CN101491552A - 一种从中药三尖杉提取液中分离三尖杉总生物碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离中药总生物碱的方法，尤其是一种从中药三尖杉提取液中分离总生物碱的方法，属中药领域。该方法包括如下技术方案：取三尖杉提取液，调整pH值1至7，滤过，取滤液加于阳离子交换树脂柱上，先以水洗脱除杂，再用0.5％～15％酸液洗脱，收集洗脱液，加碱中和，经脱盐处理，即得三尖杉总生物碱。该方法克服了现有技术提取率低、有机溶剂用量大、工艺复杂、无法大生产等不足，可以高效率地从三尖杉提取液中分离高纯度的三尖杉总生物碱。

Description

一种从中药三尖杉提取液中分离三尖杉总生物碱的方法

技术领域

本发明涉及一种中药有效成分的提取分离方法，特别是涉及一种从中药三尖杉提取液中提取分离三尖杉总生物碱的方法，属中药领域。

背景技术

生物碱是自然界中广泛存在的一大类碱性含氮化合物，是许多中草药的有效成分，是自然界中存在的一类重要物质。三尖杉是我国亚热带特有植物，系粗榧科粗榧属植物三尖杉Cephalotaxus fortunei Hook.f.的种子、枝和叶。由于其叶、枝，种子及根等可提取多种植物碱，可治疗癌症，现今已被过度利用，资源数量急剧减少，处于濒危状态。三尖杉的种子具有驱虫、消积等功效；枝、叶则具有抗癌等功效。研究表明，三尖杉总碱是其主要有效部位，包括高三尖杉酯碱(Homoharringtonine)、异三尖杉酯碱(Isoharringtonine)、脱氧三尖杉酯碱(Deoxy harringtonine)、三尖杉碱(cephalotaxine)、表三尖杉碱(epicephalotaxine)、乙酰三尖杉碱(acetylcephalotaxine)、去甲基三尖杉碱(demethyl-cephalotaxine)、红杉醇(sequoyitol)等。临床制剂主要用于治疗淋巴肉瘤、肺癌等。因此，三尖杉总生物碱有效部位制剂临床需求量很大。

现阶段，中药生物碱的提取工艺已较成熟，根据生物碱的理化特性，采用适宜的溶剂如水、酸水、酸醇及碱醇等，利用浸渍、渗漉、煎煮、回流、超声、酶解等技术将生物碱类成分提取出来，提取率能达到90％以上。但由于生物碱在中药中的相对含量较低(多数含量为0.01％-1％)，提取时势必引入大量的其他药物成分和杂质类成分，要保证最后制剂的安全有效，必须对其进行精制纯化，制备成有效部位甚至有效成分来应用，因此生物碱有效部位的精制纯化技术就显得十分重要。但由于其他多种成分的并存以及淀粉、树胶、果胶、粘液质、色素等杂质的干扰，生物碱有效部位的精制技术一直是中药现代化的“瓶颈”，严重影响了现代中药制剂对三效(高效、速效、长效)、三小(剂量小、毒性小、副作用小)、五方便(生产、运输、携带、贮存、应用方便)的要求。现今，生物碱有效部位的精制技术主要是有机溶剂萃取法、大孔树脂法以及离子树脂法等。

有机溶剂萃取法是利用亲脂性生物碱溶于亲脂性有机溶剂，而其盐溶于水的性质，使生物碱酸碱转化，利用有机溶剂(常用的如苯、三氯甲烷、乙醚等)萃取，去除大量的杂质。有机溶剂萃取法在三尖杉总生物碱的精制纯化中应用较为广泛，但该法存在很多的问题：将生物碱提取液碱化后大量中性及非极性色素等杂质易被带入，因此分离效率和纯度较低，且使用大量有机溶剂(一般萃取5次)，操作不便(萃取罐效率不高，且易乳化)安全性不佳(有机溶剂毒性大，且易燃易爆)，为实验室工艺，不适合工业大生产。

