CN101532014A - 对目标基因组区域边扩增边连接的公用接头及连接方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种对目标基因组区域边扩增边连接的公用接头，该公用接头具有两对，其中，每对接头都由一对反向互补的寡居核苷酸以5’→3’方向和以3’→5’方向碱基相互配对组合而成，所述寡核苷酸序列的结构特征为：1)每对接头其中一条寡核苷酸序列的3'端多一个碱基“T”；2)在多核苷酸扩增和连接退火温度下不与目标基因组结合；3)序列长度至少为18个碱基。本发明还涉及对目标基因组区域边扩增边连接的连接方法，以及对目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法。本发明的方法提高了边扩增边连接的效率，降低了实验成本，且具有高的实验通量。
Description
技术领域
本发明涉及一种对目标基因组区域边扩增边连接的公用接头、对一个或两个以上目标基因组区域边扩增边连接的连接方法，以及对一个或两个以上目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法。
背景技术
聚合酶链式反应技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，最早是Khorana于1971年提出这个设想。美国科学家Kary Mullis等在1985年实现了这个梦想，发明了具有划时代意义的PCR技术。
经典的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)作为最常用的分子生物学技术之一，是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法。主要由(1)高温变性模板；(2)引物与模板退火；(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。
目前，有一种采用对目标基因组区域边扩增边连接方法，其是将公用接头设计到每种聚合酶链式扩增反应(PCR反应)引物的末端，在扩增目标区域DNA的过程中，将公用接头片段连接到目标区域DNA的末端，得到可连接性DNA片段，然后再将可连接性DNA片段进行二次PCR反应扩增，从而将可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成长链DNA。但此种方法由于是将公用接头附加到了聚合酶链式扩增反应(PCR反应)引物的末端，从而造成对于所有需要扩增目标区域DNA的PCR反应，都不能将常用的扩增引物直接使用，必须要重新设计合成扩增引物，导致了实验时间的大幅延长和成本的提高；此外，由于在扩增引物末端附加了一段公用接头，也在很大程度上引起了扩增效率的降低。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题之一，在于提供一种对目标基因组区域边扩增边连接的公用接头，旨在解决现有方法不实验时间长、成本高和扩增效率低的问题。
本发明实施例所要解决的技术问题之二，在于提供一种针对一个目标基因组DNA片段两端连接公用接头获得多种非特异性连接的长链DNA的方法。
本发明实施例所要解决的技术问题之三，在于提供一种针对两个以上目标基因组DNA片段两端连接公用接头获得多种非特异性连接的长链DNA的方法。
本发明实施例所要解决的技术问题之四，在于提供一种对一个目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法。
本发明实施例所要解决的技术问题之五，在于提供一种对两个以上目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法。
本发明实施例提供的对目标基因组区域边扩增边连接的公用接头，该公用接头具有两对，其中，每对接头都由一对反向互补的寡居核苷酸以5’→3’方向和以3’→5’方向碱基相互配对组合而成，所述寡核苷酸序列的结构特征为：
1)每对接头其中一条寡核苷酸序列的3’端多一个碱基“T”；
2)在多核苷酸扩增和连接退火温度下不与目标基因组结合；
3)序列长度至少为18个碱基。
本发明实施例提供的一种对目标基因组边扩增边连接的的方法，包括如下步骤：
1)设计包含上述的两对公用接头，用于与一个目标基因组区域DNA片段连接；
2)使目标基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
3)在目标基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
4)将步骤3)中的目标基因组DNA均分成两份；
5)连接步骤1)中所述一对公用接头到步骤4)中所述的一份目标基因组区域DNA片段的两端；连接步骤1)中所述另一对公用接头到步骤4)中所述的另一份目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入上述两种不同的公用接头的可连接性DNA片段；
6)将步骤5)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤5)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
本发明实施例提供的另一种对目标基因组边扩增边连接的的方法，包括如下步骤：
1)设计包含上述的两对公用接头，用于与两个以上目标基因组区域DNA片段连接；
2)等摩尔质量混合多种目标基因组DNA片段；
3)使混合的基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
