CN101495618A

CN101495618A - 过氧化物酶体增殖物激活物受体δ（PPARδ）以及植入前胚胎的发育

Info

Publication number: CN101495618A
Application number: CNA2006800458013A
Authority: CN
Inventors: 黄邹琛; 艾尔弗雷德·W-S·温; 珍妮弗·戈尔兹比; 肯尼斯·K·吴
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2009-07-29
Also published as: WO2007047341A3; EP1933618A4; WO2007047341A2; EP1933618A2; US20090156890A1; US8632452B2

Abstract

本申请公开了用于增强植入前哺乳动物胚胎的发育以及增强体外受精的哺乳动物胚胎的活产潜能的方法和组合物。在植入前哺乳动物胚胎中激活过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)的体外方法包括将胚胎培养在胚胎培养基中，胚胎细胞中的PPARδ的表达一旦开始或开始后，通过向所述培养基中加入有效结合PPARδ的量的PPARδ配体来激活PPARδ，以阻止培养的胚胎的细胞中的凋亡和或加强培养的胚胎的细胞的增殖。

Description

过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)以及植入前胚胎的发育

发明背景

发明领域

本发明主要涉及用于体外培养哺乳动物胚胎和增强培养的胚胎在适合的哺乳动物宿主的子宫中植入后怀孕的成功率的组合物和方法。

相关技术的描述

过氧化物酶体增殖物激活物受体(PPAR)是一组配体激活的转录因子。它具有三种同种型：PPARα、PPARγ和PPARδ(也称为PPARβ)。这三种PPARs属于核受体超家族(Mangelsdorf等，1995)，该家族包括了甾体激素受体、甲状腺激素受体、类视色素(retinoid)受体和数量不断增加的孤儿受体。在与PPAR反应基因的启动子中的PPAR反应元件结合之前，结合了PPAR的配体首先与RXR(它是类视色素受体亚家族的成员)形成异源二聚体。(Willson等，2000；Berger等，2002)。

由于它们的组织特异性分布及其天然的配体，暗示了PPARα和PPARγ在能量动态平衡和炎症反应中的功能(Hihi等，2002；Wahli2002)。PPARα主要存在于肝脏、褐色脂肪组织和骨骼肌中；PPARγ主要存在于脂肪组织、巨噬细胞和结肠中。PPARα和PPARγ的天然配体包括多不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸和亚油酸)、白三烯B₄(花生四烯酸通过脂氧化酶途径的产物)、氧化型低密度脂蛋白、9-和13-羟基十八碳二烯酸、以及可能有15-前列腺素J2(Forman等，1997)。合成的PPARα和PPARγ配体被用于治疗脂类和葡萄糖紊乱：苯氧酸类(fibric acid)、PPARα配体，是一种降脂药物；噻唑烷二酮、PPARγ配体，是一种胰岛素(Berger等，2002)。

尽管PPARδ的天然配体的身份还是一个谜(Braissant等，1998)，通过合成的PPARδ配体和具有靶定的PPARδ功能的小鼠模型，已经揭示了PPARδ的多种生物学功能(Peters等，2000；Barak等2002)。被报道的PPARδ的功能包括脂类动态平衡(Forman等，1997)、子宫内膜感受性(Lim等，2000；Ding等，2003)、炎症(Lee等，2003)、创伤愈合(Michalik等，2001；Wahli 2002)、脑的髓鞘形成(Peters等，2000)以及对胁迫的抗性(Hao等，2002)。此外，PPARδ还涉及到结肠癌(Gupta等，2000；Cutler等，2003)。

环前列腺素(PGI₂)是一种推测的PPARδ的天然配体。在子宫的植入位点共表达高水平的PGI₂和PPARδ信息(message)(Lim等，1999)。PGI₂类似物或合成的PPARδ配体在环加氧酶-2靶向的小鼠中恢复了失去的子宫内膜感受性(Lim等，1999；Lim等，2000)。在不表达PGI₂受体的肾髓细胞中，伴随着PPARδ反应元件的活性的增加而增加的PGI₂的产生促进了它们在高渗环境压力下的存活(Hao等，2002)。最后，PGI₂是抑制PG合成的非甾类抗炎药物和防止结肠癌之间的可能的联系(Gupta等，2000；Cutler等，2003)。

植入前胚胎的体内发育受到一种协调的程序的促进，所述程序涉及来自输卵管和子宫的可溶性因子(Yeung等，1992)。环前列腺素(PGI₂)、由输卵管和子宫通过环加氧酶-2(COX-2)途径产生的一种因子，在胚胎发育和完成中发挥了关键性的作用(Huang等，2004a；Huang等，2004b；Huang等，2003；Lim等，1999)。与体内胚胎发育相比，培养的胚胎诸如体外受精(IYF)的胚胎的发育被延迟了，因为培养的胚胎被剥夺了输卵管的保护性环境(Hardy，1997)。我们最近的工作显示出在培养基中添加一种PGI₂的稳定类似物伊洛前列素，在体外增强了小鼠胚泡的孵化(Huang等，2003)。此外，用伊洛前列素预先处理的胚胎在转移到妊娠载体时显示出增强的植入和活产能力(Huang等，2004b)。除了输卵管和子宫之外，PGI₂的一个来源是植入前胚胎。通过用选择性COX-2抑制剂阻断内源PGI₂的产生，延迟了胚胎的孵化(Huang等，2004c)。因此，PGI₂对于胚胎的体外发育来说是关键的，它的稳定的类似物有效地促进培养的胚胎的孵化和植入。尽管植入前的胚胎表达PGI₂受体并具有功能性蛋白激酶A，但PGI₂类似物不增加它们的cAMP水平(Huang等，2003)。尚不清楚PGI₂及其类似物是如何实现这些增强的。

PGI₂通过与G蛋白偶联的前列腺素受体(IP)和/或过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)的结合发挥其效应(Forman等，1997；Namba等，1994)。PGI₂抑制血小板凝集和平滑肌细胞的松弛是由IP受体通过环AMP依赖性的激酶(PKA)途径来介导的(Namba等，1994)。PPARδ通过PGI₂参与细胞的保护(Adderley和Fitzgerald，1999；Hao等，2002；Tan等，2001)。无IP小鼠有增加的血栓形成的倾向(Cheng等，2002)；无PPARδ小鼠表现出生殖缺陷(Barak等，2002；Cheng等，2002)。

以前已经报道，在添加了PGI₂类似物的培养基中培养的胚胎显示出增强的孵化(Huang等，2003)、植入和活产(Huang等，2004；题目为“通过在培养基中添加前列腺素或前列腺素类似物增强体外胚胎发育的方法和组合物(Method and Composition for Enhancing In VitroEmbryo Development by Supplementing Culture medium withProstaglandin or a Prostaglandin Analog)”的国际专利申请PCT/US2004/029167(Huang等)；以及题目为“增强哺乳动物的胚胎发育(Enhancement of Mammalian Embryo Development)”的美国专利申请11/370,152(Huang等)，其公开的内容在此引为参考)。目前仍在继续寻找其它通过改进植入前胚胎的体外发育来增加它们成功植入子宫内的潜力以及增加从这些胚胎的活产率来进一步增加IVF的成功的方法。

发明内容

本申请公开了植入前胚胎表达PPARδ，并且除去PPARδ导致了降低的细胞增殖和不可逆的发育迟缓。用合成的配体活化PPARδ，被证实增加了胚胎细胞的增殖、增强了体外的胚胎孵化，并增强了培养的胚胎的植入。PPARδ代表了一种改进IVF结果的新型治疗靶。这些发现预期将在例如体外受精这样的医学技术中特别有用。

根据本发明的某些实施方案，提供了在植入前哺乳动物胚胎中激活过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)的体外方法，其中包括在胚胎培养基中培养胚胎，胚胎细胞中的PPARδ的表达一旦开始或开始后，通过用PPARδ配体结合表达的PPARδ来激活PPARδ，以阻止培养的胚胎的细胞中的凋亡和或加强培养的胚胎的细胞的增殖。

在某些实施方案中，PPARδ配体与表达的PPARδ的结合增强了胚胎的孵化。在某些实施方案中，该方法还包括以有效促进胚胎的完全孵化的量在培养基中添加前列腺素或其类似物。在某些实施方案中，配体包括至少一种前列腺素或其类似物以外的天然的或合成的配体。

