CN101531766B - 一种制备牛血清白蛋白杂化膜的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备牛血清白蛋白杂化膜的方法，属于生物-无机杂化技术领域。制备工艺包括：粉体杂化膜的制备；层层组装杂化膜的制备。制备多层组装蛋白质和水滑石纳米片的层层组装杂化膜，层层组装杂化膜中，蛋白质和水滑石交替成膜，蛋白质的特征光谱强度随组装层数的增加成线性增长；水滑石片紧凑地排列在基底表面，由层层组装所制备的牛血清白蛋白杂化膜的膜结构均匀连续，牛血清白蛋白的光谱强度随着组装层数的增加成线性增长；杂化膜表面紧密平滑，蛋白质均匀地分布在膜的表面。优点在于，同时制备方法简单不需要复杂的设备，成本低廉，制备过程中只使用水作为溶剂，制备方法环保。
Description
技术领域
本发明属于生物-无机杂化技术领域，特别是涉及一种制备牛血清白蛋白杂化膜的方法，制备一种蛋白质与水滑石纳米片的二元杂化薄膜，这种杂化薄膜表面平滑，结构均匀连续。
背景技术
生物-无机杂化技术作为超分子化学的一个重要分支一直是科学研究的重点，生物-无机杂化薄膜的构筑及其功能化更是最近和将来很长一段时间内人们的研究热点，结合蛋白质具有广泛应用潜力的特点，通过生物-无机杂化技术实现蛋白质的功能化和器件化，从而实现生物分子在实际应用中的价值。活性生物分子(如酶、氨基酸、肽)由于其特殊的物化性质在生物传感、催化、药物缓释、食品加工等领域具有广阔的应用前景，但由于游离活性生物分子存活的温度、pH值范围窄，容易变性和失活，对热、强酸、强碱和有机溶剂均不够稳定，而且价格昂贵，从而阻碍了他们作为一类重要生物材料的进一步研究和应用。因此首要的问题是如何提高活性生物分子的稳定性。无机纳米材料结构丰富新颖、热稳定性优良、表面活性可调节、价格低廉，将活性生物分子与无机纳米材料组装得到生物-无机杂化材料，不仅对于维持生物大分子的结构至关重要，而且固载量大、工艺简单易于工业化、载体无毒可回收且成本低廉，具有良好的工业应用前景。
基于活性生物分子与无机纳米材料组装得到的生物-无机纳米杂化材料同时具有二者的独特性质，已成为生命科学、材料科学及纳米科学等领域的研究热点。以无机材料为出发点，无机-生物杂化材料主要体现在以下三个方面：(1)基于零维的纳米粒子形成的无机-生物杂化材料。半导体纳米粒子如(CdS，CdSe，ZnS，TiO2等)或金属纳米粒子(如Au)可与酶、抗原、抗体或核酸如DNA等蛋白质偶联实现功能化，也可在生物活性分子诱导下组装成某种排列结构，功能化的纳米粒子可控制生物分子的活性、反应性或识别能力，无机纳米颗粒与生物分子在溶液或基质表面形成的二维或三维组装体可望作为生物传感器、生物电子器件等得到应用；(2)基于一维的碳纳米管和三维的介孔材料形成的无机-生物杂化材料。单壁碳纳米管(SWNT)作为纳米材料的重要单元在电子、光学、热量传输和生物传感等领域具有广阔的应用前景；(3)基于纳米颗粒和一维的碳纳米管以及三维的介孔材料组装得到的杂化材料具有一定的局限性，尤其是活性生物分子为酶分子时，酶分子不能充分地与反应物分子接触，导致活性和利用率下降。针对上述局限性，近年来二维纳米材料即层状材料(如α-磷酸锆、层状钛酸盐、水滑石)与生物分子的组装受到越来越多的关注。与上述提到的半导体或金属纳米颗粒不同，层状材料与生物分子的组装可通过主客体之间的离子键、氢键、憎水作用等形式实现，因而避免了共价作用形式所需要的苛刻反应条件，更有利于保持生物分子特有的结构和生物活性。
蛋白质是由20多种氨基酸共价连接而成、具有特定三维结构、高分子量的多肽。所以把多肽作为认识蛋白质的起点是合适的。一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽(peptide)。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。蛋白质分子中氨基酸残基的排列方式和连接顺序就是蛋白质的化学结构(一级结构)。肽分子中含有两个氨基酸残基时称为二肽，肽分子中含有多个氨基酸残基时则称为多肽。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。蛋白质有一个引人注目的特征，就是它们都具有确定的三维结构。虽然蛋白质分子是由氨基酸首尾相连的多肽链组成，但一个伸展开来或随机排布的多肽链并无生物活性。蛋白质的功能来自其特定的构象，即原子在一个结构中的三维排列方式。蛋白质由氨基酸结合而成，结合方式是通过肽键结合而成肽链，再由一个或多个肽链按各自特殊的方式结合成为蛋白质分子。