4)在混合的基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
5)将混合的基因组DNA均分成两份；
6)连接步骤1)中的一对公用接头到步骤5)中的一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；连接步骤1)中另一对公用接头到步骤5)中另一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入两种不同公用接头的可连接性DNA片段；
7)将步骤6)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤5)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
本发明实施例提供的一种对目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法，该目标基因组区域仅一个，主要步骤有：
1)使目标基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
2)在目标基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
3)将步骤2)中的目标基因组DNA均分成两份；
4)连接上述述一对公用接头到步骤3)中所述的一份目标基因组区域DNA片段的两端；连接上述另一对公用接头到步骤3)中所述的另一份目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入上述两种不同的公用接头的可连接性DNA片段；
5)将步骤4)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤4)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
6)将步骤5)所得的长链DNA用DNA随机打断法打断，得到随机目标基因组区域DNA文库。
本发明实施例提供的另一种对目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法，该目标基因组区域为两个以上，包括如下步骤：
1)等摩尔质量混合各个目标基因组DNA片段；
2)使混合的目标基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
3)在混合的目标基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
4)将混合的基因组DNA均分成两份；
5)连接上述的一对公用接头到步骤4)中所述的一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；连接上述的另一对公用接头到步骤4)中所述的另一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入上述的两种不同公用接头的可连接性DNA片段；
6)将步骤5)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤5)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
7)将步骤6)所得的长链DNA用DNA随机打断法打断，得到随机目标基因组区域DNA文库。
本发明以经典PCR技术为基础，应用碱基互补配对的基本原理，通过设计序列反向互补的两对公用接头，并将这两对接头分别连接在目标基因组区域DNA片段的5’和3’两端，然后，在随后的多核苷酸扩增反应中，将目标基因组区域在扩增的基础上按随机顺序进行高效快捷地连接。通过本发明得到的非特异性连接的长链DNA可根据研究需要应用于多种DNA分析。例如，DNA随机打断的方法打断通过本发明得到的长链DNA，建立适用于多种测序方法的针对一个或多个目标基因组区域随机DNA文库；进行一个或多个目标基因组区域DNA序列重测序工作。
与串联PCR技术，即根据具体研究的需要，设计特殊的接头，将本属基因组不同区域的DNA，甚至是不同物种基因组的DNA片断进行“特异性”连接，获得研究所需要的“功能性DNA片段”；以及通过设计一系列相互重叠的引物进行PCR反应，快速得到完整的目的基因的PCR技术不同。在本发明中，除分别在目标基因组区域DNA片段(PCR产物)的两端连接序列反向互补的公用接头1和公用接头2外，在多核苷酸扩增反应无需特殊处理，无需引物；非特异连接长链DNA的生成也无需“连接酶”作用。通过本发明获得的长链DNA不受常规扩增大片段DNA PCR反应中保真度要求的限制。另外，在本发明中，只需要设计一对序列反向互补的公用接头，无需设计多对“特异”的引物，从而不仅避免了对扩增效率的影响，而且使实验操作更加简单易行高效更降低了实验的费用。
附图说明
图1是利用公用接头进行目标基因组区域DNA片段边扩增边连接反应的流程图。
图2是连接公用接头以及目标基因组区域DNA片段边扩增边连接反应的示意图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明主要是通过分别在目标基因组区域DNA片段两端加入序列反向互补的同两对公用接头，对目标基因组区域DNA片段进行特异性多核苷酸扩增和非酶法连接，形成由目标基因组区域DNA片段按随机顺序连接而成的长链DNA混合物。