在某些实施方案中，配体在桑椹胚期或在所述胚胎发育后期加入到培养基中。在某些实施方案中，配体包括L165,041，在某些实施方案中，配体包括GW501516。

在某些实施方案中，所述方法产生了具有增加的体内植入潜能的胚胎。在某些实施方案中，所述方法产生了具有增强的建立可存活的妊娠的能力的胚胎。

根据本发明，还提供了增加体外受精的哺乳动物胚胎的活产能力的方法，所述方法包括(a)按照上述的方法增强胚胎的发育，其中所述在培养基中添加合成的PPARδ配体产生了PPARδ配体处理的胚胎；(b)将PPARδ配体处理的胚胎导入哺乳动物的子宫中；以及(c)允许导入的胚胎植入到所述子宫中，其中胚胎孵化和植入到宿主的子宫中的能力，与没有在存在该合成的PPARδ配体的情况下培养的胚胎的这些能力相比，被增强了。在某些实施方案中，步骤(b)包括了将胚泡期或前期的PPARδ配体处理的胚胎转移到子宫中。

根据本发明，还提供了用于哺乳动物胚胎体外发育的改进的胚胎培养基，其中的改进包括培养基中过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)配体的量有效增加胚胎细胞的增殖，其中所述配体不是前列腺素或其类似物。在某些实施方案中，培养基中PPARδ配体的量当胚胎在培养基中培养时有效促进胚胎的完全孵化。在某些实施方案中，培养基还含有当胚胎在培养基中培养时有效促进培养的胚胎完全孵化的量的前列腺素或其类似物。

本发明的另一个实施方案提供了上面定义的在表达PPARδ的体外培养的胚胎细胞中与PPARδ结合的PPARδ配体，在用于激活PPARδ以阻止胚胎细胞中的凋亡和或加强胚胎细胞的增殖、增强体外受精的哺乳动物胚胎在引入哺乳动物的子宫后的活产能力的药物生产中的应用。本发明的这些以及其它的实施方案、特征和优点，在参考了下面的描述和附图后，将变得明显。

附图说明

图1.小鼠胚胎表达过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)。(a)来自20只小鼠的胚泡的总RNA被反转录，并使用基于小鼠PPARδ序列的的外显子5和6的引物通过PCR进行了扩增。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳。扩增子的预期大小是334碱基对(第2道)。将～330碱基对的扩增子洗脱，用限制性内切酶SST1进行消化。未消化的和消化的DNA(分别为第4和第5道)在3％琼脂糖凝胶上进行电泳。在第5道中的两个片段具有预期的大小：95和239碱基对。(第1道和第3道是100碱基对的序列梯)。(b)60个小鼠胚泡(第1道)和肝脏(第2道，30g)的全细胞裂解物在聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，然后电转移到硝酸纤维素膜上。膜用亲和纯化的、多克隆的针对基于小鼠PPARδ序列的合成肽的兔抗体进行探测，通过化学荧光进行观察。具有免疫反应性的蛋白迁移到具有预期分子量(～58kDa)的位置。

图2.过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)蛋白被定位于胚胎细胞的核。使用Western印迹分析用的相同的抗体对远交株胚胎(ICR)中的PPARδ进行免疫组织化学定位。检验了来自不同发育阶段的胚胎和未受精的卵。在8细胞阶段及其后检测胚胎中的免疫染色。显示了一个具有代表性的胚泡：内细胞团和滋养外胚层(trophoectoderm)都显示出了PPARδ染色。PPARδ染色具有颗粒状的图案，反映了DNA结合染料4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对核的染色。

图3.过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)的特异性配体以浓度依赖性的方式增强了小鼠胚胎的孵化，(a)收获双细胞胚胎(C3B6F1)并在存在DMSO(介质，1∶10,000)或1μM合成的PPAR配体：WY14,643(PPARα)、L165,041(PPARδ)和环格列酮(PPARγ)的情况下培养。96小时后，比较完全孵化的比率。PPARδ的特异性配体L165,041增强了完全胚胎孵化(在所有组中p＜0.0001，X²＝24.6；费歇尔精确检验L165,041与对照组相比的p＝0.0097；相对风险＝1.9；95％置信区间：1.08-3.36)。括号中的数字表示在总的胚胎中完全孵化的胚胎的数量，(b)将双细胞胚胎(C3B6F1)在添加了不同浓度的L165,041的培养基中培养96小时。计算出完全孵化的比率(详见文本)。图中显示了基于3到6组各含有15-20个胚胎的独立的实验的完全孵化的平均值±SD(％)。估算的ED₅₀是21nM。(使用1μM进行了6组实验，0和3μM各进行了3组实验，其它浓度各进行了4组实验。)

图4.桑葚胚期及其后的胚胎对合成的过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)具有反应性。将双细胞胚胎(混合的C57BL6N和C3H背景)在指示的时期内在添加了1μM L165,041的培养基中培养96小时。下面的表显示了在这期间胚胎经历的发育阶段。与对照胚胎相比，在收获后0-96、24-96和48-96小时期间暴露于L165,041的胚胎具有明显高的完全孵化比率。这些结果表明，在收获后48小时，当大部分胚胎变成桑葚胚时，胚胎变得对L165,041具有反应性。括号中的数字表示相对总的胚胎完全孵化的胚胎的数量，(在5个组中p＝0.0006，X²＝19.6；相对于对照^*p＜0.0001、^**p＝0.004，^***p＝0.002)。

图5.合成的过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)配体降低了植入前胚胎的细胞凋亡并增强了细胞增殖。(图5a)将双细胞小鼠胚胎(C3B6F1)在添加了L165,041(0.1μM，合成的PPARδ配体)或介质(DMSO，1∶10,000)的培养基中培养72小时。所有达到胚泡期的胚胎(典型大约为90％)用多聚甲醛进行固定，进行TUNEL分析，使用4′-6-二脒基-2-苯基吲哚对核进行负染色。在荧光显微镜下使用适合的滤光片确定总的和凋亡的细胞。显示了17个对照和19个实验胚胎的结果(平均值±SD)。这是来自三组实验中的一组的结果。其它的两组实验使用了同样数量的胚胎，获得了类似的结果。(^*p＝0.034)(图5b)。收获双细胞胚胎(25％C57BL6/J和75％129Sl/SvImJ)，如上所述培养72小时。在与10M 5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)温育6分钟后，将胚胎固定在含有甘氨酸的酸性乙醇中(详见文本)。使用针对BrdU的特异性单克隆抗体通过免疫组织化学法检测掺入的BrdU。增殖指数是胚胎中掺入BrdU的细胞的百分数。显示了来自25个对照和31个实验胚胎的结果(平均值±SD)。每个胚胎的平均细胞数在两个组中都是63个。(^*p＝0.015)。

图6.消除过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)在体外延迟了植入前胚胎的有序进程。在注射hCG后47小时收获PPARδ-/-和野生型胚胎(WT)，并在体外观察96小时。经过48小时的培养后发育的差异变得明显。该图是基于151个PPARδ-/-和84个WT胚胎。使用类似数量的胚胎重复实验一次，结果类似。(^*p＝0.0261，双边费歇尔精确检验，相对风险＝5.393，95％置信区间＝1.113到26.138)。

图7.消除过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)在体内延迟了植入前胚胎的有序进程。在注射hCG后70和96小时获得了PPARδ-/-和野生型(WT)胚胎。基于倒置显微镜下的形态学确定胚胎的发育阶段；每个胚胎中细胞的数量通过用结合DNA的荧光染料4′-6-二脒基-2-苯基吲哚染色核来确定。在注射hCG 70小时后，(a)大部分的PPARδ-/-和WT胚胎分别是四和八细胞胚胎，并且(b)正如预期，WT胚胎比PPARδ-/-胚胎具有明显多的细胞(^*p＜0.0001)。在注射hCG 96小时后，(c)与PPARδ-/-胚胎相比明显多的WT胚胎处于胚泡期(^*p＜0.0001，相对风险2.6，95％置信区间为1.8-3.6)，以及(d)WT胚胎比PPARδ-/-胚胎具有明显多的细胞(^*p＝0.002)。(a)和(b)中的结果是基于76个PPARδ-/-胚胎和72个WT胚胎；(c)中的结果是基于PPARδ-/-和WT胚胎各155个；(d)中的结果是基于9个PPARδ-/-胚胎和18个WT胚胎。

图8.消除过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)与降低的胚胎细胞增殖有关。在注射hCG后70和96小时获得PPARδ-/-和WT胚胎，在含有5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU，10μM)的培养基中温育10分钟。将胚胎固定在冰冷的甘氨酸(50mM)的70％乙醇(pH2.0)中，使用抗BrdU小鼠单克隆抗体和FITC偶联的抗兔IgG抗体进行染色(详见文本)。细胞的核用DNA结合染料4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，5g/ml)进行染色。处于S期因此掺入了BrdU的细胞在FITC滤光片下被识别。总细胞数量基于DAPI核染色在UV滤光片下确定。增殖指数(处于S期的细胞的百分数)通过用BrdU阳性细胞的数量除以总细胞数量然后乘以100％来确定。在注射hCG后(a)70小时和(b)96小时后，WT胚胎与PPARδ-/-胚胎相比具有明显高的增殖指数。在(a)中使用了各12个胚胎；在(b)中使用了33个WT胚胎和30个PPARδ-/-胚胎。(^*p＜0.0001)。

