTGTTAGA

CCTGAACAAGGTTTACTAAAAATCCGTAAAGAACTTCAATTGTACGCCAACTT

AAGACCATGTAACTTTGCATCCGACTCTCTTTTAGACTTATCTCCAATCAAGC

CACAATTTGCTAAAGGTACTGACTTCGTTGTTGTCAGAGAATTAGTGGGAGGT

ATTTACTTTGGTAAGAGAAAGGAAGACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGG

TCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGAC

GTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACA

TCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAA

GCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCT

CACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAA

GGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTG

CTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACC

AGCCCAAAAAAAGCAAAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCC

CGTATCACTAATGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTA

TATTCAAATAAAAGATTCGATTCTTCCTGCAAAGAAGGATGACGATGTAGCTT

CCCAAGCTACTCAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGTGTTGGCTTTTTG

GATCATATGATCCATGCGTTGGCAAAACACTCTGGTTGGTCTCTTATTGTTGA

ATGTATTGGTGACCTGCACATTGACGATCACCATACTACCGAAGATTGCGGTA

TCGCATTAGGGCAAGCGTTCAAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAA

AAGATTCGGTACTGGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTA

GTCGATTTATCTAGTAGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGA

GATGATTGGTGATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAAAGTTTCG

CGGAGGCGGCCAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAGAGGTTTCAACGAT

CACCACAGAAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTGGCTGTTGCCATAAGAGAAG

CTATTTCTAGCAATGGCACCAATGACGTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATG

TGAAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATA

GTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATT

TTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGT

AATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTC

GATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGTTTCTCATTCAAGTGGTAACTGCTGTT

AAAATTAAGATATTTATAAATTGAAGCTTGGTCGTTCCGACCAATACCGTAGG

GAAACGTAAATTAGCTATTGTAAAAAAAGGAAAAGAAAAGAAAAGAAAAAT

GTTACATATCGAATTGATCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTTTGCGTCAATCA

