CN101443771A - 调节离子通道活性的药物的鉴定和功能表征的方法 - Google Patents

Abstract

提供促进钾离子通道的调质(特别是HERG通道)的鉴定和表征的材料、方法和计算机系统。

Description

调节离子通道活性的药物的鉴定和功能表征的方法

此申请要求2004年11月16日提交的美国临时申请60/636,494的优先权，其全部内容在此引入作为参考。

发明领域

本发明涉及药理学和合理的药物设计的领域。更特别地，该发明提供了鉴定调节离子通道活性的药物的方法，如此表征的药物的数据库及进一步评估潜在的治疗化合物的计算机软件程序，其包括常见结构和/或生物物理学的特征。一方面，评估这样的化合物对于特定离子通道尤其HERG钾通道的有害影响。

发明背景

引用的多种公开物和专利文献遍及说明书，以描述本发明所属的现有技术的状态。这些引文各自在此以全文并入作为参考。

HERG(人ether-a-go-go-related)基因编码作为K⁺-通道起作用的膜蛋白。这个通道参与心脏组织的复极化。复极化的延迟是与心律失常和心脏病发作相关。穿过HERG通道的钾流量的抑制，是与QT间期(长的QT；EKG记录的部分)的延长相关，即延迟的复极化。这些延迟与心动过缓和心律失常相关。具有不同的化学结构的治疗剂是与LQT相关和/或怀疑引起对HERG蛋白质的不利作用。这些不同类型的药物的实例包括下列：非镇静的抗组织胺类(阿司咪唑，特非那定)、大环内酯类抗生素类(红霉素)、喹诺酮抗生素类(司帕沙星)、抗精神病药类(氟哌啶醇、氯氮平、匹莫齐特、促动力药(西沙必利)、抗心律不齐药类(多非利特)、非钾阳离子通道阻滞剂(维拉帕米、奎尼丁)、β-肾上腺素能阻滞剂类(索他洛尔)、抗真菌药类(酮康唑)、抗疟药类(甲氟喹、氯氟菲醇)及生物胺转运抑制剂(丙米嗪、可卡因)。来自蝎子(东半球和西半球)的天然肽毒素(ergtoxin、Bekm-1)最近已被鉴定为HERG的有效和特定的抑制剂。这里还报道，cAMP通过在环核苷酸结合区域相互作用，改变了HERG活性(63)。

示例性的具有可论证的不利HERG作用的药用剂包括，例如，多非利特

西沙必利

特非那定

和阿司咪唑由于同HERG相互作用相关的不利副作用，这些药剂从市场除去。单独的西沙必利报道是造成的某些80心脏病发作和>300的住院治疗的原因(www.propulsid- eresource，com/what.cfm)。所述的先前的除去，证明了市场上的药物或研发流水线上的候选药物正在花费企业十亿的税收，数百百万的研究、研发和法律成本。

从上述中清楚的是，对HERG具有不利作用的药物可能造成严重的损害或死亡。因此，FDA期望近期的释放指导方针需要测量HERG数据，调查研究新药的顺从性。为了避免这样的有害的作用并消除安全顾虑，药物生产商需要耐用和易于实施的检测方法，以评估这种的候选药物并从开发流水线上清除。

发明概述

根据本发明，提供了鉴定调节钾通道活性的试验化合物的硅内筛选方法。示例性的方法要求汇编已知调节钾通道活性的药物的数据集，该数据集含有该药物的生物物理学和结构的特征，其包括观察到的该药物对于钾通道活性的生物学效应；提供了描述上述的结构特征与钾通道的相互作用的系列的算法；而且使用本文的算法估计有或没有这些结构特征的试验化合物，借此鉴定同也调节钾通道的该药物共享结构特征的试验化合物。本发明还包括的是通过前述方法鉴定的试验化合物。在特定优选的实施方案中，钾通道是HERG蛋白质通道，进行方法以鉴定表现出与HERG蛋白质的有害的相互作用的试验化合物。

本发明方法的另一个方面，要求HERG表达细胞与在最初的硅内筛选方法中鉴定的任何试验化合物接触，并确定试验化合物对于HERG通道功能的作用，如比较i)不表达HERG的细胞；ii)没有接触该试验化合物的HERG表达细胞；和iii)接触已知调节HERG的药物的HERG表达细胞。该方法可进一步包括可探测地标记在在初期的硅内筛选方法中鉴定任何试验化合物，在体外进行结合测定以确定用于HERG蛋白质的化合物的结合亲和力及结合位点。一旦功能性的表征，使用前述方法获得的任何数据可以包含在已知与钾通道(例如，HERG通道)相互作用的药物的数据集中，用在上述的硅内筛选法中。

而在本发明的另一个方面，提供了实现上述方法的计算机系统。计算机系统包括与钾通道相互作用的已知药物的生物物理学和结构特征的第一个数据集，包括但不限于表4中列出的钾通道。在一个优选的实施方案中，将鉴定与HERG通道相互作用的药物。计算机系统可以进一步包含第二数据库，其包括至少一个选自三维结构的数据库、序列突变数据库、失败药物数据库、天然产物数据库及化学登记数据库的数据库。在本发明的计算机系统中还包括的是含有至少一种完成所述硅内筛选方法的算法的程序。

最后，鉴定了HERG蛋白质上的新结合位点，其在此指的是E-4031位点。因此，本发明的另一个方面包括基于细胞的功能测定，用以鉴定怀疑通过与E4031位点相互作用而调节HERG蛋白质活性的试验化合物。一个这样的方法包括，使HERG表达细胞与试验化合物接触，并确定试验化合物对于HERG通道功能的作用，如比较i)不表达HERG的细胞；ii)没有接触该试验化合物的HERG表达细胞；和iii)暴露于E4031的细胞。还提供了体外测定确定对于HERG蛋白质或其片段上E-4031位点的试验化合物的结合亲和力。

在本发明的进一步方面，公开了在E4031位点进行筛选方法的试剂盒。示例性的试剂盒包含HERG表达细胞、非-HERG表达细胞；适于在所有细胞中进行功能测定的试剂；且任选地，试剂适于在体外进行结合测定。

附图简述

图1.a)HERG-转染细胞证明[³H]-阿司咪唑的剂量依赖的特异性结合。B)HERG-CHO膜煮沸使蛋白质变性，借此降低了特异性结合。

图2.随着时间[³H]-阿司咪唑与HERG蛋白质的缔合，如在CHO膜上表达的。Ymax＝最大DPM结合。K＝缔合常数；半衰期是获得1/2总平衡结合的时间(分钟)。

图3.用多种化合物抑制[³H]-阿司咪唑结合HERG-CHO膜。

图4.结合HERG-CHO膜的[³H]-阿司咪唑的饱和度。非特异性结合定义为在10μM特非那定存在下剩余。

图5.阿司咪唑剂量依赖阻断HERG K+通道。使用这样的技术，可以跟着Rb+的流出进入上清夜。使用铷，因为其通过HERG K+通道流动，也未以可检测的量存在于常规的介质/水中。

图6.Rb+从HERG-转染的CHO细胞向外流出的时间过程，使用原子吸收来检测通道功能。还证明了对于阿司咪唑的敏感性。

图7.从训练库(training library)选择的化合物的剂量响应在原子吸附(AA)功能测定法中试验。包括完全、部分和无活性的抑制剂。

图8.在[³H]-阿司咪唑结合测定、膜潜在的染色和AA功能测定中筛选26化合物的结果。在10μM下一式两份试验化合物，除了BeKm-I和Ergtoxin(0.1μM)，及阿司咪唑(1μM)。大多数的这些化合物据报道在膜片箝测定中是抑制HERG钾通道，代表不同的治疗和化学分类。某些化合物(E-4031(800％)、特非那定(200％)及匹莫齐特、舍吲哚、氯非铵(1000％)表现出显而易见的抑制，比荧光染料测定中的对照大得多。

图9.各个预测与试验性的抑制的比较，通过化合物(10μM)进行。在此扫描图象上，结合测定的准确度是显而易见的。

图10.在各个三次测定中，实验性与预测的抑制(10μM)的回归曲线图。

图11.这个图包括了硅内筛选中预测与实际体外筛选中的结果。使用的QSAR模型的数组(array)，预测了18个化合物(来自2,000个化合物的组)对HERG K+通道起作用，29个化合物被预测是无活性的。使用[³H]-阿司咪唑结合测定试验所有47个化合物的HERG活性。14(18个中的)个证实是有活性的；其中28(29个中的)证实是无活性的。HERG_INH_EXP是实验上诱导抑制的曲线图。QSAR_PREDIC是从QSAR模型中预测的抑制。各个化合物是颜色编号的。水平线表明了实际和预测之间完美的一致。

图12.这是表现标明根据说明书的化合物的分离和活性关联的“节点(nodes)或叶(leaves)”。

图13.a)选自用于抑制结合D1(X-轴)比较在相似的GPCRs的抑制的硅内模型的406个化合物的绘图。“g”is D1比D1。B)从406个中鉴定的9个化合物，较其他相似的受体其对于D1具有几乎完全的选择性。

图14.五个HERG抑制剂(绿色记号的GBR12909、白色记号的GBR12935、红色记号的特非那定、灰色记号的匹莫齐特和蓝色记号的氯非铵)的叠加显示了某些结构元素的近似。

图15.E-4031(白色)、索他洛尔(蓝色)和MK-499(灰色)的叠加，显示了不同于图14中化合物的结构元素。

图16.在用QSARIS操作时遗传算法软件的实例。

图17.这个图说明了在HERGK+-通道上的阿司咪唑位点上的潜在结合抑制的预测所用的方法(算法的组合)。每个园“指出”基于化学描述符集合的算法及其预测对于结合位点的化学亲和力的能力。当组合所有的算法时，一致使更精确的预测潜在的阳性候选对象。

图18.多样性库中7030个化合物的分子特征。

图19.图.19a)至19e)显示了选择图18的化合物的医药化学规则和滤器。

发明详述

本发明提供了计算机系统和硅内筛选方法，用于合理设计调节钾离子通道活性的试剂或治疗化合物。本文列举了HERG钾通道。我们集中于HERG蛋白质上的努力，因为以前的报道指出了与HERG通道不利的药物反应是伴随严重的健康结果，包括心脏病发作和死亡。表现出其他效应和安全的药物已退出了市场，由于和HERG通道阻滞有关的死亡。Propulsid(西沙必利)在2000年7月退出市场，由于80个死亡和340个心跳不齐的报道。两个最新和更常见的抗组织胺类和

(阿司咪唑和特非那定)也分别地撤出了市场，由于与HERG相互作用的危险。可以理解地，对于预测和鉴定化合物的方法学存在增加的需，在药物研发过程的早期所述化合物可能不利地影响HERG通道活性。在此提供了这样的方法和评估系统。

