CN101538551A - 一种设备 - Google Patents

Abstract

一种制备未分化细胞的设备，该设备包含一种用于使更定型细胞与导致更定型细胞逆向分化为未分化细胞的试剂接触的工具。

Description

一种设备

本申请是申请日为2001年5月10日的国际申请PCT/GB01/02056于2003年1月10日进入中国、发明名称为“一种设备”的专利申请01812586.7的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种技术。更具体地，本发明涉及一种制备未分化细胞的设备。特别地，但不是专门地，本发明涉及一种从更定型细胞制备未分化细胞的设备。另一方面，本发明也涉及一种形成未分化细胞的方法。该设备也可以与生产者/销售者/制造者/呼叫中心/服务中心等进行远程联系，例如远程定购新试剂和/或证实操作正在或已经正确地进行。因此，本发明也涉及进行围绕该设备的商业的方法以及其用途，例如与生产者/销售者/制造者/呼叫中心/服务中心等进行远程联系，生产者/销售者/制造者/呼叫中心/服务中心等对该联系进行回答(例如，接收和填写定单，接收和/或处理和/或回答关于操作的数据/信息和/或其更正)。

背景技术

分化是一种过程，通过此过程细胞的结构和功能逐渐定型，以产生更特异的细胞，例如从未成熟造血前体形成T细胞或B细胞。因此，当细胞变得更定型时，它们变得更特异。在大多数细胞类型中，细胞分化是导致最终分化细胞的单一途径的方法。然而，尽管一些细胞类型在整个生命周期中保持不分裂，并且不被替代，许多细胞类型在生物体的整个生命周期中持续分裂，并且进行更新。这可能是简单分裂(如肝细胞)，或者如同在造血细胞和上皮细胞中那样，是由相对未分化的干细胞进行分裂，然后由子代细胞之一进行随后的不可逆分化。然而，所有这些过程有一个共同特征：细胞或者维持其分化状态，或者变得更分化。它们不会变成未分化或甚至更不分化。

逆向分化(retrodifferentiation)是一种过程，通过该过程细胞的结构和功能逐渐改变，以产生较不特异的细胞。一些细胞反应于组织损伤而在体内天然进行有限的逆向分化。例如，已经观察到在肝退化时，肝细胞恢复为与胎儿酶模式相似的酶表达模式(Curtin andSnell，1983，Br.J.Cancer，Vol.48；495-505)。

WO96/23870中表明了可以对分化细胞进行处理，以便是它们成为未分化细胞，包括干细胞。这些未分化细胞可以增殖，产生同一细胞系或任何其它细胞系的逆向分化后代。对于逆向分化的造血细胞，这些干细胞是多能的，它们可以产生多个细胞系。WO96/23870中的这一开创性发现是完全未预料到的。

该发现的临床意义是巨大的。对于人类患者来说，干细胞极难获得。它们一般是从脐带组织、骨髓或血液中获得，在这些部位它们的存在量很小。然而，本发明提供了一种从更定型细胞产生干细胞的设备，特别是通过逆向分化的过程产生干细胞的设备。

US 6,087,168公开了一种将上皮细胞转分化为神经元细胞的方法，其中用适当的培养基将上皮细胞去分化或逆向分化。同样Lake JAet al Journal of Cell Science 113，556-566(2000)和Rathjen Jet al Journal of Cell Science 112，601-612(1999)公开了将胚胎干(ES)细胞逆向分化为早期原始外胚层样(EPL)细胞，这是反应于两种可分离的因子而导致的。

发明内容

在更宽的方面，提供了一种制备未分化细胞的设备，其中该设备包含允许更定型细胞逆向分化为未分化细胞的工具(means)。

先有技术文件(如US 6,087,168，Lake et al或Rathjen et al)都没有公开适用于制备未分化细胞的设备。尽管制备未分化细胞可以由本领域技术人员不使用本发明的设备而完成，每次进行该程序得到的终产品容易不一致，并且该结果取决于进行该程序的人的技术和经验。此外，人工制备未分化细胞所要求的“加工”时间很长，因此对于实验室来说不是经济的。

在一个特定实施方案中，提供了一种在包含定型细胞的细胞群中形成未分化细胞和/或增加未分化细胞的相对数目的设备，该设备包含一个腔室(chamber)，将包含定型细胞的细胞群引入所述腔室的工具，将可以使定型细胞逆向分化为未分化细胞的逆向分化工具引入所述腔室的工具，以及在所述逆向分化工具存在的条件下孵育所述定型细胞的孵育工具，从而使定型细胞逆向分化为未分化细胞。

在另一特定实施方案中，提供了一种在包含定型细胞的细胞群中形成未分化细胞和/或增加未分化细胞的相对数目的设备，该设备包含一个腔室，将包含定型细胞的细胞群引入所述腔室的工具，将导致定型细胞逆向分化为未分化细胞的试剂引入所述腔室的工具，以及孵育所述试剂和所述定型细胞的孵育工具，从而使定型细胞逆向分化为未分化细胞。

优选地，该试剂涉及(engage)介导定型细胞表面抗原的捕获、识别或呈递的受体。更优选地，该受体是MHC I类抗原或MHC II类抗原，如选自人白细胞相关(HLA)-A受体、HLA-B受体、HLA-C受体、HLA-E受体、HLA-F受体、或HLA-G受体的MHC I类抗原或选自HLA-DM受体、HLA-DP受体、HLA-DQ受体或HLA-DR受体的MHC II类抗原。

适当地，该受体可以含有具有同源区域的β链。优选地，该受体可以至少含有HLA-DR的β链的同源区。

一般地，定型细胞是分化细胞。优选地，定型细胞是定型的造血细胞，优选选自T细胞集落形成细胞(CFC-T细胞)、B细胞集落形成细胞(CFC-B细胞)、嗜酸性细胞集落形成细胞(CFC-Eosin细胞)、嗜碱性细胞集落形成细胞(CFC-Bas细胞)、粒细胞/单核细胞集落形成细胞(CFC-GM细胞)、巨核细胞集落形成细胞(CFC-MEG细胞)、红细胞爆裂型集落形成细胞(BFC-E细胞)、红细胞集落形成细胞(CFC-E细胞)、T细胞和B细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，更定型细胞不是癌细胞。在本发明的另一优选实施方案中，该试剂既不是致癌的，也不能促进癌生长。

在一个优选实施方案中，该试剂是受体的抗体，如受体的单克隆抗体。特殊的例子包括CR3/43和TAL.1B5单克隆抗体。

在一个优选实施方案中，该试剂调节MHC基因表达。适当地，该试剂可以调节MHC I类⁺和/或MHC II类⁺表达。

该试剂优选与生物反应调节剂，如烷化剂联合使用，例如是或包含环磷酰胺的烷化剂。

优选的未分化细胞包含干细胞抗原。在一个优选的实施方案中，未分化细胞选自胚胎干细胞、多能干细胞、淋巴样干细胞、造血干细胞、神经元干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、和髓细胞样干细胞。优选地，未分化细胞的特征在于以下一种或多种细胞表面标记符号：CD34⁺，HLA-DR^-，CD38^-，CD117，AC133，CD90和/或低CD45(CD45low)。更优选地，未分化细胞为CD34⁺和CD38^-，甚至更优选为CD34⁺，CD38，HLA-DR^-和低CD45。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，本发明也提供了一种在包含定型细胞的细胞群中增加具有细胞表面标记符号CD34⁺和/或CD38^-和/或HLA-DR^-和/或低CD45和/或CD90和/或CD117和/或AC133的细胞的相对数目的设备，该设备包含：

(i)一个腔室，

(ii)将包含定型细胞的细胞群引入所述腔室的工具

(iii)将可操作性涉及所述定型细胞的试剂引入所述腔室的工具；和

(iv)可操作性孵育由所述试剂涉及的所述定型细胞的孵育工具，使得由于所述涉及而增加CD34⁺和/或CD38^-和/或HLA-DR^-和/或低CD45和/或CD90和/或CD117和/或AC133细胞的相对数目。

本发明的设备可以任选地进一步包含富集所述未分化细胞、去除该试剂、和/或从改变的细胞群中回收所述未分化细胞的纯化和分离工具。优选地，纯化工具包含鉴定存在于未分化细胞表面的细胞表面标记或存在于定型细胞表面但基本不存在于未分化细胞表面的细胞表面标记。适当地，纯化工具可以利用例如抗细胞表面标记的抗体。适当的标记的例子包括CD34，CD45和HLA-DR。仅仅是举例说明，适当的纯化工具是CliniMACs/Isolex CD34+纯化系统。在本发明的另一优选实施方案中，这种纯化或分离工具可以任选地作为独立的工具提供。

本发明的设备可以任选地进一步包含上游负选择和/或细胞富集工具。另外，可以在插入所述设备之前任选对细胞群进行负选择和/或细胞富集。

在另一优选实施方案中，本发明的未分化细胞是CD34^-CD45^-和没有造血细胞系标记的细胞。

更分化的细胞可以与原始的定型细胞同系或不同系。

因此，除了产生未分化细胞，本发明的设备可用于将一个系的细胞转化为另一个系的细胞。

因此，本发明的另一方面提供了将包含一种造血系的定型造血细胞的细胞群诱导为另一造血系的细胞的设备，该设备包含

(i)一个腔室，

(ii)将包含定型细胞的细胞群引入所述腔室的工具

(iii)将可操作性涉及所述定型造血细胞表面的抗原的捕获、识别或呈递的试剂引入所述腔室的工具；和

(iv)可操作性孵育由所述试剂涉及的所述定型细胞的孵育工具，使得它们由于所述涉及而成为另一种造血系的细胞。

优选地，所述定型的造血细胞属于B细胞系，并且成为选自T细胞系和髓细胞系的另一种造血系的细胞。

由本发明的设备产生的未分化细胞可以用于制造治疗免疫紊乱或疾病的药物。同样，根据本发明的方法产生的定型细胞可以用于制造治疗免疫紊乱或疾病的药物。

本发明是高度有益的，因为现在可以轻易从更定型细胞中制备未分化细胞，然后用这些未分化细胞体内或体外，或二者结合制备药物，以便治疗疾病。

本发明的另一优点是它也可以用该设备将由逆向分化而制备的未分化细胞定型为重新定型的细胞，如的新分化细胞，其目的为纠正或去除原来的更定型细胞或纠正或去除其产物。例如，可以用未分化细胞产生重新定型的细胞如覆盖肺泡的细胞，由此可以替代或修复破坏肺组织或使其致病的机制(见Le Page，New Scientist 19 December2000，p20)。

名词“重新定型的细胞”表示来源于未分化细胞的细胞，即新的更定型细胞。“更定型的”表示更分化的，因此可以根据已知细胞分化途径和阶段而确定。

大多数未分化细胞和分化细胞包含主要组织相容型复合物(MHC)I类抗原和/或II类抗原。如果这些抗原与那些细胞结合，那么它们称作I类⁺和II类⁺细胞。优选地，更定型细胞可以再分化为MHC I类⁺和/或MHC II类⁺未分化细胞。

优选地，更定型细胞可以逆向分化为包含干细胞抗原的未分化细胞。

优选地，更定型细胞可以逆向分化为CD34⁺未分化细胞。

优选地，更定型细胞可以逆向分化为淋巴造血祖细胞。

优选地，更定型细胞可以逆向分化为多能干细胞。

优选地，所述增加在24小时内，优选4-8小时内发生(这样任何改变不能完全被细胞增殖所解释)。

一般地，未分化细胞数目改变的测定是通过监测具有未分化细胞的特征性细胞表面标记的细胞的数目改变而进行的。适当的细胞表面标记的例子包括CD34⁺，HLA-DR^-，CD38^-，CD117，AC133，CD90和/或低CD45。作为选择或补充，可以监测具有分化细胞而不是未分化细胞的特征性细胞表面标记的细胞的数目的减少。

适当地，本发明的设备可以任选地进一步包含监测具有未分化细胞的特征性细胞表面标记的细胞的数目改变的跟踪工具。

用于测定的优选定型细胞为定型的造血细胞，如选自CFC-T细胞，CFC-B细胞，CFC-Eosin细胞，CFC-Bas细胞，CFC-GM细胞，CFC-MEG细胞，BFC-E细胞，CFC-E细胞，T细胞和B细胞，更优选B细胞的细胞。

本发明的设备优选进一步包含一种或更多、优选两种或更多、更优选三种或更多、更优选四种或更多以下特征：

(i)测量细胞群体积的测量工具，

(ii)进行细胞计数并由此测量细胞群的细胞浓度的计数工具(如必要时进行了微型化的库尔特计数器或其它适当的细胞计数器)，

(iii)将一定量(如预定量)的细胞群从储存容器转移到腔室中的转移工具，该转移工具可以任选包含例如泵，

(iv)计算加入到腔室中的试剂的体积的计算工具，该试剂的体积取决于细胞群的体积和细胞浓度，

(v)将一定体积(如计算的体积)的试剂转移到腔室中的另一种转移工具，该另一种转移工具可以任选包含例如由步进电机等电机驱动的注射器，

(vi)用于控制腔室中二氧化碳浓度的二氧化碳控制工具(例如作为孵育工具的一部分)，

(vii)用于控制腔室中温度的温度控制工具(例如作为孵育工具的一部分)，

(viii)用于混合腔室中的细胞群和试剂的混合工具(例如作为孵育工具的一部分)，

(ix)用于对孵育阶段进行计时的计时工具(例如作为孵育工具的一部分)，以及任选的用于向用户显示剩余时间的显示工具和/或提醒用户孵育阶段完成的提醒工具，

(x)用于从腔室中收获细胞，特别是从腔室中收获未分化细胞的收获工具，

(xi)从腔室中取出包含未分化细胞的细胞群至储存容器中的取出工具，取出工具可以包含，例如泵；和

(xii)密封储存容器的密封工具，其中含有包含未分化细胞的细胞群。

适当地，在本发明的设备中，转移工具(iii)可以将一定量(如预定量)的细胞群直接从患者转移到所述腔室(即不需要储存容器)和/或取出工具(xi)可以从腔室中直接取出包含未分化细胞的细胞群至患者(即不需要储存容器)。

适当地，转移工具(iii)可以包含蠕动泵，该泵通过互联工具如管道将细胞群从储存容器中转移到腔室中。互联工具优选经过库尔特计数器或其它适当的细胞计数器(如(ii)中提到的)。以这种方式，可以在将细胞群从储存容器转移到腔室的过程中对细胞群的细胞浓度进行计算。

优选地，以上(iii)和(xi)提到的储存容器是储存袋，最好是一次性的。(iii)的储存容器优选与(xi)的储存容器优选不同，前者为输入储存容器，后者为输出储存容器。

优选地，另一种转移工具(v)包含一种试剂的储液器，以便保证任何时候都有足够的试剂。当转移工具为注射器时，可以用另一注射器提供储液器，这样当一个注射器排空时，另一注射器开始供应试剂。

优选地，用于控制腔室中二氧化碳浓度的二氧化碳控制工具包含一个阀门，它允许从气瓶中引入预定量的二氧化碳。预定量的二氧化碳是用腔室、管道和输出储存容器中的已知空气体积和输入储存容器的细胞群的测量体积计算的。适当地，通过一个端口将二氧化碳引入腔室中，该端口与加入试剂所通过的端口相同，通过这种方式，二氧化碳可以用于将所有剩余的试剂输送至端口以及周围的装备。除上述以外，二氧化碳控制工具可以进一步含有可充气的气囊，以容纳由将额外的二氧化碳引入系统而产生的多余气体体积。另外，输入储存容器一旦排空，就可以作为气囊。优选地，引入的二氧化碳在腔室中产生的终浓度为5％。

温度控制工具(vii)可以适当地包含加热工具，该加热工具可以通过例如位于腔室之下的热板提供。另外，加热工具可以通过邻近于腔室或其一部分的热水套提供。作为参考，腔室中的温度控制在约25℃-约37℃。

混合工具(viii)优选包含至少一个叶片式臂，它缓慢旋转以混合细胞群和腔室中的试剂。也可选择使用磁搅拌器。作为另一种选择，可以对腔室进行机械搅拌，例如通过平缓摇动。使用包含至少一个叶片式臂的混合工具的一个优点是该臂也可被设计作为细胞收获过程中的刮器，即当该臂缓慢旋转时，附着于腔室表面的细胞被轻轻去除。有利地，该混合工具可以操作性实现回旋运动。

取出工具(xi)优选包含一个蠕动泵。有利地，取出工具通过在腔室底部的输出端口拉出包含未分化细胞的细胞群，并通过互联工具，例如管道进入输出储存容器。

作为取出工具的选择或补充，可以在取出细胞群之前向腔室中加入游离离子掩蔽剂和/或螯合剂，例如EDTA等抗凝剂。向腔室中加入这种离子掩蔽剂和/或螯合剂导致干细胞集落分散为单个细胞的悬浮液，并因此促进通过冲洗工具从腔室中取出细胞。

密封工具(xii)优选包含一个热密封器，该热密封器对输出储存容器的关闭是通过将容器的两部分压在一起，或将位于该容器之前的互联工具的两部分压在一起，直到完全密封。例如，热密封器可能产生约2cm宽的封条，热密封器然后在其中间部分切断封条。

本发明的每一部分优选可以独立通过中央计算机系统控制。有利地，计算机系统可以从该设备的一部分接收输入信号，根据这些输入信号实现计算，并将输出信号发送到该设备的相同或另一部分。

本发明的设备具有一些优点，特别是该设备保证了每次执行程序时获得了一致的结果，并且不浪费昂贵的试剂。此外，可以对该设备进行编程，以便在逆向分化结束时提醒用户和/或在完成前显示时间剩余。如果对其编程以进行该任务，该设备可以促使用户购买新试剂。这就是说，该设备可以监测试剂的使用和储备量，因此当储备的试剂减少至临界值以下时促使用户购买。

本发明的设备可以进一步包含多个腔室，每一个用于产生定型为不同细胞系，如肌肉、毛发、神经元等的未分化细胞。这样，可以同时产生定型为不同细胞系的未分化细胞。优选地，当使用多个腔室时，每个腔室有独立的输出端口以及独立的输出储存容器。

可以通过对每个腔室使用不同处理的塑料(plastics)或向每个腔室中加入不同的化学物质而在本发明的设备中控制细胞系。

该设备的一种或多种成分优选是一次性的。例如，以下一种或多种成分可以是一次性的：腔室、输入储存容器、输出储存容器、连接储存容器与腔室的互联工具、以及转移工具(v)。适当地，一次性成分可以作为模块(cartridge)用于插入该设备。仅仅是作为举例说明，模块可以包含第一个血袋(输入储存容器)，一个腔室和第二个(输出)血袋，其中腔室通过管道(互联工具)与第一个和第二个血袋的每一个连接。适当地，该设备可以被认为是一种部分固定和部分一次性的系统。

优选地，与细胞群接触的设备的腔室和/或其他成分是用USP VI类材料、聚碳酸酯斑片或其他不能产生其他形式的细胞转化体的塑料。

优选包含的细胞群为血液。优选的试剂为抗体。

另一方面，本分明提供了一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将更定型细胞逆向分化为未分化的细胞，其中更定型细胞的逆向分化发生于血块黄层(buffy coat)血样中的或来自于血块黄层血样的更定型细胞。

另一方面，本分明提供了一种制备未分化细胞的方法，该方法包括使血块黄层血样中的或来自于血块黄层血样的更定型细胞与导致更定型细胞逆向分化为未分化细胞的试剂接触。

在本分明的一种优选实施方案中，更定型细胞不是癌细胞。在本分明的另一种优选实施方案中，该试剂不是致癌的，也不能促进癌生长。

定型的细胞优选是分化的。定型的细胞优选是定型的造血细胞，如选自CFC-T细胞，CFC-B细胞，CFC-Eosin细胞，CFC-Bas细胞，CFC-GM细胞，CFC-MEG细胞，BFC-E细胞，CFC-E细胞，T细胞和B细胞，更优选B细胞。

未分化细胞优选选自多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞。优选地，未分化干细胞的特征在于以下一种或多种细胞表面标记符号CD34⁺，HLA-DR^-，CD38^-，CD117，AC133，CD90和/或低CD45。更优选地，未分化细胞为CD34⁺和CD38^-，甚至更优选为CD34⁺，CD38^-，HLA-DR^-和低CD45。

适当地，未分化细胞为MHC I类⁺和/或MHC II类⁺细胞。

所述试剂优选涉及介导定型细胞表面抗原的捕获、识别或呈递的受体。更优选地，该受体为MHC I类抗原或MHC II类抗原，如选自人类白细胞相关(HLA)-A受体、HLA-B受体、HLA-C受体、HLA-E受体、HLA-F受体或HLA-G受体的I类抗原或选自HLA-DM受体、HLA-DP受体、HLA-DQ受体或HLA-DR受体的II类抗原。

适当地，该受体可以包含具有同源区的β链。在一种实施方案中，该受体至少可以包含HLA-DRβ链的同源区。

在一个优选实施方案中，该试剂为受体的抗体，如受体的单克隆抗体。具体的例子包括CR3/43和单克隆抗体TAL.1B5。

适当地，该试剂可以调节MHC基因表达，例如MHC I类⁺和/或MHCII类⁺表达。

在本分明的另一优选实施方案中，提供了一种增加血块黄层血样中具有细胞表面标记符号CD34⁺和/或HLA-DR^-和/或CD38^-和/或CD117和/或AC133和/或CD90和/或低CD45的细胞的相对数目的方法，该方法包括使血块黄层血样中的更定型细胞与可操作性涉及该定型细胞的试剂接触，这种涉及导致CD34⁺和/或HLA-DR^-和/或CD38^-和/或CD117和/或AC133和/或CD90和/或低CD45细胞的相对数目增加。

另一方面，本分明提供了一种制备未分化细胞的方法，该方法包括使细胞群中的一种或多种分化细胞与有效转换所述细胞群中的正常分化细胞比例的逆向分化工具接触，由此导致一种或多种所述分化细胞逆向分化为未分化细胞。

另一方面，本分明提供了转换细胞群中的正常分化细胞比例的逆向分化工具实现将一种或多种所述分化细胞逆向分化为未分化细胞的用途。

另一方面，本分明提供了一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的分化细胞逆向分化为未分化细胞，其中包含含有一种或多种分化细胞的细胞群的环境从第一种环境改变为第二种环境，其中所述第二种环境的游离离子浓度与第一种环境相比进行了有效修饰，由此导致一种或多种所述分化细胞逆向分化为未分化细胞。

另一方面。本分明提供了一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的一种或多种分化细胞与有效转换正常分化细胞比例的逆向分化工具接触，在不含离子或离子被掩蔽的第一种环境中培养细胞群，并将第一种环境改变为第二种环境，其中第二种环境中存在的离子浓度与第一种环境相比进行了有效修饰，由此导致一种或多种所述分化细胞逆向分化为未分化细胞。