AAGATTCGTTTGTTTCTTGTGGGCCTGAACCGACTTGAGTTAAAATCACTCTG

GCAACATCCTTTTGCAACTCAAGATCCAATTCACGTGCAGTAAAGTTAGATGA

TTCAAATTGATGGTTGAAAGCCTCAAGCTGCTCAGTAGTAAATTTCTTGTCCC

ATCCAGGAACAGAGCCAAACAATTTATAGATAAATGCAAAGAGTTTCGACTC

ATTTTCAGCTAAGTAGTACAACACAGCATTTGGACCTGCATCAAACGTGTATG

CAACGATTGTTTCTCCGTAAAACTGATTAATGGTGTGGCACCAACTGATGATA

CGCTTGGAAGTGTCATTCATGTAGAATATTGGAGGGAAAGAGTCCAAACATG

TGGCATGGAAAGAGTTGGAATCCATCATTGTTTCCTTTGCAAAGGTGGCGAA

ATCTTTTTCAACAATGGCTTTACGCATGACTTCAAATCTCTTTGGTACGACATG

TTCAATTCTTTCTTTAAATAGTTCGGAGGTTGCCACGGTCAATTGCATACCCTG

AGTGGAACTCACATCCTTTTTAATATCGCTGACAACTAGGACACAAGCTTTCA

TCTGAGGCCAGTCAGAGCTGTCTGCGATTTGTACTGCCATGGAATCATGACCA

TCTTCAGCTTTTCCCATTTCCCAGGCCACGTATCCGCCAAACAACGATCTACA

AGCTGAACCAGACCCCTTTCTTGCTATTCTAGATATTTCTGAAGTTGACTGTG

GTAATTGGTATAACTTAGCAATTGCAGAGACCAATGCAGCAAAGCCAGCAGC

GGAGGAAGCTAAACCAGCTGCTGTAGGAAAGTTATTTTCGGAGACAATGTGG

AGTTTCCATTGAGATAATGTGGGCAATGAGGCGTCCTTCGATTCCATTTCCTT

TCTTAATTGGCGTAGGTCGCGCAGACAATTTTGAGTTCTTTCATTGTCGATGCT

GTGTGGTTCTCCATTTAACCACAAAGTGTCGCGTTCAAACTCAGGTGCAGTAG

CCGCAGAGGTCAACGTTCTGAGGTCATCTTGCGATAAAGTCACTGATATGGA

CGAATTGGTGGGCAGATTCAACTTCGTGTCCCTTTTCCCCCAATACTTAAGGG

TTGCGATGTTGACGGGTGCGGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTT

TTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACT

TTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTA

GTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAA

TCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCA

TTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCA

GGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATC

TTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCG

ACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCG

CCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCG

TATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTC

TTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGG

TATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAG

TAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTGCC

CCAGGGAAAGCGTTACTAGCTGGTGGATATTTAGTTTTAGATCCGAAATATGA

AGCATTTGTAGTCGGATTATCGGCAAGAATGCATGCTGTAGCCCATCCTTACG

GTTCATTGCAAGAGTCTGATAAGTTTGAAGTGCGTGTGAAAAGTAAACAATTT

AAAGATGGGGAGTGGCTGTACCATATAAGTCCTAAAACTGGCTTCATTCCTGT

TTCGATAGGCGGATCTAAGAACCCTTTCATTGAAAAAGTTATCGCTAACGTAT

TTAGCTACTTTAAGCCTAACATGGACGACTACTGCAATAGAAACTTGTTCGTT

ATTGATATTTTCTCTGATGATGCCTACCATTCTCAGGAGGACAGCGTTACCGA

ACATCGTGGCAACAGAAGATTGAGTTTTCATTCGCACAGAATTGAAGAAGTT

CCCAAAACAGGGCTGGGCTCCTCGGCAGGTTTAGTCACAGTTTTAACTACAGC

TTTGGCCTCCTTTTTTGTATCGGACCTGGAAAATAATGTAGACAAATATAGAG

AAGTTATTCATAATTTATCACAAGTTGCTCATTGTCAAGCTCAGGGTAAAATT

GGAAGCGGGTTTGATGTAGCGGCGGCAGCATATGGATCTATCAGATATAGAA

GATTCCCACCCGCATTAATCTCTAATTTGCCAGATATTGGAAGTGCTACTTAC

GGCAGTAAACTGGCGCATTTGGTTAATGAAGAAGACTGGAATATAACGATTA

AAAGTAACCATTTACCTTCGGGATTAACTTTATGGATGGGCGATATTAAGAAT

GGTTCAGAAACAGTAAAACTGGTCCAGAAGGTAAAAAATTGGTATGATTCGC

ATATGCCGGAAAGCTTGAAAATATATACAGAACTCGATCATGCAAATTCTAG

ATTTATGGATGGACTATCTAAACTAGATCGCTTACACGAGACTCATGACGATT

ACAGCGATCAGATATTTGAGTCTCTTGAGAGGAATGACTGTACCTGTCAAAA

GTATCCTGAGATCACAGAAGTTAGAGATGCAGTTGCCACAATTAGACGTTCCT

TTAGAAAAATAACTAAAGAATCTGGTGCCGATATCGAACCTCCCGTACAAAC

TAGCTTATTGGATGATTGCCAGACCTTAAAAGGAGTTCTTACTTGCTTAATAC

CTGGTGCTGGTGGTTATGACGCCATTGCAGTGATTGCTAAGCAAGATGTTGAT

CTTAGGGCTCAAACCGCTGATGACAAAAGATTTTCTAAGGTTCAATGGCTGG

ATGTAACTCAGGCTGACTGGGGTGTTAGGAAAGAAAAAGATCCGGAAACTTA

TCTTGATAAATAACTTAAGGTAGATAATAGTGGTCCATGTGACATCTTTATAA

ATGTGAAGTTTGAAGTGACCGCGCTTAACATCTAACCATTCATCTTCCGATAG

TACTTGAAATTGTTCCTTTCGGCGGCATGATAAAATTCTTTTAATGGGTACAA

GCTACCCGGGCCCGGGAAAGATTCTCTTTTTTTATGATATTTGTACATAAACT

TTATAAATGAAATTCATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATGGAATATG

TTCATAGGGTAGACGAAACTATATACGCAATCTACATACATTTATCAAGAAG

GAGAAAAAGGAGGATGTAAAGGAATACAGGTAAGCAAATTGATACTAATGG

CTCAACGTGATAAGGAAAAAGAATTGCACTTTAACATTAATATTGACAAGGA

GGAGGGCACCACACAAAAAGTTAGGTGTAACAGAAAATCATGAAACTATGAT

TCCTAATTTATATATTGGAGGATTTTCTCTAAAAAAAAAAAAATACAACAAAT

AAAAAACACTCAATGACCTGACCATTTGATGGAGTTTAAGTCAATACCTTCTT

GAACCATTTCCCATAATGGTGAAAGTTCCCTCAAGAATTTTACTCTGTCAGAA

ACGGCCTTAACGACGTAGTCGACCTCCTCTTCAGTACTAAATCTACCAATACC

AAATCTGATGGAAGAATGGGCTAATGCATCATCCTTACCCAGCGCATGTAAA

ACATAAGAAGGTTCTAGGGAAGCAGATGTACAGGCTGAACCCGAGGATAATG

CGATATCCCTTAGTGCCATCAATAAAGATTCTCCTTCCACGTAGGCGAAAGAA

ACGTTAACACGTTTAAAC

SEQ ID NO：8

柠檬的γ-松油烯合成酶，针对大肠杆菌中的表达进行了密码子优化，且侧翼连接XmaI和XbaI限制性酶切位点(5’至3’)

GGAATTCCCGGGCGAGCTCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGT

GGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGAGCT

TCGATTATATTCAGAGCCTGGATTCTAAGTACAAGGGTGAATCTTACGCCCGT

CAGCTTGAGAAACTGAAAGAACAAGTGTCCGCAATGCTGCAGCAGGACAACA

AAGTCGTTGACCTGGACCCACTGCATCAGCTGGAACTGATCGATAATCTGCAC

CGTCTGGGCGTGAGCTACCATTTCGAGGATGAGATCAAACGTACCCTGGATC

GTATCCACAACAAAAACACCAACAAAAGCTTGTATGCGCGTGCGCTGAAATT

CCGCATCCTGCGTCAGTACGGCTATAAGACCCCGGTTAAGGAAACGTTCTCTC

GCTTCATGGACGAAAAAGGCAGCTTCAAACTGTCCTCTCATTCTGATGAATGC

AAAGGCATGCTGGCTCTGTACGAAGCTGCATATCTCCTGGTTGAAGAAGAAT

CTTCCATCTTCCGTGATGCGATCCGCTTTACCACGGCATACCTGAAAGAATGG

GTAGCGAAACACGATATTGATAAAAACGATAACGAATATCTGTGCACCTTGG

TGAAACACGCACTGGAACTGCCGCTGCATTGGCGCATGCGTCGTCTGGAGGC

TCGCTGGTTCATCGACGTCTATGAGTCTGGCCCGGATATGAACCCGATCCTGC

TGGAGCTGGCCAAAGTTGACTACAACATCGTTCAGGCTGTGCACCAGGAGGA

CCTGAAATACGTTTCCCGTTGGTGGAAGAAAACTGGTCTGGGCGAAAAACTG

AACTTCGCACGTGATCGTGTTGTGGAAAACTTCTTCTGGACCGTTGGCGATAT

CTTCGAACCGCAGTTCGGCTACTGCCGCCGTATGTCTGCTATGGTAAACTGTC

TGCTGACCTCCATTGATGATGTATACGATGTTTATGGTACTCTGGATGAACTT

GAACTGTTCACTGATGCGGTAGAACGCTGGGATGCTACCACTACTGAACAGT

TGCCTTATTACATGAAGTTGTGTTTCCACGCGCTGTACAACTCCGTAAACGAA

ATGGGCTTCATCGCTCTGCGTGATCAGGAAGTAGGTATGATTATTCCATATCT

GAAGAAAGCATGGGCGGATCAGTGTAAATCCTACCTGGTGGAAGCAAAATGG

TACAACTCTGGCTACATTCCTACTCTGCAGGAGTACATGGAGAACGCGTGGAT

CTCCGTTACCGCGCCTGTAATGCTGTTGCACGCGTACGCATTCACCGCTAACC

CAATCACCAAGGAAGCACTGGAATTTCTGCAGGACTCGCCGGATATCATCCG

TATCTCCTCCATGATCGTGCGTCTGGAAGACGATCTGGGTACCTCCAGCGATG

AACTGAAACGTGGTGACGTCCCGAAAAGCATCCAGTGTTACATGCACGAAAC

CGGCGTTTCTGAAGACGAGGCTCGTGAACATATTCGTGACCTCATTGCAGAA

ACCTGGATGAAGATGAACTCTGCGCGTTTCGGTAACCCGCCGTACCTGCCGG

ATGTTTTTATCGGTATCGCGATGAACCTGGTGCGTATGTCCCAATGTATGTA

TTGTACGGCGATGGTCATGGTGTACAGGAAAACACTAAAGACCGCGTCCTGT

CTCTGTTCATCGATCCGATCCCGTGATAGTAATCTAGAGGAATTT

SEQ ID NO：9

罗勒的异松油烯合成酶，针对大肠杆菌中的表达进行了密码子优化，且侧翼连接XmaI和XbaI限制性酶切位点(5’至3’)

GGAATTCCCGGGCGAGCTCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGT

GGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGGATT

TTAACTATCTGCAGTCTCTGAATAATTACCACCACAAAGAGGAACGTTACCTG

CGCCGCCAGGCCGATCTGATCGAAAAAGTGAAAATGATTCTGAAAGAGGAGA

AAATGGAGGCCCTGCAACAGCTGGAGCTGATCGACGACCTGCGTAACCTGGG

CCTGTCTTACTGCTTTGACGATCAAATTAACCATATCCTGACGACCATCTATA

ACCAGCACTCCTGCTTCCACTATCACGAAGCGGCTACCTCTGAGGAAGCGAA

CCTGTACTTCACCGCCCTGGGTTTCCGTCTGCTGCGCGAACACGGCTTCAAAG

TGAGCCAGGAAGTGTTCGATCGTTTTAAGAACGAAAAAGGCACCGATTTCCG

TCCGGATCTGGTTGATGATACCCAGGGTCTGCTGCAACTGTATGAAGCAAGCT

TTCTGCTGCGTGAAGGCGAGGACACTCTGGAATTCGCACGCCAATTCGCAAC

GAAATTCCTGCAAAAGAAAGTCGAAGAAAAGATGATTGAAGAAGAAAACCT

GCTGTCTTGGACCCTGCACAGCCTGGAACTGCCGCTGCACTGGCGTATCCAGC

GTCTGGAAGCGAAATGGTTCCTGGATGCGTACGCTTCTCGCCCAGACATGAA

CCCGATTATTTTCGAACTGGCCAAACTGGAATTTAATATCGCTCAGGCACTGC

AGCAGGAAGAACTGAAGGACCTGAGCCGTTGGTGGAACGATACTGGTATCGC

GGAAAAACTGCCGTTCGCGCGTGATCGTATCGTGGAATCCCACTACTGGGCT

ATCGGCACCCTGGAGCCGTACCAGTACCGTTACCAGCGCTCTCTGATCGCGAA

AATCATCGCTCTGACCACGGTGGTTGACGATGTGTACGACGTTTACGGTACTC

TGGACGAACTGCAGCTGTTCACCGATGCAATCCGTCGTTGGGATATCGAATCT

ATCAACCAACTGCCGTCTTATATGCAACTGTGTTACCTGGCGATCTATAACTT

TGTGTCTGAACTGGCCTATGACATCTTCCGCGACAAAGGTTTCAATTCCCTGC

CGTACCTGCACAAAAGCTGGCTGGACCTGGTAGAAGCGTATTTCCAGGAGGC

GAAGTGGTATCACAGCGGCTACACCCCGTCCCTGGAACAGTACCTGAACATT

GCACAGATCAGCGTGGCGTCTCCGGCGATCCTGTCTCAGATCTACTTCACCAT

GGCGGGCAGCATTGACAAACCGGTGATTGAAAGCATGTACAAATATCGTCAT

ATTCTGAATCTGTCCGGCATCCTGCTGCGTCTGCCAGACGATCTGGGCACCGC

CTCCGACGAACTGGGCCGTGGTGACCTGGCAAAAGCGATGCAGTGCTACATG

AAAGAGCGTAACGTTAGCGAAGAAGAAGCGCGCGATCACGTTCGTTTCCTGA

ACCGTGAAGTTTCCAAACAGATGAATCCGGCACGTGCTGCTGATGATTGCCC

GTTCACTGACGATTTTGTGGTCGCAGCAGCCAACCTGGGTCGCGTAGCTGACT

TCATGTACGTGGAAGGTGATGGTCTGGGCCTGCAATACCCTGCTATCCACCAG

CACATGGCGGAACTGCTGTTCCATCCGTATGCCTAATGATAGTAATCTAGAGG

AATTT

SEQ ID NO：10

花旗松的异松油烯合成酶，针对大肠杆菌中的表达进行了密码子优化，且侧翼连接XmaI和XbaI限制性酶切位点(5’至3’)

GGAATTCCCGGGCGAGCTCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGT

GGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGGAT

GACAACTTTATTCAGTCTCTGTCCAGCCCGTATGAAGAATCTTCTTACGGCGA

TCGTGCCGAAACTCTGATCGGCGAAGTAAAGGAGATCTTCAACAGCCTGTCT

ATGACTGGTGTAGTTAGCCCGCTGAACGACCTGCTGCAGCGTCTGCTGATGGT

GGATAACGTTGAGCGTCTGGGTATCGAACGCCACTTCCAGAACGAAATCAAG

AGCGCCCTGCAGTATGTGTACTCTTACTGGTCTGAGAATGGTATTGGCTGCGG

TAAAGACTCCGTTAGCACCGACCTGAACACCACTGCACTGGGCTTCCGTATCC

TGCGCCTGCATGGTTATACCGTGTTCTCCGACGTACTGGAACAGTTCAAAGAC

CAGAAAGGCCAGTTCGCGAGCGCTTGGTCCGCGAACCATACCGAACGCCAAA

TCCGTTCCGTCCTGAACCTGTTTCGCGCTTCCCTGATCGCGTTCCCAGGTGAA

AAAGTGATGGAAGAGGCACAAATCTTCTCCGCGACCTATCTGAAAGAGGCGC

TGCAGACTATCCCGCTGTCTGGCCTGTCTCAGGAAATCCAGTACGCGCTGGAA

TACCGTTGGCATTCTAACCTGCCGCGCCTGGAAGTTCGTAGCTATATTGATAT

CCTGGCAGAAAATACTATTAACGAAATGAGCTACCCGAAGGTTGAGAAACTG

CTGGAGCTGGCGAAACTGGAATTCAACATCTTCCATAGCCTGCAGCAGAAGG

AGCTGCAGTGTATCTGGCGCTGGTGGAAAGAATCCGGCTCTCCGGAGCTGAC

GTTTGTGCGTCATCGTTATGTAGAGTACTACACCCTGGTGGCTGGCATCGATA

TGGAACCGCAGCACTCTGCCTTCCGCATCGCGTACGTCAAGATGTGCCACCTG

ATCACCATTCTGGATGATATGTATGATACTTTCGGCACCATCGACGAGCTGCG

TCTGTTCACTGCTGCCGTAAAACGCTGGGACCGTAGCCCGACCGAGTGCCTGC

CGCAGTACATGAAAGGTGTCTATATGGTGCTGTACGACACGGTTAATGAAAT

GGCCTGTGAAGCTCTGAAAAGCCAGGGCTGGGATACGCTGAATTATGCTCGC

CAGGCTTTCGAAGATTACATCGATTCTTACCTGAAGGAGGCAGAATGGATCTC

CACTGGTTACCTGCCGACCTTCGAAGAATATCTGGAAAACGGTAAAGTGTCCT

CCGCGCACCGTGTTGCAACCCTGCAGCCGATCCTGACCCTGGATATCCCGTTT

CCACTGCACATCATCCAGGAAATCGACTTCCCGTCCAAATTTAACGATTCCGC

TTCCTCTATCCTGCGTCTGCGTGGCGATACCCGTTGTTATCAAGCGGATATGG

CACGCGGTGAAGAGGCATCCTCTATCTCCTGCTATATGCACGATAATCCGGGC

TCTACTGAAGAAGATGCGCTGAACCACATTAACGGTATGATCGAGGACATTA

TCAAAGAACTGAACTGGGAACTGCTGCGTAAGGACATCAACGTTCCGATTAG

CTGCAAAAAGCATGCGTTCGAAATTTCTCGTGGCTTCCACCACTTTTACAAAG

ATCGCGACGGTTACACTGTCTCTAACATCGAAACCAAGGATCTGGTAATGAA

AACTGTCCTGGAACCGGTGCCTCTGTAATGATAGTAATCTAGAGGAATTT

SEQ ID NO：11

pAM328的KanMX-PMET3区(5’至3’)

GAATTCGCCCTTNTGGATGGCGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGC

GACCAGCATTCACATACGATTGACGCATGATATTACTTTCTGCGCACTTAACT

TCGCATCTGGGCAGATGATGTCGAGGCGAAAAAAAATATAAATCACGCTAAC

ATTTGATTAAAATAGAACAACTACAATATAAAAAAACTATACAAATGACAAG

TTCTTGAAAACAAGAATCTTTTTATTGTCAGTACTGATTAGAAAAACTCATCG

AGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTT

TTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCAT

AGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAAT

ACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCAC

CATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTC

CAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATC

AACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGA

TCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGA

ACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAAT

ACCTGGAATGCTGTTTTGCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATC

AGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGC

CAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCC

ATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTG

TCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCA

GCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAAACGTGAGTCTTTTCCTTACC

CATGGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGATTTT

AAAAGGAAGTATATGAAAGAAGAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCTTTTATA

TTTCTCTACAGGGGCGCGGCGTGGGGACAATTCAACGCGTCTGTGAGGGGAG

CGTTTCCCTGCTCGCAGGTCTGCAGCGAGGAGCCGTAATTTTTGCTTCGCGCC

GTGCGGCCATCAAAATGTATGGATGCAAATGATTATACATGGGGATGTATGG

GCTAAATGTACGGGCGACAGTCACATCATGCCCCTGAGCTGCGCACGTCAAG

ACTGTCAAGGAGGGTATTCTGGGCCTCCATGTCGCTGGCCGGGTGACCCGGC

GGGGACGAGGCAAGCTAAACAGATCTGATCTTGAAACTGAGTAAGATGCTCA

GAATACCCGTCAAGATAAGAGTATAATGTAGAGTAATATACCAAGTATTCAG

CATATTCTCCTCTTCTTTTGTATAAATCACGGAAGGGATGATTTATAAGAAAA

ATGAATACTATTACACTTCATTTACCACCCTCTGATCTAGATTTTCCAACGATA

TGTACGTAGTGGTATAAGGTGAGGGGGTCCACAGATATAACATCGTTTAATTT

AGTACTAACAGAGACTTTTGTCACAACTACATATAAGTGTACAAATATAGTAC

AGATATGACACACTTGTAGCGCCAACGCGCATCCTACGGATTGCTGACAGAA

AAAAAGGTCACGTGACCAGAAAAGTCACGTGTAATTTTGTAACTCACCGCAT

TCTAGCGGTCCCTGTCGTGCACACTGCACTCAACACCATAAACCTTAGCAACC

TCCAAAGGAAATCACCGTATAACAAAGCCACAGTTTTACAACTTAGTCTCTTA

TGAAGTTACTTACCAATGAGAAATAGAGGCTCTTTCTCGAGAAATATGAATAT

GGATATATATATATATATATATATATATATATATATATGTAAACTTGGTTCTTT

TTTAGCTTGTGATCTCTAGCTTGGGTCTCTCTCTGTCGTAACAGTTGTGATATC

GNAAGGGCGAATTC

SEQ ID NO：12

pAM178的leu2基因的PCR扩增片段(5’至3’)

TCGACTACGTCGTAAGGCCGTTTCTGACAGAGTAAAATTCTTGAGGGAACTTT

CACCATTATGGGAAATGCTTCAAGAAGGTATTGACTTAAACTCCATCAAATG

GTCAGGTCATTGAGTGTTTTTTATTTGTTGTATTTTTTTTTTTTTAGAGAAAATC

CTCCAATATCAAATTAGGAATCGTAGTTTCATGATTTTCTGTTACACCTAACTT

TTTGTGTGGTGCCCTCCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAGTGCAATTCTTTTT

CCTTATCACGTTGAGCCAITAGTATCAATTTGCTTACCTGTATTCCTTTACTAT

CCTCCTTTTTCTCCTTCTTGATAAATGTATGTAGATTGCGTATATAGTTTCGTC

TACCCTATGAACATATTCCATTTTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATGAATTT

CATTTATAAAGTTTATGTACAAATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTTTAAGCA

AGGATTTTCTTAACTTCTTCGGCGACAGCATCACCGACTTCGGTGGTACTGTT

GGAACCACCTAAATCACCAGTTCTGATACCTGCATCCAAAACCTTTTTAACTG

CATCTTCAATGGCCTTACCTTCTTCAGGCAAGTTCAATGACAATTTCAACATC

ATTGCAGCAGACAAGATAGTGGCGATAGGGTCAACCTTATTCTTTGGCAAAT

CTGGAGCAGAACCGTGGCATGGTTCGTACAAACCAAATGCGGTGTTCTTGTCT

GGCAAAGAGGCCAAGGACGCAGATGGCAACAAACCCAAGGAACCTGGGATA

ACGGAGGCTTCATCGGAGATGATATCACCAAACATGTTGCTGGTGATTATAAT

ACCATTTGGTGGGITGGGTTCTTAACTAGGATCATGGCGGCAGAATCAATCA

ATTGATGTTGAACCTTCAATGTAGGGAATTCGTTCTTGATGGTTTCCTCCACA

GTTTTTCTCCATAATCTTGAAGAGGCCAAAAGATTAGCTTTATCCAAGGACCA

AATAGGCAATGGTGGCTCATGTTGTAGGGCCATGAAAGCGGCCATTCTTGTG

ATTCTTTGCACTTCTGGAACGGTGTATTGTTCACTATCCCAAGCGACACCATC

ACCATCGTCTTCCTTTCTCTTACCAAAGTAAATACCTCCCACTAATTCTCTGAC

AACAACGAAGTCAGTACCTTTAGCAAATTGTGGCTTGATTGGAGATAAGTCT

AAAAGAGAGTCGGATGCAAAGTTACATGGTCTTAAGTTGGCGTACAATTGAA

GTTCTTTACGGATTTTTAGTAAACCTTGTTCAGGTCTAACACTACCGGTACCCC

ATTTAGGACCAGCCACAGCACCTAACAAAACGGCATCAACCTTCTTGGAGGC

TTCCAGCGCCTCATCTGGAAGTGGAACACCTGTAGCATCGATAGCAGCACCA

CCAATTAAATGATTTTCGAAATCGAACTTGACATTGGAACGAACATCAGAAA

TAGCTTTAAGAACCTTAATGGCTTCGGCTGTGATTTCTTGACCAACGTGGTCA

CCTGGCAAAACGACGATCTTCTTAGGGGCAGACATTACAATGGTATATCCTTG

AAATATATATAGTGAAATACCGCACAGATGC

SEQ ID NO：13

引物4-49mvaA SpeI(5’至3’)