最初，我们设计体外测定的数组，其比当前所用的那些(例如，膜片箝(patch-clamp))是更易接近和顺从于高通量。然后，我们使用这些测定法来得到高质量的数据集以促进预测潜在的HERG相互作用的能力。显示出与HERG相互作用的化学药物的发散结构揭示了HERG-介导的钾流量的抑制是通过存在于蛋白质的离散位点的相互作用介导的。少量的这些药物上存在的公开证据显示了其可能结合HERG通道(10，64)的细胞内位点。关于肽毒素的文献表明，其结合通道(3-5)的细胞外前庭，同时其他药物据报道是识别通道(57，65)孔隙内部的位点。清楚地，包括蛋白质上的多个位点的结合测定的分析方法是高度期望的。

单个离子通道上存在的多个小分子结合位点是常见的。L-型钙通道在不同位点(6-11，50-51)结合苯并噻氮革类、二氢吡啶类和苯烷基胺类。影响GABA-A受体/氯化物通道络合物的药物在多个位点(67，68)相互作用。存在6个位点，调节钠通道(66)。HERG通道表面上具有这个多位点调节特征。使用平行细胞功能测定和放射性标记的配体，鉴定和进一步表征这些不同的小分子结合位点。

由放射性配体结合测定法获得的测量方法直接关联评价的化合物的小分子和物理化学特征(电荷分布、形状和大小、溶解度等)，在结合位点的特定位点之内具有其特异性相互作用环境，即生物学靶点。在定义的位点和“生物环境”评估特异性的双分子相互作用的优点和能力是能够开发高度适合的数据集，因为其可以导出坚定的构效关系。结合测定法提供的数据为高度可信和坚定的QSAR提供了基础，其数学上地关联化学描述符(小有机分子的“特征”)与观察到的生物学活性。基于细胞的功能测定提供了化学干扰的“整体”的评估，提供进一步的“体内”信息以增大从体外结合实验中获得的信息。观察到的功能响应证实无论“特异性结合事件”的确传递(deliver)细胞结果，而且还是在所有可能位点上的化学相互作用的反映。因此，基于细胞的功能测定也已经用于证实在结合测定中获得的结果，其反过来促进进一步表征HERG通道上存在的不同的小分子结合位点。与基于细胞的功能测定配对平行完成的结合研究，将揭示所有这些可能的结合位点。

定义：

本文所用的术语“钾离子通道”指的是最常见的离子通道类型。其形成跨细胞膜的钾-选择性孔。在大多数细胞中发现钾通道，控制细胞膜的电兴奋性。在神经元中，其影响动作电位并设置静止膜电位。其调节细胞过程如激素的分泌，因此其功能障碍可能导致疾病。某些钾通道是门电压离子通道，其随跨膜电压的变化而打开和关闭。其还可以随钙离子或其他信号分子的存在而打开。其他是必要的开或具有高度基部激活，如停止设置神经元的负膜电位的钾通道。当打开时，其允许钾离子以一定的速率通过膜，其几乎像其通过重力水扩散一样快。存在超过80种的编码钾通道亚基的哺乳动物基因。形成钾通道亚基的孔具有同-或异四倍体排列。四个亚基是围绕中心孔分布。所有的钾通道亚基具有特征性的孔-环的结构，其排列在孔的顶部而且负责钾的选择性。包括HERG通道的示例性的钾通道的名单，在表4中提供。

术语“硅内筛选方法”指的是基于计算机的分析方法，用以筛选和鉴定与钾离子通道上的特定位点特异性地相互作用的药物，HERG通道在此是示例性的。

术语“生物物理学和结构的特征”包括属于进行分析的试验化合物的那些化学和物理学特征。这些包括，不限于分子量、溶解度、疏水性、亲水性、原子类型、3D分子力矩、一级结构、二级结构、三级结构和化学官能团等。本文所用的“生物效应”包括，例如钾流量的调节、激动活性、拮抗活性、膜电位的改变、膜去极化、研究中不存在与钾通道的相互作用，及通道阻滞。

本文所用的术语“不利的生物效应”指的是与功能失常的钾流量相关的那些效应。这些包括，不限于心律失常。心动过缓、心脏病发作、痴呆和死亡。

如实施例1提出的，我们已经(1)开发了易于接近体外测定的数组；(2)鉴定HERG蛋白质上的多种可能的小分子结合位点；(3)产生可靠的数据集及(4)已试验的化合物的硅内预测的可行性，所述化合物怀疑与HERG不利地相互作用。这些结果在以下公开。

提供以下的实施例以说明本发明的某些实施方案。无论如何，其不意欲限制本发明。

以下提出的物质和方法是提供于促进实施例I和II的实践。

实施例1

用于膜制备的重组体细胞系和细胞培养物-从Albert EinsteinMedical College(Dr.Thomas MacDonald)购买了表达HERG蛋白质的重组体CHO细胞系。HERG-CHO细胞是在含Ham′s F-12、10％FBS、1mg/ml G418和2mM L-谷氨酰胺的培养基的标准培养条件下生长。细胞以1：30的速率一周分裂3次。使用冷冻-融化(-20℃-37℃)循环采集细胞，以从其粘附的表面释放它们，然后离心(2000G，10分钟，4℃)以提供生物量的沉淀。然后在-80℃下储藏细胞，直至使用。

膜制备和配体结合测定-冰冻的细胞沉淀首先融化，在10-20ml的测定缓冲液中匀浆化。取等分部分用于蛋白质测定，剩下的匀浆离心(48,000xg，10分钟，4℃)。根据测定蛋白质浓度，得到的沉淀混悬在Heylen′s缓冲液中，加入放射性配体和试验化合物。Heylen′s缓冲液的组合物是20niM HEPES、118mM NaCl、50mM L-谷氨酸、20mM L-天冬氨酸、11mM葡萄糖、4mM KCl、1.2mM MgCl₂、1.2mM NaH₂PO₄、14mM庚酸及0.1％BSA，pH为7.4。在室温下孵育30-45分钟之后，测定的混悬液通过0.1％PEI-处理的GF/C过滤器过滤，用5ml的冷的50mM NaCl漂洗。用液体闪烁光谱学测定结合放射性。

放射性配体的来源-使用多种不同的放射性配体来鉴定用于给定结合位点的候选化合物。实施例1所用的放射性标记的配体的列表，其商业供应商、放射标记的类型和对应的类似物号码在表1中给出。

表1

同位素      配体        目录号          来源

³H          阿司咪唑     N/A Custom     Amersham

³H          氟哌啶醇     NET-530        PerkinElmer

³H          维拉帕米     NET-810        PerkinElmer

³H          D-888        TRK-834        Amersham

³H          奎尼丁       ART-542        Amer.Radiochem

³H          WIN35,428    NET-1033       PerkinElmer

³H          红霉素       ARC-467        Amer.Radiochem

¹⁴C         Bekm-1 LP    N/Acustom      Amersham，LPmethod

¹²⁵I        Bekm-1BH     N/Acustom      Amersham，BHmethod

¹²⁵I        Bekm-1       NEX-412        PerkinElmer

使用原子吸收检测的细胞功能测定法-从HERG-转染的CHO细胞流出的铷是使用Shimadzu原子吸收系统来表征。在用50mM KCl去极化之后，测定细胞外和细胞内隔室中铷的量，接着使用相同样品培育3-分钟。原子化的缓冲液包含0.1％ CsCl₂/1％HNO₃以抑制铷的离子化。

使用膜电位染色的细胞功能测定法-以HERG-表达CHO细胞为基础开发了基于膜电位染色的功能测定法。这种测定法在相同的库中平行进行，采用放射性配体和基于AA的功能测定。HERG-表达CHO细胞用板固定，用于AA测定，除了其装载4niM DiBAC4而不是RbCl。实验样品或对照品加入到Molecular Devices FlexStation内，过了25分钟的时间范围进行读数。

膜电位测定操作-培养基中100μL的250,000细胞/mL被加入96-孔测定板，孵育整夜。细胞用含2g/L的葡萄糖的Hanks/HEPES缓冲液(装载缓冲液)洗，加入100μL的加热的装载缓冲液。然后，加入80μL的FLIPR膜电位染料(分子装置；溶解于装载缓冲液)，样品在37℃下培养45分钟。装载缓冲液中药物(10×的最终浓度)与没有药物的对照一起进行。含细胞的板固定于荧光计(加热至37℃)并培养2分钟。加入20μl的10X药物溶液，荧光测量15分钟以得到最大的响应。最大响应稳定水平是期待约7分钟。这个值将是用于EC50计算。使用具有流控技术、动力学能力及530nm兴奋和550nm的发射的FlexStation荧光计，具有550nm的发射截断。典型的HERG通道抑制剂如西沙必利(IC₅₀＝45nM)或多非利特(IC₅₀＝10nM)将是用作对照(Tang等人，2000年)。阴性对照的3SD之内的试验化合物将是认为无活性的。对于其他“活性的”，将以这种测定来确定IC₅₀值，且在Rb⁺流量测定中1或2个浓度。

收集试验化合物库和供应商-在大多数的情况下，选自训练库的化合物是基于报道的与HERG功能的相互作用和/或与LQT相关性来选择的。例外包括GBR12909和GBR12935、尼卡地平和普萘洛尔，其在HERG活性的文献中没有报道。参见表2。

表2

表2  26个化合物的列表是通过全部的所述的测定来筛选。全部都在文献中报道了抑制HERG功能。化合物22和23(BeKm-I和Ergtoxin)抑制试验的消耗是在10μM。然而，对于HERG功能的BeKm-I和Ergtoxin抑制的报道的Ki′s是处于低的纳摩尔范围。如果其结合与放射性配体相同的位点，在100nM的试验浓度将期望其相同的抑制。什么都没有看到。*标明天然的肽毒素。

QSAR模型模拟和软件应用-QSARIS v.1.2(来自SciVision-MDL)是主要的数据研究工具。训练是采用[³H]-阿司咪唑放射性配体结合测定中23个化合物的结果来进行(表2)。为早期库的一部分的大的蛋白质毒素不在训练集合中使用，由于含小分子样品的组件的大小和结构组件的差异。10^-5M下的百分比抑制是用于定义观察的生物学上的活性。软件提供超过200个不同化学描述符(包括原子类型、3D分子运动、子结构和分子性质)。不同的化学描述符是随机地组合，回归模型是是基于组合的描述符和观察到的活性之间的统计相关性产生的。然后检查模型并基于(1)R²-系数、(2)交叉确认指数及(3)P-检验确认。R²>0.9的六个模型也满足交叉确认(一随机阻止)需要。这六个模型是用于硅内预测实验。