优选逆向分化工具是任何导致细胞群中正常分化细胞的比例破坏的工具，此处称为细胞群内的负选择，由此导致细胞群中正常分化细胞的比例的破坏。

逆向分化工具可以是，例如，以下的任意一种或多种：抗体(纯的和偶联的(即结合于固定的和游离的配体，如磁性、玻璃或聚苯乙烯珠)；Histopaque，LymphoPrep(Sigma))或其他用于根据细胞密度分离细胞的任意密度梯度培养基；或右旋糖苷(例如导致红细胞沉淀)。其他导致细胞转换的适当工具见Vettese-Dadey(The Scientist，Sep 13 1999，13(18)：21)。

第二种环境中的游离离子浓度与第一种环境相比有所增加。

更优选地，第一与第二种环境的相对游离离子浓度增加，即第二种环境的游离离子浓度增加。优选地，相对游离离子浓度的增加足够导致一种或多种分化细胞逆向分化为未分化细胞。仅仅作为举例说明，将细胞从含有5mM EDTA(一种游离离子掩蔽剂和/或螯合剂)的培养基转移至含有更少或不含EDTA的另一种培养基中，导致游离离子浓度(如钙离子浓度)的增加，该增加足以导致逆向分化。

优选游离离子为阳离子。

优选游离离子为I族或II族金属。

优选阳离子为钙离子和/或镁离子。

适当地，环境的游离离子浓度可以通过用能够相对改变环境中游离离子浓度的试剂处理而进行修饰。

因此，在一种优选实施方案中，本分明提供了一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的分化细胞逆向分化为未分化细胞，其中含有该细胞群的环境通过用能够相对改变环境中游离离子浓度的试剂处理而进行修饰，从而实现第二种环境。

例如，第一种环境可以用一种或多种游离离子掩蔽剂处理，随后将其去除或减少，由此实现具有相对增加的游离离子浓度的第二种环境，从而实现细胞群中的一种或多种分化细胞的逆向分化。这就是说，例如可以通过以下方式去除或减少掩蔽剂：通过物理或化学方法从第一种环境中去除掩蔽剂或掩蔽剂的一部分，或者将细胞群转移到没有这种游离离子掩蔽剂或与第一种环境相比游离离子掩蔽剂浓度较低的第二种环境。

在任何情况下，第二种环境的游离离子浓度与第一种环境相比有所增加，从而实现了细胞群中的一种或多种分化细胞的逆向分化。

作为选择，可以在含有低浓度游离离子或不含游离离子的第一种环境中培养细胞群，然后将细胞群转移到第二种环境，或调节第一种环境，使其成为第二种环境，所述第二种环境含离子，或与第一种环境相比，离子浓度更高，从而实现了细胞群中的一种或多种分化细胞的逆向分化。此处用到的术语“低”包括与第二种环境的终浓度相比，具有相对低的游离离子起始浓度的环境。

因此，在一种优选实施方案中，本分明提供了一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的分化细胞逆向分化为未分化细胞，其中含有所述包含一种或多种分化细胞的细胞群的环境从没有游离钙离子或镁离子或钙离子或镁离子浓度低的第一种环境改变为第二种环境，所述第二种环境含钙离子或镁离子，或与第一种环境相比，钙离子或镁离子浓度更高，从而实现了细胞群中的一种或多种分化细胞的逆向分化。

不希望受到理论的限制，认为离子浓度的改变，特别是离子浓度的增加导致细胞群中的细胞聚集为集落(例如，进行同型聚集)，这些细胞间的物理接触可以诱导它们逆向分化。

掩蔽剂优选为离子螯合剂。

掩蔽剂优选同时包含胺和羧基。

优选地，掩蔽剂包含多个-N(CH₂CO₂H)_n基团，其中n＝1或n＝2。

适当地，掩蔽剂可以选自以下一种或多种：EDTA，肝素，EGTA，DTPA，柠檬酸三钠和其他相似的螯合剂和/或抗凝剂。

适当地，可以加入足够高浓度的掩蔽剂，使得对其进行去除可以导致逆向分化。一般地，对其进行去除后足够导致逆向分化的掩蔽剂的浓度为大于或等于约2mM。

在本分明的一种优选实施方案中，更定型细胞不是癌细胞。在另一种优选实施方案中，该试剂既不是致癌的，也不能促进癌细胞生长。

定型的细胞优选是分化的。定型的细胞优选是定型的造血细胞，如选自CFC-T细胞，CFC-B细胞，CFC-Eosin细胞，CFC-Bas细胞，CFC-GM细胞，CFC-MEG细胞，BFC-E细胞，CFC-E细胞，T细胞和B细胞，更优选B细胞。

未分化细胞优选选自多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞。优选地，未分化细胞的特征在于以下一种或多种细胞表面标记符号CD34⁺，HLA-DR^-，CD38^-，CD117，AC133，CD90和/或低CD45。更优选地，未分化细胞为CD34⁺和CD38^-，甚至更优选为CD34⁺，CD38^-，HLA-DR^-和低CD45。

另一方面，本分明提供了一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的分化细胞逆向分化为未分化细胞，其中包含所述含有一种或多种分化细胞的环境从第一种环境改变为第二种环境，其中所述第二种环境的游离离子浓度与第一种环境相比进行了有效修饰，由此导致一种或多种所述分化细胞逆向分化为未分化细胞。

适当地，未分化细胞为MHC I类⁺和/或MHC II类⁺细胞。

在一种实施方案中，包含定型细胞的细胞群为血块黄层血样中或来自于血块黄层血样。

有利地，可以用本分明的一种方法有效培养红细胞祖细胞，以产生红细胞，该红细胞可以用于例如补充血液供应中的短缺。适当地，本分明的一种方法可以用于产生用于血小板产生中的巨核细胞。

为了使本分明可以被清楚的理解并容易实施，将参考以下附图作为举例。

图1表示本分明设备的透视图，其前面板打开，插图表示脱离其环境的设备的切面图；

图2表示图1的设备的透视图，其前面板关闭；

图3表示血细胞的照片；

图4表示LSCs分化形成T细胞和B细胞的图表；

图5表示MSCs分化形成嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、巨核细胞、单核细胞、红细胞、粒细胞、肥大细胞、NK细胞和淋巴细胞；

图6表示淋巴造血祖细胞。

图7表示用CR3143抗体处理后CD45^-CD14^-细胞的外观；

图8表示分化B细胞的显微镜照片；

图9表示由B细胞逆向分化形成的未分化细胞的显微镜照片；

图10表示与图9同样的未分化细胞的显微镜照片；但放大倍数较低；

图11表示分化B细胞的显微镜照片；

图12表示由B细胞逆向分化形成的未分化细胞的显微镜照片；

图13表示从与图12相同的未分化细胞形成分化粒细胞的显微镜照片；

图14表示从BCLL患者得到的未处理血样的两张不同放大倍数的显微镜照片；

图15表示经处理的血样的显微镜照片；

图16和17表示在处理血样过程中时间推移显微镜照片；

图18表示DNA印迹；

图19表示用B-CLL患者的外周血细胞获得的另一种DNA印迹；

图20表示用三种试剂增加细胞群中CD34⁺细胞的相对数目；

图21表示用反相亮视野显微镜观察的干细胞集落测定；

图22表示用反相亮视野显微镜观察的贴壁细胞；和

图23表示用CR3/43mab处理B细胞过程中时间延迟录像得到的两张静止图像。

发明详述

I设备

该设备用参考号1进行整体描述，包含一个具有前面板3的外壳2，前面板3可以打开，允许达到设备1的内部。支持钩5上挂有一个输入储存容器，即血袋4。支持钩5形成了一种电平衡(未显示)，可以进行操作，用于对血袋4称重。

该设备进一步包含一个腔室6，该腔室6与输入血袋4通过管道7互联。管道7包含一个透明窗8，该窗位于库尔特计数器流路池内。可以对一个蠕动泵(未示出)进行操作，从输入血袋4拉出血液，经计数器流路池9进入腔室6。

注射器10和11含有抗原，都是用步进电机(未示出)进行驱动。注射器10、11持续维持在4℃的可锁的绝缘帕耳贴“冰箱”12中。提供了两个注射器10和11是为了保证该设备总是具有足够的血供。使用抗生素和一次性的0.2μm滤膜(一般成为参考号13)保持注射器10和11的无菌性。

该设备还包含一个二氧化碳入口14，它指导二氧化碳从气瓶(未示出)中通过管道15进入腔室6。注射器10和11也与腔室6通过管道15形成流体联通状态。阀门16控制二氧化碳和抗原流通经过管道15。加热工具(未示出)在腔室6下面。在腔室6中有一个可旋转的叶片17，可以操作将抗体和血液在腔室6中混合。当抗体和血液剩余在腔室6中时，计时工具(未示出)监测孵育时间。孵育剩余时间可以显示在控制面板显示器18上。

输出储存容器，即输出血袋19也挂在设备1中，并通过管道20与腔室6互联。管道20经过热密封器21，它可以经操作而密封管道20，由此密封输出血袋19。提供了另一个蠕动泵(未示出)，用于将腔室6的内容泵入输出血袋19。

腔室6和管道7、20和输出血袋19是一次性的物品，在每个程序后可以丢弃。

在操作中，用户将输出血袋19、腔室6和管道7、20插入设备1。管道20经过热密封器21和蠕动泵。管道7经过另一蠕动泵和库尔特计数器流路池9。用户也插入含有病人血样的血袋4并将其附着于管道7。除了上述以外，用户将腔室6的管道15附着于无菌滤膜13。然后用户关闭外壳2的前面板3，并用该设备的键盘启动设备1。

设备1自动称量输入血袋4。输入血袋4的重量自动发送到位于设备1中的中央计算系统(未示出)。根据输入血袋4的重量，计算系统可以确定设备1的血液体积。然后蠕动泵将血液经过管道7从输入血袋4中拉出。血液流经管道7的透明窗，库尔特计数器9确定通过管道7的细胞浓度。库尔特计数器直接将信号发送至中央计算系统。中央计算系统从计算的血液体积和细胞浓度确定需要通过注射器10、11中的一个或多个注射至腔室6中的抗体的正确体积。蠕动泵继续从血袋4中泵出血液，直到从中央计算系统接收到信号，该信号使泵停止。从中央计算系统发出的信号反应于从库尔特计数器9发送到中央计算系统的信号，当库尔特计数器9感觉到没有细胞再经过窗口8时发出该信号。

中央计算系统然后向附着于注射器10、11的步进电机(未示出)发出信号，使注射器10、11中的一个或多个通过管道15向腔室6中递送计算体积的抗体。

然后选择性通过打开阀门16从二氧化碳入口14引入二氧化碳(阀门16的开关机制可以通过中央计算系统控制)。加入的二氧化碳量由中央计算系统根据已知的腔室6、管道7、20和输出血袋19中的体积以及从输入血袋计算得到的血液体积进行计算。腔室6中的二氧化碳终浓度控制为约5％。通过管道15将二氧化碳引入腔室6。然后将二氧化碳吹过管道15中的任何剩余抗体，保证所有释放的抗体被加入腔室6。一旦输入血袋4排空，就成为气囊，用于容纳二氧化碳引入后额外的气体体积。

该设备可以进一步包含一个在中央计算系统控制下的加热器(未示出)，该加热器位于腔室6下面，将腔室6的温度控制在25-37℃。与加热器连接的恒温器防止过度加热或加热不足。

然后将血液和抗体试剂在腔室中孵育一段预定的时间。适当地，孵育时间不超过24小时，优选4-8小时。选择的时间应该足够允许发生逆向分化。

在孵育期间，叶片式臂17缓慢旋转，以便混合抗体和血液。

当完成孵育后，叶片式臂17继续旋转，并作为刮器臂，去除附着于腔室6表面的细胞并因此促进细胞的收获。蠕动泵将腔室6的内容物(即含有未分化细胞，即干细胞的血液)从腔室6的底部拉出，使其进入输出血袋19。该泵继续泵出，直到测量体积的血液(通过使用校准的蠕动泵确定)进入了输出血袋19。

最后，热密封器21夹住管道20，使管道20的一段约2cm的长度被密封，然后密封器21在密封处的大约中间位置切断管道20。

然后设备1可以提醒用户该过程完成。

然后用户可以取出输出血袋19。可以弃去腔室6、管道7、20和输入血袋4。

如果需要，输出血袋19可以被转移至一个纯化系统中，例如用于鉴定具有未分化细胞的特征性细胞表面标记的细胞的系统，尽管外形改变也可以用作指示。可以用纯化系统去除抗体试剂和/或也可以任选富集未分化(干)细胞。适当的纯化系统是CliniMACs/Isolex系统。

II.未分化细胞和分化细胞

体内由许多未分化细胞和分化细胞，本领域有许多关于它们的普通教导。

关于造血细胞系，可以参考例如，但不限于Levitt andMertelsman 1995(Haematopoietic Stem Cells，published byMarcel Dekker Inc-especially pages 45-59)and Roitt et al.(Immunology，4th Edition，Eds.Roitt，Brostoff and Male 1996，Publ.Mosby-especially Chapter 10)。

未分化细胞是一种不成熟细胞，它不表现成熟的分化特征，但可以产生表现成熟的分化特征的后代。未分化细胞的一个众所周知的例子是干细胞。

干细胞是一种未分化的不成熟细胞，能够自我更新(无限制分裂)和分化(特化)。发育中的胚胎有许多未成熟细胞；然而，在发育过程中它们的数目不断减少。相反，成体生物含有有限数量的干细胞，局限于某些体腔中。

一般认为干细胞是单能的、双能的或多能的。

单能和双能干细胞在发育中更受限制，并分别产生一种或两种类型的特异细胞。相反，多能干细胞(PSCs)可以分化成许多不同类型的细胞，产生组织(由其构成器官)或在全能干细胞的情况下，形成整个生物体。

多能干细胞与单能或双能干细胞不同，它可以进行多系分化，产生由不同类型或细胞系的细胞集合组成的组织。

造血干细胞是存在于髓细胞中的多能干细胞的一个例子，它可以产生各种血细胞(包括白细胞和红细胞)。

血液是一种组织液，含有淋巴细胞(Ly)、单核细胞(Mo)、中性粒细胞(Ne)、嗜碱性粒细胞(Ba)、嗜酸性粒细胞(Eso)、血小板(PI)和红细胞(Rbc)，见图3。特化的组织由造血干细胞(Hsc)的分化产生。总的说来，白细胞抵抗感染(在大循环中)，而红细胞(在小循环中)在身体中运输营养物、氧和废物。

以前，造血干细胞通过从(i)骨髓、(ii)转移生长因子的外周血或(iii)脐带血(胎盘)中分离而提取造血干细胞。最近，已经从胚胎干(ES)细胞制备了造血干细胞，它们用体外受精技术从胚胎提取。这些未分化细胞可以多系分化和重建所有身体组织，即，是多能的。

上面提到的提取方法是麻烦的，有时是危险的，并且在某些情况下被争论为不符合伦理，特别是在胚胎干细胞提取方法中。

有许多造血细胞系的未分化干细胞。这些包括多能干细胞(PSCs)、淋巴样干细胞(LSCs)和髓细胞样干细胞(MSCs)，集中称作淋巴造血祖细胞(LPCs)。

LSCs和MSCs都是由PSCs的分化形成。因此，LSCs和MSCs比PSCs更定型。

造血系的未分化细胞包括T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、巨核细胞、单核细胞、红细胞、粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞；

T细胞和B细胞由LSCs的分化形成。所以，T细胞和B细胞比LSCs更定型。更具体地，分化链为LSC→原B细胞(pro-B-cell)或前胸腺细胞。原B细胞→前B细胞(pre-B-cell)→成熟B细胞→浆细胞。前胸腺细胞→普通胸腺细胞→成熟胸腺细胞(辅助/诱导或细胞毒/抑制细胞系)-见图4。

嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、巨核细胞、单核细胞、红细胞、粒细胞、肥大细胞、NK细胞和淋巴细胞由MSCs的分化形成。所以，这些细胞中的每一种都比MSCs更定型。更具体地说，分化链为MSC→未成熟成巨核细胞(→成巨核细胞→巨核细胞→血小板)或前成红细胞(→成红细胞→网状细胞→红细胞)或髓细胞单核细胞干细胞，即分化成原粒细胞(→早幼粒细胞→中幼粒细胞→粒细胞)或成单核细胞(→幼单核细胞→单核细胞→巨嗜细胞)的双能干细胞-见图5。

已经广泛坚定了血细胞生成的分化途径，根据外形和细胞系特异的细胞表面标记容易识别各种细胞阶段(如下)。

其他干细胞包括可以产生神经元、星形细胞和寡突细胞的神经干细胞、多能干细胞(Nakafuku and Nakamura，1995，J.Neurosci Res.，vol 41(2)：153-68；Anderson，1994，FASEB J.，vol 8(10)：707-13；Morshead et al.，1994，Neuron，Vol 13(5)：1071-82)。骨骼肌卫星细胞是另一种类型的干细胞，更具体说是肌原细胞的一种独特类型，可以在成人中保持为静止的干细胞，并可以在需要时产生新的肌肉细胞(Bischoff，1986，Dev Biol.，vol 115(1)：129-39)。其他类型的干细胞是上皮干细胞、基细胞的一种亚型、内皮干细胞和间充质干细胞。

一种非常重要的干细胞类型是胚胎(ES)干细胞。这些细胞已经被广泛研究并鉴定。实际上，ES细胞被常规用于产生转基因动物。已经证明ES细胞在体外分化为一些细胞类型，包括淋巴细胞前体(Potocnik et al.，1994，EMBO J.，vol 13(22)：5274-83)和神经细胞。US 5,843,780和US 6,200,806公开了灵长类ES细胞的分离。ES细胞的特征在于许多阶段特异性的标记，如阶段特异性胚胎标记3和4(SSEA-3和SSEA-4)、高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81以及碱性磷酸酶(Andrews et al.，1984，Hybridoma，vol 3：347-361；Kannagi et a/.1983，EMBO J.，vol 2：23n 361；Foxet al.，1984，Dev.Biol.，vol 103：263-266；Ozawa et al.，1985，Cell.Differ.，vol 16：169-173)。

许多抗原与未分化细胞和分化细胞相关。“相关”在此处表示细胞表达或可以表达、或呈递或可以被诱导为呈递、或包含各自的抗原。

大多数未分化细胞和分化细胞包含主要组织相容性(MHC)I类抗原和/或II类抗原。如果这些抗原与这些细胞相关，那么它们被称作I类⁺和/或II类⁺细胞。

每种与未分化细胞或分化细胞相关的特异性抗原可以作为一种标记。因此，不同类型的细胞可以根据其相关的特定抗原或根据相关抗原的特定组合而互相区分。

这些标记抗原例子包括抗原CD34，CD19和CD3。如果存在这些抗原，那么这些特定细胞分别被称作CD34⁺，CD19⁺和CD3⁺细胞。如果不存在这些抗原，那么这些细胞分别被称作CD34^-，CD19^-和CD3^-细胞。

更具体地，PSCs为CD34⁺DR^-TdT^-细胞(其他有用的标记是CD38^-和CD36⁺)。LSCs是DR⁺，CD34⁺和TdT⁺细胞(也是CD38⁺)。MSCs是CD34^-，DR⁺，CD13⁺，CD33⁺，CD7⁺和TdT⁺细胞。B细胞是CD19⁺，CD21⁺，CD22⁺和DR^-细胞。T细胞是CD2⁺，CD3⁺和CD4⁺或CD8⁺细胞。未成熟淋巴细胞是CD4⁺和CD8⁺。激活的T细胞是DR⁺细胞。天然杀伤细胞(NKs)是CD56⁺和CD16⁺。T淋巴细胞是CD7⁺细胞。淋巴细胞是CD45⁺细胞。粒细胞是CD13⁺和CD33⁺细胞。单核细胞巨嗜细胞是CD14^-和DR⁺细胞。其他的详细内容见图4和图5。

胚胎干细胞表达SSEA-3和SSEA-4，高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81和碱性磷酸酶。它们也不表达SSEA-1，SSEA-1的存在是分化的指示。已知其他类型的干细胞的标记，例如神经上皮干细胞的Nestein(J.Neurosci，1985，Vol 5：3310)。间充质干细胞是SH2，SH3，CD29，CD44，CD71，CD90，CD106，CD120a和CD124等阳性的，而CD34，CD45和CD14阴性。

作为选择或补充，许多细胞可以通过外形特征鉴定。可以用显微镜，并任选使用染色技术鉴定细胞是称作组织学的科学的一种得到很大发展的分支，相关技术人员已经广泛掌握了该技术。清楚的细胞染色将仅仅在细胞的等分物中进行，以证实其特征，因为一般说来染色会导致细胞死亡。

因此，通过寻找以上列举的抗原标记的存在，可以鉴定某些细胞类型(即该细胞是分化细胞还是未分化细胞)，以及特异的细胞类型(即该细胞是T细胞还是B细胞)。

未分化细胞可以包含任何与抗原呈递、捕获或识别相关的任何成分。优选地，未分化细胞是MHC I类⁺和/或MHC II类⁺细胞。

更定型细胞可以包含任何与抗原呈递、捕获或识别相关的任何成分。优选地，更定型细胞是MHC I类⁺和/或MHC II类⁺细胞。

更定型细胞可以是来源于未分化细胞或可来源于未分化细胞的任何细胞。例如，更定型细胞可以是淋巴样干细胞或髓细胞样干细胞，未分化细胞是多能干细胞。

在另一种优选实施方案中，更定型细胞是分化细胞，例如CFC-T细胞，CFC-B细胞，CFC-Eosin细胞，CFC-Bas细胞，CFC-Bas细胞，CFC-GM细胞，CFC-MEG细胞，BFC-E细胞，CFC-E细胞，T细胞，B细胞，嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨核细胞、红细胞，未分化细胞是髓细胞样干细胞、淋巴样干细胞或多能干细胞。

如果更定型的干细胞是一种分化细胞，那么分化细胞优选是B淋巴细胞(激活的或未激活的)、T淋巴细胞(激活的或未激活的)、巨嗜细胞单核细胞系的细胞、能够表达I类或II类抗原的有核细胞、可被诱导表达I类或II类抗原的细胞或无核细胞(即不含有细胞核的细胞，例如红细胞)。

在另一种优选实施方案中，分化细胞选自大颗粒淋巴细胞、裸淋巴细胞和天然杀伤细胞，每一种都表达CD56和/或CD16细胞表面受体。

分化细胞甚至可以由有核细胞去核产生。

I11.试剂

试剂可操作性涉及更分化的细胞，以便使该细胞逆向分化为分化细胞。在这一点上，用于使更定型细胞逆向分化为未分化细胞的试剂可以直接或间接涉及更定型细胞。

该试剂可以在更定型细胞内起细胞内作用。然而，该试剂优选在更定型细胞外起作用。

直接涉及的一个例子是更定型细胞的表面具有至少一种细胞表面受体，如具有同源区的β链(通常发现具有相同或相似序列的区域)的细胞，所述同源区如B细胞上的同源区，其中该试剂直接涉及细胞表面受体。另一例子是更定型细胞的表面具有细胞表面受体，如具有同源区的α链(通常发现具有相同或相似序列的区域)的细胞，所述同源区如T细胞上的同源区，其中该试剂直接涉及细胞表面受体。