图9.植入前胚胎表达PPARδ。(a)通过RT-PCR分析PPARδ的转录本。从~个胚泡制备总RNA。第1道显示了分子量标记，第道是334-bp的PPARδ带，第3道是334-bp的PPARδ带的证实，通过SST1消化产生两条具有预期大小的片段，分别为95-和239-bp。(b)来自25个小鼠胚胎的细胞裂解物的Western印迹分析。测试样品的总细胞裂解物(30μg)作为对照；使用了60kd的蛋白作为分子量标记(第1道)。(c)代表性的胚泡中PPARδ的免疫组织化学染色。染色图案表明PPARδ是核定位的，与Hoechst 33258(一种DNA结合染料)染色的结果相似。正如预期的那样，PPARδ-/-胚泡没有显示出PPARδ染色。

图10.伊洛前列素(iloprost)和L-165041对野生型(PPARδ+/+)和PPARδ-/-胚胎的孵化的影响。从双细胞期开始，将胚胎在存在或不存在伊洛前列素(0.1μM)或L-165041(0.1μM)的情况下培养。96小时后，比较每个组中完全孵化的胚胎的数量。伊洛前列素和L-165041单独地以相似的程度增加了野生型胚胎的孵化。伊洛前列素和L-165041的组合没有额外的效果。另一方面，PPARδ-/-胚胎具有明显低的完全孵化比率，对伊洛前列素或L-165041都没有应答。括号中的数字表示完全孵化的胚胎的数量与总胚胎的数量的比较。^*表示p＜0.05，^**表示p＜0.01(与对照胚胎比较，卡方检验)。

图11.PPARδ的缺失降低了胚胎细胞的增殖。从双细胞期开始，将野生型和PPARδ-/-胚胎培养72小时。按照方法部分中的描述确定BrdU的摄取和细胞数量。正如每个胚胎中明显更多的BrdU阳性细胞所表明的那样，WT胚胎具有更多的细胞增殖(a)。结果，WT胚胎每个胚胎具有更多的细胞(b)。该图显示了使用22个野生型和20个PPARδ-/-胚胎的一个代表性的实验的结果；在使用类似数量的胚胎的其它两组实验中观察到了同样的结果。^*表示p＜0.01。

图12.L-165041增强胚胎的孵化，(a)L-165041浓度依赖性地刺激完全胚胎的孵化。从双细胞期开始，将野生型胚胎培养在不同浓度的L-165041中。96小时后确定完全孵化的胚胎的比率。该图是基于3到6组实验，每组实验使用15-20个胚胎；误差条线显示了平均值±SD。(b)PPARδ配体(L-165041，1μM)、而不是PPAR

(WY14643，1μM)或PPARγ(环格列酮，1μM)配体、增强了完全胚胎孵化。图中描述了1到2组各使用15-20个胚胎的独立的实验的组合结果。括号中的数字表示完全孵化的胚胎的数量与总胚胎的数量的比较，(c)L-165041(1μM)增加了双细胞、八细胞和桑椹胚期胚胎的孵化、但是不增加胚泡期胚胎的孵化。图中描述了2到4组各使用14-20个胚胎的独立的实验的组合结果。括号中的数字表示完全孵化的胚胎的数量与总胚胎的数量的比较，(d)L-165041增加了胚胎细胞的增殖。图中描述了使用24个对照和31个L-165041处理的野生型胚胎的一组代表性实验的结果。实验被重复两次；结果相似。^*表示p＜0.05，^**表示p＜0.01。

图13.PPARδ的激活改进了培养的胚胎的植入。处于双细胞期的97个PPARδ+/+和54个PPARδ-/-胚胎被培养48小时。在记录了它们的发育阶段后将胚胎转移到妊娠载体。72小时后确定妊娠囊的数量。明显较少的PPARδ-/-胚胎发育到胚泡期(a)。当转移到载体时，PPARδ-/-胚胎具有明显较低的植入率(b)。从双细胞期开始，56个和42个PPARδ+/+胚胎分别接受DMSO和L165041，培养48小时。在记录了发育阶段之后，将胚胎转移到受孕载体。72小时后确定妊娠囊的数量。在胚胎转移时两个组中胚胎发育的程度是类似的(c)。但是，L-165041处理的胚胎具有明显较高的植入率(d)。括号中的数字表示妊娠囊的数量和被转移的胚胎的数量。^*表示p＜0.05，^**表示p＜0.01。

优选实施方案的详细描述

I、增强胚胎的孵化和减少胚胎细胞的凋亡。

输卵管来源的前列环素最适化了植入前胚胎的发育，并增强了它们孵化、植入和活产的能力。前列环素在植入前胚胎中的信号传导尚不清楚。为了探索过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)可能在植入前胚胎中介导PGI₂效应(例如PGI₂的信号传导)的可能性，研究了PPARδ在植入前胚胎中的表达，并通过合成的PPARδ配体将它激活。基于完全胚胎孵化和胚胎细胞的凋亡评估了植入前胚胎对合成的PPARδ的应答。为了揭示PPARδ在植入前胚胎的发育中的作用，比较了PPARδ敲除(PPARδ靶向的(PPARδ-/-))和野生型胚胎的发育。发现，当通过RT-PCR和Western印迹分析测定时，植入前小鼠胚胎表达了PPARδ，正如在后面详细描述的那样。合成的配体对它的活化增加了胚胎孵化并减少了凋亡。合成的PPARδ配体以浓度依赖性的方式减少了凋亡、增强了增殖、并增加了胚胎孵化(ED₅₀＝21nM)。通过基因靶向消除PPARδ，在植入前胚胎中导致了降低的细胞增殖和不可逆的发育迟缓。因此，植入前胚胎表达PPARδ，而它对于正常的发育和胚胎细胞的增殖是关键的。合成的配体对PPARδ的活化增强了体外的胚胎孵化。根据这些在小鼠模型中进行的代表性研究，推测哺乳动物、包括人类的胚胎表达PPARδ。PPARδ的表达确保了植入前胚胎的有序发育，它被合成的配体的活化增加了体外的胚胎孵化。

材料与方法

试剂来源和机构批准。除非特别指明，所有的试剂都是从Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO，USA)购买的。研究方案得到休斯顿的德克萨斯大学卫生科学中心的动物福利委员会的批准。小鼠的护理和操作符合美国国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南(NIH出版号No.85-23，1996年修订)。

小鼠胚胎的收获和培养。小鼠从下列来源获得：C3H、129S1/SvImJ和C57BL6/J来自Jackson实验室(Bar Harbor，ME，USA)；ICR和C57BL6/Nhd来自Harlan(Indianapolis，IN，USA)；PPARδ-/-由R.Evans博士馈赠(the SaIk Institute，La Jolla，CA)。PPARδ-/-的野生型(WT)对应小鼠通过将129S1/SvImJ与C57BL6/J x 129S1/SvImJ的后代进行交配而育种。小鼠被保持在温度和湿度被控制的环境中(07:00开始光照，19:00停止光照)，可以自由接近食物和水。小鼠胚胎按照以前描述的方法收获和培养(Huang等，2003)。简单来说，通过对3周龄的雌性小鼠进行腹膜内注射PMSG(5IU)、然后在42-46小时后注射hCG(5IU)，来使其超排卵。在注射hCG后(在15:00)，将每只雌性小鼠与一只被证明具有生殖能力的雄性小鼠同笼。除非特别指明，胚胎(在双细胞期)在44-48小时后收获，并于37℃在5％CO₂条件下培养(每组17-20个)在含有600L无蛋白培养基的4孔板中(Nalge NuncInternational，Naperville，IL，USA)。在前48小时使用HTF培养基(SageBiopharma，Bedminster，NJ，USA；在第二个48小时，使用含有Earle′s盐和2mM谷氨酰胺的αMEM(Irvine Scientific)。经过96个小时的培养后，检查每个胚胎中透明带的存在。那些完全不具有透明带的胚胎被记录为已经完全孵化。完全孵化的比率通过用完全孵化的胚胎的数量除以总的胚胎的数量来计算。胚胎的完全孵化被用作终点，因为它是明确的终点，并与植入和活的妊娠的概率相关(Huang等，2003；Huang等，2004b)。介质(DSMO)的浓度少于1∶10,000；对照的胚胎接受同样浓度的DMSO。