随着氨基酸残基的数目、排列顺序、以及多肽链的数目和空间结构的不同，形成不同的蛋白质。蛋白质除了具有一级结构外，还具有二级结构(螺旋结构、折叠结构、转角结构、只有回转等)、三级结构(在二级结构基础上形成的很不规则的构象)和四级结构(由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚合而形成特定的构象)，因此蛋白质分子除具有通常主要的化学键外还有许多其他重要的化学键(如氢键、二硫键、离子间、酯键、疏水键和范德华力)，这些键中的一种或几种都影响蛋白质的吸附过程。尽管不是所有蛋白质都包含所有上述键，但对于任何一种蛋白质由于其固有的氨基酸结构，在1541cm-1和1642cm-1附近都有较强的吸收峰。
(1)一级结构：包括组成蛋白质的多肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。一级结构中的作用力主要是共价键，包括肽键和二硫键。
(2)二级结构：是指肽链的主链在空间的排列，或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角。
(3)三级结构：是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。蛋白质的三级结构实质上是由其一级结构决定的，是多肽链主链上各个单键的旋转自由度受到各种限制的总结果。
(4)四级结构：蛋白质的四级结构是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。维持亚基之间的化学键主要是疏水力。
组成蛋白质的20种基本氨基酸分别是甘氨酸(Glycine)、丙氨酸(Alanine)、缬氨酸(Valine)、亮氨酸(Leucine)、异亮氨酸(Ileucine)、脯氨酸(Proline)、甲硫氨酸(Methionine)、半胱氨酸(Cysteine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、酪氨酸(Tyrosine)、色氨酸(Trytophan)、精氨酸(Arginine)、赖氨酸(Lysine)、组氨酸(Histidine)、天冬氨酸(Aspartate)、谷氨酸(Glutamate)、丝氨酸(Serine)、苏氨酸(Threonine)、天冬酰胺(Asparagine)、谷酰胺(Glutamine)，除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有一样的结构通式，只是侧链烷基不同。
牛血清白蛋白是血液的主要成分(38g/100ml)，由于具有纯度高，价格便宜，商业易得等特点，常常作为标准蛋白质研究。牛血清白蛋白由三个氨基酸区域组成，每个氨基酸区域包含两个亚域，一个BSA分子由583个氨基酸组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基，分子量68kD，等电点4.8，含氮量16％，含糖量0.08％，仅含己糖和己糖胺，含脂量只有0.2％。游离的BSA分子结构以a-helix为主，三维尺寸为4*4*14nm，分子量为66KD，等电点是4.9，是一种酸性蛋白质。与所有蛋白质一样，牛血清白蛋白分子的大小以及表面的电荷分布随蛋白质溶液pH值的变化而变化，因此可以调节缓冲溶液的pH值，将牛血清白蛋白阴离子化或者是阳离子化。在中性(pH＝7.4)蛋白质溶液中，牛血清白蛋白呈扁形椭圆体，表面电荷以负电荷为主，主要分布在氨基一区和氨基二区。
无机-生物杂化材料很好的结合了无机纳米材料和活性生物分子两者的特性和优点，要想充分发挥活性生物分子的生物活性，选择合适的无机主体成为了制备性能优异无机-生物杂化材料的关键问题。水滑石(LDH)是一种阴离子粘土，其基本构造单元是八而体，八面体中心是金属离子，六个顶角是氢氧根离子，相邻八面体之间靠共用边相互联结成二维延续的配位八面体结构层，单元层以面一面堆叠形成晶体颗粒构成层状结构，决定了它多以片状形态存在。水滑石结构中类水滑石层板由共边的M(OH)6八面体构成，部分二价金属离子被三价金属离子取代产生多余的正电荷，使得LDH带正电荷，晶体结构中多余的正电荷由层间阴离子平衡以维持整个分子的电中性，层间通道中的阴离子是可交换的水滑石由于主体层板的化学组成、电荷密度、晶粒形态和尺寸均可以在一定范围内调控等特性恰好可以解决上述存在的问题，为LDHs-生物杂化材料的设计提供了较大的设计空间。另外，水滑石作为一类阴离子型层状材料，可以在水中剥离从而得到单层层板，这样分子尺寸较大的生物活性分子就能够与LDHs组装得到LDHs-生物杂化材料，实现生物分子的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备牛血清白蛋白杂化膜的方法，制备生物-无机二元杂化膜，杂化膜结构稳定，结构均匀连续。