间接涉及的另一个例子是更定型细胞的细胞表面具有至少两种细胞表面受体，该试剂涉及其中之一会影响另一种受体，这随后诱导更定型细胞的逆向分化。

使更定型细胞逆向分化为未分化细胞的试剂可以是化合物或组合物。然而，该试剂优选可以涉及更定型细胞表面的细胞表面受体。这样，在一种优选实施方案中，该试剂可操作性涉及一种存在于更定型细胞表面的受体-该受体可以由更定型细胞表达，如可以由定型细胞表达的受体。

例如，优选试剂包括任意一种或多种环腺苷酸(cAMP)、CD4分子、CD8分子、T细胞受体的部分或全部、配体(固定的或游离的)、肽、T细胞受体(TCR)、抗体、交叉反应性抗体、单克隆抗体、或多克隆抗体。也可以使用生长因子，如造血生长因子，例如红细胞生成素和粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

如果该试剂是抗体、交叉反应性抗体、单克隆抗体或多克隆抗体，那么该试剂优选是MHC II类抗原的β链，MHC HLA-DR抗原的β链，MHC I类或II类抗原的α链、HLA-DR抗原的α链、MHC II类抗原或MHC I类抗原的α和β链的任意一种或多种的抗体、交叉反应性抗体、单克隆抗体、或多克隆抗体中的一种或多种。适当抗体的一个例子是CR3/43(由Dako提供)。

名词“抗体”包括保持结合活性的各种片段(由蛋白水解剪切或重组技术)和衍生物，如Fab，F(ab′)₂和scFv抗体，以及其模拟物或生物异构体。抗体也包括基因工程变体，其中一些氨基酸序列经过了修饰，例如通过取代氨基酸残基增加了结合，其中抗体产生于需要根据本分明的方法处理的细胞以外的生物物种，以减少不良免疫反应的可能性(一个例子是“人源化”小鼠单克隆)。

用于实现将更定型细胞转化为未分化细胞的试剂优选在更定型细胞外起作用。具体地，更定型细胞优选包含可以由该试剂操作性涉及的受体，该试剂可操作性涉及该受体。

例如，该受体可以是细胞表面受体。细胞表面受体的特定例子包括MHC I类和II类受体。优选地，该受体包含α成分和/或β成分，如同MHC I类和MHC II类受体的情况。

更优选地，该受体包含具有同源区的β链，例如至少具有HLA-DRβ链的同源区。

更优选地，该受体包含具有同源区的α链，例如至少具有HLA-DRα链的同源区。

该受体优选为主要组织相容性复合物(MHC)的I类或II类抗原。在优选实施方案中，细胞表面受体是HLA-DR受体，DM受体，DP受体，DQ受体，HLA-A受体，HLA-B受体，HLA-C受体，HLA-E受体，HLA-F受体，或HLA-G受体中的一种或多种。在更优选的实施方案中，细胞表面受体是HLA-DR受体。

该试剂优选是受体的抗体，该试剂更优选是单克隆抗体。

该试剂的另一种优选的例子是调节MHC基因表达，如MHC I类⁺和/或MHC II类⁺表达的试剂。

在一种优选实施方案中，该试剂与生物反应调节剂联用。生物反应调节剂的例子包括烷化剂、免疫调节剂、生长因子、细胞因子、细胞表面受体、激素、核酸、核苷酸序列、抗原或肽。优选的烷化剂是环磷酰胺或包含环磷酰胺。

其它优选的生物反应调节剂包括可以上调MHC I类和/或MHC II类抗原表达的化合物。在一种优选实施方案中，这可以使与MHC受体结合的试剂更有效地工作。

由于任何细胞类型都可用于表达MHC I类和/或MHC II类抗原，应该提供一种用于使许多种细胞逆向分化的方法，不论它们是否组成型表达MHC I类和/或MHC II类抗原。

IV.使细胞逆向分化的方法

在本发明的方法中，使一群包含定型细胞的细胞与可操作性涉及细胞群中的一种或多种定型细胞的试剂接触。然后孵育该细胞群，以便允许由该试剂涉及的试剂发生逆向分化过程，并最终成为未分化细胞。

该接触步骤优选包含涉及以下一种或多种的试剂：I类抗原α链的同源区、II类抗原α链的同源区、CD4细胞表面受体、CD8细胞表面受体、淋巴细胞存在下II类抗原β链的同源区、淋巴细胞存在下I类抗原α链的同源区、或淋巴细胞存在下II类抗原α链的同源区。接触步骤优选在生物反应调节剂(见前面的描述)的存在下进行。

一般地，细胞群来自于生物样品，如血液或相关组织，包括骨髓、中枢神经系统或周围神经系统的神经元组织、肌肉组织、皮肤的表皮和/或真皮组织(例如口腔刮片)。生物材料优选是出生后来源的。优选使用全血或其加工产物，如血浆或血块黄层，因为从受试者中取出它们可以在最少的医学监督下进行。一般用抗凝剂如肝素或柠檬酸盐处理血样。可以对血样中的细胞进行处理，以富集某些细胞类型，去除某些细胞类型或从组织团块中解离某些细胞。用于纯化和分离细胞的有用方法包括离心(如密度梯度离心)、流式细胞术和亲和层析(如采用包含细胞表面标记的单克隆抗体的磁珠或淘选)(见VetteseDadey The Scientist(Sep.13 1999)13(18)：21)。例如，Ficoll-Hypaque分离可用于去除红细胞和粒细胞，以便留下具有单个核的细胞，如淋巴细胞和单核细胞。

由于细胞基本是原代培养物，必须给细胞群提供适当的营养物以维持存活力。适当的培养条件是本领域技术人员公知的。然而，对细胞群的处理优选在从病人中取出生物样品后立即，一般12小时内，优选2-4小时内开始。可以用公知技术，如台蓝排除法检查细胞存活力。

一般用试剂将细胞群孵育至少2小时，一般2-24小时，优选2-12小时，孵育温度一般从大约室温至约22℃，最多至约37℃，包括33℃。可以从样品中取出一个很小的等分物，用显微镜和/或流式细胞术检查细胞，从而检验逆向分化程序的进展。或者，该设备可以包含跟踪工具，以便在线监测逆向分化程序的进展。

一旦所需细胞类型的相对数目增加到适当的水平，例如低至0.1％或高达5％，可以以各种方式使用得到的改变的细胞群。对于形成的未分化细胞的数目，重要的是了解干细胞的增殖能力。尽管在一些环境中，干细胞或形成的其它未分化细胞的数目可以很低，研究表明仅50％的多能造血干细胞就可以在供体小鼠中重建完整的造血系统。所以治疗用途不需要形成大量细胞。

也可以通过给予患者与药物载体或稀释剂混合的试剂而体内进行更定型细胞向未分化细胞的转化。然而在许多情况下逆向分化在体外/离体进行。

随后可以使用在体外获得的经处理的细胞群，而只需要很少的处理。例如，它们可以是简单地与一种可药用载体或稀释剂组合，并给予需要干细胞的患者。

然而，可能需要从细胞群中富集未分化细胞，或从细胞群中纯化细胞。这可以通过许多方法方便地进行(见Vattese-Dadey-TheScientist 13(18)：21 Sep 1999)。本发明的设备可以任选包含纯化或分离工具，用于富集所述未分化细胞或从改变的细胞群中回收所述未分化细胞。例如，可以用层析和/或流式细胞术根据细胞表面标记而纯化细胞。然而，通常既不必要也不需要从细胞群中广泛纯化未分化细胞，因为细胞群中存在的其它细胞(例如基质细胞)可能保持了干细胞活力和功能。

流式细胞术是一种用于在混合细胞群中鉴定细胞并分选细胞的确立的、可靠的和强有力的技术。因此，纯化或分离工具可以包含流式细胞仪。流式细胞术是根据液体悬浮物中的颗粒的物理特征而操作的，可以通过一束光的探测区分这些颗粒。这些颗粒当然可能是细胞。物理特征包括细胞大小和结构，或者，近年来非常普遍的是用偶联于荧光分子的单克隆抗体结合的细胞表面标记。

Kreisseg et al.，1994，J.Hematother 3(4)：263-89中提到，“由于可以获得抗CD34单克隆抗体，多参数的流式细胞术成为了一种判断造血干细胞和造血祖细胞的可以选用的工具”，并且继续描述了用于通过流式细胞术定量和鉴定表达CD34的细胞的普通技术。此外，Korbling et al.，1994，Bone Marrow Transplant.13：649-54教导了根据HLA-DR表达而通过免疫吸附和其后的流式细胞术纯化CD34⁺细胞。如前面所讨论的，CD34⁺是与干细胞/祖细胞相关的有用标记。

也已经有了根据其它物理特征分选干细胞的流式细胞术技术。例如，Visser et al.，1980，Blood Cells 6：391-407教导了可以根据大小和结构化程度分离干细胞。Grogan et al.，1980，BloodCells，6：625-44也教导了，“可以从简单造血组织中以高的和可证实的纯度分选存活干细胞”。

除了根据细胞表面标记或其它物理特征的存在(正选择)选择细胞外，也可以用阴性标准富集、纯化细胞群。例如，具有细胞系特异性标记如CD4，CD8，CD42和CD3的细胞可以通过流式细胞术或亲和层析从细胞群中取出。

用于纯化细胞的一种非常有用的技术涉及使用与磁珠连接的抗体或其它亲和配体。用具有细胞表面标记，如CD34的细胞群和细胞孵育磁珠，CD34捕获亲和配体。将含有细胞的样品试管置于磁性样品浓缩器中，磁珠被吸引至试管两端。经过一次或多次洗涤步骤后，感兴趣的细胞被部分或基本完全从其它细胞中纯化出来。在负选择中，并不是通过废弃液相而洗涤与磁珠结合的细胞，而是将液相保留，然后有效地将与磁珠结合的细胞从细胞群中取出。

这些基于亲和配体的纯化方法可以用于任何已经鉴定了或可以鉴定其上的适当标记的细胞类型。

Urbankova et al.，1996.(J.Chromatogr B Biomed Appl.687：449-52)教导了通过重力场流动分级分离从小鼠骨髓悬浮液中微量制备造血干细胞。Urbankova et al.，1996进一步提到，该方法被用于从小鼠骨髓中鉴定干细胞，因为这些细胞比骨髓中的其它细胞大，所以可以从混合物中分离它们。所以细胞表面标记以外的物理参数可以用于纯化/富集干细胞。

通过本发明的方法产生的含未分化细胞和纯化未分化细胞的细胞群可以用已知技术保持在体外。一般地，采用补加了哺乳动物血清如FBS，以及任选补加自体血浆的极限生长培养基如Hanks，RPMI 1640，Dulbecco氏极限必需培养基(DMEM)或Iscove氏改良Dulbecco培养基，以提供细胞生长的适当条件。在一种优选实施方案中，在饲养层如基质细胞层上培养干细胞(见Deryugina et al.，1993，Crit Rev.Immunology，vol 13：115-150)。已经确认基质细胞分泌使祖细胞维持在未分化状态的因子。干细胞的长期培养系统描述于Dexter etal.，1977(J.Cell Physiol，vol 91：335)and Dexter et al.，1979(Acta.Haematol.，vol 62：299)。

例如，Lebkowski et al.，1992(Transplantation 53(5)：1011-9)教导了可以用基于采用共价固定于聚苯乙烯表面的单克隆抗体的技术纯化人CD34⁺造血细胞，通过该方法得到的CD34⁺造血细胞可以维持在大于85％的存活率。Lebkowski et al.，1993(J.Hematother，2(3)：339-42)也教导了如何分类和培养人CD34⁺细胞。各种方法的综述也见Haylock et al.，1994(Immunomethods，vol 5(3)：217-25)。

可以用许多体外测定，如CFC测定证实干细胞的身份(也见实施例)。通常用长期培养起始细胞(LTC-IC)测定来检测非常原始的造血干细胞(Eaves et al.1991.J.Tiss.Cult.Meth.Vol 13：55-62)。LTC-IC使造血维持5-12周。

包含未分化细胞的细胞群和包含未分化细胞的纯化制备物可以冷冻，以便以后使用。冷冻细胞和随后使它们复活的适当技术是本领域公知的。本发明的设备可以任选进一步包含用于冷冻包含未分化细胞的细胞群和/或包含未分化细胞的纯化制备物的冷冻工具。

另一方面，逆向分化优选发生于来自于血样的血块黄层的细胞或血块黄层中的细胞。“血块黄层”表示在红细胞和血浆之间形成的白细胞层，以及当未凝固的血液被离心或允许静置时的血浆。

V.转换细胞群中正常分化细胞的比例

在正常组织中，各种类型的细胞，包括分化和未分化细胞的相对数目在某一时间通常是恒定的。例如，健康的21岁个体的白细胞计数一般是每升约8×10⁶ml，其中27％是淋巴细胞，6％是单核细胞，67％是粒细胞。这些细胞的水平(包括相对数目和绝对细胞计数)在疾病中受到干扰，例如患有慢性B细胞淋巴细胞白细胞(B-CLL)的病人中的情况。

可以将全血或血块黄层铺于histopaque以去除粒细胞，从而在例如单核细胞部分中干扰或转换分化细胞的相对数目(即比例)，从而实现将分化细胞逆向分化为未分化细胞，其中未分化细胞将自我更新(增殖)并重新分化为各种细胞类型以补充被转换的细胞。

也可以在例如血块黄层(从健康的血液供体获得)中去除(在密度梯度培养基中离心或用抗体包被的磁珠进行负选择)红细胞、血小板、粒细胞、单核细胞和T淋巴细胞后，干扰或转换分化细胞的相对数目(即比例)。该处理可以称作负选择或某些分化细胞类型的富集，并且是转换组织的一个例子。当在Iscove氏改良Dulbeccos培养基(ISDM)等含钙培养基中培养这些细胞时，分化细胞将逆向分化为未分化细胞，未分化细胞将自我更新(增殖)并重新分化为各种细胞类型以补充被转换的细胞。

在此过程中首先发现细胞聚集成集落(进行同型细胞聚集)，以进行逆向分化。一旦更定型细胞转化为未分化细胞，它们就获得了增殖的能力，并且发展为各种重新分化的细胞类型，从而补充被转换细胞的相对数目。

可操作性转换细胞群中正常分化细胞比例的逆向分化工具，例如，抗体(纯的和偶联的，即结合于固定和游离配体，如磁性、玻璃或聚苯乙烯珠)；Histopaque、LymphoPrep或用于根据细胞密度分离细胞的密度梯度培养基；或右旋糖苷(例如可以导致红细胞沉淀)。其它适当的逆向分化工具可以鉴定于Vettese-Dadey的一篇文章(见The Scientist(Sep.13 1999)13(18)：21)。

将被转换细胞暴露于适当的螯合剂，包括EDTA，EGTA和肝素(所述螯合剂在可以称作生物反应调节剂)可以导致甚至更定型细胞逆向分化为未分化细胞。例如，将被转换细胞暴露于EDTA一段预定的时间，然后在含有可的松的含钙培养基中培养细胞，可以使更定型细胞逆向分化为未分化细胞。这些细胞接着进行自我更新并参与一种新的分化途径，产生红细胞祖先，如爆发集落形成单位红细胞类(BFU-红细胞类)。红细胞祖先可以被培养并在长时间内扩充，并且可用于红细胞疾病和红细胞缺乏的治疗。

VI.改变包含细胞群的培养基中的游离离子浓度

将分化细胞暴露于EGTA等离子螯合剂一段时间，然后在含有氢化可的松的含钙培养基，例如IMDM中培养这些细胞，可以导致更定型细胞逆向分化为未分化细胞。这些细胞接着进行自我更新并参与一种新的分化途径，产生巨核细胞祖先，如集落形成单位-巨核细胞(CFU-Meg)，并最终产生血小板。

VII.未分化细胞重新定型的方法

本发明的未分化细胞的一种重要应用是在组织重建，例如神经组织或造血细胞重建中的应用。这涉及由本发明的方法产生的未分化细胞的分化。它的进行可以通过仅仅给予患者未分化细胞，并允许患者体内的天然生理状况影响分化，给予未分化细胞一般在特定感兴趣的位点，如骨髓、脊髓或肺。这种方法的一个特定例子是造血系统的重建或补充，例如在CD4⁺淋巴细胞减少的AIDS患者的情况中。

另外，可以在体外实现分化(此处也称作“重新定型”)，然后扩充细胞，例如用于治疗给药。这一般是通过给予生长因子而进行的、例如，已经用视黄酸将ES细胞分化为神经元细胞。甲基纤维素处理后同骨髓基质细胞系和IL-7共培养已经用于将ES细胞分化为淋巴细胞前体(Nisitani et al.，1994，Int.Immuno.，vol 6(6)：909916)。Le Page(New Scientist 16 December 2000)教导了ES细胞可以分化为肺上皮细胞。Bischoff，1986(Dev.Biol.，vol 115(1)：129-39)教导了如何将肌肉卫星细胞分化为成熟肌纤维。神经前体细胞可以用碱性纤维生长因子和表皮生长因子进行扩充(Nakafuku andNakamura.1995，J.Neurosci.Res.，vol 41(2)：153-168)。造血干细胞可以用许多生长因子，包括GM-CSF、红细胞生成素、干细胞因子和白介素(IL-1，IL3，IL-6)进行扩充——各种因子的综述见Metcalf，1989(Nature，vol 339：27-30)。

Potocnik et al.，1994(EMBO J.，vol 13(22)：5274-83)甚至证明了采用低氧(5％)条件使ES细胞分化为造血细胞。

因此，在本发明的一种优选实施方案中，将未分化细胞定型为重新定型的细胞，如分化细胞。重新定型的细胞可以是产生未分化细胞的更定型细胞的相同细胞系。另外，重新定型的细胞可以与产生未分化细胞的更定型细胞不同系。例如，B淋巴细胞可以逆向分化为CD34⁺CD38^-HLA-DR^-干细胞。然后干细胞可以重新定型于B细胞系(同样的细胞系)或淋巴细胞系(不同系)。

未分化细胞定型为重新定型的细胞，例如分化细胞，可以以本领域技术人员公知的各种方式实现。已知通过采用特定方式，并且在特定培养基中培养未分化细胞可以实现分化为选择的细胞。

仅仅是举例说明，采用以下培养方法未分化细胞可以分化为心肌细胞：

第1天：以正常密度将未分化细胞转移至涂有明胶的板，以游离污染的成纤维细胞的培养物。

为正常转移，用胰蛋白酶消化细胞，直到集落离开。轻柔处理，以便使细胞保持松散连接成团块。将细胞在无LIF ES细胞培养基中以1∶3直接铺于细菌级Petri培养皿(如下)。

第3天：轻轻吸出培养基。避免吸出过多的聚集物。然后加入新的培养基。

第5天：如第3天那样吸出培养基，替换培养基。

第7天：将细胞铺于24轮组织培养级平板。

第9天：改变一半的培养基并观察跳动。

第11天：改变一半的培养基并观察跳动。

仅仅是作为例子，根据以下程序，未分化细胞可以分化为胶质细胞和神经元：

第1天：以正常密度将未分化细胞转移至涂有明胶的板，以游离污染的成纤维细胞的培养物。

为正常转移，用胰蛋白酶消化细胞，直到集落离开。轻柔处理，以便使细胞保持松散连接成团块。将细胞以1∶3在含1μM全反式视黄酸的无LIF ES细胞培养基中直接铺于细菌级Petri培养皿(从Sigma得到)。

第3天：收集细胞聚集物并在无LIF或RA的ES细胞培养基中重新铺于组织培养皿(每个6cm的组织培养皿约25个细胞聚集物)。轻轻吸出培养基。

第8天：改变一半的培养基。从这一天开始，至少10％的细胞表现出神经元表型。它们被甲酚紫特异性染色，并且对N-CAM抗原为强阳性。

本领域技术人员应该容易了解实现将未分化细胞定型为任何所选择的分化细胞的适当程序。

本发明的未分化干细胞可以用任何常规的胚胎干(ES)细胞培养技术培养。仅仅是举例说明，用于未分化细胞或ES细胞培养的适当培养基的细节如下：

为制备100ml培养基

DMEM(GIBCO cat#11965-062)	80ml
		15％FCS	15ml
Pen/Strep	1ml
		L-谷氨酰胺	1ml
MEM非必需氨基酸(GIBCO cat#11140-050)	1ml
		Lif(105U/ml)	1ml
BME(0.1M)	0.2ml

Lif放置于1ml的安瓿中，作为10⁷U/ml的LIF ESGRO AMRAD，它可以在100ml DMEM和10％FCS中稀释，并在-20℃下以5ml的等分物储存。

对于BME，可以将0.1ml BME(14.4M)加入14.3ml PBS，用0.2μm的acrodisc过滤，并且在-20℃下储存最多1个月。

另一种适当的培养基可以是例如PMEF培养基，100ml的该培养基可以按以下具体制备：

DMEM(GIBCO cat&num；11965-062	88ml
		10％FCS	10ml
Pen/Strep	1ml
		L-谷氨酰胺	1ml
BME(0.1M)	0.2ml

用于培养ES细胞的其它适当培养基对本领域技术人员将是显而易见的。

VIII.用于鉴定逆向分化试剂的测定

除了前面提到的试剂，可以用WO96/23870或本发明的测定方法鉴定其它的试剂。另一方面，本发明也提供了用于鉴定可以将定型细胞/分化细胞逆向分化为未分化细胞的物质的方法，该方法包括使包含定型细胞的细胞群与候选物质接触，并判断所述细胞群中未分化细胞的相对数目是否增加，其中所述接触在血块黄层存在下发生。

适当的候选物质包括与细胞表面受体结合的配体，如抗体产品(例如，单克隆和单克隆抗体，单链抗体，嵌合抗体和CDR移植的抗体)，例如与细胞表面受体结合的抗体。特别感兴趣的细胞表面抗体在前面已经描述，包括MHC受体和具有CD名称，如CD4和CD8的表面蛋白。其它与细胞表面受体结合的配体包括生长因子。

此外，可以筛选组合文库、肽和肽模拟物、确定的化学实体、寡核苷酸、以及天然产物文库作为逆向分化试剂的活性。候选物质可以批量用于最初的筛选，例如，每次反应筛选10种物质，将批量筛选中表现出抑制的物质进行个别检验。

典型的测定包括将包含定型细胞的细胞等分物放置于适当的容器，如多孔板中。将候选物质加入孔中，将细胞在孔中孵育。孵育一般在大约室温下进行，或从大约室温开始，例如约22℃至37℃，包括33℃。

逆向分化可以通过取出细胞的一个小的等分物，并通过显微镜和/或流式细胞术判断未分化细胞数是否改变而测量。一般地，未分化细胞数目改变的测定是通过监测具有未分化细胞的特征性细胞表面标记的细胞数目改变而进行的，尽管外形改变也可以作为参考。适当细胞表面标记的例子包括CD34⁺。作为选择或补充，也可以监测具有分化细胞的典型细胞表面标记，而不具有未分化细胞的典型细胞表面标记的细胞的数目减少，例如监测具有细胞系特异性标记如CD3，CD4和CD8的细胞的相对数目减少。