PPARδ-/-和WT胚胎体内发育的比较。如下所述对PPARδ-/-和WT胚胎在体内的发育进行了比较。胚胎从注射了hCG后70和96小时的plugged小鼠获得。这些时间点的选择是因为在注射hCG后70小时时，大部分的WT胚胎发育成8细胞或桑椹胚期的胚胎，而在注射hCG后96小时，大部分的WT胚胎发展成胚泡。根据胚胎细胞的数量对注射hCG后70小时获得的胚胎的发育阶段进行了比较，因为紧密的8细胞胚胎和桑椹胚期的胚胎不能根据它们的形态在相差显微镜下可靠地区分。根据它们在相差显微镜下的形态确定了注射hCG后96小时获得的胚胎的发育阶段。基于用结合DNA的荧光染料4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行核染色，然后用免疫荧光显微镜在UV滤光片下(AxioPlan 2，Carl Zeiss，Germany)检测来确定胚胎细胞的数量。

5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)的摄入和增殖指数。胚胎细胞的增殖根据它们掺入BrdU的能力来确定。分析使用商业化的试剂盒(BrdU标记与检测试剂盒I，Roche Applied Science，Indianapolis，IN)按照制造商的方法作了某些最适化后进行。改变之一是温育的时间。预实验显示在PPARδ-/-和WT胚胎之间区分S期细胞比例的最适温育时间是10分钟。为了比较对照和L165,041处理的胚胎，最适的时间是6分钟。修改后的步骤如下。在收获后，将胚胎立即在含有10M BrdU的100L预先平衡的HTF培养基中于37℃在5％CO₂条件下温育10分钟。在温育后，将胚胎在冰冷的甘氨酸(50mM)的70％乙醇(pH2.0)中于-20℃下固定30分钟。在含有1％BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中复水/封闭后，将胚胎在含有1％BSA的温育缓冲液中与稀释的抗BrdU小鼠单克隆抗体(1∶2)的温育，然后在含有1％BSA的PBS中与稀释的FITC偶联的抗兔IgG抗体(1∶4)温育。两次温育都在37℃下进行，持续30分钟；在每次温育后将胚胎在200L含有1％BSA的PBS中清洗。在DAPI(5μg/ml)中在25℃下最后温育90分钟后，将胚胎固定在含有16.6％

50-42(DuPont Wilmington，DE，USA)和2.5％1，4-二氮杂二环-(2.2.2)-辛烷的0.1M Tris HCl(pH 8.5)中。处于S期从而掺入了BrdU的细胞在FITC滤光片下进行识别。总细胞数基于DAPI核染色在UV滤光片(AxioPlan 2，Carl Zeiss，Germany)下被确定。增殖指数(处于S期的细胞的百分数)通过用BrdU阳性细胞的数量除以总的细胞数量然后乘以100％来确定。

末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)和死细胞指数。使用了商业化的试剂盒(原位细胞死亡检测试剂盒，RocheApplied Science)并作了一些修改，对经历了程序性细胞死亡的胚胎细胞通过TUNEL分析进行鉴定。在每个指示的时间点，在培养后收集胚胎或从小鼠收获胚胎，并在含有4％缓冲的多聚甲醛的PBS中于4℃固定30分钟。在进行TUNEL之前，将胚胎与5％triton的PBS溶液在37℃温育20分钟。对制造商提供的方案进行了修改。将最多20个胚泡在20 L TUNEL反应溶液(2μL TUNEL酶和18μL 1∶4稀释的标记溶液)中于37℃在加湿箱中温育60分钟。然后在安装在16.6％50-42(DuPont，Wilmington，DE，USA)的0.1M Tris HCl(pH8.5)中之前，将胚胎在DAPI(30μg/mL)中于37℃温育5分钟。使用荧光显微镜(AxioPlan 2，Carl Zeiss，Germany)分别用FITC和UV滤光片观察凋亡的细胞和总细胞。使用DNA酶处理的胚胎作为阳性对照。死细胞指数(TUNEL阳性细胞的百分数)通过用TUNEL阳性细胞的数量除以总细胞的数量然后乘以100％来确定。

RNA提取、RT/PCR和限制性酶消化分析。从20个胚泡中使用商业化的试剂盒(RNeasy，Qiagen，Chatsworth，CA，USA)提取总RNA，并用于RT/PCR。引物根据基因库中小鼠的PPARδ序列(NM_011145)进行选择。BLAST分析显示出没有已发表的小鼠序列与334bp的扩增子的序列具有同源性。使用基于外显子6的核苷酸序列的引物(5′TTCTAGAGCCCGCAGAATGG)，在42℃进行RT 30分钟。。上游(5′GCCAAGAACATCCCCAACTTC)和下游(5′CCTGGATGGCTTCTACCTGG)引物分别来自外显子5和6。PCR反应由94℃15秒、60℃1分钟和72℃1分钟共45个循环构成，最后在72℃延伸7分钟。具有预期分子量(～330碱基对)的扩增子被洗脱(QIAEX II凝胶提取试剂盒)，用限制性酶SST1(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行消化。分别使用2％和3％的琼脂糖凝胶分离PCR产物和消化的DNA(预计产生两个片段：95和239bp)，使用UV光观察。

Western印迹分析。Western印迹分析按照以前的描述(Huang等，2002)来进行，作了一些修改。使用了亲和纯化的、针对基于小鼠的PPARδ蛋白的合成肽(MEQPQEETPEAREE，Abcam Inc.，Cambridge，MA，USA)的多克隆抗体。简单来说，将细胞裂解物中的蛋白在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher&Schuell，Inc.，Keene，NH，USA)。被抗体结合的PPARδ蛋白使用增强的化学荧光(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA)来观察，其信号被STORM 860激光扫描器(Amersham Biosciences)检测。来自小鼠肝脏的总细胞裂解物被用作阳性对照。

胚泡的细胞裂解物如下进行制备。将2L培养基中的60个小鼠胚泡转移到1.5ml Eppendorf管中，管中含有30μL裂解缓冲液(150mMNaCl，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，1mM原钒酸钠，1mM EGTA和1mM氟化钠)和蛋白酶抑制剂(1mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐，0.8μM抑蛋白酶肽，50μM β-抑制素，15μM E-64，20μM亮抑酶肽半硫酸盐，10μM抑胃酶肽A，Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CA，USA)。将混合物涡旋振荡5秒，离心10秒，在冰上摇动30分钟。经过两次每次1秒的超声波冲击(Sonifier 250，Branson Co.Danbury，CT，USA)后，将裂解物与4X蛋白负载染料混合。将混合物的上清液用于Western印迹分析。

免疫组织化学。使用与Western印迹分析中使用的同样的抗体来定位胚胎中的PPARδ。免疫组织化学按照以前的描述进行(Huang等，2003)。简单来说，将胚胎(ICR)在冰冷的含有4％缓冲的多聚甲醛的PBS中固定30分钟。在用1％triton的PBS溶液通透化20分钟之后，将胚胎在含有5％牛奶的PBS中和抗PPARδ抗体(32g/mL)在37℃温育30分钟。然后将胚胎在偶联了FITC的2.5μg/mL山羊抗兔IgG抗体(Molecular Probes，Portland，OR)中在37℃温育30分钟。在两次温育之间胚胎用PBS清洗4次，每次5分钟。在与DAPI(30μg/mL)在37℃最后温育5分钟后，如上所述(在TUNEL部分中)将胚胎固定，使用荧光显微镜(AxioPlan 2，Carl Zeiss，Germany)在FITC和UV滤光片下检测。检测了未受精的卵和来自不同发育阶段的胚胎(从单细胞胚胎到胚泡期胚胎)。PPARδ-/-胚泡被用作阴性对照。

数据分析

3.0版(GraphPad Software Inc.San Diego，CA)，将Hill斜率设定在1.0，被用于估算L-165041的ED₅₀。在适当时使用卡平方和Student′s t-检验(

3.05版，GraphPad Software Inc.)。p＜0.05被认为是统计学显著的。

结果：部分I

植入前小鼠胚胎表达PPARδ。首先对胚泡(C3B6F1)进行RT/PCR和Western印迹分析以确定PPARδ的表达。用于PCR的引物分别来自外显子5和6；预期的扩增子大小是334bp。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物发现了两个扩增子：一个具有预期的分子量(约330bp)，另一个具有较低的分子量(约250bp)(图1a)。将大约330bp的扩增子从凝胶洗脱并用限制性酶(SST1)消化。通过琼脂糖凝胶电泳对消化的产物进行分析，发现了两个如根据PPARδ的cDNA序列推测的具有预期大小的片段(约95和约240bp)(图1b)。对胚泡的全细胞裂解物进行的Western印迹分析发现了单一的条带，对应于来自肝脏的PPARδ蛋白(图1c)。