大孔吸附树脂分离技术，选择性吸附中药提取液中有效成分，去除杂质。与传统的除杂方法和工艺相比，可缩小服药剂量，提高了制剂的质量，该法对水溶性较好的黄酮、皂苷等有良好的分离精制效果，如目前常用的银杏类制剂及人参皂苷的制备等。但对于生物碱的精制来讲，本法最大的不足在于：首先是吸附困难，上样药液必须是稀溶液，碱度要适宜，碱度低则生物碱仍为离子化状态，树脂的吸附率低，碱度高，生物碱为游离型，大分子生物碱水溶性差而析出，仍然无法上柱，适用的生物碱范围很小，品种太少；其次，大孔吸附树脂的非极性静电吸附原理对生物碱有效成份和脂溶性杂质的分离选择性太差，且在溶剂洗脱过程中由于没有特异性的洗脱溶剂，生物碱和大量脂溶性杂质往往一起被洗涤下来，最后精制得到的总生物碱纯度不高。

还有新兴的离子交换树脂分离技术，是通过离子交换反应达到分离和纯化的目的。目前在中药领域所普遍采用的技术是，将含有生物碱的溶液过柱后，以氨液或NaOH溶液洗脱，收集洗脱液后再以有机溶剂萃取生物碱；或者将上过样品的树脂以碱液浸泡，然后再用有机溶剂回流提取生物碱。但该方法步骤繁琐，有机溶剂萃取、将树脂柱进行有机溶剂回流提取等步骤在工业上很难实现，且以碱液洗脱的效率很低，仅停留于实验室制备小样品的水平，也无法实现大生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种安全、低成本、高效率的提取分离三尖杉总生物碱的方法。

该发明目的是通过如下工艺实现的：取三尖杉提取液，调整pH值1至7，滤过，取滤液加于阳离子交换树脂柱上，先以水洗脱除杂，再用0.5％～15％酸液洗脱，收集洗脱液，加碱中和，经脱盐处理，即得三尖杉总生物碱。

在上述工艺过程中，将含有总生物碱的提取液调至合适的酸度后，生物碱电离成为阳离子，非碱性物质不被电离，提取液过阳离子交换树脂柱后，电离的生物碱有机离子与树脂柱上的氢离子交换而被牢固地吸附于树脂柱上。这里提取液的pH值不宜过高或过低，如果过高，提取液呈中性或碱性，生物碱不能电离，也就不能完成树脂上的交换过程；如果过低，提取液中的氢离子浓度太高，阻碍了树脂柱上的氢离子解离，同样不能很好地完成树脂交换过程，因而实验中发现调整提取液的pH值为1至7是比较合适的。以水洗脱时，使用的是去离子水，以确保不引入新的离子干扰，洗脱时那些没有被树脂吸附的非碱性物质就很容易被水洗脱下来，从而与被吸附在树脂柱上生物碱有机离子分离了。此后再加较高浓度的酸液进行洗脱，由于此时酸液中的氢离子浓度很高，就会竞争性地与树脂相结合，从而将吸附在树脂柱上的生物碱有机离子交换下来，溶解在酸洗脱液中，流出树脂柱，完成生物碱的富集过程。之后，在洗脱液中加入碱中和掉多余的酸，再经常规脱盐处理，即可得到纯度较高的三尖杉总生物碱了。

该工艺过程与现有技术相比，工艺流程简单，不使用有机溶剂、无树脂单体成分残留、生物碱转移率高；其重要的贡献还在于，打破了传统理论认为的离子交换能力顺序规律，即：Ca²⁺＞K⁺≈NH₄ ⁺＞Na⁺＞H⁺。正是在这一传统理论的影响下，所有关于三尖杉总生物碱的离子交换树脂分离法中都是碱液或氨液进行洗脱，或者先用碱液中和树脂柱再用有机溶剂回流提取理论上已经游离的生物碱，而实际应用中的效果非常不理想且不适于大生产。在本发明的技术方案中，虽然氢离子的交换能力是最弱的，但通过提高酸洗脱液中氢离子的浓度，从而抵消了其交换能力弱的缺点，同时在酸性条件下，可以使交换下来的生物碱迅速溶解到酸液中，并被冲出柱子，由此保证了生物碱的洗脱效果。并且，以酸液进行洗脱，在洗脱的同时，也使阳离子交换树脂柱得以再生，从而可以循环使用，减少了碱液洗脱后再生树脂柱的过程，降低了成本。本发明的技术完全突破了现有技术中以碱液洗脱的传统观念和工艺过程，取得了意想不到的效果，极大的提高了三尖杉总生物碱的得率，使阳离子交换树脂在工业生产中用于精制分离三尖杉总生物碱成为可能。