优选地，具有未分化细胞的典型特征的细胞数增加发生在24小时内，优选4-8小时内，因此这些改变不能完全由细胞增殖解释。

可能需要预筛选与例如细胞表面受体，如MHC I类或MHC II类受体结合的试剂。然后可以将任何被鉴定为与靶细胞表面受体结合的试剂用于上述测定，以判断它们对逆向分化的作用。作为特例，可以用表达抗体结合域的噬菌体展示文库鉴定与靶细胞表面标记如MHC II类受体β链的同源区结合的抗体片段(一般是scFvs)。适当的结合测定是本领域公知的，如同噬菌体展示文库的产生和筛选。这些测定也可以用于鉴定最优化的抗体或抗体片段，例如筛选已经表现出实现逆向分化的抗体衍生物的诱变文库。

IX.用途

本发明提供了将定型细胞逆向分化为未分化细胞的方法和设备。具体地，本发明提供了从更分化细胞制备干细胞的方法和设备。它的临床意义是巨大的，因为干细胞正在用于广泛的治疗用途，但迄今为止还是非常困难、麻烦，并且有时其获得会受到伦理学的反对。

根据本发明产生的干细胞可以用于在患者中恢复特定细胞群，如造血细胞群或其亚群，如CD4T淋巴细胞。用于产生干细胞的更定型细胞可以来自于同一病人或匹配的供体。因此根据本发明产生的干细胞可以用于治愈和重建特异细胞组织和器官。例如，未分化细胞可以用于产生定型细胞如被覆肺泡的细胞，因此产生了可以替代或修复破坏或病变肺组织的机制(见Le Page，New Scientist 19 December 2000，p 20)。

因此，根据本发明产生的干细胞可以引入患者，从而在体内恢复细胞。适当地，首先移植干细胞，然后恢复。

因此，本发明也包括一种药物，该药物包含与适当稀释剂、载体或赋形剂混合的由这些方法中的任意一种或该设备制备的未分化细胞。

在一种实施方案中，包含未分化细胞的药物可以用于产生有益的更定型细胞，如具有正确基因组结构的细胞，以便缓解具有错误基因组结构的更定型细胞导致或相关的症状或状况。因此，本发明也提供了一种去除从更定型细胞获得的突变的方法，该方法包括根据本发明的方法形成一种未分化细胞，将未分化细胞定型未一种重新定型的细胞，其中该细胞的基因组和/或核的排列或重排导致该突变被去除。

该基因优选被插入基因组的免疫球蛋白区或TCR区。

本发明也提供了一种治疗患有由缺陷细胞或不需要细胞导致的疾病或紊乱的方法，该方法包括通过使更定型细胞接触导致更定型细胞逆向分化为未分化细胞的试剂而制备未分化细胞，然后任选将未分化细胞定型为重新定型的细胞，其中未分化细胞，或重新定型的细胞影响缺陷细胞或不需要细胞，从而减轻该疾病或紊乱的症状，或治愈患有该疾病或状况的病人。

另外，可以用未分化细胞产生更定型细胞，该细胞产生一种实物，它可以治愈任何具有错误基因组结构的更定型细胞导致或相关的症状或状况。

例如，本发明可以用于制备由逆向分化为未分化细胞的更定型细胞表达的抗原的抗体或T细胞受体。在这一点上，抗原可以是胎儿特异性抗原或交叉反应性胎儿特异性抗原。

本发明也包括控制未分化细胞和更定型细胞的水平的方法和设备。例如，本发明包括一种方法，该方法包括根据本发明的方法形成一种未分化细胞，然后激活一种凋亡基因，从而影响未分化细胞，例如使其死亡。

在一种优选实施方案中，本发明涉及一种将基因引入未分化细胞基因组的方法，其中该方法包括将基因引入更定型细胞，然后根据本发明的方法制备未分化细胞，由此该基因出现在未分化细胞中。

在一种优选实施方案中，本发明涉及一种将基因引入未分化细胞基因组的方法，其中该方法包括将基因插入更定型细胞的基因组中，然后根据本发明的方法制备未分化细胞，由此该基因出现在未分化细胞中。

该基因可以是一种使未分化细胞和更分化细胞从其获得更抗病原体感染如病毒感染的基因。具体地，例如，可以用艾滋病患者的B淋巴细胞产生干细胞，然后经工程化使其抗艾滋病感染。当进行扩充并引入患者中时，得到的辅助T淋巴细胞也可以抗HIV感染。

在另一种实施方案中，本发明涉及一种将基因引入未分化细胞的方法，其中该方法包括将基因插入更定型细胞的基因组中，然后根据本发明的方法制备未分化细胞，由此该基因出现在未分化细胞中。

此外，本发明也包括本发明中用于制备未分化细胞的方法，其中该方法包括将未分化细胞定型为重新定型的细胞，然后将重新定型的细胞与骨髓瘤融合。这允许体外表达大量需要的产品，例如抗体或抗原或激素等。

本发明包括用本发明的方法中的任意一种制备的未分化细胞。

在另一种实施方案中，本发明的设备和/或方法可以用于有效培养红细胞祖先，用于产生红细胞，这些红细胞可以用于例如补充血液供应的短缺。适当地，本发明的方法可以用于产生巨核细胞，以便用于产生血小板。

在另一种实施方案中，本发明的设备和/或方法可以用于制备未分化细胞库，即经过处理的细胞库。

本发明的其它方面包括：

本发明的任何一种试剂在从更定型细胞制备未分化细胞中的用途。

根据本发明的方法产生的未分化细胞在以下各方面的用途：从B淋巴细胞或T淋巴细胞产生单克隆抗体或多克隆抗体或特异性抗体中的任意一种；产生巨噬细胞单核细胞系的细胞；产生能够表达I类或II类抗原的有核细胞；产生可以被诱导表达I类或II类抗原的细胞；产生去核细胞；产生断裂细胞；或产生凋亡细胞。

根据本发明的方法产生的未分化细胞在从B淋巴细胞产生效应T淋巴细胞或反之中的用途。

根据本发明的方法产生的未分化细胞在产生以下任意一种或多种物质中的用途：药物，如包含B淋巴细胞、T淋巴细胞的药物或尤其制造的药物、巨噬细胞单核细胞系的细胞、能够表达I类或II类抗原的有核细胞；可以被诱导表达I类或II类抗原的细胞或去核细胞。

本发明也包括利用前面提到的用途的方法，以及由这些方法制备的产品或组合物。

本发明也包括一种药物，该药物包含本发明的未分化细胞或由其获得的、与适当稀释剂、载体或赋形剂混合的产品。

在一种优选实施方案中，该药物包含一种与适当稀释剂、载体或赋形剂混合的从本发明的未分化细胞获得的抗体或抗原。

该药物优选用于治疗以下任意一种疾病：癌症、自身免疫病、血液病、细胞或组织退化、器官退化、器官或组织移植的治疗、或先天性代谢疾病。

本发明的方法和由这些方法获得的产品，如未分化细胞，可以用于研究例如逆向分化、分化，以及鉴定并研究新开发的抗原和簇分化抗原。

X.给药

本发明的干细胞和重新定型的细胞，以及表现为可以逆向分化细胞的试剂，可以用于治疗方法。本发明的细胞或试剂优选与各种成分组合，以产生本发明的组合物。该组合物优选与可药用载体或稀释剂组合，以产生药物组合物(可以用于人或动物)。适当的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸缓冲液。本发明的组合物可以用于直接注射给药。该组合物可以经制剂化，用于胃肠外、肌内、静脉内、皮下、眼内、口服或经皮给药。

包含细胞的组合物一般通过注射或抑制给药。可以在悬浮液中或包埋于支持基质，如天然和/或合成的生物可降解基质中递送。天然基质包括胶原基质。合成的生物可降解基质包括聚酐和聚乳酸。这些基质为体外的松散细胞提供了支持，优选用于非造血细胞。

递送也可以是控制的递送，即在从几分钟至几小时或几天的时间内进行控制的递送。递送可以是全身的(例如通过静脉注射)或直接递送至特定的目的位点。

一般以1×10⁵-1×10⁷个细胞/kg的剂量给予细胞。例如，对于一个70kg的病人，为重建造血组织，可以给予14×10⁶个CD34⁺细胞。

这里描述的给药途径和剂量旨在仅仅作为一种直到，因为本领域技术人员可以容易判断对于任何病人和状况的给药途径和剂量。

下面的所有详细方法都适用于本发明的设备。

A.材料和方法

病人

用含有EDTA的抗凝管从患有B细胞慢性淋巴细胞白细胞的病人、患有抗体缺陷(包括IgA缺陷和X连锁婴儿低γ球蛋白血症)的病人、具有HIV感染和艾滋病的病人、患有何杰金氏淋巴瘤的病人、患有急性T细胞白细胞的病人、患有blastcytosis的6日龄婴儿、具有各种感染和临床状况的病人、健康血液供体的脐带血、骨髓和富集的B淋巴细胞制剂获得血样。

临床和实验室条件

患者的临床和实验室治疗条件，包括应用于它们的血样的各种治疗类型都描述于表1。用库尔特计数器获得示差白细胞(WBC)计数，这些都包括于相同的表1。

血液的处理

一旦获得样品，将其与HLA-DR抗原β链的同源区的纯单克隆抗体(DAKO)一起引入腔室中，并且在室温下混合最多24小时。一些样品首先混合15分钟，然后在22℃下在腔室中孵育。加入血样的单克隆抗体的浓度为10-50μl/ml血液。

此外，以同样的浓度施加其它的处理，包括加入HLA-DR抗原α链的同源区的单克隆抗体、I类抗原的同源区的单克隆抗体、CD4的单克隆抗体、CD8的单克隆抗体、PE偶联的HLA-DR抗原β链的同源区的单克隆抗体。

其它处理包括同时向血样中同时加入HLA-DR抗原α链和β链的同源区的单克隆抗体。

此外，将烷化剂如环磷酰胺与HLA-DR抗原β链的同源区的纯单克隆抗体组合加入血样中。

在这些处理之后，用一组标记的单克隆抗体，按照制造商的说明对血样染色，然后用流式细胞术分析。

与单克隆抗体的孵育期为2小时、4小时、6小时、12小时至24小时。

标记的抗体

通过流式细胞术，采用以下单克隆抗体检测以下细胞上的标记：CD19和CD3、CD4和CD8、DR和CD3、CD56&16和CD3、CD45和CD14、CD8和CD3、CD8和CD28、simultest对照(IgG1 FITC+IgG2a PE)、CD34和CD2、CD7和CD13&33、CD10和CD25、CD5和CD10、CD5和CD21、CD7和CD5、CD13和CD20、CD23和CD57、以及CD25和CD45RA(Becton&Dickenson and DAKO)。其它的标记可以包括CD71(红细胞标记)、CD61(巨核细胞标记)、血型糖蛋白A(红细胞标记)、AC133(干细胞标记)、CD38(原始干细胞标记)、CD90(干细胞标记)和CD117(多能干细胞标记)。

每个患者的血样，不论是处理过的还是未处理的，包括血块黄层样品，都采用本发明的设备中的多个上述标记抗体组进行分析，以便解释伴随不同处理类型的免疫表型改变，这些是在相同血样的不同等分物中进行的。对未处理样品和其它对照样品进行染色并同时进行分析。

流式细胞术

根据制造商的说明对白细胞样品进行染色和裂解。在FACScan@上用simultest或PAINT A GATE软件(BDIS)进行流式细胞术分析，该软件包括阴性对照反向跟踪。获得了1000-20000个事件，并储存在列表模式文件中。

外形

用显微镜和瑞氏染色分析外形。

从富集的或纯化的B-CLL(或正常的)淋巴细胞或从血样的血块黄层制备干细胞

在以下程序中应该使用无菌技术：

(A)单核细胞分离

(i)通过在Histopaque、Lymphoprep或任何淋巴细胞分离培养基(sp.grav 1.077)上以400g离心30分钟，从外周血/血块黄层样品中获得单核细胞。

(ii)收集单核细胞于50ml的锥形管中，用含有2％热激活的胎牛血清(FCS)和2mM EDTA或0.6％柠檬酸盐的30ml汉克氏平衡盐溶液(无Ca²⁺和Mg²⁺，Sigma)洗涤，并且以400g离心10分钟。

(iii)洗涤后，用台  蓝和血细胞计数器对细胞计数并评价其存活力。

(iv)如果B细胞计数高于70％(20×10⁹/L，WBC)，直接进行A(vi)。

(v)如果B细胞计数低于70％(20×10⁹/L，WBC)。用Macs微珠或FacsVantage纯化技术进行负选择，如以下C部分所描述。

(vi)将细胞沉淀物以3×10⁶/ml重悬于IMDM培养基(100μg/ml链霉素)，该培养基含有10％FCS(热灭活的)和10％HS(热灭活的)，采用20％-50％的自体血浆。

在从B-CLL患者外周血样品获得的单核细胞部分中制备干(未分化)细胞

按照上述单核细胞分离(A)方案，只是当白细胞计数超过20×10⁶/ml，其中50％以上的白细胞为B细胞时，不应该进行负选择。

以下程序可以在本发明的设备中进行。

(B)用纯CR3/43(Dako)单克隆抗体处理细胞

当在A(vi)中获得了单核细胞分离后，进行以下步骤：

(i)将输入血袋(从上面的A(vi)得到)挂在支持钩上，

(ii)采用具有6个孔的腔室，运行设备以从输入血袋(从上面的A(vi)得到)加入2ml细胞悬浮液至该多孔培养盘或腔室的每个孔中。

(iii)运行设备，处理适当数量的孔，从含有CR3/43mab的注射器向每孔加入99μl/ml(或对于血块黄层样品为49.5μl/ml)CR3/43(纯单克隆抗体，Dako)，并且不处理其它孔(阴性对照)。

(iv)在潮湿的环境下在50％CO₂，37℃(或33℃)孵育腔室。

(C)细胞纯化

已知许多分离和纯化细胞的方法(见Vettese Dadey Scientist 13(18)：21 Sep 13 1999)。

一种适当的方法是用MACS微珠(Miltenyi Biotec，此处最好根据制造商的说明)对B细胞进行负选择：

(i)按照A部分获得单核细胞。

(ii)沉淀细胞并以300μl/总共10⁸个细胞的中体积重悬细胞于HBSS(含2％FCS和2mM EDTA或0.6％柠檬酸盐)。

(iii)加入100μl/总共10⁸个细胞的CD2的纯单克隆抗体(IgG1，DAKO)。

(iv)向同样的细胞悬浮液中加入50μl/总共10⁸个细胞的CD33的纯单克隆抗体(IgG1，DAKO)。

(v)使混合物在室温下孵育10分钟。

(vi)用HBSS(含2％FCS和2mM EDTA)洗涤细胞并用同样的缓冲液以400μl/总共10⁸个细胞的终浓度重悬。在400g离心10分钟。在HBSS中重悬沉淀(同上)。

(vii)加入100μl兔抗小鼠IgG1标记的微珠/总共10⁸个细胞(或按照制造商的说明)。

(viii)完全混合细胞并在6-12℃(冰箱)孵育15分钟。

(ix)用HBSS(含2％FCS和2mM EDTA)洗涤细胞，在400g离心10分钟，用同样的缓冲液以500μl/总共10⁸个细胞的终浓度重悬。

(x)在MACS分离器的磁场中集中MS⁺/RS⁺柱。如果单核细胞计数高，采用两个MS⁺/RS⁺柱。

(xi)用3ml HBSS(含2％FCS和2mM EDTA)洗涤柱。

(xii)使细胞过柱，然后用4×500μl HBSS(含2％FCS和2mMEDTA)洗涤。

(xiii)洗脱并收集细胞于锥形管，然后沉淀并重悬于IMDM并置于如A部分(vi)的血袋中。

D)FACS Vantage纯化B细胞：

(i)从B-CLL患者的外周血样品中获得单核细胞，如上述A部分所描述。

(ii)用CD19-PE和CD20-FITC偶联的单克隆抗体的组合对这些细胞染色，以鉴定B细胞。

(iii)根据CD19/CD20荧光，用Beckton Dickenson FACSVantage和以488nm发生的氩激光分选大约10⁷个细胞。

(iv)用含50％FCS的汉克氏平衡盐溶液洗涤纯化的细胞，并允许在潮湿的孵育器中，在5％CO₂，37℃下回收过夜。

(v)沉淀并重悬细胞，置于如A部分(vi)描述的血袋中，然后用上述B部分描述的CR3/43处理。

在白细胞中制备干细胞

可以在本发明的设备中用纯CR3/43(Dako)单克隆抗体在白细胞中处理细胞：

(i)用30-200×10⁹/L的白细胞计数选择病人(73-95％的B淋巴细胞)。

(ii)通过静脉穿刺收集血液至无柠檬酸盐、EDTA或防腐剂的含肝素试管中，将血液置于血袋中。优选立即使用收集的血液，适当地，在收集后约6小时内使用。然而，在氮气中储存/冷冻的血液也可以在解冻后使用。

(iii)将从(ii)得到的含全血的血袋放置于本发明的设备中。

(iv)用库尔特计数器进行自动的示差白细胞计数。优选选择白细胞计数为30-200×10⁶/ml(其中60-90％为B细胞)的患者。

(v)也可以自动评估血液的存活力，适当的方法包括碘化丙锭和流式细胞术或台蓝和血细胞计数器，然后用氯化铵溶液裂解红细胞。

(vi)在该设备的腔室中向全血样品中加入CR3/43抗体，终浓度为1-3μl/10⁶个细胞(例如，如果WBC计数为50×10⁹/L，那么每ml血液应该加入50μl CR3/43单克隆抗体，小鼠IgG浓度为159μg/ml)。

(vii)用该设备腔室中的叶片彻底混合血液和抗体，在室温，优选18-37℃下在孵育的腔室终维持预定时间，即不少于2小时。

(viii)在加入mAbs0小时、2小时、6小时和24小时后，采用该设备的跟踪工具，用流式细胞术、集落测定、长期培养和/或PCT分析血细胞。

注意：由于B细胞的同型聚集以及由于mAb CR3/43的诱导在试管底部形成了粘附细胞，应该在分析前用宽孔微移液管头彻底混合和取样。

微量在分析过程中获得统一的细胞群，在CR3/43处理前将血样等分至多个腔室中。

准备分析通过用CR3/43单克隆抗体处理培养的B细胞产生的干细胞

用本发明的方法产生的干细胞可以在许多时间点进行评估，例如每2小时、7小时、24小时、每天、每7天或更长的时间段(用长期培养基每周补充给细胞后，每月进行)。在每个时间点分析一个或多个处理和对照孔，此后在连续的时间段分析剩下的处理和对照孔。

可以通过插入本发明的设备中的跟踪工具自动进行评估。

(i)用宽孔微移液管轻轻移去非粘附层，用宽孔微移液管重复吸取，破坏细胞团，从而获得单细胞悬浮液。

(ii)用细胞刮器刮去粘附层，用宽孔微移液管重复吸取，破坏细胞团，从而获得单细胞悬浮液。

(iii)或者，首先用HBSS冲洗，从而用胰蛋白酶消化粘附层，然后在每孔中加入2ml 0.25％的胰蛋白酶，并且在37℃下孵育10分钟。

(iv)用宽孔微移液管重复吸取，轻轻破坏细胞团。

(v)10分钟后用20％的FCS孵育达到终浓度，从而灭活胰蛋白酶。

(vi)可以将上述(ii)或(v)的每个时间点获得的每种类型的(即处理和未处理细胞)培养细胞合并，并且在400g下离心10分钟。

(vii)为进行PCR分析(见C)，应该直接使用(vi)获得的细胞沉淀(即处理和未处理细胞)。

(viii)为进行集落测定分析，将上述步骤(ii)或(v)获得的细胞沉淀(即处理和未处理细胞)重悬于含2％热激活FCS的IMDM中。可以取出小的细胞等分物，对细胞计数，并且用台蓝和血细胞计数器评估它们的存活力。

(ix)为进行FACs分析，将上述步骤(ii)或(v)获得的细胞沉淀(即处理和未处理细胞)重悬于含2％热激活FCS和5mM EDTA的汉克氏平衡盐溶液(无钙和镁)中。

干细胞分析：

可以用以下方法评估干细胞。本发明的设备可以包括用于进行下面详细讨论的方法或其一部分的跟踪工具。

(A)免疫表型

为进行全血样品的免疫表型分析(使用流式细胞术)：

(i)免疫染色(根据制造商的说明)，溶解红细胞并且在孵育期和用mAb处理后洗涤细胞。一般可以使用从Becton Dickinson购得的溶解和洗涤溶液。

(ii)应该用直接偶联于异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红素(PE)的单克隆抗体标记红细胞(位于全血、单核细胞部分、MACS负选择的B细胞或分选出的B-CLL)。

(iii)用于免疫表型分析的一组标记可以如下：

CD38  PE+CD45  FITC+CD34 PE-Cy5

CD19  PE+CD10  FITC+CD34 PE-Cy5

CD117 PE+CD3   FITC+CD34 PE-Cy5

CD33  PE+CD61  FITC+CD34 PE-Cy5

血型糖蛋白A PE+CD71 FITC+CD34 PE-Cy5

AC133 PE+CD90 FITC+CD34 PE-Cy5

CD19PE+CDS FITC

IgG1PE+IgGI FITC+IgG1PE-Cy5(同种型阴性对照)

(iv)可以进行采用IMK+试剂盒(Becton Dickinson)的双标记：由以下单克隆抗体对组成：

CD45-FITC和CD14-PE；

CD19-PE和CD3-FITC；

CD8-PE和CD4-FITC；

HLA-DR-PE和CD3-FITC；以及

CD56，CD16-PE和CD3-FITC。

也包括IgG1-FITC和IgGa-PE.的同种型匹配阴性对照。

(v)也可以使用Dako和Becton Dickinson生产的以下其它抗体：

PE偶联的：抗CD8，抗CD33，抗-13，抗CD34，抗CD19，抗CD2，抗CD14，抗CD33和抗CD5；

FITC偶联的：抗CD3、抗CD7、抗IgM、抗CD22、抗CD20、抗CD10、抗CD7、抗CD16、抗TCRαβ。

(vi)也可以使用下列抗体

也可以使用CD34特异的亲和纯化的IgG3单克隆抗体(Dako)，它可以用FITC或PE标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白F(ab)′₂片段作为第二抗体(DAKO)。

也使用Quantum红(Quantum Red)(PE-Cy5)偶联的抗CD34(Dako)。

(vii)用FACScan或FACS Vantage(Becton Dickinson)或任意其它流式细胞仪分析细胞。应该分析等量的100,000细胞并记录时间。

(viii)用Proprietary Paint-a-Gate，Lysis II，Consort 30和CellQuest软件分析数据。

为进行血块黄层样品的免疫表型分析(用流式细胞术)，例如

(i)免疫染色(根据制造商的说明)，溶解红细胞并且在孵育期和用mAb处理后洗涤细胞。一般可以使用从Becton Dickinson购得的溶解和洗涤溶液。

(ii)应该用直接偶联于异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红素(PE)的单克隆抗体单标记或双标记红细胞。