PPARδ蛋白在细胞期及以后的胚胎中是可检测的。使用与Western印迹分析中使用的相同的抗体在植入前胚胎中定位PPARδ蛋白。对未受精的卵和来自不同发育阶段的胚胎(ICR，远系繁殖株系)进行了免疫组织化学分析。结果显示PPARδ的染色位于胚胎细胞的核中。它具有颗粒的图案，反映了DNA结合染料DAPI对核的染色。PPARδ首先在细胞胚胎中变得可以被检测(未显示)。在胚泡中，内细胞团和滋养外胚层都显示出了PPARδ染色(图2)。正如预期，PPARδ-/-胚泡没有显示出染色。

合成的PPARδ配体选择性增强小鼠胚胎的孵化。为了证实PPARδ的生物学功能，确定了胚胎对三种同种型特异性的合成PPAR配体的反应。双细胞胚胎(C3B6F1)在添加了每种配体的培养基中培养96小时，胚胎的完全孵化被用作终点。在三种合成的PPAR配体中，只有PPARδ特异性相互作用的L165,041增加了胚胎的完全孵化(图3a)。L165,041是4-[3-(4-乙酰基-3-羟基-2-丙基苯氧基)丙氧基]苯氧基-乙酸。L165,041的加入以浓度依赖性的方式增加胚胎的孵化；ED₅₀被估计是21nM(图3b)。这些结果表明植入前胚胎中的PPARδ是功能性的，它的激活增加了胚胎孵化。

在植入前胚胎中对合成的PPARδ配体的反应是发育阶段依赖性的。从基因组变得活化的双细胞期开始，胚胎变得对外部刺激越来越有反应性。为了确定何时胚胎变得对合成的PPARδ配体具有反应性，进行了下面的实验。将双细胞胚胎(C3H和C57BL6Nhd混合的遗传背景)随机分配到三个组中的一个组中，其中L165,041在开始培养后24、48和72小时添加。在这些时间点，它们大部分分别发育成8细胞期、桑葚胚期和胚泡期胚胎。在培养96小时后比较各组的完全孵化比率。给出的结果显示在24-96小时和48-96小时期间(分别对应于8细胞期以后和桑葚胚期以后)接受L165,041的组与在0-96小时期间接受L165,041的组具有相同的完全孵化比率(图4)。尽管在72-96小时期间(对应于胚泡期以后)接受L165,041的胚胎显示出比对照胚胎较高的完全孵化比率，其差异不是统计学显著的(p＝0.08)(图4)。这些结果表明在培养48小时后，胚胎变得对L165,041具有反应性。根据该时间点胚胎的发育阶段，可以推论胚胎在桑葚期及以后变得对L165,045具有反应性。这与基于免疫组织化学研究的PPARδ的发育阶段依赖性表达相符合。

合成的PPARδ配体在植入前胚胎中减少了凋亡并增加了细胞增殖。以前的研究表明胚胎在体外的成功孵化依赖于足够高的细胞数量(Montag等，2000)。起初的研究显示出胚胎中总的细胞数量可以在培养72小时后可靠地测量，但是在96小时后就不能了。因此，在随后的研究中，在培养72小时后比较胚胎中凋亡和增殖的比率。凋亡的细胞和处于S期的细胞分别使用TUNEL分析和BrdU掺入来确定；DNA结合染料DAPI被用于确定总的胚胎细胞。结果显示，在培养72小时后，在对照和实验胚胎中细胞的数量是可比的(大约每个胚胎60个)，但是L165,041处理的胚胎在S期具有较少的死细胞和更多的细胞(图5)。这些结果说明，假设再过24小时，当评估胚胎的完全孵化时，L165,041处理的胚胎可能具有更多的活细胞。

PPARδ在体内和体外对于植入前胚胎的有序发展是关键的。为了调查PPARδ在植入前胚胎的发育中的作用，比较了PPARδ-/-和WT胚胎在体外和体内的发育。对于前者来说，双细胞胚胎被培养和观察了96小时；对于后者来说，胚胎在注射hCG后70和96小时被收回(原理参见材料/方法部分)。结果显示PPARδ的缺乏阻碍了胚胎的发育。在培养小时后，发育的差别变得明显了，这时57％的WT胚胎变成胚泡或孵化的胚泡，而只有10％的PPARδ-/-胚胎发展成胚泡。这种差异保持到96小时的末期：21％的WT胚胎和4％的PPARδ-/-胚胎完全孵化(图6)。值得注意的是即使在培养时期延长到120小时后，PPARδ-/-胚胎也不能“赶上”WT胚胎：在96-120小时期间，一些胚胎保持不变，而其它的则变得退化(数据未显示)。

PPARδ-/-和WT胚胎在体外发育中的反差也表现在注射hCG后70和96小时收获的胚胎中。在注射hCG后70小时，大部分的WT胚胎变成8细胞胚胎，而大部分的PPARδ-/-胚胎是双或四细胞胚胎(图7a)。类似地，在注射hCG后96小时，56％的WT胚胎和22％的PPARδ-/-胚胎发展成胚泡(图7c)。正如预期，WT胚胎比PPARδ-/-胚胎具有显著多的细胞(图7b和7d)。这些结果表明PPARδ对于植入前胚胎的有序发展是关键的。

消除PPARδ与减少的胚胎细胞增殖有关但不与增加的凋亡有关。为了确定细胞增殖的不同速度对PPARδ-/-和WT胚胎中发育的差异的贡献到何种程度，对注射hCG后70和96小时收获的胚胎进行BrdU标记。结果显示WT胚胎比PPARδ-/-胚胎掺入了更多的BrdU，并且WT胚胎具有更高的增殖指数。在注射hCG后70小时，92％的WT胚胎和4％的PPARδ-/-胚胎掺入了BrdU。WT和PPARδ-/-胚胎的增殖指数分别为45％和1％(图8a)。类似地，在注射hCG后96小时，100％的WT胚胎掺入了BrdU，与此相比PPARδ-/-胚胎只有57％。WT和PPARδ-/-胚胎的增殖指数分别为40％和18％(图8b)。为了确定在PPARδ-/-胚胎中凋亡导致的发育迟缓的程度，在注射hCG后96小时获得胚胎，进行TUNEL分析，然后比较死细胞指数。结果显示，被检测的61个PPARδ-/-胚胎中的28个(54％)和58个WT胚胎中的1个(2％)发育停止了；它们每个胚胎含有15个或更少的细胞。这些胚胎中的三个TUNEL染色阳性：在两个胚胎中各有一个TUNEL阳性细胞，在第三个胚胎中有两个TUNEL阳性细胞。比较了含有16个或更多细胞的胚胎中的死细胞指数：2.2±3.5％对比2.9±3.9％(33个PPARδ-/-胚胎和58个WT胚胎的平均值±SD，p＝0.33)。这些结果表明在植入前胚胎中PPARδ的消除与减少的细胞增殖有关，但是不与增加的凋亡有关。

讨论-部分I

在这里第一次显示了植入前小鼠胚胎表达PPARδ。它被合成的PPARδ配体的激活增加了胚胎的孵化并减少了凋亡；通过遗传靶向将它消除由于细胞增殖的减少导致了胚胎发育不可逆的延迟。

本发现进一步证实了关于PPARδ的表达和推测的生物学功能的早期报道。在E8.5天的大鼠胚胎中(到目前为止检测到的最早的发育阶段)，通过原位杂交发现了普遍存在的PPARδ信息(但不是PPARα或PPARγ信息)(Braissant等，1998)。基于这些发现，提出了PPARδ可能参与了更基本的细胞功能例如膜脂类的更新或细胞周期进程。但是，本结果超出了早期的报道，显示出在植入前胚胎中缺少PPARδ的表达与减少的胚胎细胞增殖和不可逆的发育延迟有关。

尽管PPARδ已被暗示参与细胞的增殖，它的确切功能还有争论。然而，在培养的血管平滑肌细胞中PPARδ的过量表达促进了铺满后(post-confluent)细胞的增殖(Julan等，2005)，PPARδ+/-突变株小鼠比野生型小鼠对增殖刺激反应更深刻(Michalik等，2001；Tan等，2001)。已经提出了周期蛋白A和Cdk2的增加以及p57kip2(一种Cdk2抑制蛋白)的减少是前者的机制；但还不清楚什么影响了后者。在植入前小鼠胚胎中，PPARδ的消除与细胞增殖的显著减少有关，PPARδ的激活与细胞增殖的显著增加有关。PPARδ的激活可能能够使胚胎细胞克服G1限制点，促进它们进入S期。该显示出合成的PPARδ配体在WT胚胎中增加了细胞增殖的实验结果与以前报道中的PPARδ的生长促进性质相符合。