基于上述工艺过程，发明人又进行了进一步的研究，细化各步骤的参数，筛选出最优方案，具体内容如下：

1、上柱前调整药液的pH值范围优选为2至5，效果更加明显。

2、所用的阳离子交换树脂可以是大孔型或凝胶型强酸型离子交换树脂，在实际使用时可以根据情况处理成氢型、钠型或铵型中的任一种。

3、所用阳离子交换树脂柱的柱径与柱高之比并无一定之规，但考虑生产实际，柱径∶柱高＝1∶5～1∶10时可以取得最好的效果。

4、给树脂柱上样的药液浓度为每ml相当于生药0.1～3g，具体情况可以根据药液的前处理方式决定，如果是采用浸渍、渗漉等方式，得到的药液就会比较稀；而如果是回流提取、煎煮等方式，尤其是经过浓缩处理，药液的浓度就会比较大，但只要是在这个范围内，都能实现上样。同时，上样速度也根据药液的浓度进行适时调整，基本满足在0.5～5倍柱体积/小时即可。

5、上样方式一般选择为从柱上端上样，药液靠自流力而流过整个柱子；发明人发现，如果逆流上样，即将药液从柱子底端上样，通过一定的压力，使药液注满整个柱子，这种上样方式可以发挥柱子的最大交换效率，也避免了从上端上样时由于生物碱交换不完全而发生的提前穿透问题。这一点也是发明人创造性的发现。

6、洗脱所用的酸液优选为盐酸溶液或硫酸溶液，其浓度均优选为3％～6％。

7、洗脱时洗脱液的流速不宜过快或过慢，如果过快，则氢离子与生物碱有机离子的交换不充分，酸液浪费较多；如果过慢，则解离下来的生物碱有机离子可能又重新吸附回树脂柱上，影响洗脱效率。实验发现，洗脱速度保持在2～6倍柱体积/小时为宜。进一步优选，洗脱速度保持在4～6倍柱体积/小时最好。

8、发明人还发现，如果想更高地提高洗脱效率，可以在水洗脱除杂后，不立即进行酸液洗脱，而是先在树脂柱中充满酸液并静置2小时以上，一般不需超过12个小时，再进行洗脱。经过静置后，大量的生物碱有机离子已被氢离子交换下来，或者处于半吸附半解离的状态，此时进行洗脱，生物碱富集效果明显，洗脱效率明显提高。

9、为了进一步提高洗脱效率，还可以在洗脱用的酸液中加入少量NH₄Cl、NaCl或CaCl₂，加入量不宜过少或过多，如果过少，则起不到作用；如果过多，则因盐浓度过高易盐析而影响生物碱有机离子的溶解度。实验发现，洗脱液中以NH₄ ⁺、Na⁺或Ca²⁺浓度为0.1～1mol/L时为佳，进一步优选，NH₄ ⁺、Na⁺或Ca²⁺的浓度为0.1～0.3mol/L时最好。

10、工艺中所说的脱盐方法可以是透析法除盐、膜滤过除盐以及其他各种药物生物领域常规的除盐方法，目前这些方法都已经比较成熟，并可以管道化生产。

11、该方法中所说的三尖杉提取液可以通过浸渍、渗漉、超声、微波或煎煮中的任一种方式提取制得，并且提取的溶媒可以是水、酸水、乙醇溶液、酸性乙醇溶液中的任一种，但都属于目前中药领域的常规提取方法。区别点在于，如果是用浸渍或渗漉方法制得，可以直接上样；如果是用其他方法提取得到的，还要经过醇沉、过滤或离心除杂等步骤，以保证上样的顺利。

需要说明的是，上述优选的技术参数，可以根据实际情况的需要，与基本工艺进行任意组合，且均能取得良好的效果，解决技术问题，达到本发明的目的。

下面通过对比实验来说明本发明的优点。

一、实验方案：

取三尖杉药材5000g，加pH＝3的酸水8倍量，浸泡一夜，渗漉，收集渗漉液至用硅钨酸检查无沉淀为止，合并渗漉液，离心，得上清液；将上清液均为五份，分别按下面五种方法进行生物碱的分离提纯：

(1)离子交换树脂+酸溶液洗脱：将上清液调节pH＝3，上已处理好强阳离子交换树脂001×7(氢型，径高比为1∶8)，上样速度为3倍柱体积/小时，至流出液用硅钨酸检查有沉淀停止上样，用水洗脱至洗脱液基本无色，再用3％盐酸溶液洗脱，洗脱速度为4倍柱体积/小时的速度洗脱，洗脱液用硅钨酸检查有沉淀时开始接收，接收洗脱液至用硅钨酸检查无沉淀时至，合并洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐(备用)，干燥，得三尖杉总生物碱。

