CN101517417B - 热循环器和加样口 - Google Patents

Abstract

一种用来将一定体积液体试样引入到流过连续流动管的流体载体流内的加样口，该连续流动管具有出口和引入所述载体流和所述液体试样两者的公共入口，所述加样口包括用所述流体载体连续地供应所述入口的容器，调整所述容器以在所述入口上方保持基本恒定的流体载体液位，并与所述连续流动管的所述入口可流体配合，从而，在使用中，当所述容器基本上处于大气压下时，且当所述流体载体选择成使其特性足以维持引入到所述载体内的液体试样的物理形状时，所述流体载体流和所述液体试样被抽吸通过所述连续流动管。

Description

热循环器和加样口

技术领域

本发明涉及热循环器，具体来说，涉及流体在多个温度区域之间自动和连续循环的热循环器。

本发明的开发研制主要用于核酸放大的热循环器，且下文中将参照该项应用进行描述。然而，应该认识到，本发明不局限于该特殊的应用领域。

本发明还涉及连续流动系统，尤其是涉及将一定体积的液体试样引入到连续流动系统内的加样口。然而，应该认识到，本发明不局限于该特殊的应用领域。

背景技术

在整个说明书中对现有技术的任何讨论决不应认为上承认如此的现有技术是广泛公知的，或其构成本技术领域内公知技术的一部分。

需要多次或循环的化学反应来产生要求产物的系统，经常需要小心的温度控制、以及在一定温度下维持反应的时间上需要可再现的和精确的控制。如此的反应例如包括诸如聚合酶链锁反应(PCR)和连接酶链锁反应(LCR)之类的核酸放大反应。

PCR是涉及多次循环的技术，其导致每完成一个循环就有某些多核苷酸序列的几何放大。PCR技术是众所周知的，在许多书中有描述，包括：M·J·麦克弗森等人的PCR：实践方法(PCR：A Practical Approach)，IRL出版社(IRLPress)(1991)，英尼斯等人的PCR协议：方法和应用指南(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)，学术出版社(Academic Press)(1990)，以及H·A·艾力许的PCR技术：DNA放大的原理及应用(PCR Technology：Principals and Applications for DNA Amplification)，斯托克顿出版社(StocktonPress)(1989)。PCR还在许多美国专利中有描述，包括：US 4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；4,889,818；5,075,216；5,079,352；5,104,792；5,023,171；5,091,310；以及5,066,584。

PCR技术通常包括使多核苷酸变性的步骤，其后将至少一对引物寡核苷酸退火为变性多核苷酸的步骤，即，将引物杂交至变性多核苷酸模板。退火步骤之后，具有聚合酶活性的酶催化包含引物寡核苷酸的新多核苷酸链的合成，并使用原来的变性多核苷酸作为合成模板。这一系列步骤(变性、引物的退火和引物延伸)构成一PCR循环。

当循环重复时，新合成的多核苷酸量几何地增加，因为前个循环新合成的多核苷酸可用作为其后循环中合成物的模板。通常成对地选择引物寡核苷酸，其可退火成给定的双链多核苷酸序列的相对的链，这样，两个退火部位之间的区域就得到放大。

DNA的变性通常发生在大约90至95℃，将引物退火为变性的DNA通常在约40至60℃下进行，用聚合酶延伸退火引物的步骤通常在约70至75℃下进行。因此，在PCR循环中，反应混合物的温度必须变化，并在多循环PCR试验中多次地变化。

用于DNA放大和序列化的多个热“循环”在现有技术中已有揭示，其中，一个或多个温度控制元件或“块”保持反应混合物，其中，块的温度随时间变化。这些装置存在这样的缺点：它们循环反应混合物很慢，且温度控制不够理想。为了克服循环地提升和下降加热块的温度之需要，已有人设计出在本技术领域内称之为热循环器的装置。在该装置中，多个温度控制块保持在不同的要求的温度，使用一机器人在块与块之间移动反应混合物。典型的热循环器系统揭示在US 5,443,791；5,656,493和6,656,724中。然而，将会认识到，这些系统存在它们自身的一系列缺点。例如，如人们会理解的，它们具有相当有限的产量，它们实体体积很大，易于损坏、昂贵且需要不断的日常维护。

US 5,270,183的发明部分地解决了上述装置所遇到的困难。实质上，该专利发明涉及移动通过连续管的反应剂，通过将连续管盘绕在保持变化温度的大致鼓形体上，而使该连续管的温度变化。为了防止试样之间交叉污染，将反应混合物注入到载体流体流中，载体流体分离个别的反应混合物并通过两个或三个单独的加热区域。载体流体和反应混合物是不相混的，这样，载体流体的各节段将每个试样清晰地与前面的和后面的试样分离开来。该结构允许顺序地处理多个试样。然而，该装置具有诸多缺点，例如，由于加热区域空间上分离，所以，实时地监视反应过程不很方便。此外，令加热区域彼此分离实体上趋于笨重。

WO 03/016558中描述了对于US 5,270,183所揭示发明的一种进步，其中，单个的鼓形体沿纵向划分而提供至少两个节段，它们能被加热到不同的温度，以使鼓形体具有不同温度的外围表面。当反应剂移动通过盘绕在鼓形体周围的连续管时，反应剂承受变化的温度。然而，如此热循环器的问题在于，使用扫描鼓形体外围的线性跟踪装置难于足够快地读出数据。

对于连续流动系统和装置来说，通常包括上述的热循环器，它们通常在正压下操作，并需要泵将载体流体泵送通过诸如反应管那样的连续管/导管。通常地，这些泵是高压或非常高压的泵。因此，这些现有技术的连续流动装置需要专用的高压注射口，用来将液体试样输送到正在高压下被泵送通过管子的载体流体流内。这些高压注射口具有各种缺点。然而，主要缺点是它们具有试样之间交叉污染的倾向，例如，在加载过程中试样的污染，这很大程度上是由于用于注射试样的隔膜-针结构，或沿管子行进时试样之间的污染。

因此，仍然需要有改进的连续流动系统，包括如上所述的热循环器装置，以及试样的处理和输送装置。

本发明的目的是克服或改善上述现有技术的至少一个缺点，或提供一有用的替代方案。

发明内容

本发明的某些优选实施例提供了这样一种热循环器，其能以循环的或渐进的方式变化管内流体的温度，或能保持流体处于恒定的温度，与现有技术的装置相比，改进了对流体所要维持的温度的控制，并提供改进的监视管内发生的反应的装置。本发明的其它实施例提供了用于连续流动系统，特别是试样被抽吸而不是在压力下被泵送通过柱或管的连续流动系统的加样口。