结果和讨论

采用整个细胞的功能测定法提供了这样的结果，较体外结合测定获得的那些该结果其是“体内”条件的更佳反映。功能测定提供关于受体或离子通道上相互作用分子的激动和拮抗效应的信息。

采用的基于整个细胞功能测定是基于电压敏感染料DiBaC4，使用Dr.Vince Groppi of Pharmacia-Upjohn FLIPR最初开发的检测方法及FlexStation荧光检测系统。表达离子通道如HERG蛋白质的细胞在静止状态是超极化的。离子通道活性的抑制显示了，细胞回复到正常的电位。由于细胞膜变得更加正性的，染料移动进入细胞膜，增加染料的量子效率并因此增加荧光。就实际目的而言，由于其容易操作、对于高通量格式化的再现性和适应性，荧光法是“用户友好的测定法”。大量的化合物可以容易地以96-或384-孔格式试验。检测的机理是基于响应膜环境变化的染料易位。在某些环境中，期望可进行确定的测定。

作为选择性和平行的确定测定，使用Tang(Tang等人，2001年)报道的方法学进行铷-流量测定。公开的试验设计的较小修改是必要的，因为重组体细胞中HERG蛋白质的不同表达水平。阿司咪唑、特非那定、匹莫齐特和氟哌啶醇，其完全地抑制HERG通道活性，是用于确认这个测定。

[³H]-阿司咪唑用于我们的研究中，基于先前的报道，这种化合物证明与在HEK-293细胞上表达的HERG蛋白质结合的高亲和力(KD＝3nM)(Heylen 2002年)。该观察的结合亲和力是与膜片箝观察一致的，而且是与从来自使用膜电位染料和Rb⁺流量的基于细胞的功能测定的内部观察一致的。

通常用于表达HERG K+通道的两种细胞系是HEK293和CHO。CHO细胞的使用是在此举例说明的。CHO系是相对“清洁”的系统(与对应的HEK细胞相反)。在CHO细胞中没有内源性离子“作用”，其是与受HERG蛋白质控制的离子流相似的。在使用HERG-CHO细胞的实验性系统中，K⁺流量中化学干扰或改变的评估是HERG蛋白质活性的唯一结果。HEK-293系是更复杂的。在HEK293的天然细胞中存在I_kr-样离子流。根据报道，[³H]-多非利特，一种已知是与HERG特异性反应的药物，也显示了对HEK293的天然细胞的膜组分的高亲和力(Finlayson，2001年)。

野生型及重组体HERG-表达CHO细胞证实了[³H]-阿司咪唑结合中的显著差异。如图1指出的，剂量响应曲线确认存在对HERG-转染CHO细胞的特异性结合。对照实验证实，使用加热(煮沸)变性靶点蛋白质，消除了观察的特异性结合。图2所示的进一步实验性证据指出，[³H]-阿司咪唑和HERG蛋白质之间的相互作用是在浓度和温度依赖的热力学平衡下发生。在给定的蛋白质浓度(25-50μg/管)和在室温下，达到这样的平衡的相互作用所需的时间是少于12分钟，因此在室温下采用30-60分钟的孵育时间。

[³H]-阿司咪唑结合位点的药理学特征是使用竞争结合实验评估的。在6个潜在竞争剂(即胺碘酮、氯非铵、红霉素、匹莫齐特、舍吲哚和特非那定)的存在下测定[³H]-阿司咪唑的结合。这些测定结果是如图3所示。还进行实验以确定[³H]-阿司咪唑的结合变得饱和的水平。使用十二个浓度的[³H]-阿司咪唑，范围是1-400nM，在总的和非特异性的结合环境下。饱和研究的结果是在图4中所示。

除了[³H]-阿司咪唑之外，还试验了表1中列出的不同的放射性配体。这些化合物是根据其在引起LQT中报道的活性和根据其放射性标记形式的可用性来选择的。[³H]-氟哌啶醇显示与测定所用的野生型和重组体CHO细胞的高结合水平。氟哌啶醇结合位点的阻滞剂(阻滞多巴胺能受体的螺哌隆、阻滞毒蕈碱受体的N-甲基东莨菪碱、阻滞α1-和α2-肾上腺素能受体的哌唑嗪和羟甲唑啉、阻滞∑位点的喷他佐辛及阻滞Na位点2结合位点的乌头碱)未能揭示天然细胞和转染细胞之间的差异。差异的缺乏揭示了，这种特别的放射性配体对于评估HERG相互作用是不理想的。放射性标记的维拉帕米、D-888、奎尼丁、WIN-35428和红霉素是同样地试验。对于在结合研究中中证明所述化合物作为配体的重组体蛋白，这些化合物都没有表明足够的特异性。我们也没有观察到与常规制备的碘化的蝎子毒素[¹²⁵I]-BeKm-1的足够结合。尽管已知是HERG离子通道抑制剂，在毒素的制备中所用的碘化反应似乎是修饰了结合所需的氨基酸残基。由此，我们已经得到毒素形式Perkin Elmer，其在我们的系统中很好地起作用。近来得到的数据揭示了，特非那定具有适度的亲和力用于西沙必利具有低亲和力的这个位点。

使用Tang等人的方法学，发展了Rb测定。文献的综述表明，阿司咪唑是HERG阻断所用的高亲和力的常用的商业上可得到的配体。其在我们HERG膜电位染料测定中很好地起作用。阿司咪唑IC₅₀的典型报道是约5nM用于膜片钳，100nM用于膜电位染料和10nM用于原子吸收。

最初的实验揭示了，Tang描述方法中的多次洗涤造成了细胞损失及Rb内部细胞的减少。我们确定，一次洗涤是足够的且或多或少地好于没有洗涤。为了维持样品敏感性和有足够的样品来注射，用0.1％CsCl/1％ HNO₃的1:1稀释的样品提供了更好的敏感性。1:2的稀释度也是可用的，但是1:3时敏感性变差。根据销售商的建议，我们使用具有适当洗涤步骤的200uL注射液，采用检测吸收峰。每个样品两种注射液制成Shimadzu AA，而且如果cv达到10％，完成第三种注射液；计算机选择两个较近的值。切去10％捕集较多的误差，允许合理的分析速率。进行时间过程，在图6中显示。从0-30分钟积极地发生Rb+外向通量，因此选择25分钟作为合适的时间点。在0-2.5分钟之间观察到由于加入阿司咪唑的最初变化。因此，允许药物预培育细胞5分钟。在10％和3％ DMSO时记录不利作用，然而1％及更小没有明显的作用。因此，DMSO是限制<1％。参见图5和6。

还完成了剂量响应实验(图7)。阿司咪唑、特非那定、匹莫齐特和氟哌啶醇完全地抑制HERG通道。其他药物如西沙必利提供了Rb+外向通量的部分阻滞，然而一些报道的阻滞剂如普萘洛尔、索他洛尔、丙米嗪、红霉素和苯海拉明在高达30uM时显示无抑制。表2中列出的其他化合物好像是不完全的通道阻滞剂。

在这些测定中，在10^-5M下我们试验了这类化合物。这些实验的目的是：(1)比较和交叉确认不同的测定设计；(2)使用功能测定来提供不同于[³H]-阿司咪唑位点的另外的结合位点的另外的适应症(indication)；和(3)产生少量但是一致的数据，采用这些数据我们建立预测潜在的活性(或更重要地缺乏活性)的算法。试验的化合物是根据其报道的活性选择，用作III类抗心律不齐药给药法(主要影响K+移动的药物如胺碘酮、多非利特、E-4031、索他洛尔等)，或者用于其报道的临床上观察的在QT-延长中心脏效应(如特非那定、西沙必利和阿司咪唑等)。在三个不同测定中使用重组体HERG-CHO细胞试验这类化合物得到的结果是在图8中所示。

对于大多数部分，结果和来自基于细胞的功能测定的观察结果是一致的。存在四个例外，即奎尼丁(#7)、(±)-索他洛尔(#8)、红霉素(#14)和尼卡地平(#20)。这四个化合物最初在基于染料的测定中不显示任何活性，仅仅是在使用原子吸收的测定中适度地起作用。各自好像是不同于正常的例外。

近来的研究指出，索他洛尔和红霉素的抑制功能是显著地温度依赖的(Stanat等，2003年；Kirsch等人，2004年)。在我们最初实验中，基于染料和原子吸收的整个细胞功能测定是在室温和次优的条件下进行，其可能是在原子吸收测定中观察到适度活性及在基于染料的测定中观察到无活性的原因。

另一个最近的报道指出，离子通道的奎尼丁阻断是pH、电压和时间-依赖的。在正膜电位下，主要是通过这种快速阻滞动力学，奎尼丁造成独立于频率的阻滞(Tsujimae等人，2004年)；此外，酸化作用减弱了奎尼丁对HERG通道的抑制作用(Dong等人，2004年)。使用膜电位染料作为指示剂的测定是在pH(～7.2)下进行，一旦加入奎尼丁，其检测到少许的可测量的信号，然而在相似的条件下但是具有升高的pH(～7.6)，使用原子检测观察到高于60％抑制活性。这个变化是与公布的观察结果是一致的。这种pH依赖性也是与SAR-QSAR观察结果一致。存在形成特异性分子内氢键的倾向，其消极地作用于其与蛋白质的亲和力。PH的改变可能影响H-键形成，因此影响活性。

尼卡地平，1-4二氢吡啶钙拮抗剂及一代静脉内给药的二氢吡啶钙通道拮抗剂之一，在30mg/kg时引起人持续的低血压和心动过速(Horii等人，2002年)在基于染料的测定中也缺少活性。然而，这里仍然没有确定的数据解释HERG-尼卡地平相互作用下面的机理。然而，剂量依赖性，在WT和TG小鼠中缩短了QTrc并产生了窦性停搏(Lande等人，2001年)。在另一个研究中，尼卡地平(1微摩尔)轻微地，但是显著地改变激活和稳态失活的电压依赖性至更负性电位，而且还显著地放慢了从Kv4.3L电流失活的恢复(Calmels，2001年；Hatano等人，2003年)；即钙通道抑制剂显著地影响hKv4.3电流，当在天然组织中评估暂时向往的钾通道特性时必须考虑结果。因此，其心脏效应好像是由于在HERG和其他K⁺-通道同种型上的联合作用。