(2)离子交换树脂+酸的盐溶液洗脱：将上清液调节pH＝3，上已处理好强阳离子交换树脂001×7(氢型，径高比为1∶8)，上样速度为3倍柱体积/小时，至流出液用硅钨酸检查有沉淀停止上样，用水洗脱至洗脱液基本无颜色时停止，再用2％氯化钙的0.5％的盐酸溶液浸泡树脂。再用2％氯化钙的0.5％的盐酸溶液洗脱，洗脱速度为4倍柱体积/小时，洗脱液用硅钨酸检查有沉淀时开始接收，接收洗脱液至用硅钨酸检查无沉淀时至，合并洗脱液，用氢氧化钙中和至pH＝7左右，除盐(备用)，浓缩干燥，得三尖杉总生物碱。

(3)离子交换树脂+回流提取：将上清液调节pH＝3，上已处理好强阳离子交换树脂001×7(氢型，径高比为1∶8)，上样速度为3倍柱体积/小时，至流出液用硅钨酸检查有沉淀停止上样，用水洗脱至洗脱液基本无颜色时停止洗脱，将树脂由柱中倒出，置瓷盘中晾干，加10％氨水适量，搅拌均匀，以手摸有潮湿感，但不沾手为宜。将此树脂置索氏提取器中，以氯仿回流提取2小时，将氯仿液加无水Na₂SO₄脱水后，回收氯仿至干糖浆状，干燥得三尖杉总生物碱。

(4)大孔吸附树脂法：将上清液调节PH＝10，上已处理好的DF0l型大孔吸附树脂，上样速度为4倍柱体积/小时，至流出液用硅钨酸检查有沉淀停止上样，用水洗脱至洗脱液基本无颜色时停止洗脱。以乙醇-水(70∶30)为洗脱剂，以2.5倍柱体积/小时的速度进行洗脱，洗脱液用硅钨酸检查有沉淀时开始接收，接收洗脱液至用硅钨酸检查无沉淀时至，合并洗脱液，回收乙醇，干燥，得三尖杉总生物碱。

(5)有机溶剂萃取法：将上清液调节PH＝10，先用10倍量氯仿分三次萃取，再用10倍量乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，蒸干，得三尖杉总生物碱。

二、结果计算：分别称量五种工艺所得总生物碱的重量，并与药材量相除，得总生物碱的收率；分别采用酸碱滴定的定量方法，对五种方法所得总生物碱进行含量测定，计算总生物碱的纯度。

三、结果对比，见下表：

五种工艺的效果评价表

由以上对比结果可见，本发明的技术方案可以解决现有技术中的不足，并显著地提高产品的质量、降低成本、提高安全性和生产可行性，本发明达到了发明目的。

具体实施方式

实施例1：

取三尖杉饮片1000g，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，离心，调节pH＝3，离心，上清液以4倍柱体积/小时通过阳离子交换树脂(001×7，氢型，径高比1∶8)，水洗至流出液无颜色，再用15％盐酸溶液洗脱，洗脱速度为2倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，收集洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得三尖杉总生物碱。

实施例2：

取三尖杉饮片1000g，加pH＝5的酸水渗漉，合并渗漉液加水稀释至10000ml，离心，调节pH＝1，离心，上清液以5倍柱体积/小时通过阳离子交换树脂(Doulex 50，钠型，径高比1∶5)，水洗至流出液无颜色，再用5％盐酸溶液洗脱，洗脱速度为4倍柱体积/小时，洗脱2倍柱体积后浸泡5小时，再洗脱至生物碱检查为阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，收集洗脱液，用氢氧化钙中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得三尖杉总生物碱。

实施例3：

取三尖杉饮片5kg，加70％乙醇超声提取两次，每次加5倍量，超声0.5小时，合并提取液，离心，回收乙醇，加水至5000ml，调节pH＝2，离心，上清液以2倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(001×10，钠型，径高比1∶7)，水洗至流出液无颜色，再用1％盐酸溶液(含1％的氯化钠)洗脱，洗脱速度为5倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，收集洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得三尖杉总生物碱。