适当地，可以使用以下被标记的标记：

CD34(干细胞标记)；CD19(B淋巴细胞标记)；CD45(白细胞标记)；CD3(T淋巴细胞标记)；CD33(中幼粒细胞)；CD71(红细胞标记)；CD61(巨核细胞标记)；血型糖蛋白A(红细胞标记)；AC133(干细胞标记)；CD38(原始干细胞标记)；CD90(干细胞标记)；CD10(淋巴样干细胞标记)；CD117(多能干细胞标记)；IgG1(阴性对照)。

(B)外形：

为进行外形分析：

光学显微镜

(i)用宽孔移液管头将细胞彻底重悬在含2％热激活的FCS的IMDM中。

(ii)在Leitz显微镜下进行观察，采用适当的染色液，例如采用May and Greenwald染色液分析髓细胞和淋巴细胞。本领域技术人员很容易了解其它适于鉴定其它集落的染色方法，例如瑞氏或吉姆萨染色。

(iii)可以分别在血涂片或细胞离心制备物中进行B-CLL淋巴细胞的外形分析。

共聚焦显微镜

(i)按上述内容获得B细胞(B-CLL或从健康血液供体的血块黄层中获得的健康B细胞)

(ii)按上述内容用CR3/43单克隆抗体处理B细胞。

(iii)向器官培养皿中加入2ml细胞悬浮液(在该培养皿底部装有盖玻片)。

(iv)加入15μl CD19 FITC偶联物的单克隆抗体，加入15μl CD34PE/Cy 5偶联物(Quantum红)的单克隆抗体。

(v)用碘化丙锭估计存活力，用Hoechst对核进行染色。

(D)VDJ/JHF基因重排的PCR分析

用PCR(Perkin Elmer热循环仪)分析IgH基因的VDJ和/或JHF区，采用从抗体处理前和处理后(2小时、6小时和24小时)的B-CLL外周血和血块黄层样品得到的模板DNA。该方案来自于Stolc et al(American Journal of Hematology 38：1-8；1991)。JHF引物用于种系构型中免疫球蛋白重链基因的阳性检测。JH6用作免疫球蛋白重链基因的阳性内部对照。白血病和正常淋巴细胞的B细胞中，JHF区总是被去除，因此不能被扩增，而内部对照JH6基因保持完整。β肌动蛋白基因用作对照。

(i)用Qiagen QiAmp Max血液试剂盒从全血中分离基因组DNA。采用最大产量方案。从每个样品(处理的和未处理的)提取所有的DNA。

(ii)在1.5％的琼脂糖凝胶上进行纯DNA和1∶5稀释DNA的电泳。

(iii)PCR-在96℃下加热2-3μL纯基因组DNA模板5分钟。

I)JH6a/JH6g JHFa/JHFg

根据下表的详细内容制备足够用于4名患者(处理和未处理的8个反应)的“mastermix”。可以适当按比例放大或缩小。

	体积/μL	[终末]
			无核酸酶的水PCR 10x缓冲液＊25mM MgCl2 ＊5mM dNTPs10μM P110μM P25U/μL Taq pol.	370806412880802	--1x2mM0.8mM1μM1μM10单位

*在用于平衡样品之前涡旋每个试管2-3次。

向每个含有变性基因组DNA的试管中加入等量的95μL“mastermix”。将热循环仪设定在95℃下1分30秒；55℃下2分钟；72℃下1分30秒(35个循环)；72℃下5分钟(1个循环)。

II)β肌动蛋白

制备足够用于I)中所述8个反应)的“mastermix”。可以适当按比例放大或缩小。

	体积/μL	[终末]
			无核酸酶的水PCR 10x缓冲液*25mM MgCl2 *5mM dNTPs10μM P110μM P25U/μL Taq pol.	380804812880802	--1x1.5mM0.8mM1μM1μM10单位

*在用于平衡样品之前涡旋每个试管2-3次。

向每个含有变性基因组DNA的试管中加入等量的95μL“mastermix”。将热循环仪设定在95℃下1分30秒；55℃下2分钟；72℃下1分30秒(35个循环)；72℃下5分钟(1个循环)。

用于PCR的引物

第一组设计用于扩增IgH JHF基因的240bp片段的引物如下：

JHFa AAA GGT GCT GGG GGT CCC CTG

JHFb CCC AGT GCT GGA AGT ATT CAG C

第二组设计用于扩增IgH JHF基因连接区6的242bp片段的引物如下：

JH6a CAT TGT GAT TAC TAC TAC TAC TAC

JH6b GAT CCT CAA GGC ACC CCA GTG C

第三组设计用于扩增β肌动蛋白基因的249bp片段的引物如下：

βACT-1 AAG GCC AAC CGC GAG AAG AT

βACT-2 TCG GTG AGG ATC TTC ATG AG

(D)VDJ基因重排的DNA分析

(i)用BamHI/HindII消化来自于处理的和未处理的外周血样或纯化B细胞(来自于B-CLL患者)——一般需要用许多孔中的细胞得到足量的DNA以进行分析。

(ii)将消化液溶解于0.8％的琼脂糖凝胶中并根据制造商的说明转移到

尼龙膜(Dupont)(Southern，1975)。

(iii)用32P标记的从胎盘基因组DNA分离的人JH DNA探针(Calbiochem，Oncogene Science)分析IgH基因座的J区，从而鉴定IgH基因的重排。

(iv)将自显影照片置于-70℃下几天，然后显影。

(E)长期培养：

按上述方法制备的细胞培养物可以维持更长的时间段(长期培养)，每周补充长期培养基(Iscove′s改良Dulbeccos培养基(IMDM-Gibco BRL Life Technologies Ltd)，10％热激活的FCS，10％热激活的马血清(HS)，1％氢化可的松，1％青霉素/链霉素，5×10^-7M原液)。

(i)首先，在某个时间点，如24小时后，从CR3/43处理开始，通过在每孔中加入2ml长期培养基而稀释细胞。

(ii)在去除一半的生长培养基之后，每周向孔中加入培养基。

(iii)用相差显微镜检查各个孔。

(F)集落测定

(i)在处理开始的每个时间段后，可以按上述内容获得300μl在培养基中的未粘附细胞。

(ii)在上述培养基的细胞悬浮液中加入3ml methocultGFH4434(StemCell Technologies，由含甲基纤维素的IMDM，FCS，BSA，L-谷氨酰胺，rh干细胞因子，rh GM-CSF，rh IL-3 and rh红细胞生成素组成)。

(iii)取出1.1ml细胞混合物并铺板，共铺3份。

(iv)将板在潮湿的培养皿中，37℃下5％CO₂和5％O₂中孵育14天。

(v)用相差显微镜在CR3/43单克隆抗体处理前和处理后检查各个孔。

(vi)14天后可以用流式细胞术、共聚焦显微镜和/或PCR分析细胞(集落)。

(vii)当进行集落测定时，应避免乙醇气溶胶，因为这可以导致细胞聚集或破坏，阻碍两种类型细胞的存活(处理的和未处理的)。

B.结果

CD19和CD3组

在本发明的设备中用HLA-DR抗原β链的同源区的单克隆抗体处理血样，总是减少CD 19⁺细胞的相对数目。该标记为全B细胞抗原(见表)。该抗原存在于成熟的所有阶段的所有人类B淋巴细胞上，但在最终分化的血浆细胞上则没有。因此，这表明B细胞逆向分化为未分化细胞。

同样的处理导致CD3⁺细胞的相对数目剧烈增加，特别是在B-CLL的血液中更是如此，这总是伴随CD3^-CD19^-细胞数目的相对增加。CD3存在于所有成熟T淋巴细胞和65％-85％的胸腺细胞上。发现该标记总是与α-/β-或γ/δT细胞受体(TCR)关联，这些复合物对于到细胞内部的信号转导都是重要的。所以，这表明B细胞逆向分化为未分化细胞，然后重新定型为新的分化细胞，即T细胞。

一种新的共表达CD19和CD3标记的细胞集落出现在处理过的B-CLL患者血液中，即CD19⁺和CD3⁺细胞(见图表1，在开始治疗2小时、6小时或24小时后的患者2、3和4)，该处理可以在本发明的设备中进行。其它具有不同状况的患者表现出这些细胞集落的相对数目增加。这些细胞非常大，具有很多颗粒，并且在它们的细胞膜上表达极高水平的CD19。在这些细胞上表达的CD3标记水平似乎与在正常成熟淋巴细胞上表达的CD3标记水平相似。

在表2中，患者数2、3和3是代表相同患者的试剂数字，他们的描绘仅仅是用于表示随时间的对血液的处理效果(对于该患者的实验室和临床状况见表1)。

在经处理的样品中的CD19⁺CD3⁺集落似乎随时间而减少，在2小时、6小时和24小时达到未处理样品中测定的原始水平。

在经处理的样品中检测另一种大小和颗粒多少相同的细胞类型，这些细胞表面具有高水平的CD19表达，但没有CD3标记，并且富含FC受体。然而，这些细胞的相对数目似乎随时间减少。令人感兴趣的是，在处理血样后24小时(2，3和4)，在一组细胞中的CD19^-CD3^-细胞的相对数目减少，而在处理血样2小时和6小时后观察到了该数目增加。然而，用HLA-DR抗原β链的同源区的单克隆抗体处理后的血液中白细胞群的库尔特计数减少。该发现提示该处理产生了不能由库尔特计数检测的不典型细胞(表1)，但可以被根据表面标记、大小和颗粒多少的流式细胞仪测量所计数。此外，这些不典型细胞可以在显微镜下用瑞氏染色进行外形分析而被计数。这些现象的流式细胞术图表见图表1、2、3和4，在血样处理中获得的免疫表型改变提示CD19+和CD3+淋巴细胞是一组交界的细胞，但基于与干细胞相比的CD19和CD3相对表达仍保持独特。

在表2中，患者号5和6代表同一个患者，但分别随时间监测处理和未处理血样的分析，并且在同一时间监测处理和未处理血样的分析(见表1)。

患者的血液没有B细胞恶变，表示与B-CLL患者的血液有相似的免疫表型改变趋势，但改变程度不同。然而，这些患者血液中B淋巴细胞和MHC II类阳性细胞的相对和绝对数目与B-CLL患者血液中的数目相比非常低。

在对其血液进行处理后，两个具有X连锁婴儿低γ球蛋白血症的缺乏B细胞的兄弟在CD3⁺细胞的相对数目方面表现出不同的免疫表型改变。弟弟为2个月大，没有发病，处理他的血液时表现出CD3⁺细胞相对数目的轻微增加，并伴随CD3^-CD19^-细胞相对数目的减少。另一方面，哥哥为2岁，病情十分严重，其表达DR抗原的激活的T细胞的数目相对高，并且在处理他的血液时表现出CD3⁺细胞数的减少。没有采用其它标记测量其它可能出现的免疫表型改变，因为从这两名患者中获得血样非常少(表2，ID 43/BD和04/BD)。

表2中的患者91在处理血液后表现出CD3⁺细胞相对数目的减少，它伴随CD3^-CD19^-细胞相对数目的增加。然而，在分析其它表面标记如CD4和CD8(见表3)时，发现该患者的血液中具有相对高数目的CD4⁺CD8⁺细胞，这在用DR抗原β链的单克隆抗体处理血样之前发现，并且这些双阳性细胞在血液处理后显著减少。此外，当分析其它标记时，发现CD3+细胞的相对数目增加(见表4)。

当用DR抗原β链的单克隆抗体在本发明的设备中处理从健康的血液供体中得到的B淋巴细胞富集制剂时，表现出CD3+细胞相对数目的剧烈减少，并且总是伴随CD19⁺细胞相对数目的减少和CD19^-CD3^-细胞相对数目的增加。用CD4和CD8等标记进行的进一步分析表明这些标记相对数目的同时减少。然而，当用同样的单克隆抗体处理同样的血液供体的T淋巴细胞富集制剂时，没有表现出同样的改变。

CD4和CD8组

CD4抗原是人免疫缺陷病毒的受体。CD4分子与MHC II类抗原在B2结构域结合，该区域类似于I类抗原的CD8结合位点。CD4与II类抗原的结合增强对抗原的T细胞反应性，CD8与I类抗原的结合也是如此。CD8抗原存在于人抑制/细胞毒T淋巴细胞亚型上，并且存在于天然杀伤(NK)淋巴细胞的一种亚型以及大多数正常胸腺细胞上。CD4和CD8抗原共表达于胸腺细胞上，这些细胞在成熟为T淋巴细胞时失去标记之一。

在分析CD4和CD8时——见下文——从表2中列出的大多数血样中可以看出，一种染色方式支持B淋巴细胞逆向分化为未分化细胞，并随后分化为T淋巴细胞的存在。

双阳性细胞CD4⁺CD8⁺细胞总是在用DR抗原β链的单克隆抗体处理血液后出现，并且这些类型的细胞在B-CLL患者经处理的血样中显著增加，在未处理样品中都不存在(见表3和图表1、2、3和4)。在相同的样品中，也注意到了单阳性细胞如CD8⁺和CD4⁺细胞的相对数目同时增加。此外，至少在B-CLL的情况下对应于B细胞的CD4^-CD8^-细胞相对数目的减少在处理样品中与未处理样品中相比显著减少，当随时间进行测量时，未处理样品中保持相同水平。然而，处理样品中随时间对CD8⁺CD4⁺细胞相对数目进行的测量表明单阳性细胞的增加伴随双阳性细胞相对数目的减少。这种类型的免疫表型改变是胸腺中T淋巴细胞系的祖细胞的胸腺发育的特征(患者号2、3和4)。CD4抗原存在于辅助/诱导T淋巴细胞亚型上(CD4⁺CD3⁺)以及大多数正常胸腺细胞上。然而，该抗原在单核细胞的细胞表面和单核细胞以及巨噬细胞(CD3^-CD4⁺)中以低密度存在。

低CD4⁺细胞的相对数目在本发明的设备处理后在不同血样中受不同影响。该类型细胞的相对数目似乎在B-CLL患者的血样中不受影响。这种低水平的CD4表达发现于单核细胞和非常早期的胸腺细胞。

进行处理的HIV⁺25患者表现出同时表达CD4和CD8的双阳性细胞的很大程度增加。另一方面，进行治疗的患者91表现出这种亚型细胞的减少，并且这种现象的观察是时间依赖性的。发现CD8⁺细胞的相对数目在B-CLL患者的未处理血样中随时间增加，同时发现CD4⁺和低CD4⁺细胞减少(表3，患者2、3和4)。

DR和CD3组

DR标记存在于单核细胞、树突细胞、B细胞和激活的T淋巴细胞。

用该组进行的处理和未处理样品的分析表现出与用CD19和CD3标记分析样品时相似的免疫表型改变(见表2)，这些前面提到过的抗原分别是全B细胞和T细胞标记。

在本发明的设备中用单克隆抗体处理血液似乎影响DR⁺B淋巴细胞的相对数目，因此DR⁺细胞减少。相反，CD3⁺(T细胞)细胞的相对数目显著增加(见表4和图表)。此外，大多数经处理的B-CLL患者血样中激活的T细胞的相对数目增加，这些类型的细胞在具有其它状况的患者的经处理样品中受到不同的影响。

此外，DR高阳性细胞的相对数目在B-CLL患者以及血液中DR+CD34+未成熟细胞增加的6日龄婴儿的经处理样品中以显著的数目存在。然而，应该注意，存在于该患者血液中的未成熟细胞在处理前和处理后对于T细胞和B细胞标记是阴性的，但在处理后髓细胞系抗原的阳性更强。在大多数经处理的血样中，CD3^-DR^-细胞的相对数目增加，并且与CD3+细胞(T细胞)的相对数目增加成正比，与DR+细胞(B细胞)的相对数目减少成反比。

CD56&16和CD3组

CD56&CD16标记存在于一组异源细胞、一种称作大颗粒淋巴细胞和天然杀伤(NK)淋巴细胞的淋巴细胞亚型。CD16抗原表达于基本所有的静息NK淋巴细胞，并且在一些来自于某些个体的CD3⁺T淋巴细胞上弱表达。已经发现该抗原在粒细胞上低量表达，并且与含大的嗜天青颗粒的淋巴细胞相关。CD16抗原是IgG FC受体III。

各种数目的CD16⁺淋巴细胞共表达CD57抗原或低密度CD8抗原或这两者。在大多数个体中，基本与其它T淋巴细胞抗原如CD5，CD4，或CD3抗原没有重叠。CD56抗原存在于基本所有的静息和激活的CD16⁺NK淋巴细胞，这些细胞亚型执行非主要组织相容性复合物限制的细胞毒性。

处理和未处理的B-CLL和一些其它状况的患者的血样免疫表型分析表现出表达CD56&CD16抗原的细胞数目增加，这些细胞具有许多颗粒，大小中等(见表5和图表1、2、3、4)。这些观察结果也伴随仅仅表达CD3抗原(不表达CD56和CD16标记)的细胞以及共表达CD56&CD16和CD3标记的细胞的相对数目显著增加。

在表5中，患者号2，3，和4代表相同的血样，但分别是在2小时、6小时和24小时进行分析(处理前和处理后)。该样品表明用DR抗原β链的单克隆抗体处理血液似乎导致自发产生CD56⁺和CD16⁺细胞，CD3⁺细胞和CD56⁺以及CD16⁺CD3⁺细胞，这些观察结果总是伴随B细胞标记(CD19，DR，CD56，CD16^-CD3^-)的消失。

在处理前和处理后对该血样进行的前向(onward)分析表示，CD56⁺和CD16⁺细胞水平随时间减少，CD3⁺细胞的水平随时间增加。

相对于处理和未处理样品中观察到的免疫表型改变，B-CLL患者7的血样没有表现出表达CD56，CD16和CD3抗原的细胞数目改变，这是因为加入的单克隆抗体量与B淋巴细胞的数目相比非常低。然而，在独立的情况下用适量的单克隆抗体处理患者的血样表现出CD3⁺，CD56⁺&CD16⁺和CD56⁺以及CD16+CD3⁺细胞的相对数目的显著增加。

具有其它状况的患者的血样表现出这些细胞水平的各种改变，这似乎取决于处理前、处理时存在的B淋巴细胞的数目，以及可能取决于该患者的临床状况。

CD45和CD14组

CD45抗原存在于所有人类白细胞，包括外周血、胸腺、脾和扁桃体中的淋巴细胞、单核细胞、多形核细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞，以及骨髓中的淋巴细胞祖细胞。

CD14存在于70-93％的正常外周血单核细胞，77-90％的胸水和腹水巨噬细胞。该抗原在粒细胞上弱表达，并且不存在于未刺激的淋巴细胞、促有丝分裂剂激活的T细胞、淋巴细胞、红细胞或血小板。

CD45抗原代表一种蛋白酪氨酸磷酸酶，该分子与外部刺激(抗原)相互作用，并且通过Scr家族成员影响信号传导，导致细胞生长和分化的调节。

DR抗原β链在经处理的样品，特别是从B-CLL患者中获得的样品中的参与提示，这种处理影响B淋巴细胞上CD45抗原的水平。发生在DR抗原β链的刺激上的总体免疫表型改变似乎产生不同类型的细胞，它们基于CD45和CD14的表达水平和外形而聚集，外形是通过正向散射和侧向散射(分别确定大小和颗粒多少)确定的，这些结果表示于表6和图表(1、2、3、4)。也参见图7，它证明了用CR3/43抗体处理后CD45^-CD14^-细胞的外形。这些细胞不是造血细胞。

在用本发明的设备处理时，低CD45细胞的相对数目(与未处理样品相比)显著增加，共表达CD45和CD14抗原的细胞的相对数目也是如此。这种类型的免疫表型改变与高CD45细胞的相对数目减少(与未处理样品相比)同时发生。然而，后一种细胞群可以根据外形和CD45的表达程度进一步区分。一种类型非常大，与图表中表示的其它细胞(见图表1、2、3、4)相比具有极高水平的CD45抗原。处理后随时间分析该组(见表6，患者2、3和4，以及图表1)，发现起初CD45+的相对数目随时间剧烈减少，以产生低CD45细胞。然而，24小时后分析血液，发现相反的状况。

样品5和7的免疫表型改变与从其它B-CLL患者获得的其它样品得到的结果相反，这是因为这些样品是在用单克隆抗体孵育的更早期进行的分析。实际上，对处理后血样的序贯分析提示，B淋巴细胞进行的免疫表型改变是时间依赖性的，因为它代表发育的一个阶段，在时间点X测量的免疫表型改变与时间点X以后不同(它并不是一旦诱导就固定)。然而，这些类型的改变必须在身体中以更严格的方式发生，否则将发生免疫病。从没有B细胞恶变的其它患者得到的血样的处理效果在细胞的免疫表型方面表现出各种改变，这是因为B淋巴细胞以低量存在。然而，处理从健康血液供体得到的B淋巴细胞的富集部分表现出的免疫表型改变与具有B淋巴细胞高计数的B-CLL得到的免疫表型改变相似。

CD8和CD3组

CD8抗原决定簇与I类MHC分子相互作用，导致CD8+T淋巴细胞与靶细胞之间的粘附增加。这种类型的相互作用增强了静息淋巴细胞的激活。CD8抗原与蛋白酪氨酸激酶(p56ick)偶联，随后CD8/p56ick复合物可以在T淋巴细胞激活中起作用。

在本发明的设备中用B链的单克隆抗体处理从B-CLL患者获得的血样导致CD3CD8和CD3(很可能是CD4CD3)阳性细胞相对数目的显著增加，因此更清楚地表明起初产生的双阳性细胞正在发育为成熟的T淋巴细胞。这是一个可以用CD19和DR直接测量和用CD8^-CD3^-抗原间接测量的过程。用同一患者经处理血样所进行的随时间的系列评估似乎与等同于胸腺细胞发育的过程一致(表7，患者2、3和4，以及图表1)。

CD8+细胞的相对数目在处理和未处理样品中随时间增加，但在未处理样品中增加至更高的程度。另一方面，CD8⁺CD3⁺细胞的相对数目在未处理样品中随时间减少。然而，当随时间进行测量时，处理血样中CD3⁺细胞的相对数目增加，这些类型的细胞高度对应于CD4⁺CD3⁺单阳性细胞，即一种成熟形式的胸腺细胞。此外，由于这些样品也用其它组(在表3、4、5和6中提到)进行了免疫表型分析，总体改变强烈表明B细胞参与T淋巴细胞祖先和后代的产生。

对B-CLL患者得到的血样(2、3和4号，表1、2、3、4、5、6、7)等分物不做处理，或用PE偶联的DR抗原β链同源区的单克隆抗体和同样的单克隆抗体的非偶联形式进行处理。比较PE偶联的处理清楚表明，CD3阳性细胞和其它相关标记如CD4的相对数目没有改变，而当同样的血样用抗体的非偶联形式进行处理时观察到了显著水平。然而，当随时间进行测量时发现CD45阳性细胞数目的增加，这些细胞表面没有DR抗原表达(见表8)。当随时间进行免疫表型分析时在未处理样品中注意到了相似的结果(表6)。而且，表达低CD45的细胞的相对数目随时间减少，在同一患者的未处理样品中(当随时间测量)也注意到了该现象(见图表1A)。

