CN101484183A - Hla肽疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了来源于主要组织相容性复合物(MHC)I类人白细胞抗原(HLA)例如HLA－A2的多肽，以及其衍生物或类似物。所述多肽、衍生物和类似物可以用于治疗或预防同种异体致敏，例如治疗或预防同种异体移植物排斥。

Description

HLA肽疗法
技术领域
本发明涉及肽疗法，具体地但非唯一地，涉及肽免疫疗法用于治疗或预防同种异体移植物排斥的用途。本发明可扩展到各种构建体，以及使用这类构建体治疗移植患者的方法，例如治疗患有终末期肾功能衰竭(ESRF)需要肾移植的患者。
背景技术
肾移植的效果在中短期时良好。然而，在长期时，肾功能总是会由于慢性移植物(移植)肾病而丧失。这很大程度是由于两种进行中的现象：(i)慢性排斥；和(ii)钙调神经磷酸酶抑制剂肾毒性。这两种现象均会与预先存在的结果的决定因素相互影响，所述决定因素即在移植前和移植后的早期对肾实质造成的慢性损伤。此外，在移植受体体内进行必须进行的长期免疫抑制会带来不良后果，例如对感染和恶性肿瘤(malignancy)的易感性增加。
作为对患有ESRF的患者的治疗的移植的好处表现在生活质量和增加的存活率这两者上。然而，对移植的漫长等待可能会使个体感到挫折感并且大大地影响长期的结果。许多因素决定了等待时间，但是特别重要的是在移植受体体内存在抗体，所述抗体显示出针对存在于可能的供体器官上的被称为人白细胞抗原(HLA)的多态分子的免疫特异性。由所述移植受体所产生的抗-HLA抗体可以导致非常快速的发病或者对所述移植器官的‘超急性’排斥，因此必须在移植之前确定它们的存在。然后，拒绝所述可能的受体接受带有相关HLA的移植物，且所述患者必须等待特定HLA抗原的器官，所述患者体内会不产生针对所述HLA抗原的抗体。抗-HLA抗体可能会被妊娠、输血和移植所激发。红细胞生成素的使用已经减少了输血，并且通过器官分配得以增强的HLA匹配已经减少了由移植导致的对抗体合成的刺激。
然而，抗-HLA抗体的产生——即“HLA致敏”——仍然是移植的一个明显难题。这一点在患有长期ESRF(通常从青年时期开始)且累积大量接触同种异体的(即外源HLA)的患者中特别明显。由B淋巴细胞形成亲和力成熟型转换的抗-HLA抗体的过程需要存在T辅助细胞。用于抗体产生的T辅助细胞的存在意味着T细胞受体通过间接途径衔接HLA。CD4+T淋巴细胞可以通过常规机制识别同种异体的HLA，所述机制为由自体抗原呈递细胞吸收、加工成为肽并且在自身MHCII类中呈递。这被称为同种异体识别的间接途径。除了其在抗体形成中的作用之外，人们认为T细胞还在慢性排斥反应中起到特别重要的作用。同种异体识别的直接途径是自体-MHC的特异性T细胞受体与同种异体MHC(带有相关肽)上的名义(nominal)外源肽的交叉反应。人们认为这在急性排斥反应中特别重要。因此，本发明的发明人认为用于最小化、预防或完全消除所述同种异体识别的间接途径的治疗方法能够降低排斥反应的可能性和抗-HLA抗体的合成，所以在接受移植物之前和之后均特别有价值。
移植方面的免疫研究的长期目标是开发免疫应答的抗原特异性调节方法，所述免疫应答会导致不必要的非特异性免疫抑制。尽管完全消除对免疫抑制的需求可能是不现实的，但是发明人意识到在特异性方面的任何进步都将会是受欢迎的。
非抗原特异性免疫抑制在调节慢性排斥反应和抗-HLA抗体合成过程中似乎作用有限。然而，虽然发明人不希望受限于任何假说，但他们相信间接呈递的抗原特异性减少或抑制可以减少慢性排斥反应和HLA抗体合成。通过与变态反应领域中的证据进行类比，发明人推测基于抗原片段(即肽)的治疗方法将被证明是有益的。
发明内容
因此，发明人开发了一种可以调节人体内同种异体识别的间接途径的肽免疫治疗技术。他们相信这种治疗技术具有对同种异体免疫应答进行抗原特异性调节的潜力。为了测试他们的假说，他们研究了患者体内的间接的同种异体识别，所述患者体内存在特异性的间接同种异体应答的证据。因此发明人选择研究已经产生了具有已知特异性的抗HLA抗体的患者，因为这意味着存在特异性的间接同种异体应答。发明人的研究是基于图1中所示出的共同且有问题的MHCI类抗原分子——HLA-A2。
发明人想准确地理解是该抗原分子的哪一部分能够通过所述间接途径激发T淋巴细胞，并由此在这些患者体内帮助抗-HLA-A2抗体合成。因此，使用生物信息学设计了一系列共60种重叠的15聚体肽，所述肽对应于HLA-A2分子的不同区域并且构成了所述‘表位图谱’的基础。人们认为这种对应于HLA-A2的‘图谱’在不同个体之间可能不同，这取决于基因控制元件例如HLA-DR，以及任何与HLA-A2的预先接触的性质，即致敏。令人吃惊的是，由于合成方法中的技术难题，所设计的60种重叠肽中有7种肽无法合成。发明人不希望受限于任何假说，他们相信这是因为所述无法合成的7种肽的极端疏水性的缘故。
发明人研究了图3中所列出的所述53种肽——命名为p1-p53——的生物化学特性，以观察哪些肽最有可能通过与MHCII类分子特别是HLA-DR结合从而通过同种异体识别的间接途径起到刺激因子的作用，所述53种肽是根据HLA-A2合成的。通过使用一种基于ELISA的系统，发明人测量了这53种重叠肽与各种纯化的MHCII类分子的结合亲和力。所测试的各种MHCII类分子包括：DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13、DR15、DR51、DR52、DR53、DP0401和DP0402。发明人吃惊地发现，来源自HLA-A2分子上数个位置的肽会与MHCII类随机结合。然后，发明人通过使用30种所述肽刺激来自于27个有记载的移植患者的外周血单核细胞(PBMC)进行了体外研究，所述患者具有已知的抗体致敏病史。一些受测试的患者已经被HLA-A2预先致敏并因此确实可产生抗-HLA-A2抗体，另一些患者已经被HLA-A2之外的其他HLA抗原预先致敏，并且另一些患者没有抗-HLA-A2抗体。根据受试者自身的HLA-A2表达情况将其分组。因此，发明人希望系统地确定产生的间接同种异体免疫应答所针对的肽表位。这些将构成用于治疗患者以回复和预防HLA-A2致敏的候选治疗肽。为了对产生应答的患者细胞的数目进行计数，发明人使用了一种被称为“γ-干扰素酶联免疫斑点法”的技术检测单个细胞的细胞因子的产生。
令发明人吃惊的是，他发现来源于并且对应于HLA-A2分子某些区域的肽可能对移植患者有有益作用。令发明人更加吃惊的是，他发现来源于HLA-A2的α3结构域和/或跨膜结构域的肽可能对移植患者有有益作用。因此，由于这些数据，发明人相信他们是最先发现和报道HLA-A2来源肽或者其衍生物或类似物的第一医药用途的。
发明人选择HLA-A2作为他们研究的靶抗原，因为HLA-A2是人体内最常见的类型(约50％)。他们假定抑制抗-HLA-A2特异性B细胞激活途径中的T辅助细胞将会减少抗-HLA-A2抗体的合成。因此，发明人相信来源自HLA-A2的肽或者其衍生物或类似物将具有非常广泛的治疗用途。例如，这类治疗用途包括，例如在需要反复进行血小板输注的患者中治疗特征为同种异体致敏的医学病症。
发明人还已经证实了许多来源自HLA-A2的多肽也存在于其他MHCI类HLA蛋白中，特别是HLA-B中。
因此，本发明提供了一种多肽或者其衍生物或类似物，所述多肽由不足30个来源自MHCI类人白细胞抗原(HLA)的α3结构域和/或跨膜结构域的连续氨基酸构成。
本发明还提供了：
- 一种编码本发明的多肽、衍生物或类似物的核酸分子；
- 一种含有本发明的核酸分子的重组载体；
- 一种包含本发明的重组载体的宿主细胞；
- 一种药物组合物，包括治疗有效量的本发明的多肽、衍生物或类似物或者本发明的核酸分子，以及任选地可药用载体；
- 一种用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物包括治疗有效量的本发明的多肽、衍生物或类似物或者本发明的核酸分子，以及可药用载体；
- 一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物，用作药剂；
- 一种编码来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子，或者一种在严格条件下与编码来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子，用作药剂；
- 下述物质：
(a)至少一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物；
(b)至少一种编码(a)的多肽、衍生物或类似物的核酸分子；或
(c)至少一种在严格条件下与(b)的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子；
用于制备一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的药剂的用途。
- 一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的受试者治疗有效量的：
(a)至少一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物；
(b)至少一种编码(a)的多肽、衍生物或类似物的核酸分子；或
(c)至少一种在严格条件下与(b)的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子；和
- 一种刺激T细胞的体外方法，所述方法包括在可刺激所述T细胞的条件下使所述T细胞接触：
(a)一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物；
(b)一种编码(a)的多肽、衍生物或类似物的核酸分子；或
(c)一种在严格条件下与(b)的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子；
从而刺激所述T细胞。
附图说明
图1为人MHC I类HLA-A2的胞外部分的三维结构示意图，示出了α1、α2、α3和跨膜结构域，以及结合于该处的β2微球蛋白。
图2为HLA-A2的胞外部分的示意图，示出了α1、α2、α3和跨膜结构域的氨基酸和DNA序列。
图3为一张列出了53种涵盖有多个HLA-A2区域的肽(p1-p53)、它们的分子量和它们的实际序列的表格。所述53种肽用于实施例1和实施例2中。
图4示出了由实施例1中的结合亲和力研究得到的数据，所述结合亲和力研究是对图2中所示的53种肽与纯化的MHCII分子DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13、DR15、DR51-DRB5、DR52-DRB4和DR53-DRB3进行的。
图5为人MHC I类HLA-A2的胞外部分和肽p39(HLA-A2的192-206位残基)的结构示意图。
图6为人MHC I类HLA-A2的胞外部分以及肽p50(HLA-A2的268-282位残基)和p51(HLA-A2的270-284位残基)的结构示意图。
图7为人MHC I类HLA-A2的胞外部分以及肽p52(HLA-A2的280-294位残基)和p53(HLA-A2的282-296位残基)的结构示意图。
图8为示出了单个患者体内反应细胞/500,000PBMC针对实施例1中所研究的肽的酶联免疫斑点计数数据的柱状图。
图9示出了由实施例1中的结合亲和力研究得到的数据，所述结合亲和力研究是对图2中所示的53种肽与纯化的MHC II分子DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13、DR15、DR51-DRB5、DR52-DRB4和DR53-DRB3进行的。对53种不同肽中的每一种来说，以nM为单位的IC50是通过至少三次独立实验评估得出的。生物素化的参照肽是HLA-DR分子的良好结合分子(binder)并且具有下述IC50：HA 316-318(PKYVKQNTLKLAT)对HLA-DRB1*0101(1nM；pH6)、HLADRB1*0401(22nM；pH6)、HLA-DRB1*1101(19nM；pH5)和HLA-DRB5*0101(8nM；pH5.5)；YKL(AAYAAAKAAALAA)对HLADRB1*0701(6nM；pH5)；MT2-16(AKTIAYDEEARRGLE)对DRB1*0301(303nM；pH4.5)；B121-36(TERVRLVTRHIYNREE)对HLA-DRB1*1301(131nM；pH4.5)；A3 152-166(EAEQLRAYLDGTGVE)对HLA-DRB1*1501(59nM；pH4.5)；LOL 191-210(ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT)对HLA-DRB3*0101(20nM；pH5.5)；和E2/E168(AGDLLAIETDKATI)对HLA-DRB4*0101(27nM；pH5)。*是指后续功能测定中组合使用的相邻肽对。
图10示出了实施例2中的研究受试者的年龄、性别、组织类型、移植、输血和致敏历史。根据受试者体内是否存在HLA-A2以及他们是否产生抗HLA-A2或其他HLA的抗体来定义不同的患者组。组1：HLA-A2阴性且有抗HLA-A2的抗体；组2：HLA-A2阴性且有抗非A2类HLA的抗体；组3：HLA-A2阴性且无形成抗HLA抗体的历史；组4：HLA-A2阳性且有抗非A2类HLA的抗体；组5：HLA-A2阳性且无形成抗HLA抗体的历史。
图11为示出了单个患者体内反应细胞/500,000PBMC针对实施例2中所研究的肽的酶联免疫斑点计数数据的条线图。示出了一个受试者的在存在或不存在浓度不断增加(1、10和50μg/ml)的抗MHC II类抗体(Tu39，Becton Dickinson，Oxford，United Kingdom)的条件下培养的每孔中对应细胞(5x105PBMC)的平均数目。在抗MHC II类的浓度最高时加入浓度为50μgml-1的抗HLA-DR抗体(L243 Becton Dickinson)。将PBMC在下述条件下培养：20μgml-1的肽(p39、p50/51或p52/53)、20μgml-1的PPD、与γ-干扰素酶联免疫斑点板(Mabtech)一同提供的抗CD3阳性对照或仅培养基。
图12示出了由一些图2中的肽所导致的T细胞增殖。示出了应答明显高于本底的个体针对每个肽或肽对(x轴)的平均γ-干扰素的酶联免疫斑点频率/5×105PBMC(y轴)。研究了浓度为20μgml-1(如图所示)或4μgml-1的21种不同的肽或肽对。阳性对照为10μgml-1的ppd或1μgml-1的破伤风类毒素或者在一些后期的实验中为与y-干扰素酶联免疫斑点板(Mabtech)一同提供的抗CD3。括号中示出了HLA-DR类型的有效组(responder)。
图13为肽p39(HLA-A2的第192-206位残基)的结构示意图。它还示出了p39与各种HLA-B等位基因中的对应序列之间的差异。
图14为肽p40(HLA-A2的第202-216位残基)的结构示意图。它还示出了p39与各种HLA-B等位基因中的对应序列之间的差异。
图15为肽p50(HLA-A2的第268-282位残基)和p51(HLA-A2的第270-284位残基)的结构示意图。它还示出了p39与各种HLA-B等位基因中的对应序列之间的差异。
图16为肽p52(HLA-A2的第280-294位残基)和p53(HLA-A2的第282-296位残基)的结构示意图。它还示出了p39与各种HLA-B等位基因中的对应序列之间的差异。
序列的说明
SEQ ID NO：1示出了人MHC I类抗原HLA-A2(即所述HLA*020101等位基因)的全长氨基酸序列。
SEQ ID NO：2示出了人MHC I类抗原HLA-A2(即所述HLA*020101等位基因)的成熟氨基酸序列。换言之，SEQ ID NO：2示出了HLA-A2的序列且不具有其信号序列。SEQ ID NO：2相当于SEQ ID NO：1的第25-365位残基。
SEQ ID NO：3示出了编码SEQ ID NO：1中所示的全长人MHC I类抗原HLA-A2(即所述HLA*020101等位基因)的核酸序列。
SEQ ID NO：4示出了图2中的p1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5示出了图2中的p2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6示出了图2中的p3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7示出了图2中的p4的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8示出了图2中的p5的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9示出了图2中的p6的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10示出了图2中的p7的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11示出了图2中的p8的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12示出了图2中的p9的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13示出了图2中的p10的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14示出了图2中的p11的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15示出了图2中的p12的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16示出了图2中的p13的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17示出了图2中的p14的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18示出了图2中的p15的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19示出了图2中的p16的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20示出了图2中的p17的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21示出了图2中的p18的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22示出了图2中的p19的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23示出了图2中的p20的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24示出了图2中的p21的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25示出了图2中的p22的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26示出了图2中的p23的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27示出了图2中的p24的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28示出了图2中的p25的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29示出了图2中的p26的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30示出了图2中的p27的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31示出了图2中的p28的氨基酸序列。