“结合”和“功能”测量之间的某些不一致性不是令人惊奇的。放射性配体与靶点的结合是“局部事件”。在非[³H]-阿司咪唑位点与HERG蛋白质的化学相互作用可以证明在[³H]-阿司咪唑结合测定中未观察到的亲和力的衰弱。相反，功能测定不具有如进行结合测定的相同位点限制。化学药品可以在任何可能的位点与离子通道反应，借此表现分子响应。在此数据集中，在结合测定中E-4031和西沙必利显示了受限的结果(0-15％抑制)，但是强有力的功能反应(90～100％)。因此，E-4031和西沙必利看来像是代表在非阿司咪唑结合位点与HERG蛋白质相互作用的配体。

胺碘酮存在另一种特异性。胺碘酮已知是具有最小风险的有效的前心律不齐(proarrhythmic)(与多非利特和索他洛尔相反)的III类抗心律不齐药。其也列在其他抗心律不齐药分类中(I类，Na⁺通道；II类，β-阻滞剂；III类，K⁺通道；IV类，Ca⁺⁺)。胺碘酮仅仅是在[³H]-阿司咪唑/hERG测定中显示了显著的结合亲和力的化合物，其在功能测定中也缺乏或具有很少的活性。实验观察结果中的这种不一致性提供了对心脏活动调节的洞察力，通过多种离子通道(Na⁺、K⁺和Ca⁺⁺)。

使用从这些测定中获得的化学结构及数据，建立了QSAR模型。该成果的目的是双重的：(1)确定该测定法产生的数据集是否是足够“一致和适合”用于QSAR发展；和(2)是否这些“关系”在预测潜在存在或不存在的hERG活性中是足够有用的。

使用计算软件QSARIS(Sci Vison产品)产生活性的三个模型。这种计算程序采用多重回归分析以联系化学描述符和观察的生物学活性。这个软件程序的通用性是其提供了范围是从亚结构组分至量子力学参数的化学描述符的预置排列。这些预先设定的条件使这种程序用户友好。工具饱的不足是其缺少处理不同的化学组合和多个(或不同类)相互作用(不同位点的化学相互作用)的动态能力。

表3把衍生自三个测定法的各自的数据集的QSAR模型制成表。所有的模型是使用化学描述符例如亚结构组分的有限组合产生的。清楚地显示了，放射性配体结合测定产生最适合和内在一致的数据集合。回归模型描述了显著影响HERG K+通道处的活性的化学描述符的排列。结合测定模型呈现了最高的回归性，如通过多次R-平方和P值反映的。交叉确认(相继地抑制训练集之一，比较预定值和实验值)实验(结果在图9中所示)指出，构成的模型可以是用于预测潜在的相互作用。这样的结果是期待的。结合实验是在特异性位点的双分子相互作用的直接测量，其中相互作用描述符(小分子和大分子组分)在相互作用亲和力上是反映一致的。

表3

 

数据源	模型(常规的多次回归-描述符-结构)	多次R- 平方	估计的标准误差	F-统计	P-值	多次Q-平方	交叉确认RSS
								结合	INH＝              -11.26*numHBa       -11.74*Ssso acnt    +20.73*SsF acnt     -64.62*SddssS acnt  +12.26*SHBint8 Acnt+   0.3362*fw      -18.4559	0.9463	11.77	47.01	2.81E-09	0.8973	4243
染料	INN＝             -50.64*SHBint3_Acnt+66.0386	0.3781	36.63	12.16	2.32E-03	0.2737	3.14E+04
								Rb+流量	INN＝             -29.6*Ss1_acnt+9.624*SssCH2_acnt +14.7308	0.6584	20.6	12.26	1.08E-04	0.2696	1.73E+04

表3统计学上比较了hERG的交叉确认的优选的模型，基于三个测定方法各自的训练库数据。

由功能测定得到的数据提供了不同的结果。采用这些数据，计算程序不能描述统计学上和显著地连接所观察的生物学活性的描述符的集合。这个结果也是期待的。使用回归模型的QSAR建模依赖特异性的分子将相互作用，然而功能测定得到数据可能反映多重位点的相互作用。值得注意地，确定的功能测定较其他测定法提供更加可信的数据。然而，在本研究中，由体外结合测定获得的数据产生最适合的数据集。使用不同模型的交叉确认的比较是如图10所示。

为了试验这些QSAR模型的有效性(或预测的能力)，提出了确认实验。这些实验是设计来预测或预报不在训练集合中的化学药物的能力，使用衍生的模型，然后在相应的体外测定中试验化合物(具有预报的活性水平)。确认实验的结果在图11中给出。使用QSARIS，我们得到基于“结合数据集”和不同的化学描述符集合的多种QSAR模型。不同模块使用子结构组件、量子力学参数、化学官能团或通过键的距离。使用观察的结合活性和所选化学描述符的集合之间的多重回归衍生构效关系。一些比较之后，确定六个模型提供最好的确认结果。

这六个模型是用于扫描2000个化合物、主要的给药法、测定参考药物或其他先前已知的生物活性化合物的化学药物库。十八个化合物表明是可能使用六个模型与HERG蛋白质反应(预言的抑制是>50％)。这些化合物连同另外29个化合物(预言是无活性的)在[³H]-阿司咪唑结合测定中检测活性。在18个化合物中的14个证实是大于50％抑制，2个是适度的活性，2个是无活性。这个结果给出了可能有活性的化合物的77.8-88.9％预测准确度。29个化合物之外的预言是无活性的，1个证明是超过50％活性，2个证明是适度活性(20-40％)。这些受限的结果给出了无活性化合物的90-96％预测准确度。

结论

建立了多种体外测定，所述测定法可以用于容易地评估HERG K+通道活性变化，作为与蛋白质化学相互作用的结果。预成的膜电位染料和新的放射性配体结合测定是顺从高通量筛选，而AA测定是与膜片箝结果高度一致的。使用平行的功能和结合测定，已经得到在HERG上存在多重结合位点的进一步数据。

由于小分子相互作用，还开发了预测HERG K+通道活性的可能的相互作用的方法。在此提供的结果表明，可以预测与[³H-]阿司咪唑和其他结合位点相关的潜在的活性。

实施例2

使用由先前实施例得到的数据集，我们发现从特定的放射性配体结合测定得到的测量结果是大量的，但是不能完全地适合和类似由Rb⁺流量测定得到的测量结果。这个观察结果是与先前公开的实验观察结果是一致的。将采用与基于高通量膜电位染料和Rb⁺流量鉴定组合的多种独立的体外放射性配体结合测定，以便可靠地预测潜在的HERG可能性或其缺乏。确认之后，这些体外方法将提供容易得到的、易于理解的和价廉的选择性体外试验方法。

使用不同测定结果(结合vs.“功能”)之间的数据集“差异”，鉴定了HERG蛋白质上的另外不同的小分子结合位点及对于这些位点看起来像是特异性的配体。

我们得到能够预测在阿司咪唑结合位点的潜在的HERG K+通道活性的有力的数学算法的数组。这些算法，当一起使用时，提供了优秀的预测能力，那些是先前公开的(Cavalli 2002年，Ekins 2002年)。确认研究指出，对于选择在HERG K+通道上的阿司咪唑结合位点起作用的化合物的预测能力是大约90％，指出化合物缺乏相同的手段的能力是100％。采用扩大的数据集，我们将得到更宽泛和更有力的硅内预测算法的数组。

使用基于细胞的功能测定筛选HERG相互作用的不同的化学实体的大库。首先，将根据基于整个细胞的功能性活性，使用高通量方法学筛选由收集的代表1.5-2百万个商业上易得到化学实体(且收集的已知的离子通道配体)的超过10,000个不同化学物质组成的库。具有功能活性的那些将进一步试验用于证实，使用另外的及更严格的体外测定法(包括原子吸收、基于细胞和组织的膜片箝方法)。此努力的结果将是大量和高度(交叉)确认的数据集，所述数据集包括影响HERGK⁺-通道药理学的化合物。

该库然后将是扩大至包括>150(～200)化学物质，其是先前已知具有离子通道活性(特别是K⁺-通道)，或是与已知活性的那些化合物结构上相似的化学物质。通过以多种测定法(功能/结合)筛选大量和不同的化学物质的集合，将鉴定HERG蛋白质上的所有药理学相关小分子结合位点。一旦发现提示(筛选命中)，那么化学物质库将是进一步扩大以包括与鉴定的提示是结构上相似的那些化合物。然后，将再次以功能和结合测定筛选这些新近扩大的和优化的库组分，以检测潜在的活性。

如实施例1讨论的，对于能够调节通道功能的HERG蛋白质上的多重结合位点，存在强有力的证据。识别这些位点(其不同于阿司咪唑结合位点)的配体将是常规放射性标记的并用于表征这些另外的位点。最初，将集中在E-4031结合位点和肽结合位点。然而，所有来自实施例1的“命中”将是根据这些测定法中的活性来筛选。特异反应性结果，即在所有三个测定法(阿司咪唑，E-4031和肽位点)中证明“功能性的提示(functional readings)”但不是“结合示值读数”的提示将是标记以探查新的和另外的结合区域，借此尽可能多地鉴别小分子可能结合以产生影响K⁺-通道流量的功能响应的位点。这些分别的“位点”(用各个标记的配体作记号)将是发展成个体结合测定。

放射性配体结合测定是由5个典型步骤组成：

(1)确定用于测定法的蛋白质的合适浓度。理想地，人们想要评估蛋白质浓度线性范围内的结合。另外地，期望使放射性配体与测定中的过滤器的非特异性结合降低至最小程度。使用集中在10μg蛋白质/管(0.3-300μg的总蛋白质)的7个不同蛋白质浓度。向所有管中，加入10nM的放射性标记的配体。各个集合的头3管中，加入载体(vehicle)以确定总的结合向各个集合的次3管中，加入5μM的对应的非标记的(冷)配体。反应孵育2小时，其应该至少达到平衡。得自含非标记配体的的试管的计数定义非特异性结合，此后过程(头3管与次3管的差异)定义特异性结合，因此测定中所用蛋白质的理想浓度。这个步骤还将是用天然(非转染)CHO细胞完成，以确保天然细胞不表达可检测水平的HERG通道。

(2)平衡时间-进行时间过程实验以确定达到热力学平衡(或稳态)的时间。通常使用0、15、30、45、60、90、120和150分钟时间点。一般地，在两个温度环境冰(～0℃)、室温和/或37℃下进行时间过程实验。将在第二个时间过程进行离解测定以证实结合的可逆性。在不同时间(由相关实验确定)加入大量(＠1000倍)的未标记的配体以竞争离开结合位点的标记，之后其达到平衡。

(3)统计分析-确定K_D和B_max。使用具有确定蛋白质浓度、温度和孵育持续时间的12-16个不同的放射性配体浓度(计划的放射性配体的范围是0.1nM～1,000nM(大约3-4cone/log unit)。来自饱和实验的数据将是用非线性回归程序(Graph-Pad Prizm或类似的)分析，并用Scatchard graph inset绘图为饱和等温线。第二和第三个饱和度实验将是采用设置跨距1 log单位高于或低于前测定法确定的Kd值的放射性配体浓度进行。将使用非线性和线性回归数据分析数据和绘图。非线性回归将适于测定更好配合的一个或两个位点模型。