本发明制备的牛血清白蛋白与水滑石纳米片的杂化膜是将阴离子化的牛血清白蛋白通过静电吸引等作用力与带正点的水滑石纳米片自组装，在适当的基底上成膜，对于由牛血清白蛋白与水滑石纳米片组装粉体制备的杂化膜，膜表面结构均匀连续，牛血白蛋白排列相对随意，较多的牛血清白蛋白与重金属的结合点暴露在膜表面；对于由牛血清白蛋白与水滑石纳米片交替层层组装制备的杂化膜，膜表面结构紧凑且均匀连续，牛血清白蛋白的光谱强度随着组装层数的增加成线性增长。
所述水滑石纳米片为乳酸根插层镁铝水滑石纳米片，蛋白质为牛血清白蛋白(第五组分)。
本发明的牛血清白蛋白杂化膜的制备方法如下：
(1)水滑石纳米片的制备：将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中，配制成Mg/Al为2/1的盐溶液。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石白色浆液洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离。所制备的乳酸根插层镁铝水滑石具有高度结晶的晶体结构，在水中分散剥离得到水滑石纳米片。
(2)粉体杂化膜的制备
a、基底的处理：将硅片、石英片、玻璃片基底在清洁剂、水/异丙醇中各自清洗10-60分钟，然后在体积比为5∶1∶1的水/双氧水/氨水中加热处理30-90分钟；
b、缓冲溶液的配制：配制0.2mol/L的磷酸氢二钠和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，以此配制pH 5.0-9.0的缓冲溶液，用于溶解牛血清白蛋白；
c、调节牛血清白蛋白溶液的pH 5.0-9.0，牛血清白蛋白溶液与水滑石纳米片在15-40℃的条件下自组装30-120分钟后，将处理过的基底浸渍在上述牛血清白蛋白溶液与水滑石纳米片的组装体系中15-40分钟，清洗干燥，得到粉体杂化膜，牛血清白蛋白分子均匀地分布在基底表面；
(3)层层组装杂化膜的制备
a、调节牛血清白蛋白溶液的pH 5.0-9.0，配制浓度为0.5-3mg/ml的蛋白质溶液，组装前溶解30-120分钟；
b、将处理过的基底浸渍在乳酸根插层的水滑石纳米片中10-30分钟，水洗干燥；
c、然后浸渍在配制好的蛋白质溶液中10-30分钟，水洗干燥，得到一个双层二元杂化膜；
d、重复上述(b，c)步骤，制备多层组装蛋白质和水滑石纳米片的层层组装杂化膜，层层组装杂化膜中，蛋白质和水滑石纳米片交替成膜，蛋白质的特征光谱强度随组装层数的增加成线性增长；水滑石纳米片紧凑地排列在基底表面，由层层组装所制备的牛血清白蛋白杂化膜的膜结构均匀连续，牛血清白蛋白的光谱强度随着组装层数的增加成线性增长。
本发明制备的牛血清白蛋白杂化膜，通过调变牛血清白蛋白分子的表面电荷，结合水滑石纳米片带正电的特性，通过牛血清白蛋白与水滑石纳米片的自组装粉体制备牛血清白蛋白粉体沉积膜；通过静电自组装方法，将处理过的基底交替浸渍到水滑石纳米片和牛血清白蛋白溶液中，通过静电及其它作用里实现二者的交替组装，制备牛血清白蛋白与水滑石纳米片的层层组装杂化膜。对具有潜在应用价值的蛋白质分子实现了器件化，拓展其应用。
本发明的优点在于，同时制备方法简单不需要复杂的设备，成本低廉，制备过程中只使用水作为溶剂，制备方法环保。
附图说明
图1为牛血清白蛋白与水滑石纳米片自组装粉体沉积的杂化膜的扫描电镜照片。
图2为牛血清白蛋白与水滑石纳米片通过层层组装的杂化膜的扫描电镜照片。
具体实施方式
实施例1
a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；
b、在pH 5.0的条件下，配制浓度为3mg/ml牛血清白蛋白溶液30ml，加入10ml水滑石纳米片溶液，组装1h；
c、将处理过的基底浸渍到上述组装体系中20分钟，取出水洗并干燥，得到粉体沉积杂化膜。
实施例2
a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；
b、在pH 8.0的条件下，配制浓度为1mg/ml牛血清白蛋白溶液30ml，加入10ml水滑石纳米片溶液，组装1h；