SEQ ID NO：32示出了图2中的p29的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33示出了图2中的p30的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34示出了图2中的p31的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35示出了图2中的p32的氨基酸序列。
SEQ ID NO：36示出了图2中的p33的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37示出了图2中的p34的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38示出了图2中的p35的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39示出了图2中的p36的氨基酸序列。
SEQ ID NO：40示出了图2中的p37的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41示出了图2中的p38的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42示出了图2中的p39的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43示出了图2中的p40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：44示出了图2中的p41的氨基酸序列。
SEQ ID NO：45示出了图2中的p42的氨基酸序列。
SEQ ID NO：46示出了图2中的p43的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47示出了图2中的p44的氨基酸序列。
SEQ ID NO：48示出了图2中的p45的氨基酸序列。
SEQ ID NO：49示出了图2中的p46的氨基酸序列。
SEQ ID NO：50示出了图2中的p47的氨基酸序列。
SEQ ID NO：51示出了图2中的p48的氨基酸序列。
SEQ ID NO：52示出了图2中的p49的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53示出了图2中的p50的氨基酸序列。
SEQ ID NO：54示出了图2中的p51的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55示出了图2中的p52的氨基酸序列。
SEQ ID NO：56示出了图2中的p53的氨基酸序列。
SEQ ID NO：57示出了p50/51的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的第268-282位和第270-284位的重叠氨基酸)。
SEQ ID NO：58示出了p52/53的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的第280-294位和第282-296位的重叠氨基酸)。
SEQ ID NO：59示出了p45/46的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的第239-253位和第241-256位的重叠氨基酸)。
SEQ ID NO：60示出了p39类似物1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：61示出了p39类似物2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：62示出了p39类似物3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：63示出了p40类似物的氨基酸序列。
SEQ ID NO：64示出了p50/51类似物1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：65示出了p52/53类似物1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：66示出了p50/51类似物2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：67示出了p50/51类似物3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：68示出了p50/51类似物4的氨基酸序列。
SEQ ID NO：69示出了p52/53类似物2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：70示出了p52/53类似物3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：71示出了p52/53类似物4的氨基酸序列。
SEQ ID NO：72示出了p52/53类似物5的氨基酸序列。
SEQ ID NO：73示出了p45/46类似物1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：74示出了p45/46类似物2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：75示出了编码p1的核酸序列。
SEQ ID NO：76示出了编码p2的核酸序列。
SEQ ID NO：77示出了编码p30的核酸序列。
SEQ ID NO：78示出了编码p39的核酸序列。
SEQ ID NO：79示出了编码p40的核酸序列。
SEQ ID NO：80示出了编码p50的核酸序列。
SEQ ID NO：81示出了编码p51的核酸序列。
SEQ ID NO：82示出了编码p52的核酸序列。
SEQ ID NO：83示出了编码p53的核酸序列。
SEQ ID NO：84示出了编码p45的核酸序列。
SEQ ID NO：85示出了编码p46的核酸序列。
SEQ ID NO：86示出了编码p50/51的核酸序列。
SEQ ID NO：87示出了编码p52/53的核酸序列。
SEQ ID NO：88示出了编码p45/46的核酸序列。
SEQ ID NO：89示出了编码p20的核酸序列。
SEQ ID NO：90示出了编码p21的核酸序列。
SEQ ID NO：91示出了编码p39类似物1的核酸序列。
SEQ ID NO：92示出了编码p50/51类似物1的核酸序列。
SEQ ID NO：93示出了编码p52/53类似物1的核酸序列。
SEQ ID NO：94示出了编码p40类似物的核酸序列。
SEQ ID NO：95示出了编码p45/46类似物1的核酸序列。
SEQ ID NO：96示出了编码p45/46类似物2的核酸序列。
具体实施方式
多肽
本发明提供了一种多肽或者其衍生物或类似物，所述多肽由不足30个来源自主要组织相容性复合物(MHC)I类人白细胞抗原(HLA)的α3结构域和/或跨膜结构域的连续氨基酸构成。本发明还考虑到来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物用作药剂的用途。
本文所用的术语“MHC I类HLA”是指在2005年第14届国际HLA和免疫遗传学研讨会上定义为MHC I类HLA的任何基因产物(例如，标记为SEQ ID NO：1的蛋白)。所述基因产物与人MHC I类HLA等位基因(例如，标记为SEQ ID NO：3的)所编码的基因产物和/或与来源自其他物种的人HLA同系物或者其变体或功能片段具有至少50％的同一性。更优选地，MHC I类HLA基因产物与人MHC I类HLA等位基因所编码的产物和/或与来源自其他物种的人HLA同系物或者其变体或功能片段具有至少60％、优选70％、优选80％、优选90％、优选95％和最优选99％的同一性。所述HLA可以为HLA-A、HLA-B或HLA-C。
发明人的研究是基于最常见的MHC I类抗原HLA-A2。MHC I类抗原HLA-A2的序列在本领域中是已知的，并可在公开数据库中找到，例如在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide& val＝37518361。
例如，人MHC I类抗原HLA-A2(即所述HLA*020101等位基因)的全长蛋白序列被标记为SEQ ID NO：1。例如，人MHC I类抗原HLA-A2(即所述HLA*020101等位基因)的成熟蛋白序列被标记为SEQ ID NO：2。此外，编码人MHC I类抗原HLA-A2(即所述HLA*020101等位基因)的核酸序列被标记为SEQ ID NO：3。
所述被标记为SEQ ID NO：3的核酸序列包括8个外显子和7个内含子。这些可以定义如下：外显子1:200bp-272bp；内含子1:237bp-402bp；外显子2:403bp-672bp；内含子2:673bp-913bp；外显子3:914bp-1189bp；内含子3:1190bp-1789bp；外显子4:1790bp-2065bp；内含子4:2066bp-2164bp；外显子5:2165bp-2281bp；内含子5:2282bp-2719bp；外显子6:2720bp-2752bp；内含子6:2753bp-2894bp；外显子7:2895bp-2942bp；内含子7:2493bp-3111bp；和外显子1:3112bp-3116bp。
在优选的实施方案中，所述HLA为HLA-A2。本文所用的术语“HLA-A2”是指在2005年第14届国际HLA和免疫遗传学研讨会上定义为HLA-A2的任何基因产物(例如，标记为SEQ ID NO：1或2的蛋白)。所述基因产物与人HLA-A2等位基因(例如，标记为SEQ ID NO：3的)所编码的基因产物和/或与来源自其他物种的人HLA-A2同系物或者其变体或功能片段具有至少50％的同一性。更优选地，HLA-A2基因产物与人HLA-A2等位基因所编码的产物和/或与来源自其他物种的人HLA-A2同系物或者其变体或功能片段具有至少60％、优选70％、优选80％、优选90％、优选95％和最优选99％的同一性。
在优选的实施方案中，所述HLA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
术语“来源自MHC I类HLA”是指多肽、衍生物或类似物，它包括形成MHC I类抗原HLA的的氨基酸序列并且是其衍生物、类似物或修饰。在优选的实施方案中，来源自MHC I类HLA的多肽为MHC I类HLA的片段或截短。令人吃惊的是，来源自HLA的肽或多肽或衍生物或类似物已经被证明具有治疗活性，并且具体而言，已经被证明可用于预防或最小化同种异体移植物衰竭或排斥。
术语“来源自HLA-A2”是指多肽、衍生物或类似物，它包括形成MHC I类抗原HLA-A2的的氨基酸序列并且是其衍生物、类似物或修饰。在优选的实施方案中，来源自HLA-A2的多肽为HLA-A2的片段或截短。令人吃惊的是，来源自HLA-A2的肽或多肽或衍生物或类似物已经被证明具有治疗活性，并且具体而言，已经被证明可用于预防或最小化同种异体移植物衰竭或排斥。SEQ ID NO：1、2和4-73全部为来源自HLA-A2的多肽。
术语“其衍生物或类似物”是指来源自MHC I类HLA蛋白的多肽的氨基酸残基可以被具有相似侧链或肽骨架性质的残基(天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸模拟物)置换。此外，这类肽的末端可以被具有与乙酰基或酰胺基团类似性质的N-或C-末端保护基团所保护。
类似地，术语“其衍生物或类似物”是指来源自HLA-A2蛋白的多肽的氨基酸残基可以被具有相似侧链或肽骨架性质的残基(天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸模拟物)置换。此外，这类肽的末端可以被具有与乙酰基或酰胺基团类似性质的N-或C-末端保护基团所保护。
衍生物和类似物可以通过对所述来源自MHC I类HLA蛋白(或HLA-A2)的多肽序列进行一或两个突变来形成。所述突变可以是氨基酸的置换、缺失或插入。衍生物或类似物可以与所述多肽相差至少1个氨基酸，但与SEQ ID NO：1或2所示的序列相差不到5、10、20、50、100、150、200或250个氨基酸。衍生物和类似物的实例包括下文中更加详细讨论的所有截短、类似物、变体、片段和同种异体抗原。多肽的衍生物或类似物——例如来源自MHC I类抗原或来源自HLA-A2的多肽的衍生物或类似物——与MHC II类HLA结合并且激活特异性针对该多肽的T细胞。换言之，多肽的衍生物或类似物将会与MHC II类HLA结合并且激活带有特异性针对该多肽的T细胞受体的T细胞。例如，来源自HLA-A2的多肽的衍生物或类似物将会与MHCII类HLA结合并且激活带有特异性针对所述来源自HLA-A2的多肽的受体的T细胞。如果通过使一种T细胞与一种多肽接触来对其进行筛选或克隆，则所述T细胞为特异性针对该多肽的或带有特异性针对该多肽的T细胞受体。用于筛选或克隆T细胞的方法是本领域所公知的。例如，Lamb et al.，J.Exp.Biol.，1983；157:1434-1447中描述了一种适合的方法。
MHC I类HLA包括5个结构域，即α1结构域、α2结构域、α3结构域、跨膜结构域和胞质结构域。
由SEQ ID NO：1可以看出，全长人I类组织相容性分子HLA-A2蛋白由365个氨基酸残基构成。由SEQ ID NO：2可以看出成熟人I类组织相容性分子——HLA-A2蛋白由341个氨基酸残基构成。图1示出了HLA-A2的胞外部分的结构示意图。可以看出HLA-A2包括α1结构域、α2结构域、α3结构域，还有跨膜结构域和胞质结构域，后两个结构域未在图中示出。将会理解的是，α1和α2结构域限定了HLA-A2分子的一个基本上多态性的区域，并且α3结构域和跨膜结构域限定了HLA-A2分子的一个基本上无多态性的区域。此外，β-2-微球蛋白(β2m)的分子与α1和α2结构域的连接部分结合，并且通过非共价相互作用与α3结构域结合。未在图1中示出的是存在以非共价方式结合在α1和α2结构域的α螺旋之间的沟中的短肽。将会理解的是，所述肽与α螺旋临近部分的组合构成了可被CD8+T细胞识别的表位。所述关于HLA-A2中5个结构域的结构和功能的讨论也适用于其他MHC I类HLA，例如HLA-B或HLA-C。
在一些实施方案中，本发明可以使用基本上来源自全长MHC I类HLA的多肽、其衍生物或类似物。在一些实施方案中，本发明可以使用多肽、其衍生物或类似物，它们基本上来源自全长HLA-A2蛋白分子，基本上如SEQ ID NO：1或2所限定的那样。因此，本发明中所用的MHC I类HLA或HLA-A2分子可以包括所述α1结构域、所述α2结构域、所述α3结构域、所述跨膜结构域和所述胞质结构域。所述全长HLA-A2分子包括365个氨基酸(SEQ ID NO：1)。
然而，发明人已经证明了本发明还可以使用来源自所述HLA-A2蛋白分子(即不足365个氨基酸)的多肽或衍生物或类似物。因此，本发明所用的多肽、其衍生物或类似物可能会包括全长MHC I类HLA的截短。优选地，本发明所用的多肽、其衍生物或类似物包括全长HLA-A2的截短。下文中关于截短的讨论集中于HLA-A2的截短。然而，这类讨论也适用于其他MHC I类HLA，例如HLA-B或HLA-C。
术语“截短”是指相当于所述HLA-A2蛋白的一个区域或片段，但是通过移除氨基酸减小了其长度的多肽。氨基酸的减少可以通过移除所述肽的C-或N-末端的残基或者是通过缺失所述HLA-A2分子核心(即SEQID NO：1的第2-364位氨基酸)内的一个或多个氨基酸来实现的。例如，所述肽可能会包括从所述全长HLA-A2分子上缺失5、10、15、20或25个氨基酸残基。更优选地，所述肽可能会包括从所述全长HLA-A2分子上缺失50、75、100、125、150、200、225或150个氨基酸残基。
适合地，所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物包括不足约100个氨基酸，更加适合地不足约74个氨基酸，并且甚至更适合地不足50个氨基酸。优选地，所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物包括不足30个氨基酸，并且更优选地不足20个氨基酸，并且最优选地约15个氨基酸。发明人相信在仍旧具有治疗作用的情况下减小HLA-A2的大小将会有助于对正在治疗的受试者进行治疗性给药。
由于T淋巴细胞根据蛋白的与MHC分子结合的短肽形式的一级序列来识别该蛋白，发明人相信本发明的肽、衍生物或类似物可用于特异性地脱敏T细胞应答，同时没有与‘整个’抗原接触的风险。这是特别优选的，因为全长抗原或具备二级和/或三级结构的至少大部分的该抗原自身可能会导致致敏。此外，在这类所述肽疗法中观察到的另一项临床效益是来源自MHC I类HLA(例如HLA-A2)的肽、其衍生物或类似物可能会诱导调节性T细胞，所述调节性T细胞能够对免疫系统产生抗原特异性、显性负相作用。使用肽的另一项显著优势是它们能够被容易地递送而不会诱发危险信号，这将会促进所述正在治疗的受试者体内的生产性免疫。