根据本发明第一方面，提供一种热循环器，该热循环器包括多个嵌套的用于独立地维持预定的温度的热交换器，由此，形成对应的多个温度区域；所述热交换器适于接纳反应管，以使所述反应管与所述热交换器在热传递上连通，由此，流过与所述热交换器配合的反应管的流体循环地通过各温度区域。

根据本发明的相关方面，提供包括一对嵌套的内和外热交换器的热循环器，其中，每个热交换器包括多个隧道并适于维持预定的温度，由此形成多个温度区域；以及反应管，反应管与隧道配合以与温度区域热接触，由此，反应管交替地穿过每个热交换器的相继隧道，以使流过反应管的流体循环地通过各温度区域。

热交换器最好同心地布置，但这种类型的布置对于热循环器的设计或功能并不是关键的。

较佳地，隧道平行于同心的热交换器轴线延伸。在一优选的实施例中，隧道在至少一面上敞开以提供表面槽，该表面槽将反应管基本上保持在热交换器的表面上。或者，隧道是局部封闭的表面槽，由此允许反应管“卡配-锁定”在其中。

外热交换器可具有一环结构，该结构具有大致为圆形的横截面，但该类型的布置对于热循环器的设计或功能也不是关键的。内热交换器可以是管状的或实心棒或块。热交换器可选择为螺旋形。

内热交换器环可包括至少一个狭槽，以便用光学方法监视反应管。

在一实施例中，内热交换器的端表面基本上与外热交换器对应端表面齐平。然而，在其它实施例中，内热交换器的一个或两个端表面可与外热交换器对应端表面轴向地间隔开。

可使用各种加热和/或冷却方法保持各个热交换器的预定温度。较佳地，加热和/或冷却方法可选自：电阻丝和珀耳帖装置。对于核酸放大来说，预定温度可以是约95℃、约60℃或约72℃。当然，应该理解到，对于热交换器的任何特定区段，可以容易地选定和保持任何范围的温度。热交换器最好保持在恒定温度下。然而，热交换器可适于保持轴向变化的温度分布，例如，温度曲线可从约55℃到约95℃。然而，应该认识到，根据特定的应用，可选择任何的变化温度分布。

在本发明的一特定实施例中，每个热交换器较佳地包括一组在其对应端表面上彼此相对的反应管对齐构造物。该构造物可以是纵向凹陷径向延伸的狭槽，用于定位管子以使其安置成基本上与每个热交换器的每个端表面齐平。构造物布置在外热交换器的内周缘上和内热交换器的外周缘上。

较佳地，每个热交换器内的隧道径向等距离且布置成间隔的阵列。任何数量的隧道或槽可设置在每个热交换器内/上，然而，隧道或槽的典型数量在约15和75之间。较佳地，隧道数量是40至50。

较佳地，反应管基本上透明并用诸如Teflon(聚四氟乙烯)或Tefzel(乙烯-四氟乙烯共聚物)或类似材料的惰性的弹性材料形成。较佳地，管的内表面是疏水的。选择的管子应与隧道保持紧配关系，以改善热/热量传递的连通特性，由此将热量从热交换器传递到泵送通过反应管的流体。反应管相对于热交换器的布置应可实现一连续流动的结构。较佳地，反应管可以是被移去和更换的。

在本发明的另一实施例中，外和内热交换器可以再分为多个离散的轴向间隔开的热交换器，每个热交换器适于将温度保持成与邻近热交换器温度相同或不同。使用该实施例，本发明可编程成执行2步、3步或4步反应，可根据给定温度下热交换器的数量来变化每个温度下的驻留时间。毗邻的热交换器块可用来在延长的时间内保持恒定的温度。例如，四个热交换器中的两个可保持在约70℃，以提供比变性或退火时间更长的反应。可供选择地是，高温和低温热交换器的布置可重新安排，使荧光测量可在热循环的不同时间点进行。更有甚者，热交换器可任何次数地划分以提供任何数量的温度区域，然而，应该认识到，对于大多数PCR/LCR反应来说，4个温度区域就足够了。

热循环器也可包括一个或多个包围外热交换器的另外的热交换器以提供更多的温度区域。

较佳地，反应管包括一用来将流体引入到反应管内的入口以及一保持通过反应管的流动的输送装置。在使用中，该输送装置在压力下保持通过反应管的流动。较佳地，该压力在约70至700kPa之间。背压通常施加在反应管的端部，该背压约为30至70kPa之间。在本发明的替代实施例中，通过热循环器的液体流动由施加到流动管出口的负压来维持。这样做的优点是，允许使用零接触和无污染方法在大气压下引入试样(见下文)。

较佳地，流体包括需分析或反应的试样、用于分析或反应的试剂以及载体流体。在一实施例中，试样用载体流体与后面的试样分离，基本上防止各试样之间的污染，即，载体-试样-载体的结构。然而，在一替代的实施例中，冲洗流体可散布在试样之间，即，载体-冲洗-载体-试样-载体-冲洗-载体的结构。较佳的载体流体是硅油，或没有生物污染的任何合成组合油。较佳地，冲洗流体是纯水。在热循环器用于核酸放大的实施例中，载体流体应没有诸如RNA或DNA的核酸。较佳地，需要分析或反应的试样是含有诸如DNA或RNA之类核酸的试样。试样的其它组分通常包括寡核苷酸引物、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)，以及热稳定DNA聚合酶、它的酶活化部分、它的酶活化衍生物以及逆转录酶中的至少一个。

较佳的是，通过选择流量、热交换器相对轴向长度和/或反应管的直径，试样保持在预定温度下的时间是可以预选择的。在利用热循环器用于核酸放大的本发明的一实施例中，定时足以使以下反应发生：

(a)使DNA变性为其组分串；

(b)将寡核苷酸引物退火到DNA中的补充序列；以及

(c)合成新的DNA链；

较佳的是重复这些步骤，直到放大达到要求的水平。

热循环器也可包括使试样变性的预盘管，其中，试样通常变性约2至10分钟之间。

较佳的是，也可将监视反应管内反应的标记试剂加入到反应流体和/或试样。标记试剂可从以下组群中合适地选择：荧光染料、插入染料、显色底物，或与荧光半体共价联合的寡核苷酸探头。