(4)载体效应-将分析(一式三份，在0、0.1、0.4、1，4和10％最终溶剂浓度)溶解样品的溶剂(DMSO，ETOH)对于结合的作用。

(5)药理学特征-如先前讨论的表2中所示至少20个不同化合是用于产生矩阵(20 x 3)数据集。即是，表征将是通过进行20或更多药物的剂量响应完成，一式三份使用涵盖4-log单位范围的8个浓度。GraphPad的非线性回归分析将是用于确定得自剂量响应实验的IC50和Hill slope值。各个曲线将是适于1和2-位点模型以确定最佳的拟合。抑制常数(Ki)是通过Cheng-Prusoff方程衍生自IC5O值(Cheng，Y.C.& Prusoff，W.H.，1973年)。

结合上的离子的电位效应将是通过测定缓冲液中变化的钙、钠和钾浓度试验。取得最佳水平的特异性结合的那些浓度将是用于筛选测定。

使用新的结合测定和扩大的库收集的化合物获得的结果将提供足够的数据密度以推导强有力的建模能力。关于那些证明有效能力的化合物，通过筛选结构上分组化的合物可以进一步扩大这种能力。该努力的结果将提供收集用于其化学多样性和趋同平衡的化合物。

基于在前述实验中获得数据，硅内筛选算法已经开发来建立和验证QSAR模型的矩阵。硅内筛选软件还可以是开发来有助于在此提供的算法的使用。QSAR模型的矩阵是使用设立的数据集衍生的并进一步基于在多种结合测定法中证明了活性的化合物的聚类。

离子通道作为多种疾病治疗的重要治疗靶点。在对人基因组理解上的最新进展揭示了大量的K⁺-通道亚型。结合，x-射线晶体学上的进展还得到了大量的K⁺-通道模型。大量的K⁺-通道，其不同的组织分布及生物学/生理学功能为以通道特异性方式调整通道活性的药学上重要的药物的研发提供了新的途径。

使用我们所有的数据，任何基于化学结构的数据询问工具可以用于SAR研究。我们经常使用回归递归划分(RP；Chen等人，1999年；Rusinko等人，1999年；2002年)和其他计算软件工具来询问数据集并推导结构活性关系(及结构-无活性-关系)。RP的优点是其处理大量结构-活性关系(SARs)共存的能力，以及相应地分类和集合这些关系的能力。此外，这个手段提供了模拟和预测非线性SARs的能力，当处理不同的化学数据集及与大分子的多重结合位点及定位的分别相互作用时这是是常见的现象。用于这类分析的一类商用软件包是ChemTree(GoldenHelix)。

一般地，统计的分组较其他处理算法常常是高级的，而且更加通用。当评估由暴露于不同种类的化学药物、作用的多种模式(激动剂、拮抗剂、部分激动剂、反激动剂等)、分子相互作用的不同取向得到的“活性”数据时，这种通用性是更显著的。以下的讨论涉及描述GPCR受体的数据集合。与特定活性相关的化学描述符可以是从缺乏相同活性的那些描述符中分离得到的。使用递归分类成包含与特定活性正性(positive)/负性(negative)的描述符，图12表示分离的化学物质的典型实施例。

使用与确定生物学活性相关的描述符，增加了发现具有特定活性的化合物的可能性；然而，使用缺乏这些正性描述符可能导致鉴别无活性的化合物(对抗不重要的靶点)。即是，可以使用正性描述符来发现可能与特定靶点相互反应的化合物(例如，得自组合物的库提供者)。然后，结果列表可以是用描述符连续地“整理”，所述描述符对于与远离蛋白质或受体的电位统计学上的关联是负性的。由这个分析得到后来和最终的化合物名单将是“活性偏斜的(activity biased)”小分子的浓缩的群。

这个＂连续硅内筛选＂手段将转换成发现化合物的更好的概率，所述化合物对于感兴趣的受体是活性的，对于非靶点蛋白质是无活性的。先前，我们进行研究以鉴定多巴胺D1选择性化合物。使用相继的“+/-”筛选方法，能够选择在多巴胺D2、血清素5HT2和肾上腺素能的β(1，2)受体中是D1选择性的化合物。这些7g-蛋白偶联受体(GPCR)证明了显著的序列同源性。我们使用1,573个化合物x7个生物学靶点的的full-rank训练矩阵来建立个体的分配树形图。各个“树形图”是与个体靶点相关的；所有树形图是用相同的化合物集合构造的，对于数组内的7个靶点任一是公平的。

从商业卖主购得的250,000个实际化合物的最初的库，为SD(数字编码结构文档)的形式，使用多巴胺D1-分配树形图的“正叶(positive leaves)”，编译了＂long＂名单的因为存在“正性”描述符而统计学上可能与D1反应化合物(～40,000)。由于靶点共享显著的序列同源性，不能排除这个名单的化合物与数组内的受体的反应性。然而，这种“长(long)”名单进一步用其他六个“树形图”的“负叶(negative leaves)”“整理”。“整理”过程使用“负”结点(叶)来从已经表现(硅内)可能性的D1(T7)活性的40,000个化合物的名单中选择化合物。各个“整理”步骤提供更少量的亚类，所述亚类可能是有效对抗D1和不可能是有效对抗集合中的另一个靶点，因为名单是“使用D1的正叶和其他树形图的负叶挑选的”。最终的亚类，比最初的群更小，包含具有用于D1的正性化学描述符和用于其他靶点的负性描述符的分子。名单然后使用药物类似物的“Lipinsky的5个规则”及不同的评估进一步“整理”，以提供最终406个化合物库，代表最初长名单的1％，或250,000个虚拟化合物的最初库的0.16％。最后，通过硅内研究所选的406个化合物是在实验室中筛选，在10^-7M下对抗7-靶点数组。获得了代表5个明显不同的化学结构分类的34个化合物，其对于D1受体显示了大于50％抑制活性。这个构成8.5％的命中率并证明命中率(或生产率)上的85-倍增加，如比较随机化学药物库的常规筛选(0.1％的命中率)。此外，9个化合物显示了对于D1差不多的完全特异性(与D1反应的活性是大于与相同数组中的任何其他化合物反应活性的5倍)，某一化合物显示了以nM(Ki～10^-7M)计的特异性结合能力。

简言之，这个研究证实了，“硅内概率差别筛选”可以是转变成实际的体外选择反应性乃至在给定的GPCR靶点集合中的靶点特异性。这个结论是反映在图13的“景观图”中。对于7个GPCR靶点的406个化合物的筛选结果是以“配对类型”方式绘图。全部的活性化合物移动至表示多巴胺D1结合能力的轴；此外9个化合物证实了与多巴胺D1的差不多的特异性结合能力。

在此，所述离子通道数据集的开发将增强特定K⁺-和其他离子通道的知识。提出的筛选数据集及其逐渐包括的其他离子通道(特别是其他K⁺-通道亚型)的药理学信息，提供了系统发现特定离子通道亚型及特定调节其活性的药物的机制。

基于结构-活性关系数组的预测模型(计算软件和数据集)已经建立于化学描述符和在HERG通道上的不同结合位点(测定)的数组观察得活性之间。在此所述的计算工具，像任何其他筛选工具，不是设计来代替药物安全的临床监测；像其他筛选方法学，宁愿用作评价工具，用以特定安全性担忧。

如先前涉及的，E-4031，有效的HERG K+ -通道抑制剂(功能上观察的)，在涉及阿司咪唑的结合测定中没有证明显著的结合能力。因此，E-4031在HERG蛋白质的非阿司咪唑结合的位点上“释放”其效应。基于E-4031、多非利特和阿司咪唑的化学结构及这些药物的药理学分布，显示了E-4031结合这样的区域，所述区域“桥联”或重叠多非利特和阿司咪唑的结合位点的一部分。在HERG K+-通道的细胞外区域存在另一种报道的可以影响K⁺-流的肽毒素结合位点。使用适合的结合测定将进一步表征这些位点各自。

为了鉴定所有可能影响通道活性的小分子结合位点，所述位点并非是那些依赖筛选实质上的化学库的已知位点。据报道，存在10⁷⁰治疗可能性化学实体(Valler and Green，2000年)。特别地，存在约1.5-3百万个(10⁶)商业上可得到的化合物，仅有大约一半的化合物认为是具有合理的性质(纯度和完整性)以药物发现方法中评估。

将选择5个最受好评的化学物质供应商，要求各个供应商提供2,000-2,500不同化学化合物的选择。将汇编这些化合物，使用Lipinski的5个规则对药物样的性质进行多余消除和分类。我们最初的目标是得到大约10,000(10⁴；抽样～1％的总体区域)化合物分筛选库，所述化合物代表商业上可估计的化学分子。基于功能测定用细胞中HERG-蛋白筛选这个库，将提供反映化合物区域的种子数据集，在其中开始了大多数的药物发现；某些“命中”可能影响已知位点的离子通道活性，其他的可以通过不同的位点起作用。

整体的化合物收集(10,000+)将是用于活性试验，使用含Flexstation的DiBaC₄HTS测定法(膜电位染料)。由于测定相对低灵敏度，所有化合物是在10^-4M(100μM)下一式两份试验活性。在降低错误的负性的尝试中，底物浓度将是约10-100倍高于常规HTS的浓度。

在基于细胞的功能测定法中显示了任何活性的化合物将在三个已经开发的放射性配体结合测定，即阿司咪唑、E-4031和肽毒素结合测定中表征。记录在三个特定测定法的任何之一中那些显示的结合能力。功能测定和结合测定之间的特异质，即显示功能作用而从任何特异性测定中没有任何“读数”的那些可能是与不同于已知那些的位点反应的分子。这些分子提供了关于新的和不同结合位点的信息。

显示了HERG功能活性而对于已建立的结合测定的名单没有任何指示的结合事件的化合物将试验HERG蛋白质“功能的”活性(再次)，使用检测方法：1)原子吸收和(如果化合物未能确定活性)再采用2)使用相同重组体细胞的path clamping方法以便进一步证实最初观察的功能活性及在扩张同位素标记化学底物之前消除可能的错误正性(可能由于高底物浓度的人工制品)。功能测定中最有效的化合物然后将用放射性同位素例如³H标记，以开发另外位点专一的结合测定。