因此，所述来源自MHC I类HLA蛋白的多肽或者其衍生物或类似物可能来源自一个独立地选自α1结构域；α2结构域；α3结构域；跨膜结构域；胞质结构域；或它们的任意组合的结构域。例如，所述多肽或类似物可能来源自HLA-A2的α1结构域和/或α2结构域。优选地，所述多肽或类似物可能来源自MHC I类HLA的α3结构域和/或跨膜结构域。
本发明具体地提供了一种多肽或其衍生物或类似物，所述多肽由不足30个来源自MHC I类HLA的α3结构域和/或跨膜结构域的连续氨基酸构成。在优选的实施方案中，所述多肽由不足20个或约15个来源自MHC I类HLA的α3结构域和/或跨膜结构域的连续氨基酸构成。在另一个优选的实施方案中，所述衍生物或类似物与所述肽中的至少9个连续氨基酸具有超过65％的序列同一性。本发明所提供的具体序列(SEQ IDNO：42、43、48、49和53-74)在下文中有更加详细的讨论。
类似地，来源自HLA-A2蛋白的多肽或者其衍生物或类似物可能来源自一个独立地选自HLA-A2结构域的结构域，所述HLA-A2结构域包括α1结构域；α2结构域；α3结构域；跨膜结构域；胞质结构域；或它们的任意组合。例如，所述肽或类似物可能来源自HLA-A2的α1结构域和/或α2结构域。或者，所述肽或类似物可能来源自HLA-A2的α3结构域和/或跨膜结构域。
在HLA-A2中，所述α1结构域是由外显子2(即SEQ ID NO：3的第403-672位核苷酸)编码的。因此，所述多肽、衍生物或类似物可能包括基本上SEQ ID NO：2的第1-90位残基所限定的氨基酸序列，并且可能是由SEQ ID NO：3的第403-672位核苷酸编码的。所述α2结构域是由外显子3(即SEQ ID NO：3的第914-1189位核苷酸)编码的。因此，所述多肽、衍生物或类似物可能包括基本上SEQ ID NO：2的第91-182位残基所限定的氨基酸序列，并且可能是由SEQ ID NO：3的第914-1189位核苷酸编码的。所述α3结构域是由外显子4(即SEQ ID NO：3的第1790-2065位核苷酸)编码的。因此，所述多肽、衍生物或类似物可能包括基本上SEQ ID NO：2的第183-274位残基所限定的氨基酸序列，并且可能是由SEQ ID NO：3的第1790-2065位核苷酸编码的。所述跨膜结构域是由外显子5(即SEQ ID NO：3的第2165-2281位核苷酸)编码的。因此，所述多肽、衍生物或类似物可能包括基本上SEQ ID NO：2的第275-314位残基所限定的氨基酸序列，并且可能是由SEQ ID NO：3的第2165-2281位核苷酸编码的。
令人惊奇的是，实施例1和2中所讨论的结合研究的结果表明存在相当多的可以与MHC II类相对‘随机地(promiscuously)’结合的多肽。所述肽中的一些来源自HLA-A2的超变区或多态区(即所述α1和α2结构域)。例如，肽p20(SEQ ID NO：23)来源自HLA-A2(SEQ ID NO：2)的第105-119位氨基酸残基，并且肽p21(SEQ ID NO：24)来源自第107-121位残基。两种肽均相当于一种来源自DR1的17个氨基酸的肽。发明人观察到在15名已经产生了抗HLA-A2的患者中有10名患者体内产生了阳性应答。因此，无论哪种MHC II类，单独一个可与MHC II类分子随机结合的17个氨基酸的肽即可实现该区域中的多数免疫原性。
因此，发明人相信治疗方案中可以使用单独一种肽(或两种紧密重叠的肽)。因此，本发明所用的多肽、衍生物或类似物可能来源自MHC I类HLA分子的一个相当多态的区域，并且更优选地来源自其α1和/或α2结构域。因此，本发明所用的多肽、衍生物或类似物可能来源自MHCI类HLA分子的一个相当多态的区域，并且更优选地来源自其α1和/或α2结构域。
因此，本发明所用的优选的多肽包括基本上下述氨基酸序列：
(a)HSMRYFFTSVSRPGR(SEQ ID NO：4)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第3-17位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α1结构域.???该肽在本文中被命名为p1，分子量为1827.1。
(b)MRYFFTSVSRPGRGE(SEQ ID NO：5)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第5-19位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α1结构域。该肽在本文中被命名为p2，分子量为1789。
(c)HKWEAAHVAEQLRAY(SEQ ID NO：33)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第145-159位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α2结构域。该肽在本文中被命名为p30，分子量为1808。
(d)SDWRFLRGYHQYAYD(SEQ ID NO：23)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第105-119位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α2结构域。该肽在本文中被命名为p20，分子量为1976.1。
(e)WRFLRGYHQYAYDGK(SEQ ID NO：24)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第107-121位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α2结构域。该肽在本文中被命名为p21，分子量为1959.2。
应该理解的是，所述肽(a)-(e)中的每一种均来源自HLA-A2的多态区。然而，发明人吃惊地发现相当多的个体也会对来源自HLA-A2分子中其他区域的肽产生应答，所述其他区域特别是具有有限多态性的HLA-A2的区域，例如α3结构域和跨膜结构域。发明人相信，到目前为止尚没有关于对肽产生免疫应答的报道，并且因而没有关于它们用在基于肽的疗法中的报道或计划，所述肽来源自HLA-A2的至少具有有限多态性或基本上无多态性的区域——特别是HLA-A2的α3和跨膜结构域——或任何其他HLA分子。发明人还相信，使用来源自HLA-A2的非多态性区域的肽可能具有比那些来源自HLA-A2的多态性并且因而是独特性区域的肽更广泛的应用。因为这些肽具有有限的多态性，所以它们可作为不同HLA分子之间的潜在交叉作用的位点。
因此，本发明的优选多肽、其衍生物或类似物均来源自MHC I类HLA的基本有限多态性或无多态性区域，例如α3和/或跨膜结构域。特别优选地是，本发明所用的多肽、其衍生物或类似物来源自HLA-A2分子的基本有限多态性或无多态性区域。优选地，所述多肽、其衍生物或类似物来源自HLA-A2的α3和/或跨膜结构域。
因此本发明所用的最优选的肽包括基本上下述氨基酸序列：
(f)HAVSDHEATLRCWAL(SEQ ID NO：42)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第192-206位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域。该肽在本文中被命名为p39，分子量为1708。
(g)RCWALSFYPAEITLT(SEQ ID NO：43)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第202-216位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域。该肽在本文中被命名为p40，分子量为1770。
(h)KPLTLRWEPSSQPTI(SEQ ID NO：53)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第268-282位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域和跨膜结构域。该肽在本文中被命名为p50，分子量为1752。
(i)LTLRWEPSSQPTIPI(SEQ ID NO：54)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第270-284位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域和跨膜结构域。该肽在本文中被命名为p51，分子量为1737。
(j)PTIPIVGIIAGLVLF(SEQ ID NO：55)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第280-294位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的跨膜结构域。该肽在本文中被命名为p52，分子量为1522。
(k)IPIVGIIAGLVLFGA(SEQ ID NO：56)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第282-296位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的跨膜结构域。该肽在本文中被命名为p53，分子量为1452。
(1)GTFQKWAAVVVPSGQEQR(SEQ ID NO：48)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第239-253位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域。该肽在本文中被命名为p45，分子量为1574。
(m)FQKWAAVVVPSGQEQR(SEQ ID NO：49)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第241-256位氨基酸，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域。该肽在本文中被命名为p46，分子量为1829。
应该理解的是，所述肽(f)-(m)中的每一种均来源自HLA-A2的基本无多态性区域。发明人已经发现来源自HLA-A2的非多态性区域(即α3和跨膜结构域)的肽在已经产生抗HLA-A2抗体的患者体内引发令人吃惊地高频率应答并且在一些其他患者体内引发显著应答。发明人相信这些肽之前尚未被定义为T细胞表位，并且是重要的因为它们具有有限的多态性。
发明人还发现多肽、衍生物或类似物——它们包括本文所公开的任何具有治疗作用且显示出令人吃惊的效能的优选肽的重叠区域——用于治疗特征为同种异体致敏(例如同种异体移植物衰竭或排斥)的病症的用途。因此，来源自MHC I类HLA(例如HLA-A2)的非多态性区域的多肽、其衍生物或类似物优选地包括重叠部分或区域。
因此，本发明所用的更加优选的多肽包括基本上下述氨基酸序列：
(n)KPLTLRWEPSSQPTIPI(SEQ ID NO：57)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第268-282位和第270-284位重叠氨基酸。该肽在本文中被命名为p50/51。
(o)PTIPIVGIIAGLVLFGA(SEQ ID NO：58)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第280-294位和第282-296位重叠氨基酸。该肽在本文中被命名为p52/53。
(p)GTFQKWAAVVVPSGQEQR(SEQ ID NO：59)。该肽对应于HLA-A2蛋白(即SEQ ID NO：2)的第239-253位和第241-256位重叠氨基酸。该肽在本文中被命名为p45/46。
通过与抗-HLA抗体类比，发明人相信来源自α3和跨膜结构域的优选肽可以被称为‘公共’T细胞表位。这关系到传播(spreading)针对不同HLA的免疫应答的进化，以及设计具有治疗潜力的肽及其混合物。
例如，如图5和13中所示，肽p39的序列即SEQ ID NO：42(它来源自HLA-A2的第192-206位氨基酸)还存在于下述HLA分子的序列中：HLA-A2、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A29、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69和HLA-A74。因此，当将肽p39或者其衍生物或类似物给予患者时，发明人相信它能够调节针对带有任何这类HLA分子的移植物的免疫应答，而不仅仅限于HLA-A2。将会理解的是，在疗法中使用这种肽、衍生物或类似物是一个显著的进步，因为它具有多种作用，从而可预防带有各种HLA抗原的同种异体移植物的排斥或衰竭。
此外，类似地，存在一种由图5和13中所示的全部其他HLA-A分子：HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A30、HLA-A36、HLA-A80和大多数HLA-B分子表达的p39序列(SEQ ID NO：2)的变体。该变体被称为p39类似物1并且在SEQ ID NO：60中示出。因此，当给予肽p39及其一种具有SEQ ID NO：60的序列(其中193位的丙氨酸残基被置换为脯氨酸，且194位的缬氨酸残基被置换为异亮氨酸)的类似物时，发明人相信这种组合具有调节针对带有所有HLA-A分子和大多数HLA-B分子的移植物的免疫应答的潜力。
此外，类似地，存在一种由图13中所示的其他HLA-B分子：HLA-B51、HLA-B52、HLA-B53、HLA-B58、HLA-B78表达的p39序列(SEQ ID NO：42)的变体。该变体被称为p39类似物2并且在SEQ ID NO：61中示出。因此，当给予肽p39及其一种具有SEQ ID NO：61的序列(其中193位的丙氨酸残基被置换为脯氨酸)的类似物时，发明人相信这种组合具有调节针对带有各种HLA-A分子和一些HLA-B分子的移植物的免疫应答的潜力。
此外，类似地，存在一种由图13中所示的HLA-B44表达的p39序列(SEQ ID NO：42)的变体。该变体被称为p39类似物3并且在SEQ IDNO：62中示出。因此，当给予肽p39及其一种具有SEQ ID NO：62的序列(其中193位的丙氨酸残基被置换为脯氨酸，且199位的丙氨酸残基被置换为缬氨酸)的类似物时，发明人相信这种组合具有调节针对带有各种HLA-A分子和HLA-B44的移植物的免疫应答的潜力。
通过另一个实例，如图13中所示，肽p40的序列即SEQ ID NO：43(它来源自HLA-A2的第202-216位氨基酸)还存在于下述HLA分子的序列中：HLA-A2、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A29、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74和HLA-A74。因此，当将肽p40或者其衍生物或类似物给予患者时，发明人相信它能够调节针对带有任何这类HLA分子的移植物的免疫应答，而不仅仅限于HLA-A2。将会理解的是，在疗法中使用这种肽、衍生物或类似物是一个显著的进步，因为它具有多种作用，从而可预防带有各种HLA抗原的同种异体移植物的排斥或衰竭。
此外，类似地，存在一种由图14中所示的其他HLA-A分子：HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A30、HLA-A36和大多数HLA-B分子表达的p40序列(SEQ ID NO：43)的变体。该变体被称为p40类似物并且在SEQ ID NO：63中示出。因此，当给予肽p40及其一种具有SEQ IDNO：63的序列(其中207位的丝氨酸残基被置换为甘氨酸)的类似物时，发明人相信这种组合具有调节针对带有各种HLA-A分子和HLA-B分子的移植物的免疫应答的潜力。
此外，如图6和15中所示，来源自第268-282位氨基酸的肽p50(SEQID NO：53)和来源自第270-284位氨基酸的肽p51(SEQ ID NO：54)包括仅偏移2个氨基酸的序列，并且因此跨距长17个氨基酸。类似地，如图7和16中所示，来源自第280-294位氨基酸的肽p52(SEQ ID NO：55)和来源自第282-296位氨基酸的肽p53(SEQ ID NO：56)包括仅偏移2个氨基酸的序列，并且因此跨距长17个氨基酸。在两种情况下，所标记的肽不仅存在于HLA-A2中，还存在于HLA-A25、HLA-A26、HLA-A29、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74和HLA-A80中。
p51(SEQ ID NO：54)和p52(SEQ ID NO：55)还存在HLA-B15、HLA-B18、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B45、HLA-B48、HLA-B49、HLA-B50、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B53、HLA-B54、HLA-B55、HLA-B58、HLA-B59、HLA-B73、HLA-B78、HLA-B82和HLA-B95于中(图14)。
此外，其中第276位的脯氨酸残基被置换为亮氨酸(对于17聚体268-284；SEQ ID NO：64)或其中第294位的苯丙氨酸被置换为亮氨酸(对于17聚体280-296；SEQ ID NO：65)这两种序列的类似物将会提供这样的肽序列，即所述肽序列可以由大多数HLA-A分子以一种与所述用于p39的方式类似的方式表达，唯一的实质性差异为HLA-A23和HLA-A24。
下表1中描述了p50/51和p52/53的其他类似物。
表1-p50/51和p52/53的其他类似物
 
SEQ ID NO： 类似物 用于获得类似物的变化         存在于HLA中
66 p50/51类似物2 273位的赖氨酸 A0320
67 p50/51类似物3 282位的缬氨酸 A24全部HLA-B，其中不存在p50  
68 p50/51类似物4 282位的缬氨酸283位的组氨酸 A23
69 p52/53类似物2 282位的缬氨酸294位的亮氨酸 A24
70 p52/53类似物3 282位的缬氨酸283位的组氨酸 A23