在其它实施例中，热循环器可包括其它包围外热交换器的C形热交换器，以在放大产物上提供DNA熔化分析。C形热交换器的周向间隙可以在约20至100°之间，然而，C形热交换器的周向间隙最好约为20°。C形热交换器可包括周向变化的温度分布，其从约70℃变化到约95℃。然而，应该认识到，根据特定的应用可选择任何的温度曲线。反应管可以布置在围绕C形热交换器上或下端面的单个环路内，这样，当试样围绕周界迁移时，试样暴露于变化的温度。可供选择地是，当试样围绕周界迁移时，探测试样的荧光以可确定熔化分布形式。然而，在替代实施例中，C形热交换器包括保持反应管的槽，其中，槽设置在热交换器一侧上。熔化探测研究通常在1至20分钟之间进行，最好是2分钟。

在另一实施例中，可在反应管围绕在其周围的C形热交换器上实施放大产物的后熔化，其中，C形热交换器每端处的温度维持在不同的温度。如此熔化装置上的每匝管子因此处于离散的温度，从而给出与在热交换器上所具有的多匝管子那样多的熔化确定过程中的测量结果。管子还可围绕C形热交换器的内周卷绕，这样，用高速旋转的扫描器时，根据扫描速度而不是围绕热交换器的匝数来确定熔化分辨率。如果管长可以显著地缩短(例如，10倍以上)，则这种方法还提供了快得多的熔化时间。

热循环器还可包括用来监视发生在反应管内反应过程的扫描探测器。较佳地，用荧光来测量反应过程。在一实施例中，扫描探测器包括转动单元，其轴向地安装在热循环器的热交换器环上方(或下方)，以便直接地测量在内和外热交换器之间的周向间隙内的管子。该单元可包括至少一个探测通道，其具有一入射光源和一探测器。例如，入射光源可以是带有合适过滤镜的汞弧灯，而入射光源可以是LED或激光。较佳地，该转动单元包括四个对应于蓝、绿、黄和红入射光的探测通道。此外，该单元较佳地还包括至少一个“熔化”探测通道，当安装C形热交换器时，该通道用来探测熔化分布。较佳地，转动单元转速大于500rpm(每分钟的转数)。应该认识到，上述扫描探测器每个波长只需一个激励和一个探测器端口。

在另一实施例中，扫描探测器可包括轴向转动45°的镜子，其中心地设置在内热交换器内，由此，探测通过狭槽的反应过程。在此实施例中，扫描探测器引导入射光沿热循环器轴线，当镜子完成单圈转动时，镜子将入射光反射到每“匝”的反应管，以在反应管通过转动光束时使反应管可连续地得到扫描，并探测每个反应。落射荧光可循着同样的光路被引导返回，并通过分色镜到达探测器。荧光探测可与照明同步，或采用交替的照明和探测扫描而。

应该认识到，由于快速数据采集，所以，这些探测器能实时地探测发生在反应管内的反应过程。

在其它实施例中，多个探测器安装在热交换器之间的周向间隙上方，其中，对暴露的反应管数量配备同样数量的探测器。或者，探测器测量成组的或成对的反应管。任何类型的探测器都是合适的，包括照相机、光电二极管和光电倍增管。

根据本发明的第二方面，提供使用第一方面的热循环器装置来放大PCR或LCR格式的核酸的方法。

根据本发明的第三方面，提供使用第一方面的热循环器装置来实施核酸熔化探测化验的方法。

根据本发明的第四方面，提供使用根据第一方面的装置来准备的核酸。

应该认识到，本发明的装置可以有利地应用于其它方法，例如，应用于分析抗体-抗原结合反应的方法。

根据本发明的第五方面，提供一种用来将一定体积液体试样引入到流过连续流动管的流体载体流内的加样口，连续流动管具有出口和引入所述载体流和所述液体试样两者的公共入口，所述加样口包括：用所述流体载体连续地供应所述入口的容器，所述容器适于在所述入口上方保持基本恒定水平的流体载体并与所述连续流动管的所述入口可流体配合，这样，在使用中，当所述容器基本上处于大气压下时，且当所述流体载体选择成使其特性足以维持引入其中液体试样的物理形状时，所述流体载体流和所述液体试样被抽吸通过所述连续流动管。

较佳地，液体试样是含水试样，流体载体是疏水的液体。流体载体可以合适地是诸如硅油那样的油。根据权利要求3所述的加样口，其中，疏水的液体是油。

根据本发明的第六方面，提供一种连续流动的装置，其包括根据第五方面所述的加样口。

较佳地，连续流动装置是用于实施核酸放大反应的热循环装置。放大核酸的较佳方法是PCR。

根据本发明的第七方面，提供一种用来将一定体积液体试样引入到流过连续流动管的流体载体流内的方法，连续流动管具有出口和引入所述载体流和所述液体试样两者的公共入口，所述方法包括以下步骤：提供根据第五方面的加样口；将所述连续流动管的所述入口流体配合到所述容器；将所述流体载体引入到所述容器内和将所述液体试样引入到所述流体载体内，所述流体载体选择成：所述流体载体使其特性足以维持液体试样的物理形状，且当所述容器处于大致的大气压下时，所述流体载体流和所述液体试样被抽吸通过所述连续流动管。

根据本发明的第八方面，提供一种用来将一定体积液体试样引入到流过连续流动管的流体载体流内的方法，连续流动管具有出口和引入所述载体流和所述液体试样的公共入口，所述方法包括以下步骤：提供根据第五方面的加样口；将所述连续流动管的所述入口流体配合到所述容器；将所述流体载体引入到所述容器内；将液体试样分配器浸没到装在所述容器内的所述流体载体内；在所述入口附近分配所述液体试样，并可选地用所述液体试样分配器操纵所述分配的液体试样，以将所述分配的液体试样引入到所述入口内并抽吸通过所述连续流动管，所述流体载体选择成：使其特性足以维持液体试样的物理形状，且当所述容器基本上处于大气压下时，所述流体载体流和所述液体试样被抽吸通过所述连续流动管。

除非文中另有明确要求，在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(动词)”、“包括(现在分词)”等应被认为是包含的含义，恰与排外的穷举的含义相对；这就是说，是“包括但不局限于”的含义。