证明和确认活性的任何化合物将用作结构模板来搜寻化合物，所述化合物享有相同商业上实体的子结构组件。然后，使用相同panel的体外测定法(结合和功能)试验这些化合物，然而证明可确定活性那些将用作结构向导和模板以鉴定另外相似的化合物。药物发现中我们的经验已经表明，有可能用得自商业上实体的化合物(约50-100个化合物)进行2-3次这样的重复。具有相同大小的50-100个变化活性程度的同族元素，可以基于鉴定活性相关的化学描述符建立足够强的统计模型。

如实施例1涉及的，QSAR算法描述了相关化学描述符和观察的生物学活性的潜能之间的数学关系，即活性Y是描述符X的函数，[Y＝f(X)]。化学实体可以是通过不同的化学描述符表示(描述)为子结构组件或部分，化学官能团的距离、或小分子的空间的2D或3D拓扑学、电化学、电物理学及或量子力学性质。当不同簇的化学物质与蛋白质在特异性位点范围，这些描述符的一些发现是双分子相互反应的贡献因素。

如以上提出的，用于预测潜在的HERG活性的本发明的QSAR算法是使用QSARIS、罐装软件、建立不同QSARs的工具包产生的。提供给使用者多种可能性来用不同位点的分子描述符、不同回归算法及配对使用的遗传算法(GA)“操作”。

程序提供了分成3类的缺省数的250个化学描述符，2D描述符承担结构信息为2维拓扑对象(5个亚分类，～200+个描述符)；3D描述符，其是基于量子力学和物理化学计算的物理性质的集合(2个亚分裂，24个描述符)，某一一般的描述符即logP(分配于水比有机溶剂的化合物的度量)。

程序还提提供了数据询问中的不同算法，包括常规多次(OMR)、分段(SWR)、所有可能的亚类(PSR)及部分的最小二乘方(PLS)回归和遗传算法(GA)。根据数据的类型(主要是大小)，其可以用描述符和算法的不同组合实验，以检验和建立实验模型。这些模型是实验上确认的，即在实际的体外测定中试验已预测活性(无活性)的化合物。

当处理数据集相对小的样品量时，最初数据的独立-非独立变量(命中数)、通常的多元回归(OMR)对于数据处理应当是足够的，其不应当排除使用者尝试其他方法，特别当多重共线性是未知的时。在实施例1中我们使用OMR，因为其是回归分析的最简单的方法。常规的多元回归配合的GA计算了若干非独立变量(描述符)中的最小二乘方适于独立变量(％抑制)。回归方程的形式是Y＝b₀+b₁·X₁+b₂·X₂+...+b_p·X_p；其中Y表示％-抑制(或潜能)而X表示不同的化学描述符。

化学描述符的选择对于模型建立是重要的，即需要监督“学习”。最好“代表”化合物集合的不同化学描述符的组合是使用2-维描述符的集合实验上确定的。使用2D描述符的原因是简单地，因为可得到的描述符数量及与医用化学的容易(可理解)连接。

如实施例1中提出的，24个化合物显示了对于HERG K⁺-通道“活性”的不同抑制潜能。这些潜能然后使用三个参数进一步平行表征：1)结合、2)与膜电位染料的整个细胞功能及3)含有AA。我们设置结合亲和力为化学的HERG K⁺-通道“活性”，理解为结合亲和力的程度(潜能)可以或不可以等同于“功能”潜能。

实施例1中产生的数据集的大小接近从来自商业源的化合物的反复筛选过程中发现的典型系列的化合物的大小。即是，典型筛选多种化学药物库(具有2的多余，在集合中仅有2个相似化合物)，可以发现活性导联为单峰(没有任何其他相似的命中)或双峰(两个结构相似命中)。使用“命中”的结构为模板库，可以收集20-30或更多结构同族元素的二级(或三级)焦点(focus)。

我们将使用不同的分类方法，如RP，其可以用于完成实际的数据集。在此情况下，由1)结合测定和/或2)功能测定的产生的实际数据集，将识别代表不同化合物结构和种类的提示化合物。我们的经验建议，这将是分散和非均质的数据集，因此发展QSAR关系最初是困难的。因此，我们富集化合物，从可能“表示”化学信息的地方。我们还将富集各个化合物或具有另外类似物的化合物的任选各个分组。我们还将1)使用来自分配树形图的正性“leaves”富集各个分组，以富集具有正性筛选命中的各个分组；和2)在QSAR构建的回归模型中使用RP分组亚类化合物。因此，聚类回归方法还将用于增加我们的计算模型的构建。

选择在所有三个测定中证明了一致和相关有效活性的化合物用于进一步研究。这些包括GBR12909、GBR12935、特非那定、匹莫齐特、舍吲哚和氯非铵。这些化合物包括常见的结构元素：1)氮的哌嗪基(GBR12909、GBR12935，)或哌啶基(特非那定、匹莫齐特和舍吲哚)，例外是四烷基铵基团的氯非铵，和2)这些氮至分子的疏水芳香族组分的相对穿过键的距离(～5)，其可能是认为推定的关于HERG蛋白质活性的药效团。如14中所示，绿色标记GBR 12909、白色标记GBR1 2935、红色标记特非那定、灰色标记匹莫齐特且蓝色标记氯非铵，分子调整表明，叔氮(哌嗪或哌啶的)和疏水芳香族环(或多环)的远离氮的5(或4)的键的之间的距离在其与HERG K⁺-通道蛋白质的一致活性上是起作用因素，而且来自氮(或苄型位置)的“4^th-原子”可以是氢键供体和受体的SP³-碳或杂原子如-O-或-NH-。实际上，用于该研究中剩余18个化合物中的10个包括胺碘酮、impiramine、阿司咪唑、赛庚啶、苯海拉明、氯氮平、氟哌啶醇、利培酮、维拉帕米、西沙必利，也可以是在相同的SAR构型内“成直线(aligned)”。似乎这些16个化合物代表可能的适合的小分子定向，反映如阿司咪唑结合表示的HERG蛋白质的结合位点。这种SAR观察是与使用催化剂的Lilly′s小组(Ekins，等人，2002年)公开的3-维QSAR研究一致的。该研究报道，证明HERG蛋白质结合活性的小分子的重要特征是疏水球状物的距离及可电离的特征。这是与本文所述的SAR一致的，即是可电离基团是相当于叔氮，疏水的球状物是相当于芳香族部分占据的空间。

然而，采用SAR-模型，仍然困难的是解释在基于染料的尼卡地平的测定中缺乏官能团活性，除了来自叔氮的4^th-原子是SP²构型(相似于E-4031)而且芳香族单位不是共轭的苄基。

七种其他化合物可卡因、奎尼丁、酮康唑、红霉素、普萘洛尔、E-4031和索他洛尔在本SAR模型中似乎不是适合的。不论其“功能读数”可以是多少(至少在两个功能测定之一大部分有效的)，几乎所有他们在阿司咪唑位点显示了低结合亲和力。这些化合物的某些缺乏可证明的亲和力，这可以归因于多种因素例如测定法的pH或温度。普萘洛尔和奎尼丁活性看起来好像是测定的pH条件所影响。

重要地，使用E-4031和索他洛尔获得的结果表明存在另外的HERG结合位点。这两个化合物属于“HERG K+ -通道活性”甲磺酸苯胺类的家族，其包括化合物如MK-499，(灰色)，包含在图15中。这个观察结果是与使用丙氨酸-扫描的诱变的最近的研究一致的。Mitcheson等人(Sanguinetti′s小组)报道，“结合位点，采用同源性建模确认的，是由位于S6跨膜区域上的氨基酸(G648、Y652和F656)及面对通道的空腔的HERG通道亚单元的孔(T623和V625)组成。特非那定和西沙必利与Y652和F656相互作用，但是甲磺酸苯胺类的高亲和力结合位点可以涉及不同的氨基酸残基”(Mitcheson等人，2000年)。因为E-4031一贯以两个功能性形式证明有力的功能活性，我们推定地命名这个潜在的新位点上E-4031位点。

HEK 293细胞中的膜片箝研究显示了，红霉素和克拉霉素在临床有关的浓度下显著地抑制了HERG钾流。红霉素以浓度依赖方式降低HERG编码的钾流，IC50为38.9μM。克拉霉素产生相似的浓度依赖阻滞，IC50为45.7μM(Stanat等人，2003年)。在适当修改的实验条件下使用我们的功能评估，获得相似的观察结果。在另一个报道中，“力学研究显示了通过克拉霉素的HERG流通的抑制不需要激活通道，并且是电压及时间依赖的。阻滞时间过程可以是通过药物和通道之间的一级反应描述的。结合和未结合的过程看起来似乎是加速的，因为膜是更加去极化的，表明药物-通道相互作用可以通过静电反应影响的”(Walter等人，2002年)，其可能指出分子相互作用的另一个位点，并非疏水相互作用支配的那些或疏水相互作用和离子相互作用组合支配的那些。

可卡因和酮康唑的结合位点以及这些位点上不同簇相关化合物也将是使用化学类似物及反复的结合和功能测定手段研究。

一般，筛选数据集的结构(SAR)分析已经产生了增加的结果。由此研究产生的信息如证明一致的活性的化合物的SAR研究是直接有关的，并就库设计和候选药物优化为医药化学家提供了指导。负性数据的分析及数据集之间的不一致性对于分子相互作用产生了洞察力，其可以推断是与生物学和结构活性有关的其他的离子通道。

在近年来，遗传算法已经广泛地用于组合的优化。遗传算法(GA)采用改进的操作以推动计算机辅助问题解决过程。在此所用的基本操作是随机突变及遗传重组(杂交)，而且其应用导致预先定义的选择标准的溶液的优化。这些方法与其他检索策略的差别是，其使用收集中间体溶液。然后，这些溶液是用于提出新的和希望改进的溶液的问题。关于GA的数学运算未进行更加详细描述，图16描述在QSARIS操作中GA的筛选尝试。采用这个软件，GA总是用于选择描述符的最佳子集，接着采用所选的统计操作来建立最终相关性(QSAR算法)。GA选择是便利的，“人的干涉”仍然是必需的以便揭露相同某些更少“明显”的因素，虽然如此其可能是重要的。在选择大体上化学物质描述符的子集的不同集合上我们最初的操作，是提供改进分析的不同的开始点(最初群)。

使用相同的数据处理技术(配对OMR的一致参数GA)和基于2D结构描述符的相同集合，结合数据集提供了使用高质量统计参数和交叉确认值证明的最强有力的模型“INH＝-22.18*SHBint2 Acnt+ 2.957E+004*xvch9+7.321*SaaCH acnt-28.63*SaaN acnt+ 24.52*Hmaxpos-50.3428(方程1)”。