实施例4：

取三尖杉饮片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1(60℃)，加乙醇至浓度为70％，静置，上清液回收乙醇，加水至3000ml，调节pH＝4，离心，上清液以3倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(AmberliteIR--120，氨型，径高比1∶9)，水洗至流出液无颜色，再用10％盐酸溶液洗脱，洗脱速度为6倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，收集洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得三尖杉总生物碱。

实施例5：

取三尖杉饮片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1(60℃)，加乙醇至浓度为70％，静置，上清液回收乙醇，加水至5000ml，调节pH＝5，离心，上清液以3倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(D001×4，氢型，径高比1∶10)，水洗至流出液无颜色，再用3％盐酸溶液洗脱，洗脱速度为3倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，收集洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得三尖杉总生物碱。

实施例6：

取三尖杉饮片2000g，加pH＝3的盐酸溶液，微波提取2次，每次加5倍体积微波提取0.5小时，滤过，滤液加水稀释至1600ml，调节pH＝6，离心，上清液以2倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(Doulex 50，氢型，径高比1∶6)，水洗至流出液无颜色，再用2％盐酸溶液(含0.2mol/L的氯化氨)洗脱，洗脱速度为5倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，收集洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得三尖杉总生物碱。

实施例7：

取三尖杉饮片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1(60℃)，加乙醇至浓度为70％，静置，上清液回收乙醇，加水至4000ml，调节pH＝4，离心，上清液以0.5倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(AmberliteIR--120，氢型，径高比1∶6)，水洗至流出液无颜色，再用0.5％硫酸溶液(含1mol/L的氯化钠)洗脱，洗脱速度为5倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，收集洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得三尖杉总生物碱。

实施例8：

取三尖杉饮片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1(60℃)，加乙醇至浓度为70％，静置，上清液回收乙醇，加水至10000ml，调节pH＝3，离心，上清液以3倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(001×5，氢型，径高比1∶8)，水洗至流出液无颜色，再用2％盐酸溶液(含0.3mol/L的氯化钙)洗脱，洗脱速度为6倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，收集洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得三尖杉总生物碱。

实施例9：

取三尖杉饮片1000g，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.1(60℃)，加乙醇至浓度为70％，静置，上清液回收乙醇，加水至1000ml，调节pH＝3，离心，上清液以3倍柱体积/小时通过上阳离子交换树脂(Doulex 50，氢型，径高比1∶8)，水洗至流出液无颜色，再用4％硫酸溶液洗脱，洗脱速度为4倍柱体积/小时，至生物碱检查为阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，收集洗脱液，用氢氧化钠中和至中性，除盐，滤液浓缩干燥得三尖杉总生物碱。

Claims (13)

1、一种从中药三尖杉提取液中分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于该方法为：取三尖杉提取液，调整pH值1至7，滤过，取滤液加于阳离子交换树脂柱上，先以水洗脱除杂，再用0.5％～15％酸液洗脱，收集洗脱液，加碱中和，经脱盐处理，即得三尖杉总生物碱。

2、如权利要求1所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于上柱前调整药液的pH值范围为2至5。

3、如权利要求1所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于所用阳离子交换树脂可以是大孔型或凝胶型强酸型离子交换树脂。

4、如权利要求3所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于所用阳离子交换树脂柱的柱径∶柱高＝1∶5～1∶10。

5、如权利要求1所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于该方法中上样药液的浓度为每ml相当于生药0.1～3g，上样速度为0.5～5倍柱体积/小时。

6、如权利要求5所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于上样方式优选为逆流上样。

7、如权利要求1所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于该方法中洗脱用的酸液是3％～6％的盐酸溶液或3％～6％的硫酸溶液。

8、如权利要求7所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于洗脱速度为2～6倍柱体积/小时。

9、如权利要求8所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于洗脱速度为4～6倍柱体积/小时。

10、如权利要求1所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于在水洗脱除杂后，可以先在树脂柱中充满洗脱用酸液并静置2～12个小时，再进行洗脱。

11、如权利要求7所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于洗脱用的酸液中还可以加入0.1～1mol/L的NH₄Cl、NaCl或CaCl₂。

12、如权利要求11所述的分离三尖杉总生物碱的方法，其特征在于酸液中盐的浓度优选为0.1～0.3mol/L。

13、权利要求1-12中任何一项所述的方法制备的三尖杉总生物碱。