除了在操作的实例中，或另有所指明的，本文中所使用的表达成分含量或反应条件的所有数量应理解为在所有情况下可用术语“约”来修改。所有实例并不意图限制本发明范围。下文中，或另有所指的地方，“％”意指“重量％”，“比”意指“重量比”，“部分”意指“重量部分”。

定义

在本发明的描述和权利要求中，将按照如下阐述定义使用以下术语。还应理解到，本文中使用的术语只是为了描述本发明特定的实施例并不意图限制。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学的术语具有相同的含义，该含义是本发明所涉及技术领域内的普通技术人员共同一致理解的含义。

本文中使用的“穿过……”中的“穿过”是指与热交换器配合的反应管。因此，例如，如图3清楚地所示，反应管位于热交换器隧道内或卷绕通过隧道。术语“穿过”还意指包括这样的实施例，其中，反应管可逆地被捕获地接纳在设置在热交换器表面上的表面槽内，即，“卡配锁定”，或卷绕在热交换器周围。

本发明文内所使用的术语“隧道”意指包括其中开口完全在热交换器壁内，即完全被包围住的结构，以及热交换器表面内或表面上的半圆开口、通道和/或槽也是如此，由此，可热传递连通地接纳反应管。术语“隧道”和“槽”在这里用作为可互换。

本发明文内所使用的术语“嵌套”意指这样的热交换器结构，其中，至少一个热交换器基本上包围另一热交换器，或基本上放置在另一个边界内。例如，在优选实施例中(见图1)，设置一对环，其中，一个环的直径小于另一个的直径，以使小直径的环可放置在较大直径环的边界之内。

指当一抽吸力施加到连续流动管出口上时被抽吸通过连续流动管的流体载体流所采用的术语“被抽吸(被动分词)”和“抽吸(现在分词)”是用来与以下概念相区别：当泵送力施加到入口上时，将流体载体流的“推动”、“推进”或“泵送”通过连续流动管。通常使用诸如HPCL泵那样的高压泵来提供泵送力。相比之下，抽吸力通常利用抽吸/吸气/真空泵来施加，可供选择地，可结合一真空瓶型的结构。对于本发明来说，泵送力可认为是正向力，而抽吸力是负向力。此外，对于本发明来说，当载体流体被抽吸通过连续流动管时，容器被认为没有施加显著大于大气压的压力。流体也可通过重力作用被“抽吸”通过连续流动管(当使用某种载体流体时)。

本文中使用的术语“大气压力”意指大致为101.325kPa(即，760mm Hg)的大气压力，或其在不同海拔高度处的等价压力。然而，技术人员将会认识到，该术语允许有一定程度的偏差，且认为该数值不看作是精确值。

附图说明

现将参照附图借助于实例来描述本发明的优选实施例，附图中：

图1是根据本发明热循环器的俯视立体图；

图2是图1所示热循环器的仰视立体图；

图3是图1所示热循环器的俯视图，示出螺纹地与隧道啮合的反应管的一部分；

图4是所示安装在PCR装置内的热循环器的立体图；

图5是类似于图4的视图，但包括安装在热交换器环上方的转动扫描探测器；

图6是类似于图5的视图，其中显示扫描探测器转过90°；

图7是显示探测通道的类似于图6的视图；

图8是类似于图7的视图；

图9是所示安装在PCR装置内的热循环器的俯视立体图，为了清楚起见，用叠影方式示出内部热交换器；

图10是图9所示PCR装置的侧视图；

图11是类似于图10的视图，但为了清楚起见，已移去外热交换器，而内热交换器用叠影方式示出而显示45°转动镜面和允许对反应管进行光学测量的狭缝；

图12是显示分色镜和相关光学装置的图9的仰视立体图；

图13是图12所示分色镜和相关光学装置的立体图；

图14是45°转动镜面装置的立体图；

图15是由连续扫描通过反应管的试样而组合起来的光栅图像；

图16是转换为相对强度对管圈数的曲线的图15所示的数据；以及

图17示出用模板分析的试样的DNA熔化曲线(这些曲线超过阈值)和不用模板分析的试样的DNA熔化曲线(这些曲线不超过阈值)；

图18是根据本发明第五方面装置的侧视图，显示为将液体试样引入到连续流动管入口之前的情形；

图19是类似于图1的视图，但示出引入到流体载体容器内的液体试样；

图20是类似于图2的视图，但示出抽吸入连续流动管入口内的液体试样；以及

图21是一替代装置的侧视图。

具体实施方式

首先参照图1至3，热循环器包括一对离散的、嵌套的分别为内和外直圆柱形热交换器环1和2。每个环包括多个纵向通过其壁延伸的隧道3。隧道数量可以在大约15和70之间，然而，在典型结构中设置约40个隧道。每个热交换器环1和2适于保持不同的预定温度，由此，形成两个温度区域。使用加热和/或冷却装置来保持温度，所述装置呈一个或多个电阻丝或珀耳帖装置(未示出)的形式。沿热交换器环1和2轴向长度的温度分布保持在基本恒定值上。热交换器的内环1和/或外环2也可分为一对离散的轴向间隔开的副环(未示出)。每个副环可适于保持不同的预定温度，由此，形成第三和/或第四温度区域。温度区域可保持在任何温度下，但对于使用PCR方法的核酸放大而言，它们通常选自：约95℃、约60℃和约72℃。然而，在替代的实施例中，热循环器可包括一个或多个围绕外热交换器的另外的热交换器，以提供另外的温度区域。

反应管4以紧配合的关系螺纹啮合于隧道3，由此，将热量从热交换器环1和2传导到反应管内的流体。或者，反应管也可穿过每个环1和2的相继的隧道，以使通过反应管4的的流体循环地通过各个温度区域。

通常地，反应管4为透明的，并用诸如Teflon、Tefzel或类似材料的惰性材料形成，反应管较佳地呈弹性，以使其能穿过隧道。此外，反应管4的内表面应疏水的以防止试样、其内含物或其它可能的污染物粘附在上面。

每个环1和2在对应的端表面8和9上包括彼此相对的反应管对齐构造物7的阵列5和6。构造物7设置在外环2的内周缘10上和内环1的外周缘11上。构造物7较佳地是纵向凹陷径向延伸的狭槽，用于定位管4以使其安置成基本上与每个环1和2的每个端表面8和9齐平。