71 p52/53类似物4 292位的丙氨酸293位的缬氨酸294位的亮氨酸295位的丙氨酸296位的缬氨酸 HLA-B15、18、35、37、45、48-55、58、59、73、78、82、95           
72 p52/53类似物5 282位的缬氨酸292位的丙氨酸293位的缬氨酸 全部其他HLA-B
 
294位的亮氨酸295位的丙氨酸296位的缬氨酸
因此，当将多肽p50、p51、52和p53，或者它们的衍生物或类似物的组合给予患者时，发明人相信它能够调节针对带有任何这类HLA分子的移植物的免疫应答。
显而易见的是，p39、p40、p50、p51、p50/51、p52、p53和/或p52/53与一种或多种上文所讨论的它们的类似物的特定组合具有调节针对带有所有HLA-A分子和所有HLA-B分子的移植物的免疫应答的潜力。其优势在于使用尽可能少的多肽来调节所述针对带有任何HLA-A或HLA-B分子的移植物的免疫应答。
因此，根据前文应该理解的是，优选的来源自HLA-A2的非多态性区域的多肽、其衍生物或类似物也可由许多其他HLA-A分子——而不仅仅由HLA-A2——通过作为不同HLA分子之间的潜在交叉作用的位点来加以表达。因此，令人惊奇地，发明人相信在本发明的方法中使用这类肽，特别是用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症(具体而言同种异体移植物排斥和同种异体抗体合成)的好处比单独使用HLA-A2抗原要多得多。因此，发明人相信他们的发现不仅涉及帮助抗体产生，还涉及自身移植物排斥的免疫机制，并且其涉及范围比目标HLA-A2要大得多，扩展至对一般移植抗原的应答。
本发明所用的多肽可以是同种异体抗原，或者来源于其的多肽或其衍生物或类似物。优选地，所述同种异体抗原，或者来源于其的多肽或其衍生物或类似物可能独立地选自HLA-A2、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A29、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A24、HLA-A30、HLA-A36、HLA-A80、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A23，或者它们的组合。
优选的来源自所述同种异体抗原的多肽可以包括p39(SEQ IDNO：42)、p50/51(SEQ ID NO：57)、p52/53(SEQ ID NO：58)、p50(SEQID NO：53)、p51(SEQ ID NO：54)、p52(SEQ ID NO：55)和p53(SEQ IDNO：56)或者衍生物或类似物，或者它们的组合。应该理解的是，这些多肽全部来源自HLA-A2。此外，任何本文所定义的多肽的有效衍生物或类似物也可以用在本发明中。例如，可以使用来源自其他MHC I类抗原(例如HLA-B和HLA-C)的对应多肽。
发明人还相信任何所述优选的多肽的各种类似物可能也可有效预防或最小化同种异体移植物衰竭或排斥，如下面的比对中所示：
p39(SEQ ID NO：42)               H A V S D H E A T L R C W A L
(q)p39类似物1(SEQ ID NO：60)     H P I S D H E A T L R C W A L
p50(SEQ ID NO：53)               K P L T L R W E P S S Q P T I
p51(SEQ ID NO：54)               L T L R W E P S S Q P T I P I
(r)类似物117聚体(SEQ ID NO：64)   K P L T L R W E L S S Q P T I P I
p52(SEQ ID NO：55)               P T I P I V G I I A G L V L F
p53(SEQ ID NO：56)               I P I V G I I A G L V L F G A
(s)类似物117聚体(SEQ ID NO：65)   P T I P I V G I I A G L V L L G A
p40(SEQ ID NO：43)               R C W A L S F Y P A E I T L T
(t)p40类似物(SEQ ID NO：63)      R C W A L G F Y P A E I T L T
p45/46(SEQ ID NO：59)            G T F Q K W A A V V V P S G Q E Q R
(u)p45/46类似物1                 G T F Q K W A A V V V P S G E E Q R
(SEQ ID NO：73)
(v)p45/46类似物2                 G T F Q K W A S V V V P S G Q E Q R
(SEQ ID NO：74)
因此，本发明所用的优选的多肽包括基本上下述氨基酸序列：
(q)HPISDHEATLRCWAL(SEQ ID NO：60)。该类似物衍生自肽p39(SEQID NO：42)，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域，除了其中丙氨酸残基被置换为脯氨酸残基并且缬氨酸残基被置换为异亮氨酸残基。该肽在本文中被命名为“p39类似物1”。
(r)KPLTLRWELSSQPTIPI(SEQ ID NO：64)。该类似物衍生自肽p50(SEQ ID NO：53)和p51(SEQ ID NO：54)，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域和跨膜结构域，除了第276位的脯氨酸残基被置换为亮氨酸残基。该肽在本文中被命名为“p50/51类似物1”。
(s)PTIPIVGIIAGLVLLGA(SEQ ID NO：65)。该类似物衍生自肽p52(SEQ ID NO：55)和p53(SEQ ID NO：56)，并且来源自HLA-A2分子的跨膜结构域，除了第294位的苯丙氨酸残基被置换为亮氨酸残基。该肽在本文中被命名为“p52/53类似物1”。
(t)RCWALGFYPAEITLT(SEQ ID NO：63)。该类似物衍生自肽p40(SEQID NO：43)，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域，除了第207位的丝氨酸残基被置换为甘氨酸残基。该肽在本文中被命名为“p40类似物”。
(u)GTFQKWAAVVVPSGEEQR(SEQ ID NO：73)。该类似物衍生自肽p45/46(SEQ ID NO：59)，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域，除了谷氨酰胺残基被置换为谷氨酸残基。该肽在本文中被命名为“p45/46类似物1”。
(v)GTFQKWASVVVPSGQEQR(SEQ ID NO：74)。该类似物衍生自肽p45/46(SEQ ID NO：59)，并且来源自HLA-A2分子的α3结构域，除了丙氨酸残基被置换为丝氨酸残基。该肽在本文中被命名为“p45/46类似物2”。
应该理解的是，本发明涉及任何来源自MHC I类HLA的多肽、其衍生物或类似物的用途，所述多肽、其衍生物或类似物包括基本上任何本文所述序列的氨基酸序列，包括功能变体或其片段。还应该理解的是，本发明涉及任何来源自HLA-A2的多肽、其衍生物或类似物的用途，所述多肽、其衍生物或类似物包括基本上任何本文所述序列的氨基酸序列，包括功能变体或其片段。术语“基本上的氨基酸/多核苷酸/多肽序列”、“功能变体”和“功能片段”是指与任一本文所述序列的氨基酸/多核苷酸/多肽序列具有至少40％序列同一性的序列，例如与标记为SEQID NO：2的hla-a2基因具有40％的同一性或者与标记为SEQ ID NO：1或2的HLA-A2蛋白具有40％的同一性。还考虑到了与任何本文所述序列具有高于65％、更优选地高于70％、甚至更优选地高于75％和更加优选地高于80％的序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列。优选地，所述氨基酸/多核苷酸/多肽序列与任何本文所述的序列具有85％的同一性，更优选地与任何本文所述的序列具有90％的同一性、甚至更优选92％的同一性、甚至更优选95％的同一性、甚至更优选97％的同一性、甚至更优选98％的同一性和最优选99％的同一性。
可以对任意长度的氨基酸/多核苷酸/多肽序列进行两种氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分数的测定。例如，可以测定全长序列的同一性。或者，可以测定部分序列的同一性。这种部分可以为至少350、至少300、至少250、至少200、至少250、至少150、至少100、至少50、至少30、至少20、至少15、至少10或至少9个连续氨基酸/核苷酸。
技术人员将会理解如何计算两种氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分数，例如，如http://wikiomics.org/wiki/Percentage_identity中所述。为了计算两种氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分数，必须首先对所述两种序列进行比对，然后计算序列同一性的值。
两种序列的同一性百分数可能会出现不同的值，这取决于：(i)用于比对所述序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(通过不同的程序实现)或根据3D比较得出的结构比对；(ii)所述比对方法所采用的参数，例如局部比对或者全局比对、所用的配对-打分矩阵(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)和空位罚分，例如功能形式(functional form)和常数。
已经进行比对之后，存在许多不同的用于计算所述两种序列之间同一性百分数的方式。例如，技术人员可以把同一性的数值除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数目；或(iv)除突出之外的等价位置的数目。此外，应该理解的是同一性百分数具有很强的长度依赖性。因此，一对序列越短，则可预期碰巧产生的所述序列同一性将会越高。
因此，应该理解的是，蛋白或DNA序列的准确比对是一个复杂的过程。流行的多重比对程序ClustalW(Thompson et al.，1994，NucleicAcids Research，22，4673-4680；Thompson et al.，1997，NucleicAcids Research，24，4876-4882)是一种优选的用于对本发明的蛋白或DNA进行多重比对的方法。适合的Clusta1W参数如下：对于DNA比对：空位开放罚分＝15.0、空位延伸罚分＝6.66且矩阵＝Identity。对于蛋白比对：空位开放罚分＝10.0、空位延伸罚分＝0.2且矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白比对：ENDGAP＝-1且GAPDIST＝4。本领域技术人员将会注意到有必要改变这些和其他参数以实现最优序列比对。
优选地，两种氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分数的计算是按照如(N/T)*100这样的比对进行的，其中N为所述序列中共享相同残基的位置的数目，并且T为所比较的位置的总数目，包括空位但排除突出。因此，最优选的用于计算两种序列之间的同一性百分数的方法包括(i)利用使用一组适合参数(例如，如上文所述的参数)的ClustalW程序进行序列比对；和(ii)将N和T值插入下述公式内：序列同一性＝(N/T)*100。
衍生物和类似物还可以包括保守性置换。可以按照表2进行保守性置换。第二栏中同一块内的氨基酸，以及优选地，第三栏中同一排中氨基酸可以相互置换。
表2-可用于本发明的保守性置换
Figure A200780024777D00311
可以对所述来源自MHC I类HLA的所肽或者其衍生物或类似物的氨基酸进行修饰。还应该理解的是，可以用修饰过的氨基酸和许多本领域技术人员已知的氨基酸变体代替HLA-A2来源的肽或者其衍生物或类似物以形成更优选的本发明的衍生物或类似物。这类衍生物或类似物肽将会具有抗-同种异体移植物排斥的活性，只要所述修饰没有明显改变其化学特性。例如，R或K的侧链胺上的氢可以被亚甲基基团置换(-NH2→NH(Me)或-N(Me)2)。此外，可以通过使所述肽的N末端氨基基团与羧酸反应来对其加以保护，并且可以通过使所述肽的C末端羧基基团与胺反应来对其加以保护。其他实例包括糖基化和磷酸化。
本发明的肽的类似物还可能包括可延长或缩短所述肽的体内半衰期的肽变体。能够延长本发明所用肽的半衰期的类似物的实例包括所述肽的类肽类似物、所述肽的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂合物。
可以利用许多方法(例如生物系统中的蛋白酶活性)对本发明所用的多肽进行降解。这类降解可能会限制所述多肽的生物利用度，并且因此限制所述多肽实现其生物功能的能力。存在多种成熟的技术，利用这些技术可以设计并且生产出在生物环境中具有增强的稳定性的多肽类似物或衍生物。由于对蛋白酶介导的降解的抗性增强，这类多肽衍生物可能会具有改良的生物利用度。优选地，适合用于本发明的多肽衍生物或类似物的蛋白酶抗性高于其来源的多肽。多肽衍生物及其来源多肽的蛋白酶抗性可以利用公知的蛋白降解测定法来评估。然后比较所述肽衍生物和肽的蛋白酶抗性相对值。
根据本发明所用多肽的结构的相关知识可以很容易地设计出所述多肽的类肽类似物或衍生物。可以使用市售的软件按照成熟的方案来开发类肽衍生物。
反类肽(其中所有的氨基酸均被类肽残基以倒序方式置换)也能够模拟MHC I类HLA来源肽或HLA-A2来源肽，或者其衍生物或类似物。人们预计与含有一个类肽残基的多肽或类肽-肽杂合物相比，反类肽会以相反方向结合在所述配体结合沟中。因此，所述类肽残基的侧链为方向与原始肽中的侧链方向相同的能点(able point)。
本发明所用多肽的类似物的另一个实施方案包括所述多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而非L-氨基酸制备多肽可极大地减少由正常代谢过程所导致的这类药剂的任何不需要的分解，减少药剂的必要给药量及其给药频率。
本发明所用的多肽、衍生物或类似物可以通过合成方法或重组方法来制备。例如，可以通过用表达载体转染培养物中的细胞、培养所述细胞、提取并纯化由该细胞产生的多肽来产生重组多肽，所述表达载体中包含与适合调控序列有效连接的编码所述肽的核苷酸序列。用于所述多肽的重组生产的方法在本领域中是公知的(例如Sambrook et al.，2001，Molecular Cloning：a laboratory manual，3rd edition，Cold HarbourLaboratory Press)。
核酸分子
本发明涉及提供编码上述多肽、衍生物或类似物的核酸。
所述核酸分子可以编码多肽，所述多肽构成了一个独立地选自MHC I类HLA的α1结构域、α2结构域、α3结构域、跨膜结构域、胞质结构域或者它们的任何组合的MHC I类HLA结构域。例如，所述核酸分子可以编码MHC I类HLA的α1结构域和/或α2结构域。或者，所述核酸分子可以编码MHC I类HLA的α3结构域和/或跨膜结构域。
所述核酸分子可以编码多肽，所述多肽构成了一个独立地选自HLA-A2的α1结构域、α2结构域、α3结构域、跨膜结构域、胞质结构域或者它们的任何组合的HLA-A2结构域。例如，所述核酸分子可以编码HLA-A2的α1结构域和/或α2结构域。或者，所述核酸分子可以编码HLA-A2的α3结构域和/或跨膜结构域。
所述HLA-A2基因的核酸序列被标记为SEQ ID NO：3。因此，优选地，所述核酸分子包括基本上可由SEQ ID NO：3所代表的序列(即编码标记为SEQ ID NO：1的全长HLA-A2蛋白或者SEQ ID NO：2中所示的成熟HLA-A2)。所述α1结构域的核酸序列可由SEQ ID NO：3的第403-672位核苷酸表示。因此，所述核酸分子可能包括基本上可由SEQ ID NO：3的第403-672位核苷酸所代表的序列。所述α2结构域的核酸序列可由SEQ ID NO：3的第914-1189位核苷酸表示。因此，所述核酸分子可能包括基本上可由SEQ ID NO：3的第914-1189位核苷酸所代表的序列。所述α3结构域的核酸序列可由SEQ ID NO：3的第1790-2065位核苷酸表示。因此，所述核酸分子可能包括由SEQ ID NO：3的第1790-2065位核苷酸所代表的序列。所述跨膜结构域的核酸序列可由SEQ ID NO：3的第2165-2281位核苷酸表示。因此，所述核酸分子可以被标记为SEQ ID NO：3的第2165-2281位核苷酸。
优选的核酸分子编码独立地选自p1、p2、p20、p21、p30、p39、p40、p50、p51、p52、p53、p45、p46、p50/51、p52/53和p45/46的肽
因此，优选的核酸分子包括基本上下述核苷酸序列：
(a)5’-CAC TCC ATG AGG TAT TTC TTC ACA TCC GTG TCC CGG CCC
GGC CGC-3’(SEQ ID NO：75)。该核酸分子编码肽p1。
(b)5’-ATG AGG TAT TTC TTC ACA TCC GTG TCC CGG CCC GGC CGC
GGG GAG-3’(SEQ ID NO：76)。该核酸分子编码肽p2。
(c)5’-
CAC AAG TGG GAG GCG GCC CAT GTG GCG GAG CAG TTG AGA GCC TA
C-3’(SEQ ID NO：77)。该核酸分子编码肽p30。
(d)5’-
CAC GCT GTC TCT GAC CAT GAA GCC ACC CTG AGG TGC TGG GCC CTG-
3’(SEQ ID NO：78)。该核酸分子编码肽p39。
(e)5’-
AGG TGC TGG GCC CTG AGC TTC TAC CCT GCG GAG ATC ACA CTG ACC
-3’(SEQ ID NO：79)。该核酸分子编码肽p40。
(f)5’-
AAG CCC CTC ACC CTG AGA TGG GAG CCG TCT TCC CAG CCC ACC ATC-
3’(SEQ ID NO：80)。该核酸分子编码肽p50。
(g)5’-
CTC ACC CTG AGA TGG GAG CCG TCT TCC CAG CCC ACC ATC CCC ATC-