来自于人血块黄层样品的细胞的FAC分析

在本发明的设备中用CR3/43单克隆抗体处理血块黄层样品导致CD34(干细胞标记)的出现率更高，CD19(B淋巴细胞标记)的出现率更低——见表21。

集落形成测定发现在未处理样品中，绝大多数集落是红细胞类型，而在处理样品中集落类型的改变更明显，主要的集落类型是多能细胞集落，还有粒细胞/巨噬细胞和巨核细胞以及红细胞集落形成单位。

这些结果证明经处理的细胞更能够沿其它淋巴造血途径分化，产生各种特异的细胞系。

C.比较对T淋巴细胞生成具有不同特异性的其它单克隆抗体的作用

CD19和CD3组

在本发明的设备中用DR抗原α链同源区以及MHC I类抗原同源区的单克隆抗体处理血样减少了CD3⁺细胞的数目，增加了CD19⁺细胞的数目。用DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理血样减少了CD19⁺细胞的数目，增加了CD3⁺细胞的数目。用后一种单克隆抗体和环磷酰胺处理发现了同样的作用(表14，B-CLL患者5/6，处理后2小时)。

在同样的样品中进行的CD 19⁺和CD3⁺细胞的前向分析表明，CD3⁺细胞的相对数目仅仅在用DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理的血液中进一步增加(表14，B-CLL患者5/6，处理后24小时)。然而，用环磷酰胺加DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理的血样的前向分析(表14，B-CLL患者5/6，24小时后)表明与同样条件下在2小时的孵育时间下观察到的CD 19⁺和CD3⁺细胞的相对数目相反。

总的说来，与未处理样品相比，用DR抗原α链同源区的单克隆抗体或MHC I类抗原α链同源区的单克隆抗体处理血样增加了CD19+细胞(全B标记)的相对数目。用DR抗原α链的单克隆抗体或I类抗原的单克隆抗体处理的血样中CD19^-CD3^-细胞的相对数目略微减少(见表14和图表2、3、4)。用I类抗原的单克隆抗体处理患者09的血样增加了CD3+细胞的相对数目，略微减少了CD19⁺和CD19^-CD3^-细胞的相对数目。然而，用DR抗原α链或β链的单克隆抗体处理从健康的血液供体得到的B淋巴细胞富集制剂表现出的免疫表型改变与从B-CLL患者得到的免疫表型改变相似。

用DR抗原β链的单克隆抗体处理HIV⁺和IgA缺陷患者增加了CD3⁺细胞的相对数目，减少了CD19⁺细胞的相对数目。然而，用I类抗原同源区的单克隆抗体处理同样的血样没有产生相同的作用。用DR抗原β链、I类抗原和CD4抗原的单克隆抗体处理从B细胞缺乏患者(34/BD和04/BD)获得的血样，表现出了各种免疫表型改变。

CD4和CD8组

也用CD4和CD8组对用CD19和CD3组(表19)进行过分析的血样进行免疫表型分行(表15)。这两组的结果似乎一致。用DR抗原β链同源区的单克隆抗体或同样的单克隆抗体加环磷酰胺孵育B-CLL患者的血样2小时(表15，患者5/6和10，图表2、3和4)，增加了CD8⁺和CD4⁺细胞和共表达两种标记的细胞的相对数目。另一方面，用DR抗原α链同源区或I类抗原α链同源区的单克隆抗体处理同样的样品不产生同样的作用。

比较用DR抗原β链的单克隆抗体加环磷酰胺孵育2小时和24小时后获得的免疫表型趋势，发现CD4和CD8阳性细胞相对数目的相反改变(表15，B-CLL患者5/6，2小时和24小时)，这种改变与用CD19和CD3组分析同样血样(表14，患者相同)所获得的结果一致。后一发现表明，后续的分化是可逆的，因为未分化细胞可以分化为T淋巴细胞或B淋巴细胞。

DR和CD3组

用DR和CD3(表6)组获得的免疫表型改变证实了由CD19和CD3组以及CD4和CD8组获得的结果(表14和15以及图表2、3和4)，该结果是用DR抗原α或β链同源区的单克隆抗体或I类抗原的单克隆抗体，或DR抗原β链同源区的单克隆抗体加环磷酰胺处理同样的血样后2小时分析的。

从该结果中发现，DR抗原β链同源区的单克隆抗体非常能够导致从DR⁺细胞产生CD3阳性细胞。

此外，例如涉及DR抗原α链或DR抗原β链与环磷酰胺的联合参与(延长的孵育时间)的处理促进了CD19⁺细胞或DR⁺细胞相对数目的增加。

CD56&16和CD3组

在本发明的设备中用DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理血样，尤其是处理具有B淋巴细胞高计数的B-CLL患者增加了CD56&16阳性细胞的相对数目。

在这些患者中，在用β链的单克隆抗体处理血样后也增加了CD3⁺和CD56⁺以及CD16⁺CD3⁺细胞的相对数目，证实了早期同样处理中用CD3和CD19以及DR和CD3组分析同样的血样时观察到的结果。

CD45和CD14组

在本发明的设备中用DR抗原β或α链的单克隆抗体或β链的单克隆抗体加环磷酰胺或I类抗原的单克隆抗体处理后的血样也用CD45和CD14组进行了分析(表18)。对低CD45、高CD45和中等CD45的限定是权威的。用DR抗原β链的单克隆抗体或用该单克隆抗体加环磷酰胺处理血样5/6(在2小时)产生低CD45⁺细胞并增加中等CD45⁺细胞的相对数目。然而，前一种处理增加了高CD45⁺细胞的相对数目，后一种处理减少了中等CD45⁺细胞的相对数目，这些改变似乎是时间依赖性的。

用I类抗原的单克隆抗体处理的患者5/6和10(B-CLL)的血样表现出中等CD45⁺细胞相对数目的减少，在同样处理之后的血样09和HIV⁺中与未处理样品相比也注意到了相似的观察结果。与未处理样品或用DR抗原β链的单克隆抗体处理相比，用I类抗原的单克隆抗体处理HIV+和IgA/D患者的血样增加了低CD45⁺细胞的相对数目。然而，这些患者的血样在用DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理后表现出中等CD45⁺细胞相对数目的减少。在I类抗原的单克隆抗体处理后，IgA/D患者血样中的中等CD45⁺细胞增加。在用MHC II类抗原的DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理的血样中注意到了非常大的、颗粒非常多的、表达高水平CD45抗原的细胞(见图表1、2、3、4)。

CD8和CD28组

CD28抗原存在于大约60-80％的外周血T(CD3+)淋巴细胞、50％的CD8⁺T淋巴细胞和5％的未成熟CD3^-胸腺细胞。在胸腺成熟过程中，CD28抗原表达从大多数CD4⁺CD8⁺未成熟胸腺细胞上的低密度增加至几乎所有成熟CD3⁺、CD4⁺或CD8⁺胸腺细胞上的更高密度。CD28的表达也将CD8⁺淋巴细胞分为两个功能组。CD8+CD28+淋巴细胞介导同种异体抗原特异性的细胞毒性，这是I类主要组织相容性复合物(MHC)限制的。细胞增殖的抑制由CD8⁺CD28^-亚型介导。CD28抗原是一种细胞粘附分子，作为存在于激活的B淋巴细胞上的B7/BB-1抗原的配体。

在本发明的设备中用DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理B-CLL患者(表19，患者5/6和8)增加了CD8⁺，CD28⁺和CD8⁺CD28⁺细胞的相对数目，而其它类型的处理则没有。

CD34和CD2组

CD34抗原存在于不成熟的造血前体细胞和骨髓中的所有造血集落形成细胞，包括单能(CFU-GM，BFU-E)和多能祖先(CFU-GEMM，CFU-Mix和CFU-blast)。CD34也在基质细胞前体上表达。在正常骨中，末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)⁺B和T淋巴细胞前体为CD34⁺，CD34抗原存在于表达CD33抗原但缺乏CD14和CD15抗原的早期骨髓细胞，以及表达CD71抗原并微弱表达CD45抗原的早期红细胞。CD34抗原也存在于毛细血管内皮细胞以及大约1％的人胸腺细胞。正常外周血淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和血小板不表达CD34抗原。CD34抗原密度在早期造血祖细胞上最高，当细胞成熟时减少。在完全分化的造血细胞上不存在该抗原。

未定型的CD34⁺祖细胞是CD38^-，DR^-并缺乏细胞系特异性抗原，如CD71，CD33，CD10，和CD5，而CD34⁺细胞是细胞系定型的，以高密度表达CD38抗原。

大多数CD34⁺细胞相互表达CD45RO或CD45RA抗原。大约60％的急性B淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病表达CD34抗原。该抗原在慢性淋巴细胞白血病(B或T细胞系)或淋巴瘤上不表达。CD2抗原存在于T淋巴细胞和天然杀伤淋巴细胞(NK)的一种亚型。

结果见图表2、3和4。

分析用DR抗原β或α链的单克隆抗体处理B-CLL患者的血样(表20，患者5/6，2小时)，发现CD34+相对数目的显著增加，用前一种抗体处理后，CD34+CD2+细胞相对数目显著增加。由于已经用前面提到的各组(见表14-19)对相同血样进行了免疫表型分析，这里观察到的CD34⁺和CD34⁺CD2⁺细胞相对数目的增加似乎与CD4⁺CD8⁺，CD8⁺CD3⁺和CD4⁺CD3⁺单阳性(SP)细胞相对数目的增加一致。此外，这些似乎专门涉及DR抗原β链的发现间接支持该过程通过B淋巴细胞退化导致T淋巴细胞生成。

在分析同样的处理时，24小时后CD34+细胞似乎减少到一定水平，从而导致T淋巴细胞相对数目的进一步增加。该逆向分化过程起初导致T淋巴细胞生成，该过程可被反转，导致B淋巴细胞生成。前一种现象是在用DR抗原β链的单克隆抗体加环磷酰胺2小时所观察到的，而后一过程是在对同一样品进行同一处理时的24小时孵育期所注意到的(图表2)。

用DR抗原β链的单克隆抗体处理HIV+患者的血样显著增加了CD34+和CD2+CD34+细胞的相对数目，用同时加入的HLA-DR抗原β链的单克隆抗体和同样抗原的α链的单克隆抗体处理的相同血样也是如此。然而，用HLA-DR抗原α链的单克隆抗体处理该血样不影响CD34⁺细胞的水平。用HLA-DR抗原β链的单克隆抗体和同样抗原的α链的单克隆抗体，和同时加入两种单克隆抗体处理从一名6日龄婴儿(BB/ST表20)获得的血样，产生以下免疫表型改变。

在分析未处理血样时，CD34⁺和DR⁺细胞的相对数目显著增加，用β链的单克隆抗体处理时，CD34⁺细胞的相对数目进一步增加，但用HLA-DR抗原α链的单克隆抗体处理或用一起加入的该分子的α链和β链的单克隆抗体处理时该数目减少。然而，后一种处理增加了CD34⁺CD2⁺细胞的相对数目，当单独用HLA-DR抗原β链的单克隆抗体处理时产生相反的结果。当24小时后分析同一患者经处理或未处理的血液等分物时，上述所有处理均使CD34⁺的相对数目减少，除用HLA-DR抗原β链的单克隆抗体处理时维持了更高的水平。后一种处理在24小时后继续减少CD34⁺CD2⁺细胞的相对数目。

这些结果表明，HLA-DR抗原通过β链的涉及促进了从B-CLL患者的CD2+CD34+池或B淋巴细胞等更成熟的细胞类型产生更多CD34⁺细胞，这些结果表明这种类型的处理促进了逆向分化。然而，24小时后血样的免疫表型分析提示，这些细胞类型似乎都存在于另一种细胞系，在这种情况下细胞似乎存在于或将其定型于髓细胞系，这在用CD7和CD13&33进行的经处理血样的分析中被观察到。

在用MHC II类抗原β链同源区的单克隆抗体处理B-CLL和健康个体富集(用CD19珠)部分的B淋巴细胞时，外形改变了其免疫表型特征。这些伴随了B淋巴细胞外形的改变。观察到未处理血涂片中在玻片上形成集落的B淋巴细胞被粒细胞、单核细胞、大量原始形态的细胞和有核红细胞代替。在处理或未处理血涂片上没有观察到有丝分裂特征或显著的细胞死亡。

表20的结果也进一步证明了一个重要的发现，即根据本发明的方法，可以通过使更成熟的未分化细胞逆向分化而制备未分化细胞。

D.显微镜照片

除了上述抗原检验，还使用显微镜从视觉上遵照本发明的方法。可以对本发明的设备进行编程，使其通过跟踪工具自动跟踪改变。

在这一点上，图8是在本发明的方法之前分化B细胞的显微镜照片。图9是根据本发明的方法通过B细胞逆向分化形成未分化细胞的显微镜照片，其中该试剂是HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体。未分化细胞是暗染的细胞团。图10是同样的未分化细胞的显微镜照片，但放大倍数较低。

因此图8-10从视觉上证明了通过本发明的方法，B细胞逆向分化为未分化干细胞。

图11是在本发明方法之前的分化B细胞的显微镜照片。图12是根据本发明的方法通过B细胞逆向分化形成未分化细胞的显微镜照片，其中使用的试剂是HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体。同样，未分化细胞是暗染的细胞团。图13是从图12的相同未分化细胞形成分化粒细胞的显微镜照片。

因此图11-13从视觉上证明通过本发明的方法将B细胞逆向分化为未分化干细胞，然后将未分化细胞定型为新的与原始分化细胞不同系的分化细胞。

也对用CR3/43单克隆抗体处理的B-CLL患者的血样进行了显微镜实验，如前面所讨论的，BCLL的血液可以用于帮助研究逆向分化过程，因为该血液含有的B淋巴细胞比正常数目高。该结果在图14-17中详细表示。

图14表示在两种不同的放大倍数下，从BCLL患者得到的未处理血样。未处理B淋巴细胞(蓝色细胞)表现出典型外形，即浓缩的染色质结构和稀少的细胞质。剩下的细胞是红细胞。

用抗体CR3/43处理血样一开始导致成簇的B淋巴细胞聚集(图15)。

成簇的B细胞逐渐失去它们的典型外形，其特征在于形成鹅卵石样细胞区域，染色质结构的去浓缩，典型核仁的出现，细胞体积的扩大和未分化细胞典型的细胞质嗜碱性(图16)。疏松的(去浓缩)染色质结构是未分化细胞与分化细胞相比的一种重要特征。这可能是由于需要更广泛接近转录单位，以确定沿给定细胞系定型所需要的基因表达的改变。相反，已知更分化细胞具有更浓缩的染色质结构，因为只需要少量染色质具有转录活性。

未分化细胞的出现总是伴随具有分化外形的细胞的出现(17A-17J)。重要的是，这些细胞不能通过增殖而增加数量，这是因为(i)孵育时间对于发生一次或多次完整的细胞分裂来说太短，(ii)没有看见有丝分裂特征，以及(iii)在处理之前和之后白细胞的绝对数目保持相同。此外，发现较不分化的祖先与它们的更分化后代(见图17J的骨髓前体)相关，这表明这些特异的细胞是通过分化产生的。

显微照片图17A-17J表示用CR3/43单克隆抗体处理B-CLL淋巴细胞后所看到的分化细胞的类型：血小板(PI)-图17A，中性粒细胞(Ne)-图17B，嗜酸性细胞(Eso)-图17C，巨核细胞(Meg)-图17D，嗜碱性细胞(Ba)-图17G，淋巴细胞(Ly)-图17H，单核细胞(Mo)-图17I和骨髓祖细胞(Mp)-图17J。也看到了红细胞祖先和巨噬细胞(未给出数据)。

所以，总之，这些外形结果表示BCLL患者样品中B细胞外形的改变，这些患者中具有高水平的成熟B淋巴细胞。显微镜照片表现了B淋巴细胞的外形改变，它们首先聚集成簇，然后出现各种具有从祖细胞至分化细胞的分级的外形范围的细胞(中性粒细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、巨核细胞、血小板、淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞、刺粒细胞和基质样细胞)。

此外，而且非常重要的是，看见了红细胞和髓细胞祖先(图17J-数据未示出)。该髓细胞祖先可以通过外形清楚地同其它细胞区分，它们更大，具有独特的核形态，并含有胞质颗粒。

因此，显微镜数据从外形上支持以细胞表面标记表示的流式细胞术数据。这些数据允许得出结论，即用MHC HLA-DRβ链的抗体处理B淋巴细胞导致B淋巴细胞数目的减少以及未成熟前体细胞等其它造血系细胞数目的增加。

也用显微镜观察了通过本发明的方法使采用MHC II类α链的抗体(单克隆抗体TAL.1B5)处理的T细胞逆向分化为未分化干细胞，然后将未分化细胞定型为新的分化细胞，该细胞与原始的分化细胞不同系(数据未示出)。

E.在逆向分化的淋巴细胞中分析VDJ重组重排

通过本底，用于这些实验的分化细胞(B淋巴细胞或具有某些T淋巴细胞特征的细胞)具有已经进行重排而分别编码成熟Ig或TCR的基因。在重排过程中，不作为最终的一部分的DNA中间部分、被表达的TCR或Ig基因、即在这些受体之间的可变(V)区编码片段和恒定(C)区编码片段之间的原始DNA被从基因组中切除。这些被切除的片段在细胞中以染色体外DAN的形式存在。对于真正逆向分化的细胞，被切除的DNA将重新插入基因组，使细胞处于与它们的原始分化之前相似的状态。因为这一点，与作为分化状态的特征的重排DNA相比，当DNA返回到其未重排或生殖系状态时，互补于重排基因中的序列的探针将与更大的DNA限制片段杂交。

1.Daudi细胞中TCR基因的重排

在产生图18所示DNA印迹的实验中，采用了公知细胞系Daudi，即一种具有一个重排TCR基因(另一个被去除)的B细胞淋巴瘤。从Daudi细胞制备基因组DNA，并且用EcoRI消化，进行凝胶电泳，然后用标记的TCRβ链DNA探针进行探测。采用Daudi细胞，而不是从病人中纯化的B淋巴细胞，这是因为这些细胞是克隆上相关的，而且来自于具有相同基因重排的同源细胞群，这可以通过被消化的基因组DNA的DNA印迹清楚地观察到。在正常血样中，不同的细胞具有不同的重排，所以DNA印迹将作为涂片出现。

编码TCRβ链的功能基因在淋巴细胞中聚集，这是通过在淋巴细胞成熟过程中的一系列体细胞染色体重排形成的，而这种重排使V片段、D片段和J片段聚集在一起。这些重排过程的非常清楚的解释见一本标准的大学教科书：Genes VI，Lewin，Oxford University Press.1997(P1994-1023)。下面引用了其一些特定页。

首先，通过重组过程在D-J连接反应中将D片段与一些J片段连接。然后，将许多可能的V片段(＜60)之一连接于得到的DJ片段(V-D连接)，以便形成一个完整的TCRβ链基因。恒定区基因在重排VDJ片段紧邻的下游，但可能有间插J片段，它们在RNA加工过程中被切除，使恒定区基因外显子邻近于重排的VDJ基因片段(Lewin，p998)。

在人类细胞中，有两种不同的TCRβ链恒定区基因片段，称作Cβ1和Cβ2，它们存在于两个不同的基因座，每一个前面都有一簇6或7个连接区(Jβ)基因片段(Jβ1和Jβ2)和一个D片段(Dβ1和Dβ2)(见图1，Toyonaga et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：8624-8628和Lewin，p1017)。

导致V，D和J-C片段邻近的重组事件是通过多个蛋白催化的，包括RAG-1和RAG-2，它们识别存在于V，D和J-C基因序列重组端的九聚体和七聚体序列。根据这些九聚体/七聚体序列的方向，重组导致反向或去除。两种事件都导致基因组DNA限制酶片段模式的改变。此外，去除事件并不一定导致被切除片段的完全丢失。被切除片段的末端可以被重新连接，产生保留在细胞中DAN环(Okazaki et al.，1987，Cell49：477-85；Davis et al.，1991，J.Exp.Med.173：743-6；Livak and Schatz，1996，Mol.Cell Biol.16：609-18；Harrimanet al.1993，AnnuRev Immunol.11：361-84)。当然，每种基因片段都有两个等位基因，因为细胞具有二倍体染色体互补。

在正常种系状态下，Cβ1和Cβ2基因按照Toyonaga et al.，1985中的图1所示排列。用EcoRI对基因组DNA进行限制性消化将产生两个相关的条带，它们可以被实验中采用的探针检测到(该探针为标记的来源于Cβ1的DNA片段，由于高度序列同源性，它们也与Cβ2杂交)，这两个条带为：(i)含有Cβ1序列的12kb条带；(ii)含有Cβ2序列的4kb条带。该种系构型可以在未分化的未成熟细胞中看到(图18A)。该种系构型也由图18的第3道(用CR3/43抗体，2小时)进行了完整的说明，产生与A道相同的模式。

在分化状态下，Cβ1和Cβ2的两个等位基因被重排，这样在Cβ1基因座就不是一个12kb片段，或者在Cβ1基因座就不是一个4kb片段。实际上，在凝胶上不存在来源于Cβ1基因座的杂交片段(这是因为作为重组的结果从两个Cβ1等位基因去除了杂交序列)。对于Cβ2基因座，现在实际上有两个主要的条带对应于两个染色体上重排得到的不同“等位基因”。最大的条带小于4kb，对应于两个重排等位基因之一的片段。最下面的条带是另一个重排等位基因的片段。中间的小条带可能来自于具有不同重排的Daudi细胞的亚克隆——所以它以等位基因的任何一个的亚摩尔量存在。然而，重排状态非常清楚地表示于第1道，其中两条主要的条带都非常清楚。

用结合于MHC-DRα链的阴性对照抗体(TAL.1B5)处理2小时实际上导致上面的条带消失，而最下面的条带与第1道中的未处理细胞具有相同的强度(见第2道)。对此的可能解释是细胞在分化，进一步导致在一个等位基因的Cβ2基因座的另一重组事件，这导致Cβ2序列丧失。这与已知现象的完全一致。

用阴性对照抗体处理24小时似乎恢复了在未处理细胞中看到的3个条带(见第4道)。然而，这些条带实际上比在第2道中所看到的迁移到了更低的位置。还不清楚这是为什么。一个可能的解释是发生了已经去除的序列的重新整合，与去环-切除-重新整合模型(Malissen et al.，1986，Nature 319：28-32)一致。然而，用TAL.1B5抗体在2小时或24小时没有观察到该结果，说明对种系模式进行了重排。第2和4道实际上代表阴性对照-α链的抗体不导致种系序列的恢复。

相反，用MHC-DRβ链的单克隆抗体(CR3/43)处理后2小时获得的结果表现出对应于种系构型的模式，即12kb条带和4kb条带(比较第3道和A道)。换句话说，这些结果表示等位基因的Cβ1和Cβ2基因座的种系限制模式得到了恢复。