模型强调了两个活性起作用因素的重要性：1)依据烃化合价、分支化(2.957E+004*xvch9，拓扑链/分组计数，连通性)及芳香烃的总数(7.321*SaaCH_acnt，E-态)的疏水性-芳香性；及2)最大的“可电离”的正性改变(24.52*Hmaxpos；E-态)。所有这些观察结果是与结构-活性关系分析一致的；即是HERG活性的重要性是通过1)芳香族球状物(7.321*SaaCH_acnt)、可质子化氮的可电离的正性改变(24.52*Hmaxpos)及这些两个“因素”(局部描述为(2.957E+004*xvch9)之间定义的距离确定的。两个其他结构元素看起来好像是消极影响与HERG的化学相互作用；一个因素是分子间或分子内氢键，其是与采用能够形成这些键的分子的SAR研究是一致的。另一个因素是芳香族氮的总数。

Rb-流量模型可以是通过消除我们称为统计学上的“过度分配”改进的。实际上，这反映了描述符选择上“人干涉”的实例。所所示的，衍生自RB+ -流量-AA检测方法的算法最初是描述为＂INH＝ -7.627*Gmin+766.6*xvch6-16.7*SdCH2+17.82*StsC- 8.633*SsOH acnt-14.254(方程2)。在各自算法中存在两个描述符，描述为正性(+17.82*StsC)和负性(-16.7*SdCH2)，有助于活性。当描述符是与化学-生物数据集相关时，我们鉴定，各个描述符仅仅是由一个分子：SdCH₂，“＝CH₂”，奎尼丁(#7)的部分；及StsC，“-C≡N”，维拉帕米(#21)的部分。

当两个描述符之一(例如SDCH₂)是从所选130个描述符名单中“未选择的”(阻挡的，或从描述符表中除去)，数据询问产生了显著改进的模型：“INH＝-41.09*SHBint3 Acnt-14.49*xp4+ 625.9*xvch6+2.83*k0+1.03*SHBint2+15.6723(方程3)”；具有质量参数如“多次R-平方＝0.9113；估计的标准误差＝11.11；F-统计值＝34.95；P-值＝2.299E-008；多次Q-平方＝0.8396；交叉确认RSS＝3799”。分析指出，通过回归方程训练集合是很好描述的，其在统计学上是非常显著的。交叉确认显示了，构建的模型可以是用于预测该功能测定中百分比抑制(INH)的值。尽管，这种算法中包含的化学描述符不是直接明白和如先前的可理解的(对医药化学家)，其表明在烃化合价、分支和簇(-14.49*xp4+625.9*xvch6)及k0指数(信息量和图顶角数等)中的重要性。注意是k0＝I^*(nvx)，其中nvx＝图y顶角、氢化物基团和非氢原子的数目，其描述符将在以后的实验的其他实验模型中发现。

在一实验中，我们选择仅使用电子-拓扑状态(E-状态)指数和分子性质(包括式量(fw)、分子中化学元素的数量、图形顶角数(非氢原子数、氢化物基团如-CH₃、-OH等数量；nvx)、氢键受体和供体的数)的组合，其提供了44个不同化学描述符的名单。化学描述符的这种集合不包括2D连通性组分，在先前询问中其表明是重要的。使用组合的遗传算法及平常的多次回归，计算程序产生算法：“INH＝-11.26*numHBa-11.74*SssO acnt+20.73*SsF acnt- 64.62*SddssS acnt+12.26*SHBint8 Acnt+0.3362*fw-18.4559 (方程4)”。这种算法加权数据集中不同杂原子的贡献，并且是与化学观察是一致的。结合亲和力可能是与分子的大小是相关的(而且还可以与先前模型中的k指数、形状相关)，以“填充”分别的结合腔/缝，因此式量积极有助于活性；扩张的(8-键)分子间氢键可能有助于稳定确定的各自结合构象，因此是另一个积极确定的因素。对于描述符SHBint8_Acnt而言，阿司咪唑和尼卡地平“显示了”可能的具有8-键距离的内部氢键。索他洛尔和红霉素还证明了相同可能的内部氢键，然而存在另一个胜于内部氢键贡献的因素。对于高充氧的红霉素而言，消极贡献的可能氢键受体与氧的总数之和(-11.26*numHBa-11.74*SssO_acnt)大大地胜于扩张内部氢键的积极贡献。对于索他洛尔而言，显著的消极贡献因素来自氨苯磺胺的贡献(-64.62*SddssS_acnt)。“-F”的贡献(+20.73*SsF_acnt)是具有卤素取代基的有效抑制剂的数的原因。

相同数据是通过“封闭”描述符“fw”和扩展内部氢键(>8)进一步评价。然后矩阵减少为37个E-态描述符和具有其各自抑制潜能的24个化合物的矩阵；得到的OMR算法表示为：“INH＝2678*nyx+ 6.632*SaaCH acnt+ 32.06*SaaaC acnt-53.97*SaaN acnt- 9.533*SssO acnt-66.9227”(方程5)。除了图的顶角数之外，“nvx”，其表示为非氢原子数和氢化物原子数(涉及分子的大小和重量)，部分地描述描述符，与先前讨论的“模型”相似。

除了用于产生以上比较模型的2D化学描述符之外，我们放宽描述符选择以包括通常的分子性质及性质如“cLogp”值；如成果说明模型如：＂INH-11.31*LogP+204.4*xch6+1.806E+004*xvch9- 43.29*SaaN acnt-39.0381(方程6)，具有统计质量参数如“多次R-平方＝0.9069；估计的标准＝14.62；F-统计值＝43.85；P-值＝4.803E-009；多次Q-平方＝0.8149及交叉验证RSS＝7651”。由于某些相似的“术语”，训练库通过回归方程是很好地描述，其是统计学上显著的。交叉确认显示了构成的模型可以是用于预测百分比抑制。比较仅用2D描述符集(130个描述符，方程1)衍生的算法，logP的值明显地取代芳香烃和可电离基团的“计数”。

当扩展描述符集合为包括3D化学描述符时，我们使用不同的手段。2D至3D结构的转化是使用由软件提供的比索洛尔(TM)构造器完成的。描述符是使用不同的量子力学或物理化学考虑因素计算的物理性质的集合。默认的3D描述符的集合是细分成两个亚类：1)一般-这是表征分子的形状和尺寸(表明、体积和卵形面)以及原子电荷、偶极矩和使用Gasteiger方法计算的极化率的11个描述符的集合；和2)分子力矩-这是比较分子力矩分析(CoMMA)的13个描述符的集合，其表征惯性、分子的偶极矩和四极矩的力矩的绝对值和组件。然而，与此相反，通过先前的手段，当在我们的数据分析中包括3D描述符时，开始数据集的相同矩阵24化合物(＝24活性分布)x(160，2-和3-D描述符集)，但是各个实验的区别在是不同“条件”的选择，在所述条件下获得“遗传进化”，即不同“亲代”、交配“行为”、突变“机制”及生殖和后代的概率和最大数。在很多迭代OMR模型中，看起来似乎是足够强有力并强调相似和不相似的化学描述符的集合，以下的算法证明了我们实验-1)INH＝ 0.02316*Ix+6.044*SsssCH-5.182*SssO-27.9*SdsN acnt- 98.31*SddssS acnt+12.65*ka3-5.9066(方程7)和2)INH＝- 41.46*P-6.323*SssO-122.1*SddssS acnt+12.72*ka3+ 2.537*Gmax+0.01082*Ix+71.43*Pz-1.65149(方程8)的结果。算法提供充分有力的统计参数和交叉确认结果，以致于模型在活性预测中具有能力。

结论，基于统计分析，清楚的是放射性配体结合测定产生最适合和内部一致的数据的集合。回归模型描述了显著地影响HERG K+通道上的活性的化学描述符的数组，其也是与结构-活性关系一致的。

采用这种数据集，我们从大量反复的不同计算实验(>80)、描述了(加权)不同的化学描述符及其同分别观察的活性(结合)的分别组合之间的有力的统计关系的各个算法(模型)中推导了算法的panel(数组)；算法数组表示了影响化学-HERG蛋白质相互作用的化学描述符的显著部分，并有效地预测了在阿司咪唑结合位点和其他具有信度的位点上潜在的HERG活性。

为了试验这些QSAR模型的可靠性(或预测的能力)，我们建立了验证实验。这些实验设计来预测或预言不在训练集合中的化学物质的活性，使用推导的QSAR数组，然后在相应的体外HERG结合测定中试验化合物(具有预测水平的活性)。如先前所示的，建立多次QSAR算法，各自描述了化学描述符的不同集合。算法组合的示意图是显示在图17中。

在扫描2000个化合物、主要给药法、测定参考剂或其他先前已知的生物活性化合物的化学药物库中使用这些模型。预测的等于或超过50％的抑制认为是有效的。通过所有5个模型(5/5)同时表明≥50％抑制的化合物是标记为“高度可能有效的”；5个模型中的4个(4/5)是“可能有效”；5个中3个(3/5)是或许有效的；5个中少于2个(≤2/5)是不可能有效的。

就与HERG和其他离子通道相互作用，使用选自我们所有的实际的数据集(用约1百万入口的不同供应商的SD文档编译)的化合物的不同集合，我们将评估不同的化学药物库。描述符分组将用于药物样标准的选择，采用计算工具如DiverseSolutions(Tripos St.LouisMiss)。图18中的图表示了从153,000个实际结构文档中最近选择的7,030个化合物的三维主要成分分析。基于编码拓扑学、形状、大小、极化率和静电参数的30个描述符分组化合物。为了减少维数，使用主要成分分析，用于产生7,030个化合物的多样性集合的分组是基于12个主要成分分析。

医药化学-规则和滤器是用于这种选择(7,030个实体)，如1)分子量是介于250-800；2)cLog介于0.5-6.5；3)旋转键的数量<10；4)杂原子的数是<10(不显示数据)；5)氢键供体<5；而6)H-键受体<10。另外地，不希望的(不稳定的)化学官能团如-CHO、-COX、-OCOX、-COOOC-、-SH、NCO、NCS、SO₂X是真是消除的。必然地，得到的7,030个实体是如图19中指出的分子性质的分布，方格a-e。

将以来自所选合理地代表易接近的化学空间的供应商的汇编的化学结构(数据集)的大量基础的方式使用相同的过程。意欲最初收集(取样)大约10,000个化合物，和2)以我们命中的筛选程序试验这些化合物。

然后，我们将进行命中-扩展分析以扩展生物学测定鉴定命中的“总体”，借此建立有力和可靠的预测模型。模型是基于适当数量的样本统计学上构建的，所述样本表示化学描述符和分别观察的HERGK⁺-通道活性之间的统计学上的显著性。

