CN101464265A

CN101464265A - 二氧化碳诊断/测定试剂盒及二氧化碳的浓度测定方法

Info

Publication number: CN101464265A
Application number: CNA2007101914185A
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2007-12-19
Filing date: 2007-12-19
Publication date: 2009-06-24

Abstract

本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的二氧化碳诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定二氧化碳浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、亚铁细胞色素b1、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出二氧化碳的浓度大小。

Description

二氧化碳诊断/测定试剂盒及二氧化碳的浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种二氧化碳诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定二氧化碳浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

血液内二氧化碳的含量对人体内酸碱平衡的调节起着重要的作用。血液pH的恒定是维持生命活动必不可少的条件，血浆中的多种缓冲系统中以碳酸氢盐缓冲系统最为重要，直接影响血液的pH。

血液内二氧化碳的含量变化主要反映代谢性酸碱平衡紊乱。单纯代谢性酸或碱中毒时，血液碳酸氢根[HCO₃ ^-]下降或升高，总二氧化碳也随之下降或升高。而单纯呼吸性酸或碱中毒时，血液碳酸氢根升高或下降。

总二氧化碳和碳酸氢根的测定方法较可分为直接测定和间接推算两类。直接测定主要有量气法、量压法、滴定法、比色法、Conway微量扩散法、流动注射气体扩散法等。间接推算是利用血气分析仪测得的PH与PCO₂，根据H-H方程的变换形式：

HCO₃ ^-(m mol/L)＝0.03×PCO₂(mm Hg)×antilog(PH-p ka)或HCO₃ ^-(m mol/L)＝0.225×PCO₂(k Pa)×antilog(PH-p Ka)计算获得。

式中：PH为37℃时测得值，p ka在37℃为6.10。

目前，以间接推算法应用较普遍，由血液分析仪的微处理计算机并与血气分析结果一起报告，准确性基本可以符合临床要求。

直接测定法以滴定法应用最广泛，但由于受多种因素影响，测定误差较大。

酶法测定适合自动化分析，结果可靠，应当是很有前途的测定方法，但目前尚有待深入研究。

检索中国专利发现，申请号为96190276.0、申请日为1996.02.06的发明专利申请公开了一种用来导出病人血液中气体含量的非侵入性的系统和方法。该系统相应于体积测量呼气中的二氧化碳浓度。然后处理该数据导出动脉血中二氧化碳气体水平。若数据为时间域，处理可将时间域数据转换成体积域。该方法也经迭代评估了多个变量的显著性，所得的关系可供快速和准确地对健康人和患肺病病人进行血中气体含量的测定。近年来，申请号为02282386.7、申请日为2002.10.29的实用新型专利公开了一种医用的血液碳酸氢根测定仪，主要由操作面板、进样检测机构、定滴加液机构、搅拌机构和以单片机为主控元件的电器控制部分组成。其操作面板包括有手动按键、输入键盘和显示屏；进样检测机构由沿圆周均布样本孔且在孔内放置样本瓶的样本转盘和竖直装配在转盘下面的驱动电机及对应于检测位样本孔设置的光电检测器组成；定滴加液机构由配置电机的微量泵和设置于样本孔上方的定滴头及配置在定滴头滴液口处的计滴器组成；搅拌机构由设置在样本转盘下方相应位置的搅拌电机和装配在搅拌电机轴上的磁盘及放置于样本瓶内的搅拌棒组成。

以上专利均与酶法测定无关，这从一个侧面说明，国内此方面的实验研究十分缺乏。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定二氧化碳浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的二氧化碳诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行二氧化碳浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明二氧化碳浓度测定方法原理如下：

二氧化碳+亚铁细胞色素b1 甲酸脱氢酶甲酸+

高铁细胞色素b1

甲酸+辅酶甲酸脱氢酶二氧化碳+还原型辅酶

这种方法应用二个特异性不同的甲酸脱氢酶：甲酸脱氢酶(1)(formatedehydrogenase；EC 1.2.2.1；EC 1.2.2.3)酶(偶)联甲酸脱氢酶(2)(formatedehydrogenase；EC 1.2.1.2；EC 1.2.1.43)酶促反应连续监测法甲酸脱氢酶(1)(formate dehydrogenase；EC 1.2.2.1；EC 1.2.2.3)作为作用酶，功能为将二氧化碳酶解产生甲酸。甲酸脱氢酶(2)(formate dehydrogenase；EC 1.2.1.2；EC1.2.1.43)作为循环酶：甲酸脱氢酶(2)的酶促作用使甲酸再次变回二氧化碳，使二氧化碳不断地被重复循环利用。甲酸脱氢酶(2)(formate dehydrogenase；EC 1.2.1.2；EC 1.2.1.43)又作为显色酶，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算出二氧化碳的浓度。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明二氧化碳诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

辅酶 3mmol/L

甲酸脱氢酶(1) 10000U/L

甲酸脱氢酶(2) 12000U/L

亚铁细胞色素b1 3mmol/L

本发明的二氧化碳诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)、亚铁细胞色素b1。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、亚铁细胞色素b1。

试剂2

缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)。

辅酶、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)、亚铁细胞色素b1在试剂l或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、亚铁细胞色素b1。

试剂2

缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶(2)。

试剂3

缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶(1)。

辅酶、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)、亚铁细胞色素b1在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定二氧化碳浓度的方法，其辅酶可以是NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的二氧化碳诊断/测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

辅酶 3mmol/L

甲酸脱氢酶(1) 10000U/L

甲酸脱氢酶(2) 12000U/L

亚铁细胞色素b1 3mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二氧化碳样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出二氧化碳的浓度大小。

实施例二

本实施例的二氧化碳诊断/测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

辅酶 3mmol/L

亚铁细胞色素b1 3mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

甲酸脱氢酶(1) 10000U/L

甲酸脱氢酶(2) 12000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二氧化碳样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟，检测时间2分钟左右。

实施例三

本实施例的二氧化碳诊断/测定试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

辅酶 3mmol/L

亚铁细胞色素b1 3mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

甲酸脱氢酶(2) 12000U/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

甲酸脱氢酶(1) 10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定二氧化碳浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测二氧化碳样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟，检测时间2分钟左右。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.055；吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达15mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.16±0.08ΔA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。

Claims

1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的二氧化碳的浓度测定方法，其方法原理如下：

二氧化碳+亚铁细胞色素b1 甲酸脱氢酶甲酸+

高铁细胞色素 b1

甲酸+辅酶甲酸脱氢酶二氧化碳+还原型辅酶

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出二氧化碳的浓度大小测定结果。

2.一种二氧化碳诊断/测定试剂盒，主要成分包括：

缓冲液 20——500mmol/L

稳定剂 1——4000mmol/L

辅酶 1——6mmol/L

甲酸脱氢酶(1) 1000——80000U/L

甲酸脱氢酶(2) 1000——80000U/L

亚铁细胞色素b1 1——50mmol/L

试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)、亚铁细胞色素b1组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)、亚铁细胞色素b1组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、亚铁细胞色素b1组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)组成。辅酶、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)、亚铁细胞色素b1在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、辅酶、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)、亚铁细胞色素b1组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、亚铁细胞色素b1组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶(2)组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、甲酸脱氢酶(1)组成。辅酶、甲酸脱氢酶(1)、甲酸脱氢酶(2)、亚铁细胞色素b1在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述二氧化碳诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1—4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。