从这些结果我们得出结论，在第3道中看到的条带模式表示分化细胞基因组DNA的重排，以重新产生种系构型。

该发现的重要性不应被忽视。可以对包括去除在内基因组重排进行逆转，使基因组恢复到分化过程发生之前的状态。最可能的解释是分化中由Cβ2等位基因重排导致的反向被逆转，导致失去12kb条带的Cβ1序列的去除也被逆转。Cβ1序列消失的来源似乎是最初的去除事件中核内存在的附加形环状DNA。该环状DNA的存在在先有技术中已有记载(见引用的参考文献)。然而，发生这种种系基因组恢复的确切机制并不重要，重要的是它确实发生了。

在本发明的设备中用MHC-DRβ链的单克隆抗体(CR3/43)继续孵育，产生了更复杂的条带模式(第5道)。然而这些条带并不代表未处理对照中的相同条带。具体地说，仍然存在与探针杂交约12kb的片段(″Cβ2等位基因″)。此外，重要的是理解标有″Cβ2等位基因″的条带并不对应于未处理对照中观察到的小于4kb的条带(第1道)。第5道中观察到的结果的最可能的解释是发生了第二次重排过程，因为杂交模式类似于其中的T细胞的特征在于重排的TCR基因(该解释与流式细胞术数据一致，该数据表现出具有T细胞的特征性细胞标记的细胞增加)。然而，不管确切的分子解释如何，在暴露于CR3/43抗体24小时后在第5道看到的结果支持2小时暴露后第3道的结果。

2.B-CLL细胞中Ig基因的重排

用慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)患者外周血细胞获得了图19B所示的DNA印迹。从这些大量单克隆B细胞制备基因组DNA，用BamHI和HindIII消化，进行凝胶电泳，并且用标记的TCR DNA探针进行探测。用这里所描述的CR3/43(抗HLA-DR、DP和DQ的II类MHC链)处理这些B-CLL细胞。用放射性标记Ig J区探针探测该印迹。A道中从未处理细胞获得的两条带代表两个重排的Ig等位基因(父源和母源)。这些条带在B道中不出现，B道表示用抗体处理细胞24小时后的模式。在它们的位置出现了种系Ig基因的特征性5.4kb条带。

在图19A所示另一实验中，对细胞不进行处理，或处理用抗II类MHCβ链抗体所指示的时间。在分化(对照)和抗体处理的B-CLL细胞中(凝胶的左半部分)通过PCR扩增IgVDJ区。这从为处理细胞产生了VDJ扩增产物。然而，在抗体处理的细胞中没有观察到这样的条带，因为作为插入经切除的基因组DNA，“种系”DNA构型不易经受用VDJ的特定引物进行的PCR扩增。相似的实验(凝胶右侧)允许我观察到对照，即编码β肌动蛋白的管家基因的行为。不管处理如何，β肌动蛋白PCR扩增产物没有差异。因此，该“对照”基因似乎不受逆向分化过程的影响，该过程在同样条件下使同样细胞的Ig基因产生很大改变。

上面提到的结果表示用涉及适当细胞表面受体的试剂处理细胞可以诱导这些细胞的逆向分化，这通过观察分化状态的特征性染色体DAN重排的逆行而在分子水平上证实(和监测)。因此，在分子遗传学和外形证据的基础上可以得出结论，用涉及II类MHCβ链的试剂(mAb)处理B淋巴细胞系的细胞可以使其逆向分化。相反，用涉及II类MHCα链的试剂处理同样的细胞不相似地诱导逆向分化。它们似乎沿B细胞途径分化(正向)。

F.对B淋巴细胞逆向分化的进一步研究

按上述方法在本发明的设备中用CR3/43抗体处理BCLL患者的FACsVantage纯化的BCLL细胞(95％纯的B细胞)，用流式细胞术处理细胞。下面的表A中表示的结果进一步证实了前面得到的结果。具有B淋巴细胞系的特征性细胞表面标记(CD19，CD20和CD22)的细胞的数目大大减少，同时出现了CD34⁺细胞数目的显著增加。从表A中需要注意的重要一点是，同时为CD34阴性和细胞系阴性的细胞数目增加。这些未分化细胞不定型为造血系，在分化中先于CD34⁺干细胞。此外，通过光学显微镜检查样品，发现许多粘附细胞类型具有非造血细胞的外形特征。

表A

标记	0小时	2小时	24小时
				CD20	73	67	16
CD14	0	3	23
				CD34	0	1	23
CD7	0	2	0
				CD16	8	3	2
CD19	95	71	1
				CD22	5	3	2
CD33	0	0	0
				CD3	0	0	0

也证明了失去CD19标记，伴随在同样的细胞上出现CD34细胞表面标记，并且用共聚焦显微镜即时记录在录像带上。加入CR3/43单克隆抗体之前的B淋巴细胞用FITC偶联的CD19的单克隆抗体染成绿色。在加入CR3/43单克隆抗体之后，细胞失去了它们的绿色荧光，开始用PE/Cy5(或quantum红)偶联的CD34的单克隆抗体染成红色，而不是绿色(见图23，它表示从时间延迟录像中得到的两张静止图象)。该结果清楚地证明，在B细胞逆向分化中，细胞系特异性标记如CD19消失，而干细胞标记如CD34重新表达。

G.诱导B淋巴细胞逆向分化为造血干细胞的其它试剂

起初的研究实际上鉴定了三种试剂——粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素和mAb CR3/43。在本发明的设备中用这三种试剂之一，以上述对CR3/43和TAL.1B5所描述的方法处理富集的、纯化的正常B淋巴细胞制剂，并且按上述内容用流式细胞术检查处理过的样品。与阴性对照相比，用GM-CSF、红细胞生成素或mAbCR3/43处理的所有三种样品都表现出与逆向分化一致的改变。具体地说，所有三种试剂都增加了细胞群中CD34⁺细胞的相对数目(见图20)。然而，用CR3/43观察到了最大的效果，因此，选择该试剂用于这里提到的更详细的研究。

H.由逆向分化过程产生的造血干细胞的特性

集落形成测定

为了证实通过流式细胞术观察到的CD34+细胞和通过显微镜鉴定的未分化细胞具有未分化造血细胞的特性，对用II类MHCβ链的抗体(CR3/43-见上文)处理过的血样进行集落形成测定——即本领域中公知的用于评估原始造血细胞能力的标准方法。该集落形成测定可以在本发明的设备中自动进行，作为跟踪机制的一部分。

造血干细胞的体外集落测定允许对具有增殖、分化和发育为表型和功能成熟的髓细胞和/或红细胞的能力的原始祖细胞进行定量。例如，在生长因子存在下，当干细胞种植/固定于软凝胶基质中时，可以进行体外集落生长(增殖)和分化。

图21是本发明的方法产生的干细胞的集落测定，采用反相亮视野显微镜。在此测定中，用CR3/43mab处理从健康血液供体的血块黄层得到的B细胞，然后按材料和方法部分所述进行集落测定。

图21的(a)-(e)说明：

a)以亮视野显微镜3倍放大所观察的培养皿中表现出红细胞、骨髓细胞和混合(由成熟骨髓细胞和红细胞组成)集落，它们容易用肉眼观察到。每种集落通过增殖和随后的分化由单个造血干细胞产生。

b)MIX-CFC，该集落产生于单个多能造血干细胞(能够产生骨髓细胞和红细胞系细胞的干细胞)。

c)M-CFC，该集落由巨噬细胞组成。

d)GM-CFC，该集落由髓系组成，包括巨噬细胞、粒细胞和巨核细胞。

e)BFU-E，该集落由属于红细胞系的细胞组成，如晚幼红细胞和去核红细胞。这些细胞的红色表示它们含有许多血红蛋白。该集落很大，说明它来自于极原始的干细胞。

用B-CLL细胞获得了相同的结果(数据未示出)。未处理的B细胞没有产生造血集落(数据未示出)。因此这些结果证明，在用II类MHCβ链的单克隆抗体CR3/43处理的血样中存在存活的造血干细胞，但未处理血样中则不存在。

长期培养

长期测定检查造血干细胞的自我更新潜能。在该培养中，骨髓造血的大多数成分在体外增殖。该培养的重要特征是持续的造血，这是在未加入生长因子的情况下发生的。在此测定中，造血过程绝对取决于骨髓来源的基质细胞粘附层的建立。基质细胞(由许多非造血细胞，如成纤维细胞、脂肪细胞等组成，并且包括所有属于间充质系统的细胞类型)通过提供适当的环境(分泌生长因子并合成细胞外基质)而促进干细胞的存活、自我更新、增殖和分化，从而支持造血。

在此测定中，用CR3/43mab处理从健康血液供体的血块黄层获得的B细胞，导致在加入抗体几小时内形成粘附层(用B-CLL细胞也获得同样的结果)，并且随时间增加。

粘附层由基质细胞组成，基质细胞(覆盖细胞，主要由成纤维细胞/间充质类型的细胞组成/用反相亮视野显微镜观察时为光折射大的细胞)在12周内和更长的时间内支持造血细胞的生长和发育(这些细胞表现出与造血细胞的紧密接触)。在粘附层中也可以看到成组的原始造血细胞(也称作鹅卵石区/暗细胞簇)，它们是长期产生造血细胞的来源。

在基质层顶部的非粘附层(亮细胞簇)由形成造血灶簇的小圆细胞组成。该层含有干细胞和造血系统的更定型祖先。非粘附层可以产生MIX-CFC，GM-CFC，M-CFC，BFU-E(用集落测定判断)和CFU-F(集落形成单位-成纤维细胞)(当用长期培养基进行亚克隆时)。

I.用HLA-DRβ链的抗体处理的细胞的RT-PCR

在用CD34、c-kit(干细胞因子的配体)、ε-血红蛋白(血红蛋白的胚胎形式)和β肌动蛋白的CR3/43mab处理的Ramos(B淋巴瘤)和K562(红细胞白血病)细胞中测定到了基因转录。

方法

在CR3/43mab处理前和处理后用RNAZOL(CINA BIOTECH)提取mRNA。在室温下用4μl标准缓冲液、2μl dNTPs、1μl RNASIN、1μl反向引物(随机六聚体引物)和1μl MMLV反转录酶孵育5分钟，使mRNA接受六聚体引发的反转录。将该混合物在38℃下进一步孵育1小时。然后采用设计用于扩增CD34，c-kit，ε-血红蛋白和β肌动蛋白的序列的引物在标准条件下对混合物进行PCR。根据公开的数据，在Randell Institute Kings学院合成引物。

结果

所获得的结果显示，用CR3/43mAb处理后，β肌动蛋白mRNA的水平没有改变，而和ε-血红蛋白mRNA的水平都显著增加。CD34和c-kit的结果进一步支持了前面的详细数据，这些数据证明B淋巴细胞逆向分化产生造血干细胞。

从ε-血红蛋白获得的结果甚至更有趣，因为ε-血红蛋白正常情况下只在胚胎细胞表达。因此用CR3/43mAb处理不仅产生造血干细胞，甚至还可以产生更原始的未分化细胞，如胚胎干细胞。

J.总结

简言之，本发明的设备可用于将分化细胞逆向分化为干细胞。体外实验描述的例子揭示了非常有趣和开创性的发现，该发现是关于T和B淋巴细胞的个体发生和发育，它们可用于产生干细胞，从而在大约几小时内影响外周血样中的淋巴造血细胞生成。

用II类抗原β链同源区的单克隆抗体处理从B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)患者得到的外周血样，导致单阳性(SP)T细胞和它们的祖细胞的相对数目显著增加，它们的祖细胞对于胸腺细胞标记CD4和CD8抗原是双阳性的，这些是同时共表达的。然而，这些现象总是伴随B淋巴细胞相对数目的显著减少。当用II类抗原α链同源区或I类抗原同源区的单克隆抗体处理同样的血样时没有发现这些结果。

在本发明的设备中用HLA-DRβ链同源区的单克隆抗体处理从B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)患者得到的全血，似乎导致T淋巴细胞生产。该事件是以共表达CD4和CD8标记的双阳性细胞的出现、表达CD34的细胞的出现以及伴随出现的CD4⁺CD3⁺和CD8⁺CD3⁺细胞数目的增加为标志的。此外，在这些细胞产生过程中发生的免疫表型改变与胸腺细胞发育中的改变相同，特别是随时间测量时更是如此。

发现B淋巴细胞总是失去CD19，CD21，CD23，IgM和DR等标记，这与CD34⁺和CD34⁺CD2⁺细胞的出现、CD7⁺细胞的增加、CD8⁺CD28⁺和CD28⁺细胞的增加、CD25⁺细胞的增加、CD10⁺和CD34⁺细胞以及CD34⁺和CD19⁺细胞的出现、CD5⁺细胞、以及表达低水平CD45抗原的细胞的增加一起发生。这些改变是由于用HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体进行了处理。

与这种处理相关的免疫表型改变与B细胞逆向分化和随后的定型(即重新定型)一致，因为B-CLL患者血液中的大多数白细胞为B淋巴细胞。而且，B-CLL患者的B淋巴细胞在用环磷酰胺和HLA-DR抗原β链的单克隆抗体处理后被诱导成为T淋巴细胞，它们可以在用该处理长时间孵育后逆转为B淋巴细胞。

用CD16&56和CD8及CD3组对HLA-DR抗原β链的单克隆抗体处理的样品进行分析，表达这些标记的细胞的相对数目稳定增加，这与用CD19和CD3以及DR和CD3等组所测定的结果一致。用比浊法和免疫电泳进行的HIV患者的经处理和未处理样品上清液的研究发现IgG水平的增加，说明B细胞已经经过了血浆细胞期。前面提到的细胞的相对数目的增加也伴随表达CD56&16抗原的中等大小、颗粒非常多的细胞以极高的量出现。其它极大并且颗粒非常多的细胞也瞬时观察到，它们对于CD34是阳性的，对CD4 CD8标记为双阳性。也观察到了其它瞬时细胞，它们较大，含有颗粒，对于CD3和CD19为阳性。在大多数B淋巴细胞上存在的CD25消失，代之以由新形成的T淋巴细胞表达，观察到T淋巴细胞的数目总是增加。

用DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理B-CLL患者的全血后出现了CD28⁺CD8⁺和CD28⁺细胞。这些发现是由于用HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理了血液。

以此方式产生的T淋巴细胞生成也在健康血液供体的外周血、脐带血、骨髓、HIV⁺个体和AIDS患者等各种感染的患者、从健康血液供体血样得到的B淋巴细胞的富集部分中观察到。此外，在用HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理的两名B-CLL患者的样品中进行的髓细胞标记分析显示了表达髓细胞标记如CD13和CD33的细胞的相对数目增加。这些标记与CD56&16或CD7抗原共表达。然而，在单独的细胞群中观察到了具有T淋巴细胞标记并且没有髓细胞抗原的CD7+细胞的相对数目。在未处理样品或用I类抗原或HLA-DR抗原α链同源区的单克隆抗体处理的样品中没有发现这些特定的观察结果(见图表2和3)。这些最终的结果表示，一旦通过HLA-DR抗原β链激发了B淋巴细胞，它们就不能返回为T淋巴细胞祖细胞，但可以存在于髓细胞和红细胞系中。

因此，本发明中的数据证明，在本发明的设备中，(i)可以将健康细胞从一个细胞系转化为具有一些其它细胞系细胞的细胞表面标记和外形特征的细胞，以及(ii)可以从分化的B淋巴细胞和T淋巴细胞获得具有原始祖细胞的细胞表面标记和外形特征的细胞(例如干细胞)。

应该注意，已经用BCLL细胞进行了一些实验。BCLL细胞是可以分化至血浆细胞的最终分化状态的成熟B淋巴细胞。此外，由于染色体缺陷，它们表现出高水平的增殖，因此BCLL患者血液中存在大量B淋巴细胞。通过与先有技术描述的许多肿瘤细胞进行比较，在用于本发明的方法之前，BCLL细胞没有进行任何形式的有限的逆向分化。而且它们也没有以基因组结构、细胞标记或细胞外形的形式表现未分化细胞的任何特征。它们都是成熟的B淋巴细胞。

因此，尽管某些恶性细胞可能具有一定程度的未分化细胞的特征，对于BCLL细胞来说则并非如此，它们是研究B淋巴细胞的理想实验系统。实际上，在与这些实验相关的任何方面，BCLL和Daudi细胞并不能从正常细胞中完全区分出来。事实上，Martensson et al.，1989，Eur.J.Immunol.19：1625-1629(见P1625rhs.1^5tpara)已经证实了BCLL细胞作为模型系统的适当性。

此外，用CR3/43单克隆抗体处理从健康供体血样得到的血块黄层使CD34(干细胞标记)的出现率更高，CD19(B淋巴细胞标记)的出现率更低。

应该注意，用本发明的方法产生的干细胞可以是任何组织的干细胞，不限于淋巴造血祖细胞。

对本发明的其它修饰对本领域技术人员来说应该是明显的。

本领域技术人员应该很容易理解，本发明的设备不必限于使用这里所公开的包含定型细胞的细胞群和/或试剂，并且适用于任何要求用含有试剂的流体混合和孵育的程序。

在此引入前面提到的所有公开文献作为参考。对本发明的各种修饰和改变对本领域技术人员来说应该是明显的，这并不偏离本发明的范围和精神。尽管本发明是联系特定实施方案进行描述的，应该理解，要求保护的本发明不应过分限制于这些特定实施方案。实际上，对分子生物或相关领域的技术人员明显的、对实施本发明的方式进行的修饰也应该包含在以下权利要求的范围内。

表1

患者的临床诊断和血样的实验室条件，包括用各种单克隆抗体和其它试剂处理血样品之后和之前的库尔特计数(WBC)

患者ID	诊断	实验室条件	白细胞/LX10-9B     A	％淋巴细胞B    A	#淋巴细胞/L10X-9B    A	试剂ML/mL
							1	B-CLL	12HRAT22C	100   ND	86.1 ND	86.1 ND	ANTI-B50
2	B-CLL	2HRAT22C2HRAT22C	39.1  9.639.1  37.7	74.4 63.374.4 75.1	29.9 6.129.9 28.3	ANTI-B50ANTI-BPE50
							3	B-CLL	6HRAT22C6HRAT22C	39.5  9.339.5  37.7	71.9 67.271.9 72.5	28.3 6.228.3 27.4	ANTI-B50ANTI-BPE50
4	B-CLL	24HRAT22C24HRAT22C	39    9.339    36.2	73   66.573   70.4	28.4 6.228.4 25.5	ANTI-B50ANTI-BPE50
							5	B-CLL	2HRAT22C				ANTI-B50ANTI-A50ANTI-I50ANTI-B&细胞毒试剂25+25

患者ID	诊断	实验室条件	白细胞/LX10-9B    A	％淋巴细胞B      A	#淋巴细胞/L10X-9B    A	试剂ML/mL
							6	B-CLL	24HRAT22C				ANTI-B50
7	B-CLL	24HRAT22C	170  128178130	95.4   91.194.290.4	16.9 11.616.811.9	ANTI-B10ANTI-I10ANTI-B&细胞毒试剂10+20
							8	B-CLL	24HRAT22C	16   7	81.9   51.2	14   3.0	ANTI-B20
9	B-CLL	12HRAT22C	+++  89.5++++++95.4	87     85.185.489.484.9	+++  76.2++++++	ANTI-B30ANTI-I30ANTI-430ANTI-I+II+410+10+10
							10	B-CLL	2HRAT22C	19.3 ND	86     ND	16.7 ND	ANTI-B30ANTI-I30
92	门诊病人	2HRAT22C	5.4 ND	74.5   ND	ND	ANTI-B20
							87	门诊病人	2HRAT22C	4.8 ND	59.3   ND	ND	ANTI-B20
91	门诊病人	2HRAT22C	4.2 ND	54.0   ND	ND	ANTI-B20
							21	门诊病人	2HRAT22C	3.9 ND	47.4   ND	ND	ANTI-B20

患者ID	诊断	实验室条件	白细胞/L×10-9B    A	％淋巴细胞B     A	#淋巴细胞/L10X-9B    A	试剂ML/mL
							34	门诊病人	2HRAT22C	7.2  ND	20.0  ND	ND	ANTI-B20
36	婴儿	4HRAT 22C	13.4 ND	7.3   ND	ND	ANTI-B20
							93	HIV+婴儿	4HRAT22C	5.6  ND	43.4  ND	ND	ANTI-B20
BB/ST	血液中40％的未成熟细胞6日龄	2HRAT22C24HRAT 22C	60.5 ND	20.2  ND	12.2 ND	ANTI-B50ANTI-A50ANTI-AB25+25
							HIV25	AIDS	2HRAT22C	7.5  ND	34.8  ND	2.6  ND	ANTI-B50ANTI-A50ANTI-AB25+25
43/BD	B细胞缺乏	4HRAT22C				ANTI-B20ANTI-I20ANTI-420
							OB/BD	B细胞缺乏	4HRAT22C				ANTI-B20ANTI-I20ANTI-420
患者ID	诊断	实验室条件	白细胞/LX10-9B  A	％淋巴细胞B  A	#淋巴细胞/L10X-9B  A	试剂ML/mL
							HIV+	AIDS	6HRAT22C				ANTI-B20ANTI-I
IgA-D	IgA缺乏	6HRAT22C				ANTI-B20ANTI-I20

EXPT COND：实验室条件

B：之前

A：之后

ANTI-B：HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体

ANTI-A：HLA-DR抗原α链同源区的单克隆抗体

ANTI-I：I类抗原同源区的单克隆抗体

ANTI-AB：一起加入的ANTI-B和ANTI-A

ANTI-4：CD4抗原的单克隆抗体

ANTI-I+II+4：一起加入的ANTI-I和ANTI-B和ANTI-4

细胞毒试剂：环磷酰胺

ML/ml：微升每毫升

L：升

表2

用HLA-DRβ链同源区的单克隆抗体处理血样之前和之后用CD19和CD3的单克隆抗体进行的B-CLL和其它状况的患者的免疫表型分析

患者	％CD19+	％CD3+	％CD19+CD3+	％CD3-CD19-	％CD19+HGCD3-FC+
							B    A	B    A	B    A	B    A	B    A
1	88   40	5    19	1    2	6    26	0    12
						2	73   15	10   33	2    7	15   41	0    5
3	73   11	11   33	2    2	14   52	0    2
						4	71   13	11   37	2    2	16   47	0    2
5	85   40	5    16	1    1	6    26	3    18
						6	85   43	5    18	1    1	6    27	3    10
7	90   72	2    4	0    2	7    8	0    14
						8	62   25	7    13	0    1	29   55	2    6
9	90   85	2    3	0    0	2    1	1    4
						10	78   50	7    14	0    0	14   26	0    8
92	12   10	38   49	0    1	49   40	0    0
						91	7    3	35   29	0    1	59   67	0    0
87	5    3	32   38	1    1	63   58	0    0
						21	1    1	27   29	1    0	71   70	0    0
34	1    1	13   13	0    2	86   84	0    0
						39	10   6	23   25	0    0	67   69	0    0
93	6    3	26   27	1    1	68   70	0    0
						BB/ST	1    1	12   13	0    0	87   86	0    0
HIV25	7    2	26   27	0    0	68   67	0    0
						43/BD	0    0	40   42	0    1	58   54	0    0
						04/BD	0    0	49   41	0    3	43   41	0    0
HIV+	1    1	10   14	0    0	89   87	0    0
						IgA/D	10   1	21   25	2    3	67   71	0    0