GCTACTAGTAGGAGGAAAACATCATGCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCG

SEQ ID NO：14

引物4-49mvaAR XbaI(5’至3’)

GCTTCTAGACTATTGTTGTCTAATTTCTTGTAAAATGCG

SEQ ID NO：15

引物HMGS 5′Sa mvaS-S(5’至3’)

GAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGACAATAGGTATCGACAAAATA

AACT

SEQ ID NO：l6

引物HMGS 3′Sa mvaS-AS(5’至3’)

TTGCATGATGTTTTCCTCCTACTAGTTACTCTGGTCTGTGATATTCGCGAAC

SEQ ID NO：17

引物67-1A-C(5’至3’)

ACACTCGAGGAGGAATAAATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG

SEQ ID NO：18

引物67-1B-C(5’至3’)

TGATGGTACCTTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTGGC

SEQ ID NO：19

引物67-1C-C(5’至3’)

ACTAGGTACCAGGAGGAATAAATGAAGCAACTCACCATTCTGGGC

SEQ ID NO：20

引物67-1D-C(5’至3’)

AATTGATGGGCCCTCAGCTTGCGAGACGCATCACCTC

SEQ ID NO：21

引物67-1E-C(5’至3’)

CATAAAGGGCCCAGGAGGAATAAATGGCAACCACTCATTTGGATG

SEQ ID NO：22

引物67-1F-C(5’至3’)

TATTGTTCATATGTTATGTATTCTCCTGATGGATGGTTCG

SEQ ID NO：23

引物67-1G-C(5’至3’)

AACTAACACATATGAGGAGGAATAAATGCGGACACAGTGGCCCTC

SEQ ID NO：24

引物67-1H-C(5’至3’)

TGTTAGTTACGCGTTTAAAGCATGGCTCTGTGCAATGG

SEQ ID NO：25

引物67-2A-C(5’至3’)

ACGGGATCCAGGAGGAATAAATGCGAATTGGACACGGTTTTGACG

SEQ ID NO：26

引物67-2B-C(5’至3’)

TTTAGTTGGGCCCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC

SEQ ID NO：27

引物67-2C-C(5’至3’)

TACTAAGGGCCCAGGAGGAAATAATGCATAACCAGGCTCCAATTCAACG

SEQ ID NO：28

引物67-2D-C(5’至3’)

TCCGGGTACCTTATTTTTCAACCTGCTGAACGTCAATTCG

SEQ ID NO：29

引物67-2E-C(5’至3’)

AACAGGTACCAGGAGGAAATAATGCAGATCCTGTTGGCCAACC

SEQ ID NO：30

引物67-2F-C(5’至3’)

TGGATGAAGTCGACTTAATCGACTTCACGAATATCGACACGCAGC

SEQ ID NO：31

引物67-2G-C(5’至3’)

CATCAAGTCGACAGGAGGAAATAATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTG

SEQ ID NO：32

引物67-2H-C(5’至3’)

TAATGCAAGCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCG

SEQ ID NO：33

引物67-2I-C(5’至3’)

CAGTAAAGCTTAGGAGGAAATAATGGACTTTCCGCAGCAACTCG

SEQ ID NO：34

引物67-2J-C(5’至3’)

TAGTTCCATGGTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCCGC

SEQ ID NO：35

引物9-156A(5’至3’)

ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGG

SEQ ID NO：36

引物9-156B(5’至3’)

TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAG

SEQ ID NO：37

引物61-67-CPK001-G(5’至3’)

GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACT

SEQ ID NO：38

引物61-67-CPK002-G(5’至3’)

ACTGCAAAGTACACATATATCCCGGGTGTCAGCTCTTTTAGATCGG

SEQ ID NO：39

引物61-67-CPK003-G(5’至3’)

CCGATCTAAAAGAGCTGACACCCGGGATATATGTGTACTTTGCAGT

SEQ ID NO：40

引物61-67-CPK004-G(5’至3’)

GTTTAAACGGCGTCAGTCCACCAGCTAACA

SEQ ID NO：41

引物61-67-CPK005-G(5’至3’)

GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACAC

SEQ ID NO：42

引物61-67-CPK006-G(5’至3’)

AAAGATGAATTGAAAAGCTTCCCGGGTATGGACCCTGAAACCACAG

SEQ ID NO：43

引物61-67-CPK007-G(5’至3’)

CTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTT

SEQ ID NO：44

引物61-67-CPK008-G(5’至3’)

GTTTAAACCCAACAATAATAATGTCAGATC

SEQ ID NO：45

引物61-67-CPK009-G(5’至3’)

GTTTAAACTACTCAGTATATTAAGTTTCGA

SEQIDNO：46

引物61-67-CPK010-G(5’至3’)

ATCTCTCGCAAGAGTCAGACTGACTCCCGGGCGTGAATAAGCTTCGGGTGAC

CCTTATGGCATTCTTTTT

SEQ ID NO：47

引物61-67-CPK011-G(5’至3’)

AAAAAGAATGCCATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTCAGT

CTGACTCTTGCGAGAGAT

SEQ ID NO：48

引物61-67-CPK012-G(5’至3’)

GTTTAAACAATTTAGTGTCTGCGATGATGA

SEQ ID NO：49

引物61-67-CPK013-G(5’至3’)

GTTTAAACTATTGTGAGGGTCAGTTATTTC

SEQ ID NO：50

引物61-67-CPK014alt-G(5’至3’)

GCGGGGACGAGGCAAGCTAAACTTTAGTATATTCTTCGAAGAAA

SEQ ID NO：51

引物61-67-CPK015alt-G(5’至3’)

TTTCTTCGAAGAATATACTAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGC

SEQ ID NO：52

引物61-67-CPK016-G(5’至3’)

CAATCAACGTGGAGGGTAATTCTGCTAGCCTCTCCCGGGTGGATGGCGGCGTT

AGTATCG

SEQ ID NO：53

引物61-67-CPK017-G(5’至3’)

CGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAGAGGCTAGCAGAATTACCCTCCAC

GTTGATTG

SEQ ID NO：54

引物61-67-CPK018-G(5’至3’)

GTTTAAACGCCGCCGTTGTTGTTATTGTAG

SEQ ID NO：55

引物61-67-CPK019-G(5’至3’)

GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAA

SEQ ID NO：56

引物61-67-CPK020-G(5’至3’)

GGGTGACCCGGCGGGGACGAGGCAAGCTAAACGTCTTCCTTTCTCTTACCAA

AGT

SEQ ID NO：57

引物61-67-CPK021-G(5’至3’)

ACTTTGGTAAGAGAAAGGAAGACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCA

CCC

SEQ ID NO：58

引物61-67-CPK022-G(5’至3’)

AATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTCCCGGGTGGATGGCGGCGTTAGTATCG

AATCGACAGC

SEQ ID NO：59

引物61-67-CPK023-G(5’至3’)

GCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAAAGATTCTCTTTTTT

TATGATATT

SEQ ID NO：60

引物61-67-CPK024-G(5’至3’)

GTTTAAACGTGTTAACGTTTCTTTCGCCTACGTGGAAGGAGAATC

SEQ ID NO：61

引物61-67-CPK025-G(5’至3’)

TCCCCCCGGGTTAAAAAAAATCCTTGGACTAGTCA

SEQ ID NO：62

引物61-67-CPK031-G(5’至3’)

TCCCCCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAA

SEQ ID NO：63

引物61-67-CPK032-G(5’至3’)

TCCCCCCGGGTATATATATATCATTGTTAT

SEQ ID NO：64

引物61-67-CPK035-G(5’至3’)

TCCCCCCGGGAAAAGTAAGTCAAAAGGCAC

SEQ ID NO：65

引物61-67-CPK040-G(5’至3’)

TCCCCCCGGGATGGTCTGCTTAAATTTCAT

SEQ ID NO：66

引物61-67-CPK041-G(5’至3’)

TCCCCCCGGGTAGCTTGTACCCATTAAAAGAATTTTATCATGCCG

SEQ ID NO：67

引物61-67-CPK046-G(5’至3’)

TCCCCCCGGGTTTCTCATTCAAGTGGTAAC

SEQ ID NO：68

引物61-67-CPK047-G(5’至3’)

TCCCCCCGGGTAAATAAAGAAAATAAAGTT

SEQ ID NO：69

引物61-67-CPK050-G(5’至3’)

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGA

SEQ ID NO：70

引物61-67-CPK051-G(5’至3’)

TCCTAATTTCTTTTTCTGAAGCCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

SEQ ID NO：71

引物61-67-CPK052-G(5’至3’)

AGTTTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA

SEQ ID NO：72

引物61-67-CPK053-G(5’至3’)

TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGGCTGCAGACCAATTGGTGAAAACT

SEQ ID NO：73

引物61-67-CPK054-G(5’至3’)

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTT

SEQ ID NO：74

引物61-67-CPK055-G(5’至3’)

AACAAAGTTTAGTTGAGAGTTTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

SEQ ID NO：75

引物61-67-CPK056-G(5’至3’)

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCTCAGAACGTTTACATTGTAT

SEQ ID NO：76

引物61-67-CPK057-G(5’至3’)

ATACAATGTAAACGTTCTGAGACATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

SEQ ID NO：77

引物61-67-CPK058-G(5’至3’)

TGCAGAAGTTAAGAACGGTAATGACATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA

SEQ ID NO：78

引物61-67-CPK059-G(5’至3’)

TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGCA

SEQ ID NO：79

引物61-67-CPK060-G(5’至3’)

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTG

SEQ ID NO：80

引物61-67-CPK061-G(5’至3’)

CACTGAAGGCTCTCAACTCTGACATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

SEQ ID NO：81

引物61-67-CPK062-G(5’至3’)

GGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA

SEQ ID NO：82

引物61-67-CPK063-G(5’至3’)

TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGACCGTTTACACAGCATCCGTTACC

SEQ ID NO：83

引物61-67-CPK064-G(5’至3’)

AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGC

SEQ ID NO：84

引物61-67-CPK065-G(5’至3’)

GCATACTATTGTTGTCGGCAGTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

SEQ ID NO：85

引物61-67-CPK066-G(5’至3’)

GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCAC

AGGAAACAGCTATGACC

SEQ ID NO：86

引物61-67-CPK067-G(5’至3’)

TTGCGTTTTGTACTTTGGTTCGCTCAATTTTGCAGGTAGATAATCGAAAAGTT

GTAAAACGACGGCCAGT

SEQ ID NO：87

引物50-56-pw100-G(5’至3’)

GAGTGAACCTGCTGCCTGGCGTGCTCTGACTCAGTACATTTCATAGTGGATGG

CGGCGTTAGTATC

SEQ ID NO：88

引物50-56-pw101-G(5’至3’)

CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGATATCACA

ACTGTTACGA

SEQ ID NO：89

引物PW-91-079-CPK373-G(5’至3’)

TCGACTACGTCGTAAGGCCGT

SEQ ID NO：90

引物PW-91-079-CPK374-G(5’至3’)

GCATCTGTGCGGTATTTCACTATATATATTTCAAGGATATAC

SEQ ID NO：91

引物PW-91-079-CPK376-G(5’至3’)