以前关于PPARδ激活和降低凋亡的研究更一致。已经提出PPARδ的抗凋亡性质促进了皮肤的创伤愈合(Michalik等，2001；Wahli 2002)，并在肾脏细胞中增加了对高渗胁迫的抗性(Hao等，2002)。它可能在结肠直肠癌的肿瘤发生中也扮演了中心的角色(Gupta等，2000；Cutler等，2003)。该显示了合成的PPARδ配体在WT胚胎中减少凋亡的实验结果与以前关于PPARδ的抗凋亡性质的报道相符合。

在L165,041处理的胚胎中与增加细胞增殖和减少凋亡有关的分子机制仍需被确定。不希望受到具体的理论的限制，建议该机制可能包括配体依赖性的转录激活和辅阻遏物BCL-6介导的转录抑制。据报道，结合了配体的PPARδ上调了14-3-3的表达，它又转过来上调Bcl2家族的抗凋亡成员的表达(Liou等，2004)。最近的证据表明脱辅基PPARδ(apo-PPARδ)螯合(sequester)了辅阻遏物BCL-6，并且一旦与PPARδ配体结合后，脱辅基PPARδ释放出BCL-6，这时它可以自由抑制其它基因的转录(Shi等，2002)。已知被BCL-6抑制的基因包括细胞周期抑制剂诸如p27kip1(Shaffer等，2000；Kusam等，2004)。该转录激活/抑制耦合可能也包含了其它的细胞周期调节物。例如据报道，增加的周期蛋白A和Cdk2以及降低的p57kip2(一种Cdk2抑制蛋白)的表达导致了过量表达PPARδ的铺满后细胞的增殖(Julan等，2005)。

与在PPARδ配体处理的WT胚胎中观察到的(即减少了凋亡但具有可比的总细胞数量)相比，PPARδ-/-胚胎不比WT胚胎具有更多的凋亡。PPARδ-/-胚胎具有明显减少的细胞增殖，但是没有可察觉的凋亡的增加。这种现象可以有几种可能的原因。首先，在注射hCG后96小时，54％的PPARδ-/-胚胎(相比而言WT胚胎是2％)具有少于16个细胞，这是在注射hCG后72小时就应该达到的细胞数量。所有这些严重延迟的胚胎中只有3个显示出TUNEL染色。不希望受到任何具体的理论的限制，建议可能这些严重延迟的胚胎更早地经历了凋亡，并且DNA的损伤可能非常严重，使得它们不再被TUNEL分析染色为阳性。第二，来自输卵管的可溶性因子可能补偿了PPARδ的缺乏，并在体内胚胎中维持了正常的凋亡比率。与人类输卵管细胞共培养的胚胎已知具有显著低的凋亡(Xu等，2000)。第三，有可能、尽管不是非常可能，合成的PPARδ配体诸如L165,041的功能可能与天然的PPARδ配体的功能有所不同。

这些发现为PPARδ-/-小鼠的生殖表现型提供了新的见解。尽管PPARδ的消除通常是致命的，那些存活的PPARδ-/-小鼠一般是健康的和有生殖力的(Barak等，2002)。一种PPARδ-/-小鼠的生殖表现型是小的一次产子数(与R.Evans博士的私人联络)。这已经被归因于不正常的胎盘蜕膜接触导致的孕中期死亡(Barak等，2002)，即植入后事件。本现象表明PPARδ-/-胚胎在植入前期间的高度损耗可能是另一个原因。PPARδ-/-和WT雌性对PMSG的超排卵反应一样好(从11个PPARδ-/-和7个WT小鼠收集的卵的数量分别为26.0±17.2和33.1±22.7，平均值±SD)；PPARδ-/-和WT雄性使雌性受孕具有可比的效率(上述卵的受精率分别为93％和95％)。但是在排卵被hCG启动后70小时，在PPARδ-/-胚胎中的不可逆发育迟缓变得明显。因此，在植入前期间胚胎的失去是PPARδ-/-小鼠少的一次产子数的另一个原因。

合成的PPARδ配体在人类IVF中可能具有潜在的应用。以前已经报道了一种PGI₂类似物伊洛前列素增加胚胎的孵化(Huang等，2003)，并且当转移到妊娠载体中时，伊洛前列素处理的胚胎比对照胚胎产生了多28％的活产(Huang等，2004b)；PCT/US2004/029167(Huang等)，其公开的内容在此引为参考。因为L165,041(一种合成的PPARδ配体)增加胚胎的孵化，可能添加了合成的PPARδ配体的培养基也增加胚胎的活产能力并增加IVF的成功。可能PPARδ和PGI₂可以对胚胎发挥附加的甚至协同的影响。因此，用PGI₂类似物和合成的PPARδ配体添加IVF培养基可能可以比单独使用配体或单独使用PGI₂类似物提供更好的IVF成功率。使用上述的小鼠模型观察到的结果，据信至少在某种程度上是使用其它的哺乳动物包括人类的胚胎将获得的可以预料的结果。当然，在人类IVF中使用PPARδ配体在进行治疗性应用之前还需要进一步的安全性研究。据信所有的PPARδ配体、包括合成的化合物GW501516(2-甲基-4-((4-甲基-2-(4-三氟甲基苯基)-1，3-噻唑-5-基)-甲基磺酰基)苯氧基-乙酸(Calbiochem，U.S.A.))，至少在某种程度上具有活性，就像用代表性的配体L165,041所证实的那样。

II.增加胚胎孵化和植入

进行了一系列进一步的研究以调查通过PPARδ途径增加胚胎孵化和植入。除了下面指明的之外，使用的材料和方法与前面描述的相同。

Western印迹分析(II)

Western印迹分析按照以前的描述(Huang等，2004c)来进行，使用亲和纯化的、针对小鼠的PPARδ肽(MEQPQEETPEAREE)的多克隆抗体(Abcam Inc.，Cambridge，MA)。将2L培养基中的25个小鼠胚泡转移到1.5ml Eppendorf管中，管中含有30μL裂解缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，1mM原钒酸钠，1mM EGTA和1mM氟化钠)和蛋白酶抑制剂(1mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐，0.8μM抑蛋白酶肽，50μM β-抑制素，15μM E-64，20μM亮抑酶肽半硫酸盐，10μM抑胃酶肽A，Calbiochem-Novabiochem Corp.，SanDiego，CA，USA)。将混合物涡旋振荡5秒，离心10秒，在冰上摇动30分钟，然后进行两次每次1秒的超声波冲击(Branson Co.Danbury，CT，USA)。与4X蛋白载样染料混合后，将上清液用于Western印迹分析。将裂解液在12％梯度聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher&Schuell，Inc.，Keene，NH)。被抗体结合的PPARδ蛋白使用增强的化学荧光(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway，NJ)来观察，其信号被STORM 860激光扫描器(GEHealthcare Bio-Sciences Corp)检测。来自小鼠睾丸的总细胞裂解物被用作阳性对照。胚泡的细胞裂解物如下进行制备。

免疫组织化学分析(II)

免疫组织化学分析按照以前的描述进行(Huang等，2004c)。简单来说，将胚胎在冰冷的含有4％缓冲的多聚甲醛的PBS中固定30分钟。在用1％triton X-100的PBS溶液通透化20分钟之后，将胚胎在含有5％牛奶的PBS中和抗PPARδ抗体(32g/mL)在37℃温育30分钟。然后将胚胎在偶联了FITC的山羊抗兔IgG抗体(2.5μg/mL，Invitrogen)中在37℃温育30分钟。在两次温育之间胚胎用PBS清洗4次，每次5分钟。在Hoechst 33258(30μg/mL)中于室温最后温育5分钟后，将胚胎固定，在FITC和UV滤光片下检测。检测了未受精的卵和来自不同发育阶段的胚胎(从单细胞胚胎到胚泡期胚胎)。

5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)的摄入(II)。

胚胎细胞的增殖根据它们掺入BrdU的能力来确定。分析使用BrdU标记与检测试剂盒I(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)按照制造商的方法作了修改后进行。简单来说，将细胞在含有10M BrdU的100L预先平衡的HTF培养基中于37℃在5％CO₂条件下温育6分钟，再在冰冷甘氨酸(50mM)的70％乙醇溶液(pH2.0)中于-20℃下固定30分钟，然后与含有1％BSA的稀释的抗BrdU小鼠单克隆抗体(1∶2)的缓冲液温育30分钟。将胚胎在200L含有1％BSA的PBS中清洗，在含有1％BSA的的PBS中与稀释的FITC偶联的抗兔IgG抗体(1∶4)温育30分钟。清洗后，将胚胎用Hoechst 33258(30μg/ml)在25℃处理5分钟，固定在含有16.6％elvanol 50-42(DuPontWilmington，DE)和2.5％1，4-二氮杂二环-(2.2.2)-辛烷的0.1M Tris HCl(pH 8.5)中。掺入了BrdU的细胞在FITC滤光片(AxioPlan 2，Zeiss，Oberkochen，Germany)下被鉴定。总细胞数量基于Hoechst 33258核染色在UV滤光片下被确定。