具体来说，一种对目标基因组区域DNA片段(PCR产物)边扩增边连接的公用接头，该公用接头具有两对，其中，每对都由一对反向互补的寡居核苷酸(例如：uper1-1/F1，down1-1/R1和uper1-2/F2，down1-2/R2)以5’→3’方向和以3’→5’方向碱基相互配对组合而成，每对寡居核苷酸其中的一条(uper1-1/F1，uper1-2/F2)在3’端都比另外一条(down1-1/R1，down1-2/R2)多了一个碱基“T”——胸腺嘧啶核苷酸。除在3’端uper1-1/F1比down1-2/R2，uper1-2/F2比down1-1/R1分别多了一个碱基“T”外，uper1-1/F1与down1-2/R2，uper1-2/F2与down1-1/R1的核苷酸序列完全相同，因此在聚合酶链式扩增反应中，uper1-1/F1寡居核苷酸就也可以与uper1-2/F2寡居核苷酸，down1-1/R1寡居核苷酸也可以与down1-2/R2寡居核苷酸退火配对结合。是以5’→3’方向和以3’→5’方向碱基互补的寡核苷酸序列，即两个接头的序列反向互补。所述寡核苷酸序列的结构特征为：
1)每个接头其中一条寡核苷酸序列的3’端多一个碱基“T”；
2)在多核苷酸扩增和连接退火温度下不与目标基因组结合；
3)序列长度至少为18个碱基。
按照以上原则，可以设计出很多配合使用的公用接头，例如如下1至5所示的5组序列。其中，包括公用接头1和与之配合使用的公用接头2，公用接头1包括公用接头1-1至1-5，公用接头2包括公用接头2-1至2-5。
1、公用接头1-1与与之配合使用的公用接头1-2
公用接头1-1
1)uper1-1/F1：GCGGATCCGCGGCCGCTCT
2)down1-1/R1：GAGCGGCCGCGGATCCGC
公用接头1-2
1)uper1-2/F2：GAGCGGCCGCGGATCCGCT
2)down1-2/R2：GCGGATCCGCGGCCGCTC
2、公用接头2-1与与之配合使用的公用接头2-2
公用接头2-1
1)uper2-1/F1：GCGCCCAATACGCAAACCT
2)down2-1/R1：GGTTTGCGTA TTGGGCGC
公用接头2-2
1)uper2-2/F1：GGTTTGCGTATTGGGCGCT
2)down2-2/R1：GCGCCCAATACGCAAACC
3、公用接头3-1与之配合使用的公用接头3-2
公用接头3-1
1)uper3-1/F1：GCGTTGGCCGATTCATTAT
2)down3-1/R1：TAATGAATCGGCCAACGC
公用接头3-2
1)uper3-2/F1：TAATGAATCGGCCAACGCT
2)down3-2/R1：GCGTTGGCCGATTCATTA
4、公用接头4-1与之配合使用的公用接头4-2
公用接头4-1
1)uper4-1/F1：GCTCGTATGTTGTGTGGAT
2)down4-1/R1：TCCACACAACATACGAGC
公用接头4-2与之配合使用的公用接头4-2
1)uper4-2/F1：TCCACACAACATACGAGCT
2)down4-2/R1：GCTCGTATGTTGTGTGGA
5、公用接头5-1与之配合使用的公用接头5-2
公用接头5-1
1)uper5-1/F1：CAGCTATGACCATGATTAT
2)down5-1/R1：TAATCATGGTCATAGCTG
公用接头5-2
1)uper5-2/F1：TAATCATGGTCATAGCTGT
2)down5-2/R1：CAGCTATGACCATGATTA
本发明实施例提供的一种对目标基因组边扩增边连接的的方法，包括如下步骤：
1)设计包含上述的两对公用接头，用于与一个目标基因组区域DNA片段连接；
2)使目标基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
3)在目标基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
4)将步骤3)中的目标基因组DNA均分成两份；
5)连接步骤1)中所述一对公用接头到步骤4)中所述的一份目标基因组区域DNA片段的两端；连接步骤1)中所述另一对公用接头到步骤4)中所述的另一份目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入上述两种不同的公用接头的可连接性DNA片段；
6)将步骤5)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤5)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
本发明实施例提供的另一种对目标基因组边扩增边连接的的方法，包括如下步骤：
1)设计包含上述的两对公用接头，用于与两个以上目标基因组区域DNA片段连接；
2)等摩尔质量混合多种目标基因组DNA片段；
3)使混合的基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
4)在混合的基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
5)将混合的基因组DNA均分成两份；
6)连接步骤1)中的一对公用接头到步骤5)中的一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；连接步骤1)中另一对公用接头到步骤5)中另一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入两种不同公用接头的可连接性DNA片段；
7)将步骤6)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤5)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