反应管4还包括一将流体引入到管内的入口以及一保持恒定流通过管(未示出)的输送装置。该输送装置合适地呈一正排量泵的形式，该泵保持在约70至约700kPa之间的压力下的通过反应管的100-200μL/min的流量。也可在反应管的端部处施加一背压，并该背压可保持在约30至约70KPa之间，然而，没有背压情况下系统也可很好地操作。如果施加背压，则流体保持在压力之下而避免或尽可能减小流体流的脱气或蒸发。

引入到反应管内的流体包括一待分析或反应的试样、在分析或反应中要使用的试剂以及载体流体。载体流体使要分析或反应的试样与后面的试样分离，并基本上防止试样之间的污染。载体流体通常是硅油，但也可使用没有诸如RNA(核糖核酸)或DNA(脱氧核糖核酸)那样的生物污染的任何合成油。

核酸放大的典型试样可包括DNA、寡核苷酸、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)，以及热稳定DNA聚合酶、它的酶活化部分、它的酶活化衍生物以及逆转录酶中的至少一个。

正如以后将会认识到的，流量、热交换器环1和2的相对轴向长度和/或反应管4的直径可控制试样保持在预定温度下的时间。在典型的核酸放大反应中，该时间足以使以下反应发生：

(a)使DNA变性为其组分链；

(b)将寡核苷酸引物退火到DNA的补充序列中；以及

(c)合成新的DNA链。

当试样被逐步地泵送通过各个温度区域时，重复这三个步骤，直到达到理想的放大程度为止。放大步骤的数量正比于设置在热循环器内的隧道数量，即，试样通过指定温度区域的次数。

也可将监视反应管内化学反应的标记试剂添加到试样中。该标记试剂通常是荧光染料，但可以是插入染料、显色底物，或与荧光半体共价联合的寡核苷酸探头。

在另一些实施例中，热循环器包括一包围外热交换器2的C形热交换器(未示出)，用来在放大产品上提供后熔化。C形热交换器的周向间隙通常约为20°而热交换器包括介于约70℃至约95℃之间的周向变化的温度分布。在特别优选的实施例中，管4围绕C形热交换器的外周设置，以在试样围绕周界泵送时，试样可经受熔化分布形式。然而，在最佳的实施例中，反应管4保持在一设置在C形热交换器面上的槽内。

在替代的实施例中，热循环器可包括一扫描探测器，其用来探测标记反应剂，并因此监视发生在反应管4内的反应过程。在一实施例中，如图5至8中清楚地所示，扫描探测器包括一安装在环1和2上方(或下方)的可转动单元12，用来在热交换器、或构造物7、或设置在C形热交换器面上的槽之间，直接扫描周向间隙13内的管4。例如，一入射光线和探测系统可安装在定位在热交换器环1和2上方的转动单元的边缘上。可安装四个探测通道(LED/二极管或激光/二极管组合)，从而多达四个荧光团可在一个试样内多路传输，且所有四个通道可同时地获得数据。诸如IR二极管那样的沿着转动轴线的光耦合装置可将数据流从探测器馈送到主数据处理单元，或数据可馈送到探测器内。然而，任何无线的数据传输装置都是合适的。从安装在转动单元12上的“熔化”通道20中收集熔化数据。

扫描探测器理想地由安装在转动探测器头内的小发电机供电。或者，可采用旋转刷。然而，可采用任何对探测器供电的装置，例如，步进电动机21。

在其它结构中，内热交换器环包括一环形狭槽14，以便用光学方法监视反应管。如图10清晰地所示，分色镜15轴向地安装在PCR装置一侧，一轴向转动45°的镜16设置在内环内，由此，探测通过环形狭槽14的反应管内反应过程。扫描探测器引导入射光线沿着热循环器的轴线，当镜16完成一圈转动时，光线反射在每一圈的管子上。管子可被连续地扫描，且在管通过转动光束时探测每一反应。落射荧光沿同一光路返回，并通过分色镜16到一探测器(未示出)。借助于电机17使镜快速转动可使管连续地得到扫描，且在管通过转动光束时使每一反应得到探测。使用交替的照明和探测扫描，荧光探测可以与照明同步或延迟。

在还有其它的实施例中，扫描探测器的每次扫描将光强度数据送到一数据处理计算机中，用于试样的识别。每次扫描中的字节数相同，以使数据可被储存在缓冲器内，当添加上每一新的扫描时，将数据转换为新的数据。这可形成管荧光的动态图像，伸展开到一线性平面上。然后，一独立的计算机程序用边缘探测图像分析技术来探测试样。试样“小块”或团块内的数据点被进行平均，并在该循环数下对该“小块”产生一荧光水平。荧光水平和循环数然后被用来产生标准的Rotor——gene REX文件数据格式，以便用Rotor——gene软件进行分析，然而，任何合适的数据格式都是可接受的。

现转到加样口组件和其与连续流动系统的使用，正如将会认识到的，根据本发明的加样口允许将液体试样引入到一连续的流动柱内，无需现有技术的高压注射口或专用的注射装置。与现有技术的高压注射口相比，该加样口相对较便宜，其没有移动零件和没有磨损部件(诸如隔片)。此外，根据本发明的加样口允许试样在大气压下用标准空气移动的吸液管末端进行加载，由于末端与针筒注射器装置相比相对便宜，所以，末端可容易地进行批量消毒，并且每个末端用后即可丢弃，由此，消除了试样的交叉污染。相比之下，现有技术的针筒注射装置必须在试样注射之间进行清洗/消毒。更有甚者，“发射(touch off)”的加载技术是“零接触”的，这意味着加载加样口内不存在污染。还有，根据本发明的加样口特别适用于自动化试样加载，事实上，用市场上出售的任何机器人系统就可实现。

较佳地，通过对管出口施加一抽吸力，流体载体被“抽吸”(与通过高压下泵送的“推动”相对)通过连续流动管。与现有技术装置相比，由于现不需要高压泵，更为重要的是，不需高压注射口，所以，抽吸流体载体流通过连续流动管带来了成本收益。然而，在一替代的实施例中，选择流体载体使其在重力作用下被抽吸通过连续流动管。

施加到连续流动管出口的抽吸力可以相当容易地提供，例如，将连续流动管出口配合到一简单的真空泵结构中。例如，将约10至100kPa的真空负压施加到内直径为1mm的15米长的连续流动管，可提供约50至500μL/min之间的流量。然而，应该认识到，流量正比于管内直径和/或油的等级和/或施加到管出口的真空量。管甚至可以是重力馈送，通过合适地选择油等级和管内直径就可实现这一点。本技术领域内的技术人员将会认识到，根据特定的应用，可以提供其它的真空和流量。较佳地，应控制真空以保持通过连续流动管的均匀流量。