胚胎转移和植入率的确定

胚胎转移按照以前的描述进行(Huang等2004b)。简单来说，在解剖显微镜(Olympus SZ-PT，Shinjuku-ku，Tokyo，Japan)下，在假孕的2.5天，将胚胎转移到妊娠载体(ICR雌性小鼠)。麻醉后，通过1.5cm的侧翼切口评估每个子宫角。通过用一对钳子夹住近端输卵管，用30号针头在子宫角的远端与肠系膜相对的一侧产生一个开口。开口允许内径为135m的转移吸管(MidAtlantic Diagnostics，Inc.，MountLaurel，NJ)进入。向每个角转移1.5μL转移培养基(含有25mM HEPES和1％BSA的MEM)，其中含有最多7个胚胎。每次转移后，在解剖显微镜下检查吸管的内含物以鉴定保留的胚胎。为了避免由于胚胎互换造成的胚胎的混合(Dr.Andreas Zimmer，University of Bonn，Germany，MGI18List，the Jackson Laboratory)，每个妊娠载体只接受一种胚胎。为了维持转移技术的一致性，胚胎转移按照相同的步骤由同一个人(J-CH)操作。胚胎转移72小时后，根据以前描述的方法进行一些修改后(Paria等，1993)确定植入率。简单来说，在安乐死前3分钟，通过妊娠载体的尾部静脉注射0.1ml芝加哥蓝(1％)。在载体被处死后，打开子宫角，对妊娠囊计数。植入率被表示为妊娠囊对总转移胚胎的百分率。97个野生型和54个PPARδ-/-胚胎被分别转移到7个和4个妊娠载体中。

结果-部分II

PPARδ在植入前胚胎体外发育中的基本功能

正如分别用RT-PCR和Western印迹分析所确定的那样，胚泡期的胚胎表达PPARδmRNAs和蛋白(图9a和9b)。PPARδ可以在细胞期及以后的野生型胚胎中检测到，但是不能在PPARδ-/-胚胎中检测到(图9c上图和下图)。为了评估PPARδ在胚胎发育中的功能，我们比较了PPARδ+/+和PPARδ-/-胚胎之间的胚泡孵化。从PPARδWT和裸小鼠(null mice)制备的双细胞期胚胎在体外培养96小时。计数完全孵化的胚胎。30％(20/67)的PPARδ+/+胚胎在96小时时已经完全孵化，相比而言只有3％(4/144)的PPARδ-/-胚胎完全孵化(图10)。伊洛前列素(0.1μM)在WT中增加了完全孵化的胚胎的数量到50％(37/74)，但是对PPARδ-/-胚胎没有作用(3/144)。L-165041、一种特异性PPARδ配体、将完全孵化的胚胎的百分率增加到54％，与此相比在未处理的WT胚胎中是30％。伊洛前列素和L-165041都不影响PPARδ-/-胚胎的孵化。伊洛前列素和L-165041组合在一起处理将孵化的胚胎增加到52％，这与单独使用任何一种配体相比没有明显的增加。这些结果表明伊洛前列素和L-165041通过PPARδ起作用。然后进行了实验以确定PPARδ在胚胎发育中的功能。来自WT和PPARδ-/-小鼠的双细胞期胚胎在不含PPARδ配体的培养基中培养96小时。在48、72和96小时，对胚泡、桑葚胚和较早期胚胎(表示为＜桑葚胚)进行计数。在每个时间点，PPARδ-/-胚胎明显比WT胚胎发育缓慢。在96小时时，29％的PPARδ-/-胚胎仍处于比桑葚胚更早的阶段，28％正在孵化或已经孵化，而所有的WT胚胎都已经达到了胚泡期，85％经历了孵化或已经完全孵化(表I)。值得一提的是，预备实验显示出将培养延长到120小时，在两个组中都没有改变完全孵化的胚胎的百分率(数据未显示)。这些数据综合起来表明PPARδ对于体外胚胎发育和孵化是基本的。胚胎的孵化受胚泡细胞的数量的影响(Montag等，2000)，它引起透明带变薄从而便于孵化。我们假设PPARδ-/-胚胎受损的孵化是细胞增殖减少的结果。为了验证这个假设，我们比较了WT和PPARδ-/-胚胎的BrdU摄入。BrdU阳性细胞的数量在PPARδ-/-胚胎中极大地减少了(图11a)。在PPARδ-/-胚胎中每个胚胎的细胞数量也明显减少了(图11b)。

PPARδ配体对胚胎孵化的刺激

伊洛前列素和L-165041都以类似的程度增加WT胚胎的孵化(图10)。它们的刺激效应由PPARδ缺失所消除(图~1)。L-165041以浓度依赖性的方式增加了孵化的胚胎的百分数，ED50值为21nM(图12a)。PPARα配体Wyl4,643和PPARγ拮抗剂环格列酮都不刺激胚胎的孵化(图12b)。L-165041当在双细胞、八细胞或桑葚胚期加入到胚胎中时，有效刺激胚胎的孵化(图12c)。一旦大部分胚胎达到胚泡期时，在培养基中加入L-165041不再有效刺激孵化(图12c)。已经提出当胚泡中的细胞达到临界数时，胚胎的孵化发生(Montag等，2000)。因此，我们确定了L-165041增加胚胎细胞增殖的程度。与未处理的对照相比，L-165041(10μM)增加了BrdU阳性细胞的百分率(图12d)。这些结果综合起来表明外源的PPARδ配体例如L-165041和伊洛前列素通过刺激胚胎中的细胞增殖来加速孵化。

通过PPARδ调节胚胎的植入

为了确定PPARδ参与植入的程度，将从WT和PPARδ-/-小鼠获得的双细胞胚胎培养48小时，计数，然后转移到妊娠载体的接受子宫中。72小时后计数妊娠囊。从双细胞期PPARδ-/-胚胎发育的早期和晚期胚泡的数量明显低于从WT胚胎发育的数量(图13a)。PPARδ-/-胚胎的植入率也明显低于WT胚胎的植入率(28％对44％，p＜0.05)(图13b)。接下来我们确定了用L-165041预处理双细胞胚胎对植入率影响的程度。来自WT小鼠的双细胞胚胎用L-165041处理48小时。对胚胎计数，然后转移到妊娠载体中。72小时后评估植入率。尽管L-165041没有明显增加胚泡的形成(图13c)，它极大地增加了植入率(64％对41％，p＜0.05)(图13d)。这些结果表明胚胎的PPARδ在植入中发挥了重要作用。外源的PPARδ配体促进了植入而不改变胚泡的形成。

讨论-部分II

我们的研究表明胚胎的发育和孵化需要PPARδ。来自PPAR-/-小鼠的双细胞胚胎能够发育成胚泡，但是胚泡形成的速度与WT胚胎相比滞后。PPARδ对于胚泡的孵化是特别重要的。与WT胚胎相比，在培养96小时后，有大量的双细胞PPARδ-/-胚胎不能孵化。值得注意的是，将培养时间延长到120小时也不改变结果，因为大部分的胚泡在此期间变得衰弱。已经提出胚胎的孵化由两个主要因素介导：(1)胚胎中决定性的细胞数量的增加(Montag等，2000)，这导致了透明带的变薄；以及(2)透明带被蛋白水解酶消化(Sawada等，1990)。我们的结果表明PPARδ介导了胚胎细胞的增殖，从而增加了胚胎细胞的数量。与WT胚胎相比，PPARδ-/-胚胎表现出非常低的BrdU掺入。在培养72小时后，PPARδ-/-胚胎的细胞数量仅为WT胚胎的细胞数量的大约30％。