通过本发明获得的长链DNA可应用于诸多DNA分析实验，尤其在高通量重测序工作中，具有重要的作用。通过超声法、喷雾法、化学剪切法、酶剪切法等DNA随机打断法将DNA随机打断后，可重新获得含有目标基因组区域片段的DNA片段，这些DNA片段可高效地涵盖整个目标区域，可以将其作为重测序工作的随机DNA文库(DNA library)，有效地进行目标基因组区域的高通量重测序工作。
本发明实施例提供的一种对目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法，该目标基因组区域仅一个，主要步骤有：
1)使目标基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
2)在目标基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
3)将步骤2)中的目标基因组DNA均分成两份；
4)连接上述述一对公用接头到步骤3)中所述的一份目标基因组区域DNA片段的两端；连接上述另一对公用接头到步骤3)中所述的另一份目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入上述两种不同的公用接头的可连接性DNA片段；
5)将步骤4)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤4)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
6)将步骤5)所得的长链DNA用DNA随机打断法打断，得到随机目标基因组区域DNA文库。
本发明实施例提供的另一种对目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法，该目标基因组区域为两个以上，包括如下步骤：
1)等摩尔质量混合各个目标基因组DNA片段；
2)使混合的目标基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
3)在混合的目标基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
4)将混合的基因组DNA均分成两份；
5)连接上述的一对公用接头到步骤4)中所述的一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；连接上述的另一对公用接头到步骤4)中所述的另一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入上述的两种不同公用接头的可连接性DNA片段；
6)将步骤5)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤5)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
7)将步骤6)所得的长链DNA用DNA随机打断法打断，得到随机目标基因组区域DNA文库。
本发明实施例中，直接在目标基因组DNA序列的两端连接公用接头，解决了加在引物两端而影响对目标基因组区域进行扩增的问题，大大提高了边扩增边连接的效率，同时用设计一对公用的接头取代设计多种含有公共接头的PCR引物大大降低了实验成本。
在本发明实施例中，所述目标基因组序列区域可以为任意长度的目标基因组区域；在本发明上下文中，所述公用接头的设计、连接方法以及针对多个目标基因组区域进行边扩增边合成的方法，适于两个或两个以上的任意多个目标基因组区域DNA片段。在本发明中，所述公用接头的设计、连接方法以及建立针对多个目标基因组区域重测序随机DNA文库的方法，同样适用于两个或两个以上的任意多个目标基因组区域。
在本发明实施例中，对目标基因组区域DNA片段进行等摩尔量混合可用QPCR技术进行准确定量。也可通过对目标片段区域进行凝胶电泳，与已知量的DNA Marker比对进行粗略定量。
在本发明中“可连接性DNA片段”是指两端连接权利要求1所述公用接头的目标基因组区域的DNA片段(PCR产物)。
在本发明中Con-PCR反应(即多核苷酸扩增反应)是指将通过连接权利要求1所述的公用接头后获得的“可连接性DNA片段”，作为多核苷酸扩增反应的模板，在DNA双链解旋、打开后，在碱基互补配对原则的指引下，一条可连接性DNA片段的单链3’端的公用接头与另一条可与之互补的可连接性DNA片段的单链3’端的公用接头彼此配对，作为多核苷酸扩增反应的引物，在无需另加特殊引物的条件下，进行可连接性DNA片段的连接和多核苷酸扩增反应。
在本发明中非特异连接是指多聚核苷酸是按照随机顺序方式进行连接的。
在本发明中的Con-PCR(多聚核苷酸的扩增)反应中，无需连接酶的处理，原始DNA片段在公用接头的带领下，利用碱基互补配对原则，在扩增的同时进行随机顺序的连接，形成“非特异连接的长链DNA”，即“边扩增边连接”反应。
在本发明中，打断非特异性连接的长链DNA片段的DNA随机打断法有超声法、喷雾法、化学剪切法、酶剪切法等本领域周知的打断DNA序列的方法。
图1是利用公用接头进行目标基因组区域DNA片段边扩增边连接反应的流程图。
图2是以公用接头1-1与与之配合使用的公用接头1-2为例，用以说明连接公用接头以及目标基因组区域DNA片段边扩增边连接反应的示意图，其中：图2-A是公用接头设计以及连接方式。一共有两个接头且它们的序列是反向互补的；每个接头其中一条寡核苷酸序列的3’端多一个碱基“T”，用于与目标基因组区域DNA片段3’端加的碱基“A”通过碱基互补配对原则将公用接头与目标基因组区域DNA片段连接起来，形成可连接性DNA片段；