c、将处理过的基底浸渍到上述组装体系中20分钟，取出水洗并干燥，得到粉体沉积杂化膜。
实施例3
a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；
b、在pH 5.0的条件下，配制浓度为3mg/ml的牛血清白蛋白溶液；
c、将处理过的基底浸渍到50ml水滑石纳米片中20分钟，取出水洗并干燥；
d、将上述预铺了一层水滑石薄膜的基片浸渍到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中20分钟，取出水洗并干燥；
e、重复c和d步骤，制备牛血清白蛋白与水滑石纳米片的多层膜。
实施例4
a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；
b、在pH 8.0的条件下，配制浓度为3mg/ml的牛血清白蛋白溶液；
c、将处理过的基底浸渍到50ml水滑石纳米片中20分钟，取出水洗并干燥；
d、将上述预铺了一层水滑石薄膜的基片浸渍到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中20分钟，取出水洗并干燥；
e、重复c和d步骤，制备牛血清白蛋白与水滑石纳米片的多层膜。
实施例5
a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离；
b、在pH 8.0的条件下，配制浓度为0.5mg/ml的牛血清白蛋白溶液；
c、将处理过的基底浸渍到50ml水滑石纳米片中20分钟，取出水洗并干燥；
d、将上述预铺了一层水滑石薄膜的基片浸渍到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中20分钟，取出水洗并干燥；
e、重复c和d步骤，制备牛血清白蛋白与水滑石纳米片的多层膜。
Claims (2)
1.一种制备牛血清白蛋白杂化膜的方法，其特征在于，工艺步骤为：
(1)粉体杂化膜的制备
a、基底的处理：将硅片、石英片、玻璃片基底在清洁剂、水/异丙醇中各自清洗10-60分钟，然后在体积比为5∶1∶1的水/双氧水/氨水中加热处理30-90分钟；
b、缓冲溶液的配制：配制0.2mol/L的磷酸氢二钠和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，以此配制pH 5.0-9.0的缓冲溶液，用于溶解牛血清白蛋白；
c、调节牛血清白蛋白溶液的pH 5.0-9.0，牛血清白蛋白溶液与水滑石纳米片在15-40℃的条件下自组装30-120分钟后，将处理过的基底浸渍在上述牛血清白蛋白溶液与水滑石纳米片的组装体系中15-40分钟，清洗干燥，得到粉体杂化膜，牛血清白蛋白分子均匀地分布在基底表面；
(2)层层组装杂化膜的制备
a、调节牛血清白蛋白溶液的pH 5.0-9.0，配制浓度为0.5-3mg/ml的蛋白质溶液，组装前溶解30-120分钟；
b、将处理过的基底浸渍在乳酸根插层的水滑石纳米片中10-30分钟，水洗干燥；
c、然后浸渍在配制好的蛋白质溶液中10-30分钟，水洗干燥，得到一个双层二元杂化膜；
d、重复上述(b，c)步骤，制备多层组装蛋白质和水滑石纳米片的层层组装杂化膜，层层组装杂化膜中，蛋白质和水滑石纳米片交替成膜，蛋白质的特征光谱强度随组装层数的增加成线性增长；水滑石纳米片紧凑地排列在基底表面，由层层组装所制备的牛血清白蛋白杂化膜的膜结构均匀连续，牛血清白蛋白的光谱强度随着组装层数的增加成线性增长。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水滑石纳米片的制备步骤为：
将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁Mg(NO3)2·6H2O溶于60mL去离子水中，配制成Mg/Al为2/1的盐溶液；将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中，调节体系的pH值6-11；加入Mg/Al混合盐溶液，继续滴加NaOH溶液至pH值6-11，加热至回流并晶化7-12小时，得到白色浆液，离心分离，洗涤烘干；取上述乳酸插层水滑石白色浆液洗涤至中性后，在一定体积水中分散，加热回流至剥离。所制备的乳酸根插层镁铝水滑石具有高度结晶的晶体结构，在水中分散剥离得到水滑石纳米片。
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