CN101503439A - 核酸分子si-cypj-52及其在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’－CCAGCAAUUUGUCAAGUUA－3’或者5’－CCAGCAATTTGTCAAGTTA－3’。在本发明中被称为SI－CYPJ－52。本发明的核苷酸分子SI－CYPJ－52可以明显抑制肿瘤细胞增殖；施用于裸鼠时，与相同培养条件下的对照裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。本发明为肿瘤的治疗和缓解提供了一种新的途径和手段。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤疾病现已上升为世界第2号″杀手″，其死亡人数仅次于心血管病。几年来，国外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的药物。目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选，两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有较大的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。近年来，为了开发出能特异性地杀伤癌细胞而对正常细胞无毒负作用的药物，人们对癌症的发病机制从细胞，分子水平上的研究予以高度重视和巨额投资。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子。
本发明的另一个目的是提供上述核苷酸分子的应用。
本发明提供了一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’-CCAGCAAUUUGUCAAGUUA-3’或者5’-CCAGCAATTTGTCAAGTTA-3’。在本发明中被称为SI-CYPJ-52。
其中，A、T、U、G和C分别是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。
在本发明中，术语“核苷酸分子SI-CYPJ-52”该术语还包括5’-CCAGCAAUUUGUCAAGUUA-3’或者5’-CCAGCAATTTGTCAAGTTA-3’的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括：若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，在5’-CCAGCAAUUUGUCAAGUUA-3’后(3‘端)加入若干dT(脱氧胸苷)后形成的序列。
本发明中，SI-CYPJ-52可以是具有抑制肿瘤生长的活性并且包括5’-CCAGCAAUUUGUCAAGUUA-3’dTdT的序列。
本发明中，SI-CYPJ-52可以是具有抑制肿瘤生长的活性并且是5’-CCAGCAAUUUGUCAAGUUA-3’dTdT的序列。
本发明中，SI-CYPJ-52可以是具有抑制肿瘤生长的活性并且是5’-CCAGCAATTTGTCAAGTTA-3’的序列。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，与SI-CYPJ-52连接成为重组载体。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林脑炎病毒表达系统(SemlikiForest Virus)。慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒亚属，以人类免疫缺陷病毒(human immunod efficiency virus，HIV)为代表.慢病毒不仅具有感染分裂靶细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和干细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。
另一方面，本发明还提供了上述的核苷酸分子SI-CYPJ-52的制备方法，即按SI-CYPJ-52的序列，将各核糖核酸分子依次脱水缩合。
本发明的核苷酸分子SI-CYPJ-52可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的核苷酸分子SI-CYPJ-52序列通常可以用酶解法或人工合成的方法获得。
本发明还提供了上述的核苷酸分子SI-CYPJ-52在制备抗肿瘤药物中的应用。
实验表明，本发明的SI-CYPJ-52可明显抑制肿瘤细胞增殖。将SI-CYPJ-52或者含有SI-CYPJ-52的细胞施用于裸鼠，与相同培养条件下未施用SI-CYPJ-52的裸鼠(所用的干扰RNA正向序列为GCCAGCAATTTGTCAAGTTA)相比，前者瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。
本发明的核苷酸分子SI-CYPJ-52及其类似物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的核苷酸分子SI-CYPJ-52为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的核苷酸分子SI-CYPJ-52可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的SI-CYPJ-52还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的核苷酸分子SI-CYPJ-52被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明中，所述的抗肿瘤药物是由含有效治疗量的核苷酸分子SI-CYPJ-52和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至10毫克/千克体重。
本发明中，所述药物可以是针剂、粉剂或者片剂。
本发明的核苷酸分子SI-CYPJ-52可以明显抑制肿瘤细胞增殖；施用于裸鼠时，与相同培养条件下的对照裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。本发明为肿瘤的治疗和缓解提供了一种新的途径和手段。
具体实施方式
实施例一 SI-CYPJ-52抑制肿瘤细胞增殖
LV-CYPJ-RNAi是携带靶向CYPJ小发夹状RNA(sh-RNA)的病毒载体，而LV-non-silencing是携带对照片段的病毒载体。慢病毒从上海吉凯基因技术有限公司购得。
病毒感染肝癌细胞株SK-Hep1：(A)实验前一天分别接种3～5×103个目的细胞于96孔培养板中，所加培养基体积为100μl。(B)实验时取-70℃保存的病毒在冰上融化，按照需要稀释病毒。(C)从培养箱中拿出细胞弃去原培养液，用50μl无血清培养基清洗细胞，然后加入50μl无血清培养基后，加入病毒稀释液50μl。培养液总体积为100μl，混匀后放于37℃培养。48h后换为含血清的正常培养基。(D)在病毒感染72h后用倒置荧光显微镜观察GFP绿色荧光(或者RFP红色荧光)，检测病毒对目的细胞的感染情况。结果显示，感染率达到70％以上，细胞生长明显减缓。
实施例二 抑制裸鼠肿瘤生长
2.1 裸鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)成瘤：大量培养检测SK-Hep1细胞，胰酶消化，离心收获所培养的细胞，用PBS洗涤后计数，重悬于PBS，并将细胞用一次性注射器对裸鼠进行皮下注射，每组注射≥5只，(雌性，30-40天)，每只裸鼠的细胞注射量为200μl，细胞数约为2×106，一周后肿瘤长出。
2.2 病毒注射：当肿瘤体积长至10-30mm3体积时，将20μl含有3×107TU滴度病毒的PBS用注射器直接注射进入肿瘤内。实验组注射LV-CYPJ-RNAi病毒，对照组注射LV-non-silencing病毒。两天后，再用同样的方法和剂量注射一次病毒。
2.3 肿瘤监测和瘤块切取：每天检测小鼠的状态，每三天测量一次肿瘤的体积。实验组和对照组小鼠各五只进行测量，从感染第29天起，实验组肿瘤和对照组肿瘤体积出现显著差异(P<0.01)。32天后，处死小鼠，并从皮下取出瘤块进行称量。实验组肿瘤的平均体积为0.43±0.12cm3，对照组肿瘤的平均体积为0.70±0.08cm3，差异显著(P<0.01)。实验组肿瘤的平均重量为0.21±0.07cm3，对照组肿瘤的平均重量为0.5±0.15cm3，差异显著(P<0.01)。对瘤体的切片、染色和荧光检测显示，LV-CYPJ-RNAi和LV-non-silencing病毒均成功感染了瘤体。
结果显示，与对照组相比，注射病毒(含有SI-CYPJ-52)的裸鼠瘤体生长明显减慢。这说明，本发明的SI-CYPJ-52可以明显抑制肿瘤生长。
Claims (6)
1.一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’-CCAGCAAUUUGUCAAGUUA-3’或者5’-CCAGCAATTTGTCAAGTTA-3’。
2.如权利要求1所述的一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’-CCAGCAAUUUGUCAAGUUA-3’dTdT。
3.如权利要求1所述的一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列是5’-CCAGCAAUUUGUCAAGUUA-3’dTdT。
4.如权利要求1所述的一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列是5’-CCAGCAATTTGTCAAGTTA-3’。
5.一种如权利要求1-4中任一种核苷酸分子的制备方法，其特征在于，按权利要求1-4中任一种核苷酸分子的序列，将各核糖核酸基团或者脱氧核糖核酸基团依次脱水缩合。
6.如权利要求1-4中任一种核苷酸分子在制备抗肿瘤药物中的应用。
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