3’(SEQ ID NO：81)。该核酸分子编码肽p51。
(h)5’
CCC ACC ATC CCC ATC GTG GGC ATC ATT GCT GGC CTG GTT CTC TTT-
3’(SEQ ID NO：82)。该核酸分子编码肽p52。
(i)5’-
ATC CCC ATC GTG GGC ATC ATT GCT GGC CTG GTT CTC TTT GGA GCT-
3’(SEQ ID NO：83)。该核酸分子编码肽p53。
(j)5’-
GGA ACC TTC CAG AAG TGG GCG GCT GTG GTG GTG CCT TCT GGA CAG
-3’(SEQ ID NO：84)。该核酸分子编码肽p45。
(k)5’-
TTC CAG AAG TGG GCG GCT GTG GTG GTG CCT TCT GGA CAG GAG CAG
AGA-3’(SEQ ID NO：85)。该核酸分子编码肽p46。
(l)5’-
AAG CCC CTC ACC CTG AGA TGG GAG CCG TCT TCC CAG CCC ACCATC
CCC ATC-3’(SEQ ID NO：86)。该核酸分子编码肽p50/51。
(m)5’-
CCC ACC ATC CCC ATC GTG GGC ATC ATT GCT GGC CTG GTT CTC TTT G
GA GCT-3’(SEQ ID NO：87)。该核酸分子编码肽p52/53。
(n)5’-
GGA ACC TTC CAG AAG TGG GCG GCT GTG GTG GTG CCT TCT GGA CAG
GAG CAG AGA-3’(SEQ ID NO：88)。该核酸分子编码肽p45/46。
(o)5-TCG GAC TGG CGC TTC CTC CGC GGG TAC CAC CAG TAC GCC
TAC GAC-3’(SEQ ID NO：89)。该核酸分子编码肽p20。
(p)5’-TGG CGC TTC CTC CGC GGG TAC CAC CAG TAC GCC TAC GAC
GGC AAG-3’(SEQ ID NO：90)。该核酸分子编码肽p21。
此外，优选的核酸分子编码肽类似物：
p39类似物1、p50/51类似物、p52/53类似物1、p40类似物、p45/P46类似物1或p45/46类似物2。因此，所用的优选的核酸分子包括基本上下述核苷酸序列：
(q)5’-
CAC CCC ATC TCT GAC CAT GAG GCC ACC CTG AGG TGC TGG GCC CTG-
3’(SEQ ID NO：91)。该核酸分子编码肽类似物-p39类似物1。
(r)5’-
AAG CCC CTC ACC CTG AGA TGG GAG CCT TCT TCC CAG CCC ACC ATC
CCC ATC-3’(SEQ ID NO：92)。该核酸分子编码肽类似物-p50/51类似物1。
(s)5’
CCC ACC ATC CCC ATC GTG GGC ATC ATT GCT GGC CTG GTT CTC CTT
GGA GCT-3’(SEQ ID NO：93)。该核酸分子编码肽类似物-p52/53类似物1。
(t)5’
AGG TGC TGG GCC CTG GGC TTC TAC CCT GCG GAG ATC ACA CTG ACC
-3’(SEQ ID NO：94)。该核酸分子编码肽类似物-p40类似物。
(u)5’-
GGA ACC TTC CAG AAG TGG GCG GCT GTG GTG GTG CCT TCT GGA GAG
GAG CAG AGA-3’(SEQ ID NO：95)。该核酸分子编码肽类似物-p45/46类似物1。
(v)5’-
GGA ACC TTC CAG AAG TGG GCG TCT GTG GTG GTG CCT TCT GGA CAG
GAG CAG AGA-3’(SEQ ID NO：96)。该核酸分子编码肽类似物-p45/46类似物2。
该核酸分子可以包括分离的或纯化的核酸分子。该核酸分子可以包括DNA序列。该核酸分子还可以包括能够调控和/或增强其表达的元件。该核酸分子可以被包含在适合的载体中以构成重组载体。所述载体可以是例如质粒、粘粒或噬菌体。
其他适合的载体对于本领域技术人员来说是显而易见的。这一方面的其他实例请参考Sambrook et al，2001，Molecular Cloning：alaboratory manual，3rd edition，Cold Harbour Laboratory Press。
这类重组载体可被用在所述用于使用核酸分子转化细胞的递送系统中。因此，本发明提供了一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含任何本文所公开的核酸。例如，本发明提供了一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子。
重组载体还可以包括其他功能元件。例如，可以将重组载体设计成会使得所述载体能在细胞内自主复制。在这种情况下，所述重组载体中可能会需要有能诱导核酸复制的元件。或者，可以将所述重组载体设计成会使得所述载体和重组核酸分子能整合进细胞基因组中。在这种情况下，需要有利于定向整合(例如通过同源重组)的核酸序列。重组载体还可以包括编码可在克隆过程中用作筛选标记的基因的DNA。所述重组载体还可以进一步包括启动子或调节子以便根据需要调控所述基因的表达。
所述核酸分子可以(但非必须)被引入到正在接受治疗的受试者的细胞DNA中。未分化的细胞可被稳定地转化，导致产生基因修饰过的子细胞(此时需要使用特定的转录因子或基因激活子调节所述受试者体内的表达)。或者，可以将所述递送系统设计成有利于对正在接受治疗的受试者体内的分化细胞进行不稳定或暂时的转化。在这种情况下，表达的调节会变得不那么重要，因为当该转化细胞死亡或停止表达所述蛋白时(理想地当所需治疗效果已经实现时)DNA分子的表达将会停止。
所述递送系统可为该受试者提供所述核酸分子，且不必将其合并到载体中。例如，所述核酸分子可以被掺入脂质体或病毒颗粒中。或者，可以利用适合的方法(例如直接内吞吸收)将“裸”核酸分子插入到受试者的细胞内。可以通过转染、感染、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击(ballistic bombardment)的方法用所述核酸分子转染所要治疗的受试者的细胞。例如，通过使用包被金颗粒、含有所述核酸分子的脂质体、病毒载体(例如腺病毒)的弹道转染以及通过直接施加所述核酸分子来产生直接核酸吸收(例如内吞)的方法来实现所述转移。
本领域技术人员已知用于鉴别相似序列的备选方法。本发明涉及使用一种核酸分子，所述核酸分子与一种编码来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子或其互补序列杂交。优选地，本发明涉及使用这样一种核酸分子，所述核酸分子与一种编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子或其互补序列杂交。例如，一种可在严格条件下与SEQ ID NO：3中所示序列或它们的互不序列杂交的序列将可以编码基本上类似的核苷酸序列。严格条件是指在大约45℃下使所述核苷酸与滤膜结合(filter-bound)的DNA或RNA在3x氯化钠或柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在大约20-65℃下用0.2x SSC/0.1％ SDS冲洗至少一次。
由于遗传密码的简并性，所以很明显的是，可以对任何核酸序列进行变化或改变以其功能性变体，同时基本上不会影响其所编码的蛋白的序列。适合的核苷酸变体为那些具有通过用不同密码子进行置换而改变的序列的核苷酸变体，所述不同的密码子在该序列中编码相同的氨基酸，因此未产生变化。其他适合的变体为那些具有同源核苷酸序列但是通过用不同密码子进行置换而改变了全部或部分序列，所述不同密码子编码侧链的生物物理学性质与其所置换的氨基酸类似的氨基酸，以产生保守性变化。例如，小的非极性、疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性、疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性、中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正电(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸、负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，应该理解哪些氨基酸可能会被具有类似生物物理学性质的氨基酸置换，并且技术人员将会知道编码这些氨基酸的核苷酸序列。也参考了上文中的表2。
疗法
本发明还涉及在疗法中使用本文所述的多肽、衍生物、类似物和核酸。具体而言，本发明提供了一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物，用作药剂。本发明还提供了一种本发明的多肽、衍生物或类似物的核酸分子，或者一种在严格条件下与编码本发明的多肽、衍生物或类似物的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子，用作药剂。本发明还提供了下述物质：
(a)至少一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物；
(b)至少一种编码(a)的多肽、衍生物或类似物的核酸分子；或
(c)至少一种在严格条件下与(b)的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子；
用于制备一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的药剂的用途。可以使用任何上文所述的多肽、衍生物、类似物和核酸分子。
本发明还提供了一种来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，用作药剂。本发明还提供了一种来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物用于制备一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的药剂的用途。本发明还提供了一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的受试者治疗有效量的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物。
因此，在一个最优选的实施方案中，提供了一种来源HLA-A2的α3结构域或跨膜结构域的多肽或者其衍生物或类似物，用作药剂。此外，在另一个最优选的实施方案中，提供了一种来源自HLA-A2的α3结构域或跨膜结构域的多肽或者其衍生物或类似物用于制备一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的药剂的用途。特别优选的是，所述药剂为用于治疗或预防同种异体移植物排斥。
应该理解的是，本发明所用的来源HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物还代表了能够利用多种技术来给药的良好药剂，所述技术包括编码这类分子的核酸序列的细胞表达。这类细胞表达方法特别适合于医疗用途，其中需要所述HLA-A2来源的肽或者其衍生物或类似物的治疗作用持续很长时间。因此，本发明还提供了一种编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子，用作药剂。
此外，本发明还提供了一种编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物用于制备一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的药剂的用途。优选地，所述药剂为用于治疗或预防同种异体移植物衰竭或排斥。
术语“同种异体致敏”是指发展出抗外源抗原的抗体，这会导致许多疾病病症。通常患有这类病症的患者需要反复进行输血。然而，同种异体致敏通常能够使得患者几乎不能接受输血，并且会危及生命。因此，特征为同种异体致敏的病症包括地中海贫血和输血。
已知HLA-A2是移植器官排斥中的一个重要因素，移植器官排斥是发明人特别感兴趣的一个医疗问题，因此发明人已经发现HLA-A2来源的肽或者其衍生物或类似物对于治疗或预防同种异体移植物排斥特别有用。
术语“同种异体移植物”是指这样一种移植过程，其中从一个个体(即供体)身上取出一种组织或器官并且置入另一个遗传上不相同的个体体内(即受体)。所述供体和受体均为相同物种的成员。术语“同种异体移植物”还可用于描述所述被抑制的组织或器官。
术语“组织”是指一组经过特化以进行类似的功能的类似的细胞，例如肌肉、神经、骨骼、软骨、皮肤或结缔组织。
术语“器官”是指含有经过组织化以实现身体特定功能的不同组织的身体结构，例如心脏、肺、脑、皮肤、肝脏等。
然而发明人不希望受限于任何假说，他们相信使用来源自HLA-A2或其他MHC I类HLA(例如HLA-B或HLA-C)的多肽或者其衍生物或类似物将会对移植结果产生有益作用，所述作用不仅是通过抑制抗-HLA抗体的形成而且是通过抑制同种异体移植物排斥的其他经认定途径来产生的。这种作用不仅通过直接抑制某些效应细胞的激活而且通过激活可抑制这些效应细胞的调控细胞来产生，所述效应细胞会损伤同种异体移植物或器官移植物。因此发明人相信，所述关于来源自HLA-A2或者其衍生物或类似物的反应模式的令人吃惊的发现表明，这类肽或类似物被用在一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏(例如输血)的病症的方法中。
发明人相信所述关于来源自HLA-A2或者其衍生物或类似物的反应模式的令人吃惊的发现还表明这类肽或其类似物可以被用在一种用于治疗或预防移植患者体内的同种异体移植物排斥的方法中，不仅当存在匹配HLA-A2的器官时而且存在于大多数移植病例中。这同样适用于来源自其他MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物。因此，特别优选的是该方法被用于治疗同种异体移植物排斥。
发明人相信对这类基于肽的表位的鉴定使得可以开发出基于肽的疗法，所述疗法包括给予受试者一种肽的混合物，所述混合物可以被用在许多具有不同MHC II类表位的个体体内。
因此，优选的是本发明的方法包括给予需要治疗的受试者治疗有效量的至少一种多肽或者其衍生物或类似物，并且优选许多来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物。来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物的结合物或混合物可以被给予所述受试者。可以给予任何上文所述多肽的结合物或混合物。
因此，特别优选的是本发明的方法包括给予需要治疗的受试者治疗有效量的至少一种多肽或者其衍生物或类似物，并且优选许多来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物。来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的结合物或混合物可以被给予所述受试者。
所述至少一种多肽、衍生物或类似物或者多种多肽、衍生物或类似物可以被给予致敏的患者，即已经产生抗-HLA抗体的患者。或者，所述至少一种多肽、衍生物或类似物或者其混合物可以被给予个体，然后进行移植或输血以便消除对HLA的致敏。考虑到脱敏时，技术人员可以预期到肽p39(SEQ ID NO：42)、p50/51(SEQ ID NO：57)和p52/53(SEQ IDNO：58)会有益于自身那些没有表达这些序列的个体，即表达了HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A30或HLA-A36并且随后接受了(或者之前已经接受了)表达HLA-A2、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A29、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74的不匹配移植物(或输血)的受试者。
因此，根据前文应该理解的是，优选的来源自HLA-A2的非多态性区域的多肽、其衍生物或类似物也可由许多其他HLA-A分子——而不仅仅由HLA-A2——通过作为不同HLA分子之间的潜在交叉作用的位点来加以表达。因此，令人惊奇地，发明人相信在本发明的方法中使用这类肽，特别是用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症(具体而言同种异体移植物排斥和同种异体抗体合成)的好处比单独使用HLA-A2抗原要多得多。因此，发明人相信他们的发现不仅涉及帮助抗体产生，还涉及自身移植物排斥的免疫机制，并且其涉及范围比目标HLA-A2要大得多，扩展至对一般移植抗原的应答。
因此，在另一个方面中，提供了一种同种异体抗原或者来源于其的多肽或者其衍生物或类似物用于制备一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的药剂的用途。优选地，所述药剂为用于治疗同种异体移植物排斥。优选地，所述同种异体抗原，或者来源于其的多肽或其衍生物或类似物可能独立地选自HLA-A2、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A29、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A24、HLA-A30、HLA-A36、HLA-A80、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A23，或者它们的组合。优选的来源自所述同种异体抗原在上文中有所讨论。
在所述受试者已经接受了同种异体移植物或移植物或输血之后，可以给予所述受试者治疗有效量的来源自MHC I类HLA(例如HLA-A2)的多肽或者其衍生物或类似物。然而，最优选的是先将其给予所述受试者，然后给予该受试者同种异体移植物或移植物或输血。因此，优选地，将所述药剂给予受试者，然后使其与抗原接触，例如在进行所列出的移植或输血时。因此，所述方法优选地包括给予疫苗或所谓的‘阴性疫苗’，所述疫苗包括治疗有效量的来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物。所述方法优选地还包括给予疫苗或所谓的‘阴性疫苗’，所述疫苗包括治疗有效量的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物。