B：处理前  A：处理后

表3

用HLA-DRβ链同源区的单克隆抗体处理血样之前和之后用CD4和CD8的单克隆抗体进行的B-CLL和其它状况的患者的免疫表型分析

患者	％CD8+	％CD4+	％CD4+CD8+	％CD4-CD8-	CD4+LOW
							B    A	B    A	B    A	B    A	B    A
1	2.8  16	2.9  11.4	0    3.2	93.1 67.6	0    0
						2	6.2  13.2	9.1  24.3	0    9.4	78.7 46	5.8  6.3
3	7.2  13.1	7.4  23.9	0    8.2	78.8 48.1	6.3  6.6
						4	10.1 24.2	7.6  24.9	0.3  2.8	77.5 42	4.6  5
5	2.9  16.2	1.8  7.6	0    2	95   62.3	0    0
						6	ND   12	ND   8.1	ND   1.7	ND   75.7	ND   0
7	1.9  2.6	1.9  2.8	0    0	95.8 94.3	0    0
						8	3.2  7	3.9  6.9	0.1  2	87.3 79.8	4.3  6
9	2.8  2.9	3    3	0    0	94   94.1	0    0
						10	5.7  9.4	4.7  9.1	0.6  0.8	88.7 79.2	0    0
92	21   19	21.6 21	0.8  1.9	50.5 52.5	5.3  4.8
						91	15.4 18.1	13.6 17.9	6.2  2.6	57   57.3	7.3  3.5
87	16.8 21.8	13.4 20.4	2.9  2.6	59.5 48.9	7    5.6
						21	16   24.1	9.1  15.2	1    2.6	69.6 53.2	3.7  4.2
34	9.4  11.9	5.7  4.9	2    3.3	67.6 65.3	14.4 14.5
						39	121  12.6	13.1 14.6	0.4  1.3	62.3 66.7	11.9 4.3
93	18.9 20.3	9.7  10.3	1.8  1.4	65.5 65.9	3.4  1.8
						BB/ST	6.3  13	5.7  7.3	2.2  1.1	34.7 70.3	50.3 7.6
HIV25	24.1 24.9	0.8  1.1	1.3  5	70.2 69.3	2.9  3.8

表4

用HLA-DRβ链的单克隆抗体处理血样之前和之后用CD3和DR的单克隆抗体进行的B-CLL和其它状况的患者的免疫表型分析

表5

用HLA-DRβ链同源区的单克隆抗体处理血样之前和之后用CD16+56和CD3的单克隆抗体进行的B-CLL和其它状况的患者的免疫表型分析

表6

用HLA-DRβ链的单克隆抗体处理血样之前和之后用CD45和CD14的单克隆抗体进行的B-CLL和其它状况的患者的免疫表型分析

表7

用HLA-DRβ链的单克隆抗体处理血样之前和之后用CD8和CD3的单克隆抗体进行的B-CLL和其它状况的患者的免疫表型分析

表8

用PE偶联的HLA-DRβ链的单克隆抗体处理血样之后用CD45和CD14的单克隆抗体所测量的B-CLL患者随时间的免疫表型分析

时间	DR+CD45+CD14+r	CD45+L	CD45+H
				2HR	81.7	8.2	8.2
6HR	80.7	8.1	10.6
				24HR	79	1.1	18.4

表9

用PE偶联的HLA-DRβ链的单克隆抗体处理血样之后用CD19和CD3的单克隆抗体所测量的B-CLL患者随时间的免疫表型分析

时间	CD19+DR+r	CD3+	CD3+DR+	CD19-CD3-DR-
					2HR	87.4	10.1	1.8	10.7
6HR	75.5	10.4	3.1	10.7
					24HR	74	11.7	2.9	11

表10

用PE偶联的HLA-DRβ链的单克隆抗体处理血样之后用CD4和CD8的单克隆抗体所测量的B-CLL患者随时间的免疫表型分析

时间	CD8+&DR+r	CD4+	CD4+&CD8+&DR+r	CD4+DR+	CD4-CD8-DR-
						2HR	77.6	6.8	5.4	1.3	8.8
6HR	75.8	6.7	6.4	1.8	9.3
						24HR	77	6.4	4.8	1.9	11

表11

用PE偶联的HLA-DRβ链的单克隆抗体处理血样之后用CD3和DR的单克隆抗体所测量的B-CLL患者随时间的免疫表型分析

时间	DR+	CD3+	CD3+DR+	CD3+DR-
					2HR	75	9.5	4.2	10.9
6HR	74.8	8.8	4.8	10.9
					24HR	ND	ND	ND	ND

表12

用PE偶联的HLA-DRβ链的单克隆抗体处理血样之后用CD16&56和CD3的单克隆抗体所测量的B-CLL患者随时间的免疫表型分析

时间	CD56+&16+DR+r	CD3+	CD56+CD16+&CD3+DR+r	CD56-CD16-&CD16-DR-
					2HR	82.5	9.5	4.1	3.5
6HR	84.3	7.5	4.1	3.3
					24HR	ND	ND	ND	ND

表13

用PE偶联的HLA-DRβ链的单克隆抗体处理血样之后用CD8和CD3的单克隆抗体所测量的B-CLL患者随时间的免疫表型分析

时间	CD8+DR+	CD3+	CD8+CD+3&DR+r	CD8-CD3-DR-
					2HR	76.2	6.6	6.7	10.6
6HR	76.5	6.2	6.2	10.3

表14

随时间测量的用HLA-DRα链同源区的单克隆抗体、HLA-DRβ链同源区的单克隆抗体、两种单克隆抗体一起、β链同源区的单克隆抗体加环磷酰胺以及I类抗原同源区的单克隆抗体处理之前和之后B-CLL患者的免疫表型分析

B＝之前；A＝之后；AB＝加入β链的抗体之后；AA＝加入α链的抗体之后；ABC＝加入α链或β链的抗体和环磷酰胺之后；A1＝加入I类的抗体之后。

表15

CD8和CD4

表16

CD3和DR

表17

CD16&56和CD3

表18

CD45和CD14

表19

CD8和CD28

表20

CD34和CD2

表21

用来源于人血块黄层的细胞进行的FACs分析

		2h分析	2h分析	24h分析	24h分析	5d分析	5d分析
								CD标记	初始分析	未处理细胞	经处理的细胞	经处理的细胞	经处理的细胞	未处理细胞	经处理的细胞
CD45
								CD38	54.9	55.6	30.1	51.8	52.8	13.0	5.4
CD34	0.6	0.5	11.5	9.7	8.0	0.4	25.1
								CD10	0.2	0.0	0.9	1.9	1.B	0.0	0.2
CD19	13.2	0.0	15.1	11.1	2.3	8.7	0.7
								CD34	1.8	13.1	0.4	13.0	9.1	0.4	25.8
CD3	56.3	62.6	29.7	46.9	69.2	79.8	63.4
								CD117	0.3	0.6	0.0	1.3	0.8	0.2	0.1
CD34	1.8	0.6	7.4	6.4	6.0	0.2	24.6
								CD71	1.5	0.4	0.0	4.8	3.9	0.2	42.9
GLYCA	5.4	2.3	10.1	3.6	2.8	3.8	1.8
								CD34	1.3	0.6	14.3	12.5	8.9	0.4	24.3
CD90	18.4	12.6	0.0	9.3	5.0	0.1	0.3
								AC133	0.1	0.0	2.0	0.3	0.4	0.0	0.1
CD34	1.5	0.6	11.9	10.8	7.7	0.0	13.2

值表示为表达标记的细胞百分比

图表1

随时间测量的未处理的和用HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理的患者(2、3和4)血样的免疫表型改变

无            有         FL1        FL2         时间

NOTHING001    WITH002    CD45       CD14        2HR

NO001         WE002      CD45       CD14        6HR

001001        002002     CD45       CD14        24HR

NOTHING003    WITH004    CD3        CD19        2HR

NO003         WE004      CD3        CD19        6HR

001003        002004     CD3        CD19        24HR

NOTHING004    WITH005    CD4        CD8         2H

NO004         WE005      CD4        CD8         6HR

001004        002005     CD4        CD8         24HR

NOTHING005    WITH006    CD3        DR          2HR

NO005         WE006      CD3        DR          6HR

001005        002006     CD3        DR          24HR

NOTHING006    WITH007    CD3        CD56&16     2HR

NO006         WE007      CD3        CD56&16     6HR

001006        002007     CD3        CD56&16     24HR

N003          W004       CD3        CD8         2HR

NO007         WE008      CD3        CD8         6HR

001007        002008     CD3        CD8         24HR

图表1A

随时间测量的未处理的和用偶联于PE的HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理的患者(2、3和4)血样的免疫表型改变

ID        FL1        FL2         时间

WL003     CD45       CD14        2HR

WEL003    CD45       CD14        6HR

003003    CD45       CD14        24HR

WL005     CD3        CD19        2HR

WEL005    CD3        CD19        6HR

003005    CD3        CD19        24HR

WL006     CD4        CD8         2HR

WEL006    CD4        CD8         6HR

003006    CD4        CD8         24HR

WL007     CD3        DR          2HR

WEL007    CD3        DR          6HR

WL008     CD3        CD65&16     2HR

WEL008    CD3        CD56&16     6HR

WL005     CD3        CD8         2HR

WEL009    CD3        CD8         6HR

图表2

随时间测量的未处理的和用HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体、该抗体和环磷酰胺、HLA-DR抗原α链同源区的单克隆抗体和I类抗原同源区的单克隆抗体处理的患者(1)血样的免疫表型改变

有            无        FL1        FL2         时间

              NA001     CD45       CD14        2HR

A2B001：AB              CD45       CD14        2HR

A2A：AA                 CD45       CD14        2HR

DNAA001：ABC            CD45       CD14        2HR

A1001：AI               CD45       CD14        2HR

              NC001     CD3        CD19        2HR

C2B001：AB              CD3        CD19        2HR

C2A001：AA              CD3        CD19        2HR

DNAC001：ABC            CD3        CD19        2HR

C1001：AI               CD3        CD19        2HR

A124H001：AI            CD3        CD19        24HR

A2B24H001：AB           CD3        CD19        24HR

A2A24H001：AA           CD3        CD19        24HR

A2BX24H001：ABC         CD3        CD19        24HR

              ND001     CD4        CD8         2HR

D2B001：AB              CD4        CD8         2HR

D2A001：AA              CD4        CD8         2HR

DNAD001：ABC            CD4        CD8         2HR

D1001：AI               CD4        CD8         2HR

D124H001：AI            CD4        CD8         24HR

D2BX24H001：ABC         CD4        CD8         24HR

D2B001：AB              CD4        CD8         24HR

D2A001：AA              CD4        CD8         24HR

E1001：AI               CD3        DR          2HR

E2B001：AB              CD3        DR          2HR

E2A001：AA              CD3        DR          2HR

F1001：AI               CD3        CD56&16     2HR

F2B001：AB              CD3        CD56&16     2HR

F2A001：AA              CD3        CD56&16     2HR

G1001：AI               CD28       CD8         2HR

G2A001：AA              CD28       CD8         2HR

G2B001：AB              CD28       CD8         2HR

H1001：AI               CD7        CD33&13     2HR

H2A001：AA              CD7        CD33&13     2HR

有            无        FL1        FL2        时间

H2B001：AB              CD7        CD33&13    2HR

I2A001：AA              CD21       CD5        2HR

I2B001：AB              CD21       CD5        2HR

J2A001：AA              CD34       CD2        2HR

J2B001：AB              CD34       CD2        2HR

B2A24H001：AA           CD34       CD2        24HR

B2B24H001：AB           CD34       CD2        24HR

B2BX24H001：            CD34       CD2        24HR

ABC

K2B001：AB              CD10       CD25       2H

K2A001：AA              CD10       CD25       2HR

图表3

未处理的和用HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体处理的患者(8)血液的免疫表型改变

有            无        FL1        FL2        时间

              AN001     CD45       CD14       2HR

A2001                   CD45       CD14       2HR

              CN001     CD3        CD19       2HR

C2001                   CD3        CD19       2HR

              DN001     CD4        CD8        2HR

D2001                   CD4        CD8        2HR

              EN001     CD3        DR         2HR

E2001                   CD3        DR         2HR

              FN001     CD3        CD56&16    2HR

F2001                   CD3        CD56&16    2HR

              GN001     CD28       CD8        2HR

G2001                   CD28       CD8        2HR

              HN001     CD7        CD5        2HR

H2001                   CD7        CD5        2HR

              IN001     CD13       CD20       2HR

I2001                   CD13       CD20       2HR

              JN001     CD45RA     CD25       2HR

J2001                   CD45RA     CD25       2HR

              KN001     CD57       CD23       2HR

K2001                   CD57       CD23       2HR

图表4

未处理的和用HLA-DR抗原β链同源区的单克隆抗体和I类抗原同源区的单克隆抗体处理的患者(10)血样的免疫表型改变

有        无         FL1        FL2        时间

          CLL0001    CD45       CD14       2HR

CLL1001              CD45       CD14       2HR

CLL2001              CD45       CD14       2HR

          CLL0003    CD3        CD19       2HR

                     CD3        CD19       2HR

CLL1003              CD3        CD19       2HR

CLL2003              CD3        CD19       2HR

          CLL0004    CD4        CD8        2HR

CLL1004              CD4        CD8        2HR

CLL2004              CD4        CD8        2HR

          CLL005     CD3        DR         2HR

CLL1005              CD3        DR         2HR

CLL2005              CD3        DR         2HR

          CLL0006    CD3        CD56&16    2HR

CLL1006              CD3        CD56&16    2HR

CLL2006              CD3        CD56&16    2HR

Claims (54)

1.一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将更定型细胞逆向分化为未分化的细胞，其中更定型细胞的逆向分化发生于血块黄层血样中的或来自于血块黄层血样的更定型细胞。

2.一种制备未分化细胞的方法，该方法包括使血块黄层血样中的更定型细胞与导致更定型细胞逆向分化为未分化细胞的试剂接触。

3.根据权利要求1或2的方法，其中定型细胞不是癌细胞。

4.根据权利要求1-3的任一项的方法，其中定型细胞是分化细胞。

5.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中定型细胞是定型的造血干细胞。

6.根据权利要求1-5的任一项的方法，其中定型细胞选自CFC-T细胞，CFC-B细胞，CFC-Eosin细胞，CFC-Bas细胞，CFC-GM细胞，CFC-MEG细胞，CFC-E细胞，T细胞和B细胞。

7.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中未分化细胞是多能干细胞。

8.根据权利要求1-7的任一项的方法，其中未分化细胞是选自造血干细胞、神经元干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞的干细胞。

9.根据前述任意一项权利要求的方法，其中未分化细胞的特征在于以下一种或多种细胞表面标记符号：CD34⁺，HLA-DR^-，CD38^-，CD117，AC133，CD90和/或低CD45。

10.根据权利要求1-9的任一项的方法，其中未分化细胞是MHCI类⁺和/或MHC II类⁺细胞。

11.根据权利要求1-10的任一项的方法，其中所述试剂涉及介导定型细胞表面的抗原的捕获、识别或呈递的受体。

12.根据权利要求11的方法，其中该受体为MHC I类抗原或MHCII类抗原。

13.根据权利要求12的方法，其中I类抗原为HLA-A受体、HLA-B受体、HLA-C受体、HLA-E受体、HLA-F受体、或HLA-G受体，所述II类抗原为HLA-DM受体、HLA-DP受体、HLA-DQ受体或HLA-DR受体。

14.根据权利要求13的方法，其中该受体为HLA-DR受体。

15.根据权利要求11的方法，其中该受体包含具有同源区的β链。

16.根据权利要求15的方法，其中该受体至少包含HLA-DRβ链的同源区。

17.根据权利要求11的方法，其中该试剂为受体的抗体。

18.根据权利要求17的方法，其中该试剂为受体的单克隆抗体。

19.根据权利要求17或18的方法，其中抗体选自单克隆抗体CR3/43和单克隆抗体TAL1B5。

20.根据权利要求2-19的任一项的方法，其中该试剂调节MHC基因表达。

21.根据权利要求20的方法，其中该试剂调节MHC I类⁺和/或MHC II类⁺表达。

22.一种在血块黄层血样中增加具有细胞表面标记符号CD34⁺和/或HLA-DR^-和/或CD38^-和/或CD117和/或AC133和/或CD90和/或低CD45的细胞的相对数目的方法，该方法包括使血块黄层血样中的更定型细胞于可操作性涉及所述定型细胞的试剂接触，从而使CD34⁺和/或HLA-DR^-和/或CD38^-和/或CD117和/或AC133和/或CD90和/或低CD45细胞的相对数目由于这种涉及而增加。

23.一种制备未分化细胞的方法，该方法包括使细胞群中的一种或多种分化细胞与有效转换所述细胞群中的正常分化细胞比例的逆向分化工具接触，由此导致一种或多种所述分化细胞逆向分化为未分化细胞。

24.逆向分化工具在转换细胞群中正常分化细胞比例，从而实现将一种或多种所述分化细胞逆向分化为未分化细胞中的用途。

25.一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的分化细胞逆向分化为未分化细胞，其中包含所述含有一种或多种分化细胞的细胞群的环境从第一种环境改变为第二种环境，其中所述第二种环境的游离离子浓度与第一种环境相比进行了有效修饰，由此导致一种或多种所述分化细胞逆向分化为未分化细胞。

26.一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的一种或多种分化细胞与有效转换正常分化细胞比例的逆向分化工具接触，在不含离子或离子被掩蔽的第一种环境中培养细胞群，并将第一种环境改变为第二种环境，其中第二种环境中存在的离子浓度与第一种环境相比进行了有效修饰，由此导致一种或多种分化细胞逆向分化为未分化细胞。

27.根据权利要求23-24或26的任一项的方法或用途，其中所述逆向分化工具是任意一种导致细胞群内负选择，由此导致细胞群中正常分化细胞比例破坏的任何工具。

28.根据权利要求23-24或26-27的任一项的方法或用途，其中所述逆向分化工具是以下任意一种或多种：抗体；用于根据细胞密度分离细胞的密度梯度培养基；或导致红细胞沉淀的物质。

29.根据权利要求25或26的方法，其中第二种环境的所述游离离子浓度与第一种环境的所述游离离子浓度相比有所增加。

30.根据权利要求25-26或29的任一项的方法，其中与第一种环境相比，第二种环境的所述相对游离离子浓度增加。

31.根据权利要求25-26或29-30的任一项的方法，其中所述游离离子为阳离子。

32.根据权利要求25-26或29-31的任一项的方法，其中所述游离离子为I族或II族金属。

33.根据权利要求25-26或29-32的任一项的方法，其中所述游离离子为钙离子和/或镁离子。

34.根据权利要求25-26或29-33的任一项的方法，其中通过用能够相对改变环境中游离离子浓度的试剂处理所述第一种环境而修饰环境中的所述游离离子浓度，从而实现所述第二种环境。

35.根据权利要求34的方法，其中用一种或多种离子掩蔽剂处理所述第一种环境，该离子掩蔽剂随后被去除或浓度被减小，由此实现具有相对增加的游离离子浓度的第二种环境，从而实现细胞群中的一种或多种分化细胞的逆向分化。

36.根据权利要求25-26或29-35的任一项的方法，其中用一种或多种游离离子掩蔽剂处理所述第一种环境，然后将细胞群转移至第二种环境，该第二种环境的游离离子浓度与第一种环境相比有所增加，从而实现细胞群中的一种或多种分化细胞的逆向分化。

37.根据权利要求25-26或29-35的任一项的方法，其中可以在含有低浓度游离离子或不含游离离子的第一种环境中培养所述细胞群，然后将细胞群转移到第二种环境，或调节第一种环境，使其成为第二种环境，所述第二种环境含游离离子，或与第一种环境相比，游离离子浓度更高，从而实现了细胞群中的一种或多种分化细胞的逆向分化。

38.根据权利要求35或36方法，其中所述掩蔽剂为游离离子螯合剂。

39.根据权利要求35-36或38的任一项方法，其中所述掩蔽剂包含胺和羧基。

40.根据权利要求35-36或38-39的任一项的方法，其中所述掩蔽剂包含多个-N(CH₂CO₂H)_n基团，其中n＝1或n＝2。

41.根据权利要求35-36或38-40的任一项的方法，其中所述掩蔽剂可以选自以下的任意一种或多种：EDTA，肝素，EGTA，DTPA，柠檬酸三钠和其他相似的螯合剂和/或抗凝剂。

42.根据权利要求35-36或38-41的任一项的方法，其中加入足够高浓度的所述掩蔽剂，使得对所述掩蔽剂进行去除可以导致逆向分化。

43.根据权利要求42的方法，其中对其进行去除后足够导致逆向分化的掩蔽剂的所述浓度为大于或等于约2mM。

44.根据权利要求23-43的任一项的方法，其中更分化细胞不是癌细胞。

45.根据权利要求23-44的任一项的方法，其中更分化细胞是定型的造血细胞。

46.根据权利要求23-45的任一项的方法，其中更分化细胞选自CFC-T细胞，CFC-B细胞，CFC-Eosin细胞，CFC-Bas细胞，CFC-GM细胞，CFC-MEG细胞，BFC-E细胞，CFC-E细胞，T细胞和B细胞。

47.根据权利要求23-46的任一项的方法，其中未分化细胞是多能干细胞。

48.根据权利要求23-47的任一项的方法，其中未分化细胞是选自造血干细胞、神经元干细胞、上皮干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞和胚胎干细胞的干细胞。

49.根据权利要求23-48的任一项的方法，其中未分化细胞的特征在于以下一种或多种细胞表面标记符号CD34⁺，HLA-DR^-，CD38^-，CD117，AC133，CD90和/或低CD45。

50.根据权利要求23-49的任一项的方法，其中未分化为MHC I类⁺和/或MHC II类⁺细胞。

51.根据权利要求23-50的任一项的方法，其中包含定型细胞的细胞群是血块黄层血样或来自于血块黄层血样。

52.一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的分化细胞逆向分化为未分化细胞，其中含有所述包含一种或多种分化细胞的细胞群的环境从没有游离钙离子或镁离子或游离钙离子或镁离子浓度低的第一种环境改变为第二种环境，所述第二种环境含游离钙离子或镁离子，或与第一种环境相比，游离钙离子或镁离子浓度更高，从而实现了细胞群中的一种或多种分化细胞的逆向分化。

53.一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的分化的造血细胞逆向分化为未分化细胞，其中含有所述包含一种或多种分化的造血细胞的细胞群的环境从第一种环境改变为第二种环境，其中所述第二种环境的游离离子浓度与第一种环境相比进行了有效修饰，由此导致一种或多种所述分化的造血细胞逆向分化为未分化细胞。

54.一种制备未分化细胞的方法，该方法包括将细胞群中的分化细胞逆向分化为未分化细胞，其中通过用能够相对改变环境中游离离子浓度的试剂处理第一种环境而修饰含所述细胞群的环境，从而实现第二种环境。

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