较佳地，容器敞开于大气压或保持在大气压下，由此，提供一“零压加载加样口”。较佳的容器包括一中心成锥度的底部，其适于捕获地接纳连续流动管。然而，在一替代的实施例中，容器可以与一段导管预先配装，以使预配装段导管的出口可以与预先存在的连续流动管的入口流体配合。为了确保没有空气夹带在连续流动管内，容器应构造成：当容器完全充满流体载体时，管的入口浸没在装在容器内的流体载体的体积之内。管入口最好基本上是垂直地构造，以便从上面接纳液体试样。较佳地，连续流动管的一部分插入到容器内，从而当容器充满流体载体时，使连续流动管入口设置大约在装在容器内的流体载体的体积高度的中心处。一合适的泵(诸如蠕动泵)向容器供流体载体，一光学传感器通过控制添加到容器内流体载体的流量来保持预定的流体液位。或者，可提供一堰型的结构来保持流体液位。然而，只要容器在基本上大气压下充分地保持有流体载体，本技术领域内的技术人员将会明白其它的结构。

首先将诸如吸液管末端之类的试样分配器的末端定位在刚好连续流动管入口上方，然后缓慢地分配液体试样，由此可将液体试样引入到连续流动管内。较佳地，液体试样约为20μL。然而，液体试样可以少至1μL或多至50μL。由于表面张力的作用，分配到疏水油载体中的含水液试样基本上呈球形。可供选择地是，吸液管的末端保持与液体试样球的接触，以帮助操纵该球到连续流动管入口，并防止它“落掉”到容器壁。由于流体载体流动到连续流动管入口内，所以，液体试样球就可“发射”到入口中，并且，它从那里通过施加到出口的抽吸力被抽吸到连续流动管内。可以认识到，多个液体试样可以规定的时间间隔引入到连续流动管内。液体试样可以相同或不同的试样。较佳地，尽管不是必要的，但可将插入的“冲洗”流体添加到试样之间。为作解释，一较佳的试样加载包括以下顺序：冲洗一试样一冲洗一试样一冲洗等。当然，每一冲洗/试样流体被载体流体所分离。该顺序减少了试样的交叉污染，这是因为可能被移走的试样任何部分被冲洗流体而不是被前一试样所“捕获”。冲洗流体较佳地是水。

本发明的加样口特别适用于高产量的自动化系统。在本发明的一实施例中，借助于机器人试样操作系统，可用多个序列的试样(如需要的话，以及冲洗流体剂量)对加样口进行装载。在高产量应用的加样口的其它实施例中，可提供多个连续流动管。连续流动管的入口较佳地间隔成容器内的一个阵列。该实施例也有助于藉助其机器人系统可将多个液体试样引入到多个连续流动管入口内的机器人试样操作。或者，连续流动管的阵列可以并联结构在下游合并成单个连续流动管，由此，形成一“并联”的总管。在该实施例中，液体试样顺序地从总管一端加载到另一端，由此，当液体试样被抽吸入并通过连续流动管时，使液体试样能均匀地间隔开。然而，在其它实施例中，连续流动管开口的阵列可在下游串联地合并到单个连续流动管内，由此，形成一“串联”的总管。有利地是，在此实施例中，液体试样可同时地加载。

在另一替代方面，提供一用于高压连续流动系统的低压试样加样口。在该方面，提供一对间隔开的管，它们容纳在一对间隔开的转动板之间以形成一转动台。在一个位置，两个管之一敞开到大气中，而另一个管与高压连续流动管对齐。通向大气的那根管含有流体载体并可接纳液体试样。一旦加载液体试样转该动台就转动，使通向大气的管子切换到“对齐”，使另一管可接纳其后液体试样。然后重复该过程。应该认识到，该加样口结构提供用一次性可丢弃的末端来引入试样，而无需针筒的注射器装置，因为没有可刺穿的隔膜，因此减少试样交叉污染的可能性。

应该认识到，根据本发明的加样口将适用于许多类型的连续流动装置。当然，需要将抽吸力施加到连续流动管的出口以抽吸流体/液体通过其中，而不是通过高压泵送方法来“推动”流体流。然而，由于真空泵是相对常用且便宜的实验室装置，它相当容易地适于对连续流动管的出口提供抽吸力，所以，本申请人相信，用本发明装置来修改现有的连续流动系统所涉及的成本将是相对小的。

在一实施例中，本发明适用于任何用抽吸力进行操作的连续流动装置。例如，本发明可适用于PCT公报第WO 03/016558号中所描述的连续流动装置。根据W003/016558，被多个液体试样间断的流体载体流在压力下被泵送通过盘绕在圆柱形热交换器周围的连续流动管，所述热交换器具有多个不同温度区域。选择温度区域来提供以下操作：将核酸变性到其组分链内；将寡核苷酸引物退火到核酸内的补充序列；以及合成新的核酸链。流过连续流动管液体试样以循环的方式经受这些变化的温度，直到达到要求水平的放大(放大成比例于连续流动管围绕热交换器盘绕的次数)。上述的和类似的现有技术装置必须要求使用高压泵来强制流体载体流通过连续流动管，以及必须要求使用高压注射口将液体试样引入到流体载体流内。该设备相对复杂、昂贵，需要定期维护和熟练的操作者。与之不同，通过使用本文所述的新颖加样口，且通过抽吸而不是推动/推进/泵送流体载体流通过连续流动管，本发明有利地避免使用如此的高压设备。

当使用连续流动系统进行PCR时，所使用的流体载体最好没有生物污染物，例如，RNA或DNA那样外来的核酸，并将流体载体选择成基本上防止流过连续流动管的液体试样之问的污染。然而，在本发明中，也较佳的是选择流体载体以保持液体试样的物理特性。本申请人业已发现，硅油特别适用于本发明。理想地是，流体载体是粘度在约5至50厘沲之间的硅油。然而，应该认识到，油粘度不局限于此范围。如果不希望受理论的局限，那么，可以认为合适的硅油主要是取决于相对均匀的链长度。因此，合适粘度和具有这些链长度特征的任何油都可用作为流体载体。本申请人还已经发现较佳的硅油是对液体试样提供中性浮力的硅油，即，密度在约0.95至O.99g/cc之间的硅油。然而，应该认识到，油密度不局限于此范围。