因此，提供了一种包括来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物的疫苗。还提供了一种包括来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的疫苗。
发明人相信可以在大约1-6个月的过程中，通过约每周(但是可以是例如每天、每隔一天)使用越来越高剂量的所述‘阴性疫苗’进行治疗过程。所给予的多肽、衍生物或类似物的量的范围为约1μg-10mg。
应该理解的是，本发明为用于预防或治疗特征为同种异体致敏、同种异体移植物排斥或者输血后继发的同种异体免疫的病症。将来自供体受试者的移植组织或器官移植到受体受试者体内是通行的做法。因此，本发明扩展到治疗或预防任何组织(例如肌肉、神经、骨骼、骨髓、软骨、皮肤或结缔组织)或任何器官(例如心脏、肺、脑、皮肤、肝脏等)的衰竭或排斥或者输血后继发的同种异体免疫。
然而，发明人的研究着眼于患有终末期肾功能衰竭的患者。因此，特别优选的是所述药剂可以被用于治疗或预防肾移植的排斥，或者进行这类肾移植后继发的或进行输血前的同种异体免疫。此外，正在用本发明的方法进行治疗的受试者可能患有肾移植物排斥。因此，优选地是所述同种异体移植物或移植物包括肾或其一部分。
下述讨论设计单一疗法、组合疗法、给药时间、组合物、给药途径、释放装置，以及来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的剂量。然而，这也适用于来源自其他MHC I类HLA(例如HLA-B或HLA-C)的多肽、其衍生物或类似物，以及编码它们的核酸。
应该理解的是，所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码HLA-A2或其多肽、衍生物或类似物的核酸分子可以被用在单一疗法中(即单独使用来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码它们的核酸来预防和/或治疗同种异体移植物衰竭或排斥)。或者，来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码它们的核酸可以被用作添加剂(adjunct)，或者与用于治疗特征为同种异体致敏的病症(例如同种异体移植物排斥)或使用钙调神经磷酸酶抑制剂、TOR抑制剂或靶向淋巴细胞抗原的抗体预防同种异体致敏(例如常规免疫抑制)的已知方法组合使用。
在所述受试者已经接受了同种异体移植物或移植物之后，可以给予所述受试者治疗有效量的所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子。或者，可以预防性地给予受试者所述至少一种肽或其混合物，即减弱对HLA的应答。
然而发明人不希望受限于任何假说，他们相信如果所述减弱机制包括显性负相调节，那么这可能也会减弱对其他不匹配抗原的应答，例如当植入HLA-A2不匹配移植物时。因此，优选的是在所述受试者已经接受了同种异体移植物或移植物之前，给予所述受试者治疗有效量的所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子，即与疫苗接种类似。
发明人设想给予受试者至少一种，且优选多种来源自HLA-A2的肽或者其衍生物或类似物。他们相信所述或者每种肽、其衍生物或类似物可以被用于下调所述对同种异体抗原的应答，并且因此改善移植的结果和/或使得已经产生抗-HLA抗体的患者脱敏。
所述来源自HLA-A2的肽或者其衍生物或类似物，或者编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子可以被组合成具有许多不同形式的组合物，这主要取决于使用所述组合物的方式。
例如，所述组合物可以为粉末、片剂、胶囊、液体、软膏剂、乳膏、凝胶、水凝胶、气凝胶、喷雾、微团、透皮贴剂、脂质体或任何其他可以被给予需要治疗的受试者的适合形式。应该理解的是，所述本发明的组合物的载体应该可以被接受它的受试者良好地耐受，并且优选地使得所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子可以被递送到免疫系统中。所述本发明的组合物的载体应该可以被接受它的受试者良好地耐受，并且优选地使得所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子可以被递送到免疫系统中。
可以以多种方式使用本发明所用的包括来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子的组合物。例如，当所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子被包含在可以例如以片剂、胶囊或液体形式经口服摄入的组合物中时，可能需要口服给药。所述包括来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的组合物可以通过吸入(例如经鼻内)给药。组合物可以被配制为用于局部应用。例如，可以将软膏剂施加到皮肤上。
还可以将所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子掺入到缓释或延释装置中。这类装置可以，例如被插入到皮肤上或者置于皮肤之下，并且所述组合物可以被持续释放数周或则甚至数月。但是当需要使用本发明所用的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子进行长期治疗时并且通常需要频繁给药(例如至少每天注射)时，这类装置可能特别有利。
然而，在一个最优选的实施方案中，通过注射到血流中来将所述包括来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的组合物给予需要这种治疗的受试者。注射可以是静脉的(快速推注或滴注)或皮下的(快速推注或滴注)或真皮内的(快速推注或滴注)。
应该理解的是，所需的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的量可以通过其生物学活性和生物利用度来确定，所述生物学活性和生物利用度又取决于给药模式、所采用的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的物理化学性质，以及所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子是否可被用在单一疗法或组合疗法中。给药频率还将会受到上述因素的影响，并且具体地受到该正在接受治疗的受试者体内的所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的半衰期的影响。
所要给予的最佳剂量可以由本领域技术人员来决定，并且将会随着具体使用的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子、制品强度、给药模式和疾病状况的进展而变化。取决于正在接受治疗的具体受试者的其他因素将会导致需要改变剂量，包括受试者年龄、体重、性别、饮食和给药时间。
已知的方法——例如那些通常被制药工业所采用的(例如体内实验、临床试验等)——可以被用于确定本发明所用的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的具体剂型，以及精确的治疗方案(例如所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的每日剂量和给药频率)。
通常，可以是使用每千克体重0.001μg-100μg来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的每日剂量来预防和/或治疗同种异体移植物衰竭或排斥，每日剂量取决于所使用的来源自HLA-A2的具体多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子。更优选地，所述每日剂量为每千克体重0.01μg-10μg，并且最优选地为每千克体重0.01μg-1μg。
每日剂量可以为单次给药(例如每日注射一次)。或者，需要在一天中给予两次或多次所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子。作为一个实例，可以以0.07μg-7000μg(即假设体重为70kg)的每日两次(或多次，取决于病症的严重程度)剂量来给予来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子。接受治疗的患者可以在苏醒时服用第一剂量，然后在晚上或者在其后的3或4个小时的间隔时服用第二剂量(如果是两次剂量方案)。或者，可以使用缓释装置来为患者提供最佳剂量，而不必反复给药。
本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的本发明的多肽、衍生物或类似物或者本发明的核酸分子，以及任选地可药用载体。优选地，本发明提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子，以及任选地可药用载体。所述组合物可以包括上文所述多肽、衍生物、类似物或核酸中的一种或多种。
本发明还提供了一种用于制备药物组合物的方法，包括将治疗有效量的本发明的多肽、衍生物或类似物或者本发明的核酸分子与可药用载体相组合。优选地，本发明提供了一种用于制备药物组合物的方法，包括将治疗有效量的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物，或者编码来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的核酸分子与可药用载体相组合。
下述关于给药量、给药载体和给药途径的讨论涉及来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物。然而，这也适用于来源自其他MHC I类HLA(例如HLA-B或HLA-C)的多肽、其衍生物或类似物，以及编码它们的核酸。
所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的量可以为约0.01μg-约800μg，并且优选地为0.01mg-约500μg。优选的是，所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子的量为约0.01mg-约250mg，更优选约0.1mg-约60mg，并且最优选约0.1mg-约20mg。“治疗有效量”是指当将来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子给予受试者时可预防和/或治疗特征为同种异体致敏的病症(同种异体移植物衰竭或排斥)的上述物质的任何剂量。“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜，并且优选地是人。本文所述的“可药用载体”是指任何本领域普通技术人员已知的可用于配制药物组合物。在一个实施方案中，所述可药用载体可以是固体，并且所述组合物可以是粉末或片剂的形式。固体可药用载体可以包括一种或多种还可以作为调味剂、润滑剂、溶解剂、助悬剂、填充剂、助流剂、压缩助剂、粘合剂或片剂-崩解剂的物质；它还可以是一种封装材料。在粉末中，所述载体是一种细分散的固体，所述固体与细分散的来源自HLA-A2的活性多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子混合。在片剂中，将所述来源自HLA-A2的活性多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子与一种具有所必需的压缩性质的载体以适合的比例混合并且压缩成所需形状和大小。优选地，所述粉末和片剂含有最高达99％的所述来源自HLA-A2的活性多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子。适合的固体载体包括，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖类、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施方案中，所述药物载体可以是凝胶，并且所述组合物可以为霜剂等形式。
然而，在一个优选的实施方案中，所述药物载体为液体，并且所述药物组合物为溶液形式。液体载体可以用于制备溶液、悬液、乳液、糖浆、酏剂和压缩的组合物。可以将所述来源自HLA-A2的活性多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子溶解或悬浮到可药用的液体载体中，例如水、有机溶剂、两者的混合物或者可药用油或脂肪。所述液体载体可以包含其他适合的药物添加剂，例如溶解剂、乳化剂、缓冲液、防腐剂、甜味剂、调味剂、助悬剂、稠化剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服和非消化道给药的液体载体的适合实例包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇类(包括单羟基醇和多羟基醇，例如二醇)及它们的衍生物，以及油(例如分馏的椰子油和花生油)。对于非消化道给药，所述载体还可以为油酯，例如油酸乙酯和异丙基肉豆蔻酸酯。无菌液体载体可用在无菌液体形式的组合物中以进行非消化道给药。用于压缩组合物的液体载体可以为卤化烃或其他可药用推进剂。
无菌溶液或悬液形式的液体药物组合物可以通过例如肌内注射、鞘内注射、硬膜外注射、腹膜内注射、静脉注射，特别是皮下注射、脑内注射或脑室内注射来加以利用。可以将所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子制备成无菌固体组合物，所述组合物在给药时可以被溶于或悬浮于无菌水、盐水或其它适当的无菌注射介质中。载体意在包括必需的且惰性的粘合剂、助悬剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、染料和包衣。
所述来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子可以以无菌溶液或悬液形式经口服给药，所述无菌溶液或悬液含有其他溶质或助悬剂(例如，足够的盐水或葡萄糖以产生等渗溶液)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、山梨聚糖、单油酸酯、多山醇酯80(山梨糖醇的油酸酯和它的与环氧乙烷共聚的酸酐)等。
本发明所用的来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物或者核酸分子还可以以液体或固体组合物形式经口服给药。适合于口服给药的组合物包括固体形式，例如丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂和粉末；液体形式，例如溶液、糖浆、酏剂和悬液。用于非消化道给药的形式包括无菌溶液、乳液和悬液。
增加HLA活性的试剂
应该理解的是来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的治疗作用可能会受到某些试剂的“间接”调节，所述试剂可增加这类肽或类似物的活性。因此，本发明还提供了这类试剂的第一医疗用途。
因此，本发明还提供了一种能够增加来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的生物学活性的试剂，用作药剂。
能够增加来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的生物学活性的试剂可以通过许多方式来实现其作用。例如，这类试剂可能会增加来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的表达。可选地或附加地，这类试剂可能会延长来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物在生物系统中的半衰期，例如通过减少来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物的周转。由于它们的生物学活性增强，所以来源自HLA-A2的多肽或者其衍生物或类似物可被用作抗-同种异体移植物排斥的试剂。
体外方法
本发明还提供了一种刺激T细胞的体外方法，所述方法包括在可刺激所述T细胞的条件下使所述T细胞接触：
(a)一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物；
(b)一种编码(a)的多肽、衍生物或类似物的核酸分子；或
(c)一种在严格条件下与(b)的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子；
从而刺激所述T细胞。
在该方法中可以使用任何上文所述的多肽、衍生物、类似物和核酸。适合用于刺激T细胞的条件在本领域中是已知的。
本发明的方法具有多种用途。例如，可以在取自正在经历移植物慢性排斥的移植患者的T细胞样品进行所述方法。所述患者的T细胞对所述HLA来源多肽的阳性应答表明所述慢性排斥涉及免疫系统成员。所述患者的T细胞对所述HLA来源多肽的阴性应答表明所述慢性排斥是由于基于非免疫系统的机制，例如环孢菌素的中毒性肾损害。
在任何组合中，本文所述的所有性质(包括任何所附权利要求、摘要和附图)，和/或所公开的任何方法或工艺的所有步骤均可能会与上述任何方面结合，除了其中至少一些这类性质和/或步骤相互排斥的组合之外。
为了更好地理解本发明并且为了显示相同的实施方案如何生效，将会参考下述实施例。
实施例
概述
发明人认识到抗-HLA抗体的存在表明肾移植不当，并且移植术后会伴随同种异体移植物衰竭。此外，HLA特异性抗体的获得暗示在间接同种异体识别过程中存在T辅助细胞，并且该途径还会在并不依赖于同种异体抗体合成的排斥中起作用。因此，发明人系统地研究了对单个MHC I类分子HLA-A2的应答，所述HLA-A2在等待器官移植的致敏患者(即已经产生HLA-A2抗体的患者)体内是共同的靶抗原。
在实施例1和2中，发明人设计了一系列共60种重叠的15聚体肽，所述肽横跨了HLA*020101的一级序列。然而，使用F-moc技术仅可以合成53种肽(p1-p53)。然后利用ELISA研究了这53种肽对13种不同MHC I类分子的结合亲和力。发明人发现来源自HLA-A2分子上数个位置的肽会与MHC随机结合。