PPARδ是一种核受体，其够与许多内源和合成的配体结合(Forman等，1997)。我们以前的研究表明，胚胎中的COX-2衍生的PGI2可能是一种内源的PPARδ配体。配体激活的PPARδ与结合反应元件的类视色素X受体(RXR)形成了异源二聚体，并激活基因转录(Kliewer等，1994)。已经报道了许多PPARδ介导的基因，这些基因中的两个，14-3-3∈和磷酸肌醇依赖性激酶-1(PDK-I)、参与了保护细胞免于凋亡(Di-Poi等，2002；Liou等，2006)。但是PPARδ促进胚胎细胞增殖的机理尚不了解。据报道，在血管平滑肌细胞中过量表达PPARδ，通过增加了周期蛋白A和CDK2以及减少了p57kip2而增加了铺满后细胞的增殖(Zhang等，2002)。可能PPARδ介导的14-3-3的上调参与了细胞的增殖，因为14-3-3蛋白被认为是大量蛋白、包括信号传导分子和受体的支架(Fu等，2000；Tzivion和Avruch，2002)。解决这种可能性的工作正在进行中。在通过14-3-3∈(Liou等，2006)和PDK-I(Di-Poi等，2002)保护胚胎细胞免于凋亡中，PPARδ可能也发挥了重要的作用。已经报道，培养的胚泡的内细胞团(ICM)易受氧化凋亡的伤害(Brison和Schultz，1997；Schratt等，2004)。PGI₂激活的PPARδ可能通过上调14-3-3∈从而保护了ICM免于凋亡，所述14-3-3∈螯合了通过PDK-1和Akt途径磷酸化的Bad(Datta等1997；Zha等，1996)。PPARδ的抗凋亡功能可能对胚泡中细胞数量的增加和孵化的增加有贡献。

已经报道子宫中COX-2衍生的PGI₂参与了胚胎的植入，并且PPARδ被显示可能与PGI₂的作用有关(Lim等，1999)。胚胎PPARδ在植入中的作用还没有被报道。本研究的结果为胚胎PPARδ在植入中的决定性的作用提供了直接的证据。为了模拟IVF过程，我们在体外将WT和PPARδ-/-双细胞胚胎培养了48小时。对处于不同发育阶段的胚胎进行计数，并转移到接受妊娠的载体中。72小时后计数子宫中的妊娠囊。来自PPARδ-/-胚胎的妊娠囊的数量明显少于来自WT胚胎的妊娠囊数量。PPARδ-/-胚胎的植入的减少与PPARδ-/-胚胎延迟的胚胎发育和胚泡的形成有关。这些结果着重说明了PPARδ介导的增加的细胞增殖在促进植入前胚胎的生长、成熟(孵化)和植入中的重要性。

我们的研究的主要目标是改进IVF。我们以前已经报道了一种稳定的PGI₂的类似物伊洛前列素增加胚胎的植入和活产的能力(Huang等，2004b)。在本研究中，我们证实了以前的数据，并对外源伊洛前列素增加胚胎的孵化和植入的机制进行了阐明。我们的结果显示，在植入前胚胎中PPARδ是PGI₂的靶。在PPARδ-/-胚胎中伊洛前列素对胚泡孵化的增加被完全消除了。合成的PPARδ配体L-165041发挥与伊洛前列素类似的效应，但是将伊洛前列素与L-165041组合没有附加的效果。这些结果进一步表明在培养的胚胎中内源的PGI₂的生产是有限的，并且外源的PGI₂类似物或合成的PPARδ配体可以进一步活化PPARδ。合成的配体或PGI₂类似物(伊洛前列素)对PPARδ的激活进一步促进了细胞增殖，产生较高的孵化比率。值得注意的是L-165041的效应不限于双细胞期的胚胎。L-165041即使是在桑葚胚期的胚胎中也对增加胚胎孵化相当有效。但是，L-165041对于胚泡期的胚胎不显示出效果。上面提到的结果可能是因为某些胚泡发育更完善从而易于孵化。这种观察对于选择在培养基中添加伊洛前列素或PPARδ配体的时机具有实践上的重要性。自然，在人类IVF中施用PPARδ配体需要对其安全性状况进行全面的研究。

L-165041显示出通过不依赖于它对胚泡形成的影响的机制增加胚胎的植入，因为在胚胎转移时，对照和实验胚胎的发育阶段是类似的，而被转移的实验胚胎仍产生了更多妊娠囊。延迟作用的分子基础尚不清楚。我们推测，L-165041通过PPARδ诱导了持续性的信号传导活化以增加植入。在子宫和胚胎的PPARδ的转录信号传导之间可能存在互相干扰。胚胎发育和子宫内膜蜕膜化之间的协调确保了成功的植入。分子机制的阐明将对我们对胚胎植入和提高IVF的成功的能力的理解具有重大的影响。

总的来说，植入前胚胎表达PPARδ，它在胚胎的发育、胚泡的形成、胚胎的孵化和植入中发挥重要的作用。胚胎PPARδ的激活是改进IVF结果的一种新型治疗策略。

表I

在96小时的培养过程中PPARδ+/+和PPARδ-/-胚胎的发育阶段

⁺括号中的数字表示百分率。

§＜桑葚胚期是指双细胞、四细胞和8细胞期胚胎。

孵化中是指正在孵化的胚泡。

已孵化是指完全孵化的胚泡。

^*表示相对于PPARδ-/-胚胎p＜0.05，^**表示p＜0.01。

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不需要进一步的详细描述，相信本技术领域的技术人员可以使用本文的描述，最大程度地利用本发明。上述的实施方案应该被视为说明性的，而不是以无论任何方式对本公开的范围进行限制。尽管已经显示并描述了本发明的优选实施方案，本领域的技术人员可以对其作出修改而不背离本发明的精神和教导。本文描述的实施方案仅仅是示例性的，并不是限制性的。本文公开的发明的许多变化和修改是可能的，也属于本发明的范围之内。所有本文中引用的专利、专利申请和出版物的公开内容，在它们为本文提出的材料提供程序上的或其它详细的补充材料的程度上，在此引为参考。

序列表

<110>德克萨斯系统大学董事会

(Board of Regents of the University of Texas System)

<120>过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)以及植入前胚胎的发育

(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor delta(PPAR delta)andthe Development of Preimplantation Embryos)

<130>SCT081686-00

<150>US 60/725928

<151>2005-10-12

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>Synthetic primer sequence

<400>1

ttctagagcc cgcagaatgg 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>Synthetic primer sequence

<400>2

gccaagaaca tccccaactt c 21

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>Synthetic primer sequence

<400>3

cctggatggc ttctacctgg 20

<210>4

<211>14

<212>PRT

<213>Unknown

<220>

<223>Synthetic sequence reagent for antibody production

<400>4

Met Glu Gln Pro Gln Glu Glu Thr Pro Glu Ala Arg Glu Glu

1 5 10

Claims

1.在植入前哺乳动物胚胎中激活过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)的体外方法，包括：

在胚胎培养基中培养胚胎，以及

在胚胎细胞中PPARδ的表达开始发生时或发生后，通过将PPARδ配体与表达的PPARδ结合来激活PPARδ，从而在培养的胚胎细胞中阻止凋亡和/或促进培养的胚胎细胞的增殖。

2.权利要求1中的方法，其中PPARδ配体与所述PPARδ的结合增加了胚胎的孵化。

3.权利要求2中的方法，还包括以有效促进胚胎的完全孵化的量在培养基中添加前列腺素或其类似物。

4.权利要求1中的方法，其中所述配体包括至少一种除了前列腺素或其类似物之外的天然的或合成的配体。

5.权利要求1中的方法，其中所述配体在所述胚胎发育的桑葚胚期或之后加入到所述培养基中。

6.权利要求1中的方法，其中所述配体包括L165,041。

7.权利要求1中的方法，其中所述配体包括GW501516。

8.权利要求1中的方法，其中所述方法产生了具有增加的体内植入能力的胚胎。

9.权利要求1中的方法，其中所述方法产生了具有增加的建立可存活的妊娠的能力的胚胎。

10.增加体外受精的哺乳动物胚胎的活产能力的方法，包括：

进行权利要求1-9任一项的方法以获得PPARδ配体处理的体外培养的胚胎；

将所述PPARδ配体处理的胚胎导入哺乳动物的子宫中；以及

允许导入的胚胎植入到所述子宫中，其中胚胎孵化和植入到宿主的子宫中的能力与没有在存在所述合成的PPARδ配体的情况下培养的胚胎的这些能力相比增强了。

11.权利要求10中的方法，其中所述导入的步骤包括将胚泡期或较早期的PPARδ配体处理的胚胎转移到子宫中。

12.用于哺乳动物胚胎的体外发育的改进的胚胎培养基，其中的改进包括培养基中过氧化物酶体增殖物激活物受体δ(PPARδ)配体的量有效地增加胚胎细胞的增殖，其中所述配体是除了前列腺素及其类似物之外的配体。

13.权利要求12中的培养基，其中所述PPARδ配体的量有效促进在培养基中培养的胚胎的完全孵化。

14.权利要求12中的培养基，还含有有效促进在培养基中培养的胚胎的完全孵化的量的前列腺素或其类似物。

15.权利要求6或7中限定的在表达PPARδ的体外培养的胚胎细胞中与PPARδ结合的PPARδ配体在制备用于激活PPARδ以阻止胚胎细胞中的凋亡

或加强胚胎细胞的增殖来增强体外受精的哺乳动物胚胎在引入哺乳动物的子宫后的活产能力的药物中的应用。