较佳地，液体试样是用于PCR试验的组分的混合物。例如，液体试样包括待分析或反应的试样和用于分析或反应的试剂。较佳地，待分析或反应的试样是包含诸如DNA或RNA之类核酸的试样。试样的其它组分通常包括寡核苷酸引物、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)，以及热稳定DNA聚合酶、它的酶活化部分、它的酶活化衍生物以及逆转录酶中的至少一个。

连续流动管较佳地基本上为透明、弹性的，并由具有疏水内表面的惰性材料形成。例如，由Teflon或Tefzel或类似材料形成的连续流动管是首选的。然而，连续流动管可由使流体在抽吸力下能被抽吸穿过其的任何合适材料形成。较佳地，管的内直径在约1至1.6mm之间。

应该认识到，尽管本发明的加样口特别适用于连续流动的PCR装置，但是本发明的装置和方法不局限于该领域。例如，本发明适用于蛋白质分离系统和等温反应，其中，在每个循环中测量试样荧光。然而，本发明特别适用于机器人方法，以减少试样加载到连续流动系统内的污染。

现将参照说明加样口及其在连续流动系统中的使用的附图，在所有附图中，相同的标号表示相同的零件。首先参照图18，本发明提供呈加样口1形式的装置和将一定体积液体试样2引入到流入和流过连续流动管4的流体载体3内的方法。连续流动管4较佳地由Teflon形成，并包括一出口(未示出)和一引入流体载体3流和液体试样2的公共入口5。加样口1包括一容器6，其用流体载体3连续地供应到入口5。由于容器6较佳地构造成通向大气，所以，借助于重力或在对出口施加足够的抽吸力时，可抽吸流体载体3流通过连续流动管4。

如上所讨论，本发明特别适用于使用PCR来放大核酸的连续流动装置，还特别适用于采用机器人系统的自动化高产量的试样处理。通常地，在这些装置中，将多个液体试样2引入到连续流动管4内，其中，每个液体试样2被一定体积的流体载体3分离，以防止液体试样2之间的污染。在现有技术的装置中，该液体试样2流和流体载体3被泵送通过连续流动管4，且连续流动管4暴露于至少一个由合适热交换器7提供的温度区域。然而，在本发明的该方面，液体试样2流和流体载体3可通过对连续流动管的出口施加抽吸力而被抽吸通过连续流动管4，例如，通过一真空瓶型的装置8施加抽吸力。液体试样2可以是用于PCR试验的液体的混合物，而流体载体3是诸如油那样的疏水流体，它最好是没有外来生物污染物，例如，诸如RNA或DNA之类的核酸。

再参照图18，容器6较佳地包括一中心锥形的底部9。连续流动管入口5浸没在容器6中装的流体载体3的体积内，并垂直地构造成从上方接纳液体试样2。设置一堰10来维持流体载体3的液位。容器6的表面11通向大气压，诸如蠕动泵那样的一泵(未示出)通过入口12对容器6提供流体载体3。井14内的流体载体3的溢流13返回到泵以作再循环。

现参照图18至20，本发明的方法包括首先将连续流动管4配合到含有流体载体3的容器6，以及将抽吸力施加到出口上，以使流体载体3均匀地被抽吸通过连续流动管4。然后，通过将吸液管16的末端15定位在连续流动管入口5上方，并分配约10μL的液体试样2，将液体试样2引入到连续流动管4内。分配到硅油3内的含水液体试样2基本上呈球形。较佳地，吸液管16的末端15保持与液体试样2球接触，以帮助操纵球到连续流动管入口5，并防止它“落掉”到容器6的壁。由于有流体载体3流动进入连续流动管入口5内，所以，液体试样2的球可被“射发”到入口5内(见图20)，通过施加在出口的抽吸力，液体试样可从入口5被抽吸到连续流动管4内。

如上所讨论，尽管流体载体3防止流过连续流动管4的液体试样2之间的污染，但本申请人已确定，也应选择流体载体3来保持液体试样2的物理特性。为了作解释，流体载体3最好是硅油，且该硅油具有约5至50厘沲之间的粘度以及约0.98g/cc的密度，由此，对液体试样2提供中性的浮力。本申请人业已发现，如果使用不合适的油，则液体试样2的球趋于“落掉”到容器6的壁并变为粘附/驻留在壁上。此外，如果球下降得太快，则它可在连续流动管入口5附近被“捕获”且不被完全地抽吸入到连续流动管4内。

现参照图21，在一替代的加样口结构中设置一对试样管17、18。试样管17、18被容纳在一对间隔开的平行板19之间以形成一转动台20。试样管17之一连续地从泵补充流体载体3，而另一试样管17自由地接受大气压下的液体试样2。一旦液体试样2加载到试样管18内，管18就可通过转动可转动台20而切换到“对齐”，由此将液体试样2引入到连续流动管4内。因此被试样管18“代替”的试样管17(刚被切换到“对齐”)可接纳其后的液体试样2。

在高产量应用中的一替代结构中，可提供多个连续流动管4来同时地进行多个核酸放大。连续流动管入口5较佳的是间隔成容器6内的一阵列内。该实施例有助于机器人试样操作，由此，一机器人系统可将多个液体试样2引入到多个连续流动管入口5内。或者，连续流动管阵列可在下游以并联结构合并到单个连续流动管4内，由此，形成一“并联”总管。在该实施例中，液体试样2从总管的一端顺序地加载到另一端，由此，当液体试样2被抽吸入和流过连续流动管4时，使液体试样2均匀地间隔开。在其它实施例中，连续流动管开口5的阵列可在下游串联地合并到单个连续流动管4内，由此，形成一“串联”总管。如将会认识到的，在此实施例中，液体试样2可同时地加载。

根据本发明的加样口容易地适于许多类型的连续流动装置。除了加样口本身，这些现有装置的唯一实质变化是，对连续流动管出口提供抽吸力(如果重力馈送不足够的话)以抽吸流体通过，而不是通过高压泵来“推动”液体流通过。抽吸力(需要的话)可用标准真空泵等提供。

现将参照以下实例来描述本发明，这些实例应在所有方面看作是说明性的并无限制意义。

实例

实例1：试样注射(正向加压系统)