然后，使用所述与MHCII类结合的30种肽刺激取自40名有记载的移植患者的外周血单核细胞(PBMC)，所述患者具有已知的抗体致敏病史。利用γ-干扰素酶联免疫斑点法评估应答，并且在下文中总结了所述研究结果。
在实施例3中，发明人对所述一些来源自HLA-A2的15聚体肽的序列和其他HLA多肽中的序列进行了比较以寻找相关的其他序列。
实施例1
材料和方法
1)计算机辅助表位预测
为了使所要用直接MHC-肽结合测定法筛选的肽的数目最少并且使可能的目的区域的区别最大，采用了一种系统的方法，包括对所述HLA-A*0201分子(即HLA-A2)的基本氨基酸序列进行基于计算机的初步评估。将所述HLA-A2的DNA序列标记为SEQ ID NO：3并且将所述氨基酸序列标记为SEQ ID NO：1和2。
参考图1，示出了人I类组织相容性分子HLA-A2的胞外部分的三维结构示意图。β构象的伸展用宽箭头表示(从N末端指向C末端)。α螺旋区域以螺旋带形式示出。圆球对代表二硫桥。β-2-微球蛋白(β2m)的分子与α1和α2结构域的连接部分结合，并且仅通过非共价相互作用与α3结构域结合。未在图1中示出的是存在以非共价方式结合在α1和α2结构域的α螺旋之间的沟中的短肽。肽与α螺旋相邻部分的结合构成了可被CD8+T细胞识别的表位。HLA-A2的跨膜结构域和胞质结构域未示出，但是应该理解的是所述跨膜结构域从约第283位氨基酸残基开始向前延伸。
使用广泛应用的算法TEPITOPE(Sturniolo，T.，et al.，Generation of tissue-specific and promiscuous HLA liganddatabases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.Nat Biotechnol，1999.17(6)：p.555-61)实施对所述HLA-A2分子的一级氨基酸序列的分析。使用该程序来鉴定与先前鉴定并且表征的表位共享HLA结合基序的序列。然而，因为这类计算机辅助方法可能会遗漏那些没有形成标准基序的表位，发明人进行了额外的文献和数据库搜索以便鉴定出所有已经报道过的来源自HLA-A2分子的MHCII类结合序列。
2)可溶性分析
使用预测性的基于计算机的算法(例如EXPASY(www.expasy.org/))评估那些经预测认为会与MHCII类分子结合的序列的可溶性。发明人相信这类可溶性分析是物理结合测定法的一个重要前导(precursor)，因为它可以鉴定出任何含有重要的、天然加工的、名义上不可溶的MHC-结合核心基序。通常，可以通过加上各种在天然情况下存在于所述源蛋白中的侧翼残基来使得这类表位可溶。该方法避免了某些耗时且昂贵的肽合成，所述肽在MHC结合测定过程中不会产生数据，并且因此最终对临床干预几乎没有用处。
3)肽合成
设计了一系列共60种重叠的15聚体肽，所述肽的跨距长为HLA*020101的一级序列。然而，只能合成53种肽(p1-p53)。因此，利用标准的Fmoc化学方法生成了HCl盐形式的一系列共53种仅偏移2-5个残基的合成的重叠15聚体——对应于可溶的MHCII类结合基序——并且将其制成冻干成粉末(NeoMPS SA，Strasbourg，France)。将肽用10-4M HCl复原。
参考图2，示出了全部53种肽的详细情况，命名为p1-p53。图2示出了每种肽的位置、分子量和序列。
4)在体外与纯化的MHC分子结合的肽
所述肽-MHC结合测定法为一种竞争性测定法，其中将“查询”肽滴定到含有固定的纯化的MHC分子和已知浓度的生物素化的参照肽的孔中，已知所述肽会以高亲和力与所研究的分子结合。
用于研究的MHC分子包括：DRB1*0101(DR1)、DRB1*0301(DR3)、DRB1*0401(DR4)、DRB1*0701(DR7)、DRB1*1101(DR11)、DRB1*1301(DR13)、DRB1*1501(DR15)；DRB3*0101(DRB3)、HLA-DRB4*0101(DRB4)和HLA-DRB5*0101(DRB％)；HLA-DPA1*0103/DPB1*0401(DP401)和HLA-DPA1*0103/DPB1*0402(DP402)。这些都是在CEA-Saclay研究中心进行的，使用其实验室中成熟的用于分析其他抗原的技术(Texier，C，et al.，HLA-DR restricted peptide candidates for bee venomimmunotherapy.J Immunol，2000.164(6)：p.3177-84)。
将结合实验独立的随机重复三次以确认结果。将结果表达为：nmIC50；和与以已知的高亲和力与每种特定MHC等位基因结合的参照肽(也用所述测定法筛选)相比，每种肽的结合率。
认为结合率低于20的为高亲和力结合分子，结合率为21-100的那些为中等的结合分子。在先的数据表明重要的T细胞表位很少具有超出这些窗口的结合亲和力，但是存在例外。
参考图4，示出了所产生的结合研究数据。这些数据表明与50％结合浓度的对照肽相比，50％抑制浓度(IC50)的测试肽与所研究的MHCII类分子的比率。
5)体外功能分析-外周血单核细胞的免疫应答
上述研究鉴定出了各种各样的与至少一种MHCII类分子结合的肽，但是少数表现出随机结合。基于这些研究，用于进行进一步研究的肽的数目由53降至30。未对与MHCII类几乎没有或没有明显结合的23种肽——它们的结合亲和力与对照的结合亲和力的比例>100——进行进一步研究。进行该研究以便限制每名被研究患者所需的血量。
使用γ干扰素酶联免疫斑点法确定是否存在特异性抗任何给定肽的淋巴细胞，所述γ干扰素酶联免疫斑点法使用500,000个外周血单核细胞/孔，重复四次。简言之，外周血单核细胞(PBMC)是通过密度离心从肝素化的全血中分离出来的。将这些细胞冲洗并且重悬于完全培养基中(含有10％的AB血清)。将细胞与各种肽在96孔γ干扰素酶联免疫斑点板(Mabtech，Nacka Strand，Sweden)的100μl完全培养基中培养，肽的浓度为4μg和20μg/ml。利用酶联免疫斑点法评估产γ干扰素细胞的频率，如图7中所示的单个示例患者的。然后比较致敏和未致敏组中个体的肽特异性应答的频率和特异性。
6)招募用于研究的受试者
受试患者招募自伯明翰大学医院的肾移植候补名单。首先找到在伯明翰大学医院进行透析的患者，然后获得当地研究伦理委员会的批准书。排除目前正在接受免疫抑制或血红蛋白低于10g/dl的受试者。在已经获得完全知情同意的情况下，在进行常规静脉切开术时收集50ml静脉血。
通过中英格兰西输血服务免疫遗传实验室(West Midlands BloodTransfusion Service Immunogenetics Laboratory)的常规临床评估，可以获得每名受试者的所述利用标准分子技术确定的HLA类型。该实验室使用标准的基于流式细胞术的技术(包括在常规临床实践环境中使用单特异性珠)表征抗-HLA抗体的特异性，并且提供了关于各个受试者的抗体特异性的相关历史信息。
结果
发明人检查了下表中所总结的5组患者。
表3-患者组
使用标准的固相的基于流式细胞术的技术(‘Luminex’)确定存在抗体与否。每组中的分母表示所研究的患者的数目，分子为每组中对至少1种肽产生应答的患者的数目。
在组1中，有10名患者对肽p20/21产生应答。所述肽来源自HLA-A2的高度多态性区域。紧密重叠的肽来源自人B淋巴细胞HLA DR1，即已经证明它是‘天然加工的’和呈递的内源蛋白。还已经鉴定出在排斥A2阳性肾的患者体内含有这些序列的较大肽为DR15限制性表位。
在组1中：有10名患者对来源自α3和跨膜结构域的肽产生应答，所述结构域具有非常有限的多态性。这些肽中最常见的是p39(192-206)、p50/51(268-284)和p52/53(280-296)，但是少量的其他位点也会导致应答，包括p40(202-216)和p45/46(239-256)。先前并没有报道过这些肽是T细胞表位。在其中的两名患者中，所述α3/跨膜肽中的一些为自身表位，例如患者1为A68阳性，并且因此与HLA-A2共享p39、p52/p53的序列。
参考图5，示出了p39的序列。左侧的圆圈示出了其中所述同源区域的序列与HLA-A2共享的HLA类型，并且右侧的圆圈示出了那些其中所述同源区域与HLA-A2不同的HLA类型和所相差的两个氨基酸(193位的丙氨酸被置换为脯氨酸，且194位的缬氨酸被置换为异亮氨酸)。
参考图6，示出了p50和p51的序列。左侧的圆圈示出了其中所述同源区域的序列与HLA-A2共享的HLA类型，并且其他圆圈示出了那些其中所述同源区域与HLA-A2不同的HLA类型和所相差的氨基酸(对于A3、A11、A30、A36等，276位的脯氨酸被置换为亮氨酸)。
参考图7，示出了p52和p53的序列。左侧的圆圈示出了其中所述同源区域的序列与HLA-A2共享的HLA类型，并且其他圆圈示出了那些其中所述同源区域与HLA-A2不同的HLA类型和所相差的氨基酸(对于A1、A3、A11、A30、A36等，294位的苯丙氨酸被置换为亮氨酸)。
在组2中：没有应答。
在组3中：1/5的患者对来源自所述α3和跨膜结构域的肽产生应答。这再次符合下述假说，即非HLA-A2的其他HLA-A致敏的患者可能会对所共享的来源自所述α3和跨膜结构域的序列产生应答。
在组4中：1/6的患者产生应答。这是对p39、p50/51、p52/53和p11的自发应答。在1/6的‘未透析’的正常对照中也已经观察到这类应答。
在组4中：2/8的患者对p39或p50/51和p52/53产生应答。这些患者之前已经接受输血并且因此已经在T淋巴细胞水平被致敏，但未产生抗-HLA抗体。
示例患者
参考图8，示出了肽反应细胞/500,000PBMC的Elispot计数。肽浓度为20μg/ml。数据表明该个体——在先前妊娠和输血的背景下，她已产生高水平的抗-HLA抗体达将近10年之久——产生对p20、p39以及p52和p53的混合物的高频率应答。她的组织类型为A1、68；B37、44；C6、7；DR10、11。因此，该患者对高度多态性区域特别是对所述位于覆盖p20和21的第105-121位HLA-A2序列残基中的序列产生应答，发明人已证明所述序列会与MHC II类随机结合。她还对来源自HLA-A2的α3和跨膜区域的肽产生应答，它们的性质如上文所述。其实在她这种情况下，这些应答是自身反应性的，因为这些序列是与HLA-A68共享的。阳性对照应答是针对结核分枝杆菌的纯化蛋白衍生物(PPD)的，并且阴性对照是针对培养基的。
总结
总而言之，结果显示来源自α3和跨膜结构域的具有有限多态性的肽通常会诱发免疫应答。其特异性通常是同种异体的，但是有时是自身免疫的。对这些肽的应答与HLA-A2致敏之间的关联意味着它们与抗-HLA抗体形成有关。它们还会构成间接呈递的表位，所述表位可能会通过T细胞介导的损伤机制来驱动慢性排斥。随着这些肽被广泛地表达，它们是进行治疗性脱敏的理想靶标。此外，本文所公开的含有一个或多个氨基酸置换的肽类似物几乎可以完全代表HLA-A。
此外，本发明的每种优选的肽可以利用许多其他HLA-A分子来表达，而不仅仅是HLA-A2。因此，发明人相信在本发明的方法中使用这类肽——特别是用于治疗或预防同种异体移植物衰竭或排斥——和/或经由这种或其他同种异体致敏的方法进行的抗体合成的好处比单独使用HLA-A2抗原要多得多。因此，发明人相信他们的发现不仅涉及抗体产生，还涉及自身移植物衰竭或排斥的免疫机制，并且其涉及范围比目标HLA-A2要大得多，扩展至对一般移植抗原的应答。
然而，发明人不希望受限于任何假说，他们相信本发明的肽、衍生物或类似物的混合物或“鸡尾酒”可被用于下调对同种异体抗原的应答，并且因此改善移植的结果和/或允许脱敏已经产生抗-HLA抗体的患者。本发明的新颖性不仅在于限定了HLA-A2的准确肽序列(即表位)，还在于所述令人吃惊的发现，即这些序列可能是‘公共的’；目前为止该术语仅适用于B细胞表位，因为T细胞尚无法识别它们。因此，这一令人吃惊的发现使得可以使用含有有限数量的肽的混合物或鸡尾酒，所述肽具有潜在地广泛疗效。
实施例2
材料和方法
肽的设计
设计60种重叠肽——15或16个氨基酸长——以便给出HLA-A*020101对假定T细胞表位的最佳覆盖范围，使用程序Tepitope(33)。使用www.expasy.org的程序预测肽的可溶性。使用如前所述的Fmoc化学方法合成肽(NeoMPS，Strasbourg，France)，但是所设计的这些肽中仅可以合成53种。对照肽的生物素化是通过与所述分子NH2末端的生物素基-6-氨基己酸(Fluka Chimie，St.Quentin Fallavier，France)反应来实现的。所有的肽均是通过在C18Vydac柱上利用反相HPLC纯化的，并且它们的质量是利用电喷雾质谱和分析HPLC来加以评估的。
HLA-DR分子的纯化
如前文所述(Texier et al，J Immunol 2000；164(6)：3177-84)，HLA-DR分子是通过使用单克隆抗-DR抗体L-243的亲和层析从HLA-纯合EBV细胞中纯化出来的，所述单克隆抗-DR抗体L-243与蛋白A-琼脂糖CL4B凝胶偶联(Amersham Pharmacia Biotech，Orsay，France)。
HLA-DR肽结合测定
使用如前所述的竞争性测定法(Texier et al.，Eur J Immunol2001；31(6)：1837-46)测定肽与不同HLA-DR分子的结合。使用生物素化的对照肽(参见图9)，所述肽是所研究的MHC II类分子的良好结合分子，并且使用纯化且固定的MHC II类测试用所述结合测定法滴定的肽。最大结合通过在不存在竞争剂的情况下将所述生物素化的肽与MHCII类分子共同孵育来确定的。将数据表达为可防止所标记的肽的50％结合(IC50)的肽浓度。认为小于20的对照肽与测定肽的IC50比为高亲和力结合，并且20-100为中等亲和力。
研究人群
该研究是在南伯明翰研究道德委员会(South Birmingham researchethics committee)的许可下进行的。所有的受试者都是在伯明翰大学医院或里兹的圣詹姆士医院进行透析的。血液样品是在进行常规静脉切开术时从透析患者身上收集的。HLA基因型是在英国伯明翰国家血液服务实验室使用标准分子技术确定的——由此可以获得每名受试者的同种异体抗体形成的历史——并且是利用标准生物毒性、流式细胞术和固相测定进行筛选的。
排除患有贫血的患者或者在研究的3个月内接受了免疫抑制药物的患者。根据组织类型和抗-HLA抗体合成的历史将受试者分为5组(参见表4)。
表4-患者组
组1 HLA-A2阴性且具有抗HLA-A2抗体
组2 HLA-A2阴性且具有抗非-A2HLA抗体
组3 HLA-A2阴性且不具有抗HLA抗体形成的历史
组4 HLA-A2阳性且具有抗非-A2HLA抗体
组5 HLA-A2阳性不具有抗HLA抗体形成的历史
酶联免疫吸收斑点测定
PBMC是在使用前利用Ficoll密度梯度离心前从外周血中分离出来的。活细胞是利用台盼蓝拒染法计数的按照生产商的说明书(Mabtech，Nacka Strand，Sweden)使用γ-干扰素斑点测定法。将总计5 x 105个PBMC加入到每个孔中，终体积为100μl的‘完全培养基’、95％ RPMI1640培养基(Sigma，Poole，UK)/5％人AB血清(PAA laboratories，Somerset，UK)、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(Sigma)，以及终浓度为4μgml-1或20μgml-1的肽。单独使用肽，或者成对使用一些序列偏移2个氨基酸的肽。
阴性对照孔仅含有应答PBMC的培养基。阳性对照孔含有终浓度为10μgml-1的PPD(SSI，Copenhagen，Denmark)、1μgml-1的破伤风类毒素(Calbiochem，Merck Biosciences，UKL)或者近来由所述Elispot测定的制造商提供的阳性对照(基于抗-CD3)。将所述PBMC在37℃下在5％的CO2培养48小时，然后弃去并且将该板用PBS清洗6次。然后，将板在室温下用一步检测试剂(碱性磷酸酶-缀合的检测单克隆抗体7-B6-1，通过用过滤的含有0.5％胎牛血清(Sigma)的PBS稀释至1：200制备的)孵育。然后将其弃去并且将板用PBS清洗5次。加入生产商提供的过滤待用的产色性碱性磷酸酶底物(氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP/NBT-plus))至体积为100μl/孔。使该板继续反应，并且在出现斑点时终止反应。将板用大量自来水清洗，然后在黑暗中空气干燥至少12小时，单后进行分析。然后使用AID Elispot板读数器(Strassberg，Germany)对每个孔中的斑点数目进行计数。将对测试肽的阳性应答定义为利用ANOVA法算出每个孔中斑点的数目明显高于对照。
使用抗-MHC II类抗体抑制间接的同种异体免疫应答
通过将抗MHC II类单克隆抗体(Tu39，Becton Dickinson，Oxford，United Kingdom)和抗-DR单克隆抗体(L243，Becton Dickinson)的混合物加入到细胞培养物中来研究对肽的MHC限制性应答。
利用CFSE评估增殖
在37℃下以106细胞/ml的浓度将PBMC重悬到温RPMI中，在所述RPMI中加入CFSE至终浓度为10μM。将其在37℃下在5％CO2中培养且间歇地搅拌10分钟，加入AB血清(Sigma)以终止标记，然后将细胞清洗两次。在不存在或存在终浓度为4μgml-1或20μgml-1的测试肽或10μgml-1的PPD的情况下，将细胞以2.5x105细胞/ml的浓度重悬到96孔圆底培养板的200μl完全培养基中，然后在37℃下在5％CO2中培养10天。将细胞从3个或多个孔中回收出来，清洗2次并且用抗CD4(SK3-PerCP，Becton Dickinson)或CD8(SK1-PerCP，BectonDickinson)抗体或者同种型对照(IgG1-PerCP，Becton Dickinson)染色。通过使用Winmdi 2.8软件(Scripps Research)的FACS Calibur流式细胞仪(Becton Dickinson)对样本进行分析，获得总计50,000个活细胞的信息。
结果
肽结合研究证实了与HLA-DR随机结合的多个区域。
设计了总计60种跨距长为HLA-A2的15聚体肽并且制备了53种。其他7种肽——多数来源自所述跨膜区域——是不可溶的并且因此无法被令人满意地合成出来。肽与HLA-DR的亲和力在图9中示出。
数据表明几种肽可与许多HLA-DR随机结合。这些包括对应于在先报道的来源自实验的序列的肽20(105-119)、紧密重叠肽21(107-121)和肽7(31-45)，在所述实验中肽来源自MHC II类。显然大量来源自HLA-A2的不同表位会与具有不同特异性的MHC II类结合(图9)。这特别值得注意，因为在自身MHC II类环境中呈递的自身来源的MHC肽的复合表位是一种可用于定义自身的可靠方法。