TATGGTGCACTCTCAGTACAATCTG

SEQ ID NO：92

引物PW-91-079-CPK375-G(5’至3’)

GTATATCCTTGAAATTATATAGTGAAATACCGCACAGATGC

Claims (25)

1.燃料组合物，其包含一种混合物或可从该混合物获取，该混合物包含：

(a)柠檬烷；

(b)石油基燃料；以及

(c)燃料添加剂，

其中所述柠檬烷化合物的量为至少约11体积％且所述石油基燃料的量为至少约5体积％，这两个量均基于所述燃料组合物的总体积，且其中该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点。

2.燃料组合物，其包含一种混合物或可从该混合物获取，该混合物包含：

(a)柠檬烷；

(b)石油基燃料；

(c)燃料添加剂；以及

(d)芳香族化合物，

其中所述柠檬烷化合物的量为至少约11体积％且所述石油基燃料的量为至少约5体积％，且所述芳香族化合物的量为约15体积％至约35体积％，所有量均基于所述燃料组合物的总体积，且其中该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点。

3.喷气燃料组合物，其包含：

(a)柠檬烷；

(b)石油基燃料；以及

(c)喷气燃料添加剂，

其中所述柠檬烷化合物的量为至少约11体积％，所述石油基燃料的量为至少约5体积％，这两个量均基于所述喷气燃料组合物的总体积，且其中该燃料组合物在15℃具有约750kg/m³至约850kg/m³的密度，并具有等于或大于38℃的闪点。

4.如权利要求1-3任意一项所述的燃料组合物，其中所述柠檬烷为

或其组合。

5.如权利要求1-3任意一项所述的燃料组合物，其中基于该燃料组合物的总体积，所述柠檬烷的量为约11体积％至约15体积％。

6.如权利要求1-3任意一项所述的燃料组合物，其中基于该燃料组合物的总体积，所述柠檬烷的量为约15体积％至约80体积％。

7.如权利要求1-3任意一项所述的燃料组合物，其中基于该燃料组合物的总体积，所述柠檬烷的量为约20体积％至约75体积％。

8.如权利要求1-3任意一项所述的燃料组合物，其中基于该燃料组合物的总体积，所述柠檬烷的量为约25体积％至约75体积％。

9.如权利要求2所述的燃料组合物，其中该组合物包含对伞花烃。

10.如权利要求2所述的燃料组合物，其中基于该燃料组合物的总体积，所述芳香族化合物的量最多为约25体积％。

11.如权利要求1或2所述的燃料组合物，其中所述石油基燃料为煤油。

12.如权利要求1或2所述的燃料组合物，其中该燃料组合物在15℃具有约750kg/m³至约850kg/m³的密度。

13.如权利要求1-3任意一项所述的燃料组合物，其中所述石油基燃料为Jet A、Jet A-1或Jet B。

14.如权利要求13所述的燃料组合物，其中该燃料组合物符合对Jet A的ASTM D 1655规范。

15.如权利要求13所述的燃料组合物，其中该燃料组合物符合对Jet A-1的ASTM D 1655规范。

16.如权利要求13所述的燃料组合物，其中该燃料组合物符合对Jet B的ASTM D 1655规范。

17.权利要求3所述的喷气燃料组合物，其中该燃料添加剂为至少一种选自氧化剂、抗氧化剂、热稳定改良剂、稳定剂、低温流动性改进剂、燃烧改良剂、消泡剂、消光雾添加剂、腐蚀抑制剂、润滑性能改良剂、防冰剂、喷射器清洁添加剂、防烟剂、减阻添加剂、金属减活剂、分散剂、去污剂、破乳剂、染料、标记物、防静电剂、杀虫剂及其组合的添加剂。

18.制备燃料组合物的方法，其包括：

(a)将类异戊二烯起始原料与氢在催化剂的存在下相接触，以形成柠檬烷；并

(b)将所述柠檬烷与石油基燃料相混合，以制备所述燃料组合物；

其中所述柠檬烷化合物的量为至少约11体积％且所述石油基燃料的量为至少约5体积％，这两个量均基于所述燃料组合物的总体积，且其中该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点。

19.如权利要求18所述的方法，其中该类异戊二烯起始原料为柠檬烯、β-水芹烯、γ-松油烯、异松油烯或其组合。

20.从单糖制备燃料组合物的方法，其包括：

(c)将能够生成类异戊二烯起始原料的细胞与所述单糖在适于生成该类异戊二烯起始原料的条件下接触；

(d)将所述类异戊二烯起始原料转化为柠檬烷；以及

(c)将所述柠檬烷与石油基燃料相混合，以制备所述燃料组合物；

其中所述柠檬烷化合物的量为至少约11体积％且所述石油基燃料的量为至少约5体积％，这两个量均基于所述燃料组合物的总体积，且其中该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述类异戊二烯起始原料为柠檬烯、β-水芹烯、γ-松油烯、异松油烯或其组合。

22.通过权利要求18-21任意一项所述的方法制备的燃料组合物。

23.交通工具，其包括内燃机、与该内燃机连接的燃料箱、以及燃料箱中的燃料组合物，其中该燃料组合物为权利要求1-3任意一项所述的燃料组合物，其中所述柠檬烷化合物的量为至少约11体积％且所述石油基燃料的量为至少约5体积％，这两个量均基于该燃料组合物的总体积，且其中该燃料组合物具有等于或大于38℃的闪点，且其中该燃料组合物被用于向该内燃机提供动力。

24.向发动机提供动力的方法，其包括在所述发动机中燃烧权利要求1-3任意一项所述的燃料组合物的步骤。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述发动机为喷气发动机。

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