图2-B、C是边扩增边连接的过程。连接有公用接头的可连接性DNA片段，作为多核苷酸扩增反应的模板，在DNA双链解旋、打开后，一条可连接性DNA片段的单链3’端的公用接头与另一条可与之互补的可连接性DNA片段的单链3’端的公用接头彼此配对(图2-B中Uper1与Uper2配对，图2-C中R1与R2配对，F1与F2配对)，并作为多核苷酸扩增反应的引物，在无需另加特殊引物的条件下，进行可连接性DNA片段的边随机连接边扩增反应；
图2-D是通过本发明得到的非特异连接的长链DNA的模式图。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1、一种对目标基因组区域边扩增边连接的公用接头，该公用接头具有两对，其中，每对接头都由一对反向互补的寡居核苷酸以5’→3’方向和以3’→5’方向碱基相互配对组合而成，所述寡核苷酸序列的结构特征为：
1)每对接头其中一条寡核苷酸序列的3’端多一个碱基“T”；
2)在多核苷酸扩增和连接退火温度下不与目标基因组结合；
3)序列长度至少为18个碱基。
2、一种对目标基因组边扩增边连接的的方法，包括如下步骤：
1)设计包含如权利要求1所述的两对公用接头，用于与一个目标基因组区域DNA片段连接；
2)使目标基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
3)在目标基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
4)将步骤3)中的目标基因组DNA均分成两份；
5)连接步骤1)中所述一对公用接头到步骤4)中所述的一份目标基因组区域DNA片段的两端；连接步骤1)中所述另一对公用接头到步骤4)中所述的另一份目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入权利要求1所述两种不同的公用接头的可连接性DNA片段；
6)将步骤5)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤5)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
3.一种对目标基因组边扩增边连接的的方法，包括如下步骤：
1)设计包含权利要求1所述的两对公用接头，用于与两个以上目标基因组区域DNA片段连接；
2)等摩尔质量混合多种目标基因组DNA片段；
3)使混合的基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
4)在混合的基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
5)将混合的基因组DNA均分成两份；
6)连接步骤1)中所述的一对公用接头到步骤5)中所述的一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；连接步骤1)中所述的另一对公用接头到步骤5)中所述的另一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入权利要求1所述的两种不同公用接头的可连接性DNA片段；
7)将步骤6)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤5)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
4.一种对目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法，该目标基因组区域仅一个，主要步骤有：
1)使目标基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
2)在目标基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
3)将步骤2)中的目标基因组DNA均分成两份；
4)连接权利要求1中所述一对公用接头到步骤3)中所述的一份目标基因组区域DNA片段的两端；连接权利要求1中所述另一对公用接头到步骤3)中所述的另一份目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入权利要求1所述两种不同的公用接头的可连接性DNA片段；
5)将步骤4)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤4)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
6)将步骤5)所得的长链DNA用DNA随机打断法打断，得到随机目标基因组区域DNA文库。
5.一种对目标基因组区域建立重测序随机DNA文库的方法，该目标基因组区域为两个以上，包括如下步骤：
1)等摩尔质量混合各个目标基因组DNA片段；
2)使混合的目标基因组DNA片段的5’末端磷酸化；
3)在混合的目标基因组DNA片段的3’末端加上一个碱基“A”；
4)将混合的基因组DNA均分成两份；
5)连接权利要求1中所述的一对公用接头到步骤4)中所述的一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；连接权利要求1中所述的另一对公用接头到步骤4)中所述的另一份混合的目标基因组区域DNA片段的两端；得到在各个目标基因组区域5’端和3’端加入权利要求1所述的两种不同公用接头的可连接性DNA片段；
6)将步骤5)获得的两种不同的可连接性DNA片段混合在一起进行多核苷酸扩增反应，边扩增边连接；得到由步骤5)所得不同的可连接性DNA片段按随机连接顺序连接而成的长链DNA。
7)将步骤6)所得的长链DNA用DNA随机打断法打断，得到随机目标基因组区域DNA文库。
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