肽20和21还对应于可被DR15 T细胞克隆识别的表位(92-120)，所述DR15 T细胞是由具有衰竭的HLA-A2不匹配肾移植物的受体产生的。
根据所述关于与MHC II类以高或中度亲和力结合的较常见的发现，利用功能实验进一步评估30种肽。以两个肽的混合物的形式使用少数偏移两个氨基酸的肽，以便优化PBMC的利用。
应答于来源自HLA-A2的肽的γ-干扰素的产生
所招募的受试者的详情在图10中示出。与(不匹配)的健康对照337(40-885)/106PBMC相比，在已经产生了同种异体抗体的透析患者体内应答于PPD：143(15-422)/106PBMC而产生γ-干扰素的细胞的数目明显较低(p＝0.007)。在这些受试者中培养基对照的变化范围为0-9/106PBMC，并且对肽的最大应答为122/106PBMC。
利用γ-干扰素elispot估算出的所述对至少一种肽产生应答的患者的数目在表5中示出。示出了每组患者组中所述对至少一种HLA-A2来源肽产生应答的患者的数目。产生抗-HLA-A2抗体的患者可能明显多于对HLA-A2来源肽产生间接应答的其他患者。
表5-所述5组中每组结果的概述
Figure A200780024777D00581
在大多数患者体内，使用浓度为20μgml-1的肽时应答细胞数目最高，但是少数肽的最佳浓度为4μgml-1。在图1中示出了每个个体对20gml-1的肽的应答。
在受试者组1中，14/18的患者会对至少一种来源自HLA-A2的肽产生应答，如图1a中所示。组1中产生应答的患者的数目在统计学上明显高于其他组(p<0.0001)(尽管单独与组2相比，根据Fisher exact检验，差异没有达到显著性p＝0.08)。对HLA-A2的间接同种异体免疫应答与特异性抗HLA-A2抗体的形成之间的关联符合同种异体抗体形成的动物模型(Lovegrove et al，J Immunol 2001；167(8)：4338-44)。
较出乎预期的发现是这样一个观察结果，即尽管有12名‘组1’受试者对来源自α1和α2超变区的肽(最常见的是p20或p21)产生应答，但是这些受试者中有8名受试者还会对其他来源自α3和早跨膜区的肽产生应答；而且还有两名受试者会单独对这些产生应答。据我们所知，在人或动物研究中尚未有关于对来源自这些区域的肽的应答的报道。这些序列具有非常有限的多态性，它们可由表6中所示的各种等位基因所表达。
表6-对在p39、40、50、51、52和53的区域中与HLA-A2共享序列的HLA类型的说明
此外，3名‘组1’患者会对来源自α3结构域的肽产生显著应答，所述肽为HLA-A2与自身HLA-A68(患者1.1会对p39和p52/53产生应答)之间所共享的、HLA-A2与自身HLA-A33(患者1.10会对p52/53产生应答)之间所共享的或者HLA-A2与自身HLA-A32(患者1.17会对p39和p52/53产生应答)之间所共享的。
在受试者‘组2’中，3名患者对许多HLA-A2来源肽产生应答(结果未示出)。例如，受试者2.1对许多不同HLA-A中存在的肽p30、p40、p45/46、p50/51和p52/53(表5)产生应答，包括超变区肽p30。在受试者2.2和2.3体内观察到与同时对超变区、α3区和跨膜区产生的应答类似的模式。这些肽对于HLA-A2来说不是唯一的，所以该发现仍然符合抗体产生的历史。在受试者2.2体内，对与自身HLA-A68共享的序列p39和p52/53产生应答。
在‘组3’中，3名受试者会对HLA-A2来源的肽产生显著应答。受试者3.3对p39产生应答、受试者3.1对p1/2和p39产生应答并且受试者3.7对p19和p52/53产生应答。尽管这些患者没有产生在现有或历史血清中可检测的抗-HLA抗体，所有患者均经历过多次输血并且因此所有患者均可被这些肽所初免而不会产生体液性应答。在患者‘组4’中，患者4.9——他在测试前17个月时由于Banff III排斥而迅速失去了肾移植物(A3，11)——会对p39、p50/51、p52/53以及p20产生自身免疫应答，所述p20对HLA-A2来说是独特的。‘组5’的患者5.1也会对肽p39、p50/51和p52/53产生自身免疫应答。还测试了一个具有15名正常对照的组(命名为组6)，所述正常对照不具有已知的在先致敏事件。一名雄性(6.3)患者对HLA-A2来源的肽(包括p39、p50/51和p52/53)产生免疫应答。该个体为HLA-A32阳性，因此这些应答为自身免疫的。没有其他的正常对照产生任何可检测的应答。
应答于HLA-A2肽的γ-干扰素的产生会受到抗MHC II类抗体的抑制
所述应答的II类限制是根据3名个体体内抗MHC II类抗体对干扰素产生的抑制推断得出的。代表性实验在图11中示出。
应答于HLA-A2肽所产生的CD4+T细胞增殖
研究了‘正常对照’体内的增殖与γ-干扰素产生之间的对应性：利用elispot估算的对肽p39和p52/53产生应答的6.3。如图12中所示，在存在这些肽且不存在对照肽的情况下存在CD4+细胞的增殖，所述对照肽不会刺激干扰素产生。
讨论
在各种移植的实验模型中，间接同种异体识别对于排斥的贡献是公知的(例如Benichou et al，J Exp Med 1992；175(1)：305-8)。在临床研究中，已经将间接同种异体识别与对肾、心脏和肺的慢性排斥关联起来。这些临床研究中所用的抗原包括：冻融裂解的细胞、跨距为HLA-DR的β1结构域的肽和来源自I类HLA的α1结构域的肽。所述间接同种异体识别已经可以利用elispot通过IL2产生、细胞增殖(在原代或继代培养物中)或细胞因子的产生来加以检测。
在实验和临床研究中，经常会有报道称存在单个的‘免疫显性’表位，但是这些发现可以通过实验设计来确定，例如在体外使用继代培养物来检测T淋巴细胞初步扩增之后的应答。事实上，许多表位均可以在移植后的不同时间点时使用上述方法来加以检测。此外，在移植的动物模型中，显然可能会识别出除‘增殖性免疫显性’表位之外的许多表位；并且这些应答可能包括‘自隐性的’。
使用elispot技术可以检测出以较低频率存在于原代培养物中的抗原特异性T淋巴细胞。它使得我们可以对肾移植候补名单上的患者体内的间接同种异体识别进行评估。具体而言，我们分析了患者的免疫应答，所述患者产生了具有已知的抗HLA-A2特异性的同种异体抗体。我们所观察到的应答频率与通过干扰素γ-elispot估算的在肾移植受体体内所观察到的应答频率一致，所述受体是使用来源自供体HLA-DR的20聚体肽刺激的。这些频率与下述频率具有相同的数量级，所述频率为利用有限稀释分析DNA合成估算的由供体PBMC溶胞产物刺激的肾移植受体体内的频率以及利用有限稀释DNA合成估算的由一种或多种α1结构域肽(来源自A1、A2、B8和B44)刺激的患有闭塞性细支气管炎的肺移植受体体内的频率(SivaSai et al，Transplantation 1999；67(8)：1094-8)。在Sivasai及其同事的报道中，使用了来源自HLA-A2的α1结构域的25聚体肽：60-84，但是我们仅在一名患者体内观察到了对该区域的应答。
我们的结果证明尽管与文献中所预计的一样，对超变区肽的应答较常见，但是却意外地发现了对来源自α3和跨膜区域的肽的应答。如表6中所示，诸如p39、p40、p50/51和p52/53的肽序列广泛地存在于HLA-A中，并且那些其中不存在上述序列的分子中通常存在包括了大多数其他类型的单或双氨基酸多态性。因此上述肽可以被描述成‘公共T细胞表位’，其含义是与一种HLA分子接触可以导致会对许多其他HLA-A家族成员产生应答的T淋巴细胞的初免，或者反之亦然。由于这些表位与那些可被抗体识别的表位不同，所以这是致敏患者体内同种异体移植物存活率下降的一种潜在机制，不考虑对供体特异性抗体的检测。类似地，这表明存在这样一种机制，即输血可以籍此影响记忆抗体应答，不考虑是否存在识别的B细胞表位。
由于HLA-A2中被标记为‘公共T细胞表位’的序列仅具有非常有限的多态性，所以部分同种异体应答可能会与自身肽交叉反应，Benichou及其同事已经报道了小鼠体内对MHC I类肽的免疫应答(Tamet al，J Immunol 1996；156(10)：3765-71)；目前正在研究这种可能性。事实上，许多图2中所述的应答是自身免疫性的，因为所述可针对其产生应答的肽的序列为HLA-A2与自身之间共享的。患者1.1、1.10和1.17对此进行了举例说明。这与Lovegrove及其同事所观察到的大鼠模型中的对隐性自身表位的应答类似，所述大鼠模型为与同种异体抗原形成有关的排斥的模型(Lovegrove et al，J Immunol 2001；167(8)：4338-44)。
‘公共T细胞表位’的发现还与输血效应机制有关：在大范围使用钙调神经磷酸酶抑制剂之前通常会观察到预输血有益于肾移植物存活。输血效应实验模型证实了对特异性针对间接呈递的同种异体抗原的调节T细胞的诱导(Kishimoto et al，J Am Soc Nephrol 2004；15(9)：2423-8)。尽管通常报道供体抗原特异性耐受，但是现在存在这样的模型——试图模拟临床情况——其中随机输血会诱导抵御排斥的调控细胞(Bushell et al，Transplantation 2003；76(3)：449-55)同时显然不会对免疫应答进行非特异性抑制(Bushell et al，J Immunol 2005；174(6)：3290)。
在人类中，所述输血效应要求血液供体和受体之间共享至少一种HLA-DR和较小量的输注以产生最大的益处。这没有考虑受体可能遇见的各种同种异体抗原。这可以通过自身限制性调控细胞的诱导来加以说明，特异性针对在许多供体中很常见的同种异体表位。上文所述的‘公共T细胞表位’不必一定来源自MHC，此时它们也具有必需用于说明许多现有证据的性质。
许多来源自HLA-A2的肽表位的第二性质为它们在一定程度上与MHCII类随机结合，并且相应地在较高比例的致敏患者体内诱导应答。HLA-A2独特表位和‘公共T细胞表位’均具有这种性质。这部分地使得我们可以从仅对55名未就HLA类型进行筛选的受试者进行的研究中得出结论。虽然与这类肽在脱敏方案中的潜在应用相比，所述含义要广泛得多。
人们对调节同种异体抗原来源肽导致的排斥一直有浓厚的兴趣。上述作用通常是抗原特异性的，所述作用如果被转换到临床中则会限制这类方法的有效性。因此，那些已经激发起浓厚兴趣的HLA来源肽会对不依赖于常规的TCR基抗原识别的途径产生影响。这与许多关于肽诱导的耐受的动物模型不同，其中通过诱导调控T细胞证明了抗原特异性。来源自α3和跨膜结构域的表位所表现出的性质——公共的且随机的——可鉴定出理想的可用于探索移植的肽免疫疗法的候选药剂。例如，已经报道了在使用肽脱敏方法治疗过的过敏患者体内存在对调控T细胞活性的诱导。
总而言之，对来源自MHC I类的α3和跨膜区域的间接同种异体识别的鉴定对于同种异体免疫应答、其调节和抗原特异性疗法的开发具有重要的意义。
实施例3
发明人将实施例1和2中所鉴定的一些15聚体同种异体表位的序列与其他HLA多肽中的对应序列进行了比较。由此发明人鉴定了其他的同种异体表位。结果在图13-16中示出。
序列表
<110>伯明翰大学
<120>HLA肽疗法
<130>WO73856PWO
<160>96
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>365
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
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Claims (42)

1.一种多肽或者其衍生物或类似物，所述多肽由不足30个来源自主要组织相容性复合物(MHC)I类人白细胞抗原(HLA)的α3结构域和/或跨膜结构域的连续氨基酸构成。
2.权利要求1的多肽、衍生物或类似物，其中所述多肽由不足20个或约15个来源自MHC I类HLA的α3结构域和/或跨膜结构域的连续氨基酸构成。
3.权利要求1或2的多肽、衍生物或类似物，其中所述衍生物或类似物与MHC II类HLA结合并激活特异性针对所述多肽的T细胞。
4.前述权利要求任一项的多肽、衍生物或类似物，其中所述衍生物或类似物与所述多肽中的至少9个连续氨基酸具有超过65％的序列同一性。
5.前述权利要求任一项的多肽、衍生物或类似物，其中所述HLA为HLA-A、HLA-B或HLA-C。
6.权利要求5的多肽、衍生物或类似物，其中所述HLA为HLA-A2。7.权利要求6的多肽、衍生物或类似物，其中所述多肽由不足30个来源自SEQ ID NO：2的残基183-274和/或残基275-314的连续氨基酸构成。
8.前述权利要求任一项的多肽、衍生物或类似物，其中所述多肽由SEQID NO：42、43、48、49和53至74的任一序列构成。
9.一种编码权利要求1至8任一项所述的多肽、衍生物或类似物的核酸分子。
10.权利要求9的核酸分子，其中所述核酸分子包括SEQ ID NO：78至88和91至96的任一序列。
11.一种核酸分子，其中所述核酸分子在严格条件下与权利要求9或10所述的核酸分子或其互补序列杂交。
12.一种重组载体，含有权利要求9至11任一项所述的核酸分子。
13.权利要求12的重组载体，其中所述载体为质粒、粘粒或噬菌体。
14.一种宿主细胞，包含权利要求13所述的重组载体。
15.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1至8任一项所述的多肽、衍生物或类似物或者权利要求9至11任一项所述的核酸分子，以及任选地包括可药用载体。
16.一种用于制备药物组合物的方法，包括将治疗有效量的权利要求1至8任一项所述的多肽、衍生物或类似物或者权利要求9至11任一项所述的核酸分子与可药用载体相组合。
17.一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物，用作药剂。
18.权利要求17的多肽、衍生物或类似物，其中所述衍生物或类似物与MHC II类HLA结合并激活特异性针对所述来源自该HLA的多肽的T细胞。
19.权利要求17或18的多肽、衍生物或类似物，其中所述衍生物或类似物与所述来源自该HLA的多肽具有超过65％的序列同一性。
20.权利要求17-19任一项的多肽、衍生物或类似物，其中所述HLA为HLA-A、HLA-B或HLA-C。
21.权利要求20的多肽、衍生物或类似物，其中所述HLA-A为HLA-A2。
22.权利要求17-21任一项的多肽、衍生物或类似物，其中所述来源自该HLA的多肽包括不足30个该HLA的连续氨基酸。
23.权利要求22的多肽、衍生物或类似物，其中所述不足30个该HLA的连续氨基酸来源自该HLA的α1结构域或α2结构域。
24.权利要求23的多肽、衍生物或类似物，其中所述来源自该HLA的多肽包括SEQ ID NO：4、5、23、24和33的任一氨基酸序列。
25.权利要求22的多肽、衍生物或类似物，其中所述不足30个该HLA的连续氨基酸来源自该HLA的α3结构域或跨膜结构域。
26.权利要求25的多肽、衍生物或类似物，其中所述衍生物或类似物包括SEQ ID NO：42、43、48、49和53至74的任一氨基酸序列。
27.权利要求17-26任一项的多肽、衍生物或类似物，其中所述多肽、衍生物或类似物如权利要求1至8任一项所限定。
28.一种编码权利要求17-27任一项所限定的多肽、衍生物或类似物的核酸分子，或者一种在严格条件下与编码权利要求17-27任一项所限定的多肽、衍生物或类似物的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子，用作药剂。
29.权利要求28的核酸分子，其中所述核酸分子如权利要求9至11任一项所限定。
30.下述物质：
(a)至少一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物；
(b)至少一种编码(a)的多肽、衍生物或类似物的核酸分子；或
(c)至少一种在严格条件下与(b)的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子；
用于制备一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的药剂的用途。
31.权利要求30的用途，其中所述衍生物或类似物与MHC II类HLA结合并激活带有特异性针对所述来源自该HLA的多肽的受体的T细胞。
32.权利要求30或31的用途，其中所述衍生物或类似物与所述来源自该HLA的多肽具有超过65％的序列同一性。
33.权利要求30至32任一项的用途，其中所述HLA为HLA-A、HLA-B或HLA-C。
34.权利要求33的用途，其中所述HLA-A为HLA-A2。
35.权利要求30至34任一项的用途，其中所述来源自该HLA的多肽包括不足30个该HLA的连续氨基酸。
36.权利要求35的用途，其中所述不足30个该HLA的连续氨基酸来源自该HLA的α1结构域或α2结构域。
37.权利要求36的用途，其中所述衍生自该HLA的多肽包括SEQ IDNO：4、5、23、24和33的任一氨基酸序列。
38.权利要求35的用途，其中所述不足30个该HLA的连续氨基酸来源自该HLA的α3结构域或跨膜结构域。
39.权利要求38的用途，其中所述衍生物或类似物包括SEQ ID NO：X至Y的任一氨基酸序列。
40.权利要求30至38任一项的用途，其中所述多肽、衍生物或类似物如权利要求1至8任一项所限定，或者所述核酸分子如权利要求9至11任一项所限定。
41.权利要求30至40任一项的用途，其中所述药剂为用于治疗或预防同种异体移植物排斥。
42.一种用于治疗或预防特征为同种异体致敏的病症的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的受试者治疗有效量的：
(a)至少一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物；
(b)至少一种编码(a)的多肽、衍生物或类似物的核酸分子；或
(c)至少一种在严格条件下与(b)的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子。
43.一种刺激T细胞的体外方法，所述方法包括在可刺激所述T细胞的条件下使所述T细胞接触：
(a)一种来源自MHC I类HLA的多肽或者其衍生物或类似物；
(b)一种编码(a)的多肽、衍生物或类似物的核酸分子；或
(c)一种在严格条件下与(b)的核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子；
从而刺激所述T细胞。
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