本发明的一重要方面是没有污染的试样注射，即，当试样通过装置时完全分离试样，在油的流动中不打碎含水试样的能力，且一个试样的荧光不会污染下一个试样。在实践中，重要的是，清洗不锈钢注射器的内部和外部，然后，注射试样，其后实施另一清洗步骤。例如，具有300mm长度的不锈钢针安装在一CAS机器人头部上，并用来收集和加载试样。较佳地，针的内部容积大于试样体积，以最大程度地减小污染。在这些实施例中，针的内部容积近似为8μL，于是，多达5μL的试样可安全地进行加载，而不会有试样被抽出针的后部外而进入注射器筒内。加载的注射器系统用米利Q(milliQ)水进行清洗，而试样如下地加载到针内：

1)加载2μL油

2)加载5μL试样

3)用“水起泡器”清洗针的外面

4)加载2μL油

从静止管中加载油，然而，在替代的实施例中，可使用一“油起泡器”，从而不再需要用“水起泡器”清洗针外面。

5)将8μL加载到系统的加样口内

6)从加样口移去针

7)用100μL水清洗针以清洗针的内部和外部

8)等待15-30秒

9)将20μL的MilliQ水注入到加样口内

10)等待15-30秒

11)重复1)

实例2：实时监视反应管

参照图15，该图提供连续扫描通过反应管的试样而组合起来的光栅图像。水平线代表每个扫描，在水平线中荧光用递增的灰度表示。图上的数字表示三个移动通过管子的试样。试样中荧光显影之后，只有最后几匝管子显示在该图像中。

图15所示数据可变换为图16，图中绘出试样对于管子匝数的相对强度。图16中所示数据允许对通过流动装置的试样中的荧光变化作动态分析。在该特定实例中，试样C2、C4和C6含有用于所用的特定扩增子的DNA模板，而替代的试样C1、C3、C5和C7不含有模板。

实例3：DNA熔化-探测研究

参照图17，该图显示用模板(这些曲线超过阈值)和没用模板(这些曲线不超过阈值)所作分析的试样的DNA熔化曲线。产物熔化的温度可用作为已经形成基本上正确产物的确认。

实例4：大气压加样口(“零污染”试样注射)

使用本发明的加样口能获得一种无污染试样施加的改进方法，以及能使用可容易地进行消毒的标准吸液管末端来注射试样，且按照要求，每个末端在试样施加之后就可丢弃。

根据本发明的加样口流体地配合ETFE(乙烯四氟乙烯)(Tefzel)连续流动管，该连续流动管具有1.0mm内直径，1.6mm外直径和约15m长度。拖拉硅油具有与水相似的密度和5厘沲的粘度。当注射口比连续流动管的出口高约50cm时，该油足以在重力作用下流过管子，且油以100μL/min的流量流动。当拖拉密度与水相似且粘度为50厘沲的硅油时，需要对管出口施加20kPa的真空以获得200μL/min的流量。

市购的PCR缓冲液和TAQ供应时包括表面活性剂。该表面活性剂致使DNA在流动过程中从水态迁移到油态。运行正向和负向PCR控制在正向之后约20次循环中在负向试样产生污染(即百万分之一)。因为通常达到十亿分之一水平的放大的PCR应用来说，该污染水平是不可接受的。

在另外一组试验中，每个试样在用milliQ水进行清洗后加载如下：

1)加载5μL水

2)加载5μL试样

3)重复1)

通过在每个PCR反应试样(即，“冲洗”流体)之间注入纯水试样，在循环3下放大的正试样和运行到43次循环的负试样之间没有观察有污染。注入的试样是H₂O-正-H₂O-负-H₂O-正……等。因此，每个试样之间的注水提供了大于十亿分之一的污染水平。

尽管参照特定的实例描述了本发明，但本技术领域内的技术人员将会认识到本发明可实施为许多其它的形式。

Claims (10)

1.一种用来将一定体积的液体试样引入到流过连续流动管的流体载体流内的加样口，所述连续流动管具有出口和引入所述载体流和所述液体试样两者的公共入口，所述加样口包括：用所述流体载体连续地供应所述入口的容器，所述容器适于在所述入口上方保持基本恒定的流体载体液位，并与所述连续流动管的所述入口可流体配合，从而，在使用中，当所述容器基本上处于大气压下时，且当所述流体载体选择成使其特性足以维持引入到所述载体内的液体试样的物理形状时，所述流体载体流和所述液体试样被抽吸通过所述连续流动管。

2.如权利要求1所述的加样口，其特征在于，所述液体试样是含水试样。

3.如权利要求1或2所述的加样口，其特征在于，所述载体流体是疏水液体。

4.如权利要求3所述的加样口，其特征在于，所述疏水液体是油。

5.如权利要求4所述的加样口，其特征在于，所述油是硅油或硅基油。

6.一种用来将一定体积的液体试样引入到流过连续流动管的流体载体流内的方法，所述连续流动管具有出口和引入所述载体流和所述液体试样两者的公共入口，所述方法包括以下步骤：提供如权利要求1所述加样口；将所述连续流动管的所述入口流体配合到所述容器；将所述流体载体引入到所述容器内和将所述液体试样引入到所述流体载体内，所述流体载体选择成：所述流体载体的特性足以维持所述液体试样的物理形状，且当所述容器基本上处于大气压下时，所述流体载体流和所述液体试样被抽吸通过所述连续流动管。

7.一种用来将一定体积的液体试样引入到流过连续流动管的流体载体流内的方法，所述连续流动管具有出口和引入所述载体流和所述液体试样两者的公共入口，所述方法包括以下步骤：提供如权利要求1所述加样口；将所述连续流动管的所述入口流体配合到所述容器；将所述流体载体引入到所述容器内；将液体试样分配器浸没到装在所述容器内的所述流体载体内；在所述入口附近分配所述液体试样，并可选地用所述液体试样分配器操纵所述分配的液体试样，以使所述分配的液体试样引入到所述入口内并抽吸通过所述连续流动管，所述流体载体选择成：使其特性足以维持所述液体试样的物理形状，且当所述容器基本上处于大气压下时，所述流体载体流和所述液体试样被抽吸通过所述连续流动管。

8.一种连续流动装置，该装置包括如权利要求1所述的加样口。

9.如权利要求8所述的连续流动装置，其特征在于，它是执行核酸放大反应的热循环装置。

10.一种放大PCR或LCR格式的核酸的方法，该方法使用如权利要求9所述的连续流动装置。

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