不利地影响钾流量的药物可以导致严重的健康后果，包括死亡。表4提供了对于本发明的硅内筛选方法是稳定靶点的钾通道的目录。

表4

Kv1.1-1.8       Kca5.1         K2p10.1

Kv2.1-2.2       Kir1.1         K2p12.1

Kv3.1-3.4       Kir2.1-2.4    K2p13.1

Kv4.1-4.3       Kir3.1-3.4     K2p15.1

Kv5.1           Kir4.1-4.2     K2p16.1

Kv6.1-6.3       Kir5.1         K2p17.1

Kv7.1-7.5       Kir6.1-6.2     CNGA1-CNGA4

Kv8.1           Kir7.1         CNGB1

Kv9.1-9.3       K2p1.1         CNGB3

Kv10.1-10.2     K2p2.1         HCN1-HCN4

Kv11.1-11.3     K2p3.1         TRPC1-TRPC7

Kv12.1-12.3     K2p4.1         TRPV1-TRPV6

Kca1.1          K2p5.1         TRPM1-TRPM2

Kca2，1-2.3     K2p6.1         TRPM4

Kca3.1          K2p7.1         TRPM6-TRPM8

Kca4.1-4.2      K2p9.1

符号-符号指的是存在的所有序列号。

来自“The IUPHAR Compendium of Voltage-gated Ion Channels＂，William A.Catterall，K.George Chandy和George A.Gutman编辑，由IUPHAR媒体2002年公开。

某些已知的K⁺-通道配体缺乏靶点特异性。这样化合物的实施例是列于表5中。大多数的这些化合物已经是RSMDB收集的部分，已经分别地描述对抗对于广泛受体、酶、运载体和离子通道(Ca⁺⁺和Na⁺)的数组的活性。我们将评估这些化合物，与以上列出的钾离子通道的相互作用，包括与HERG通道的相互作用。

表5

重要的离子通道(K+)-相关的化合物

1-乙基-2-苯并咪唑啉

(1-EBIO)               西沙必利            氟哌啶醇       昂丹司琼       他克林

5，8-二乙氧基补骨脂素  氯米卡兰(HMR1883)   氟烷           P1075          替地沙米

乙酰唑胺               氯非铵              HMR1098        Paxiline       特非那定

黄曲霉震颤毒素         克霉唑              HMR1556        震颤毒素A      tertiapin

阿莫兰特               氯氮平              HMR1883        PI1-NH         thiopiridazine

氨巴利特               可卡因              伊布利特       PI1-OH         甲苯磺丁脲

阿米替林               CP308408            丙米嗪         毛果芸香碱     TRAM-34

蜂毒明肽               CP-339，818         Isofluorane    匹莫齐特       三氟拉嗪

阿普卡林               色满卡林            酮康唑         吡那地尔       Tskappa

阿司咪唑               赛庚啶              L735821        哌仑西平       筒箭毒碱

阿齐利特               DCEBIO              L-768673       PNU-37883A     U89232

苄普地尔               Dequalinium         利诺吡啶       PNU83757       UCL 1608

BIIA0388               DHS-1               氯雷他定       PO5            UCL 1684

比卡林                 二氮嗪              甲氟喹         奎尼丁         UK 78,282

BMS-180448             Dilitazem           甲基黄嘌呤     瑞格列奈       震颤真菌毒素

BMS-189269             DMP543              米诺地尔       瑞替加滨       WAY133537

BMS-191095             多非利特            MK-499         利鲁唑         WAY151616

BMS-204352             D-索他洛尔          那格列奈       Rimakalim      WIN 17317-3

BRL32872               E-047/1             尼可地尔       RO 316930      XE-991

布比卡因               E-4031              硝苯地平       卢帕他定       YM-099

辣椒辣素               益康唑              尼莫地平       RWJ 29009      YM-934

卡马西平               F3                  NDP            S 9947         ZD0947

西替地尔               氨吡啶(4AP)         NIP 121        SDZ 217 744    ZD6169

CGS7181                氟卡尼              NS 004         SDZ PCO 400    ZM244985

氯丙嗪                 格列吡嗪            NS 1619        司美利特       氯苯唑胺

氯磺丙脲               格列本脲            NS 8           舍吲哚

氯唑沙宗               氯氟菲醇            NS1608         西帕曲近

色原烷醇293B                               尼群地平       Symakalim

大多数的化合物这些化合物(命中)是从组合化学的商业供应商购得。此外，这里有很多可得到的类似物。根据我们的经验，每次命中，通过结构组件分析及或其他范畴的化学描述符，我们可以发现大约30-50个类似物。因此，为了扩大“命中名单”，我们将获得在相同排列的测定如第二代聚焦(与多样性相反)化学药物库中是相似和用于活性的试验的那些，以得到用于统计建模询问的足够的数据。

我们已经描述了过程，在其中我们探究和询问反映大分子的特定位点上的双分子相互作用的多维度的有力数据集。该过程提供了定量的SARs的有力集合，各自反映了化学描述符的及其关于相对结合亲和力的组合的不同的统计学的贡献。作为矩阵，这些关系提供了有力的统计学上的预测模型。

使用所述的新的测定法和手段，我们应当获得大量和高密度的数据集。最初，使用基于化学描述符如上述的2-维拓扑化学描述符连同递归分类的分组方法，询问整体的数据集。值得注意的是指出，RP不仅仅是可得到的工具和算法。目前，我们从GoldenHelix(ChemTree的制造商)获得许可的源代码(Java)，用于从摩尔和SD文档中产生2D拓扑化学描述符。采用这个工具，我们可以产生“相互作用表”，其连接和联合分子及其基于描述符的分别的结构与它们各自的生物活性。其他数据处理方法，如1)Forgy和Mc Queen算法的“K-Means”(Hastie，2001年)，基因数组分析上普及的数据处理技术(Corbeil等人，2001年；Fink等人，2003年)，其很好地作用于大量和“不规则”(失去的数据点)数据集，或2)杂种处理方法如HAC，其使用组合手段来以两步建立分类树。我们可以(1)使用“快速”分组方法(K-Means)来产生很多低水平的聚类，并且(2)使用这些分组用于dendogram构造(Wang，1982年)；或3)使用更多“冗长的”分类和回归算法(Radivojac等人，2004年)，具有程序如DTREG(www.dtreg.com/technical.htm)，其对于小的、密集和连续的数据集询问良好。试验不同数据处理技术的点提供了进一步的方法以实验性确定和以识别“最可能性”结构分组(SAR分组)，其可以是进一步询问有力的QSARs。

为了解旋(de-convolute)或译解不同的分子结合位点，我们利用组合功能和结合手段，借此把高维度(异种多样的位点)“相互作用”分成更小的集合的位点特异性(更低的尺寸)相互作用，使用生物化学测定手段，即各个更低尺寸数据集，反映在大分子特异性位点的双分子相互作用的集合，所述大分子可以是更可靠把握和询问的。

简言之，我们开发了可靠的方法和系统，用以预测HERG蛋白质相互作用的模型。算法的数组已经建立，反映了观察的生物学活性(含有HERG蛋白质)和描述对于观察的活性负责的化学结构组件的基本的化学描述符的数学上的关系。这些算法是能够分级化学物质，根据其是否具有与HERG蛋白质的潜在的反应。使用这些算法，在化合物采集(或库设计过程)时或先于虚拟的化学物质库转化成显示的化学物质库时，医药化学家将能够“扫描”化学物质库。就便利而言，算法应当是在库设计过程的早期完成，以便避免产生具有明显HERG-不利的化合物。

描述了实施例I和II中利用的试验化合物的参考

苯海拉明

I)Zareba W等人，Electrocardiographic findings in patients with diphenhydramine overdose，Am J Cardiol，1997年11月，80卷(9)：1168-73页。

2)Wang WX等人，“Conventional”antihistamines slow cardiac repolarization in isolated perfused(Langendorff)feline hearts，JCardiovasc Pharmacol，1998年7月，32卷(1)：123-8页。

Ergtoxin

3)Pardo-Lopez L，Garcia-Valdes J，Gurrola GB，RobertsonGA，Possani LD，Mapping the receptor site for ergtoxin，a specific blocker of ERG channels，FEBS Lett，2002年1月，10卷(1-2)：45-9。

BeKm-I

4)Korolkova YV，等人，New bindingsite on common molecular scaffold provides HERG channel specificity of scorpion toxin BeKm-I，J Biol Chem，2002年11月，277卷(45)：43104-9页。

5)Korolkova YV等人，An ERGchannel inhibitor from the scorpion Buthus Eupeus，J Biol Chem，2001年3月，276卷(1)：9868-76页。

维拉帕米

6)De Ponti F，Poluzzi E，Cavalli A，Recanatini M，Montanaro N，Safety of non-antiarrhythmic drugs that prolong the QT interval or induce torsade de pointes：an overview.Drug Saf，2002年，25卷(4)：263-86页。

7)Yang T，Snyders D，Roden DM，Drug block of I(kr)：model systems and relevance to human arrvthmias，J Cardiovasc Pharmacol，2001年11月，38卷(5)：737-44页。

8)Chouabe C，Drici MD，Romey G，Barhanin J，Effects of calcium channel blockers on cloned cardiac K+channels Ikr and Iks，Therapie，2000年1-2月，55卷(1)：195-202页。

9)Waldegger S等人，Effect of verapamil enantiomers and metabolites on cardiac K+channels expressed I Xenopus oocytes.CellPhysiol Biochem，1999年，9卷(2)：81-9页。

10)Zhang S，Zhou Z，Gong Q，Makielski JC，January CT，Mechanism of block and identification of the verapamil binding domain to HERG potassium channels，Circ Res，1999年5月，84卷(9)：989-98页。

11)Chouabe C，Drici MD，Romey G，Barhanin J，Lazdunski M，HERG and KvLQT1/IsK，the cardiac K+channels involved in long QT svmdromes，are targets for calcium channel blockers，MoI Pharmacol，1998年10月，54卷(4)：695-703页。

舍吲哚

12)Kongsamut S，Kang J，Chen XL，Roehr J，Rampe D，Acomparison of the receptor binding and HERG channel affinities for a series of antipsychotic drugs，Eur J Pharmacol，2002年8月，450卷(1)：37-41页。

13)Kang J，Chen XL，Rampe D，The antipsychotic drugs sertindole and pimozide block erg3，a human brain K+channel，Biochem Biophys ResCommun，2001年8月，286卷(3)：4999-504页。

14)Rampe D，Murawsky MK，Grau J，Lewis EW，The antipsychotic agent sertindole is a high affinity antagonist of the human cardiac potassium channel HERG，J Pharmacol Exp Ther，1998年8月，286卷(2)：788-93页。

利培酮

12)Kongsamut S，Kang J，Chen XL，Roehr J，Rampe D，A comparison of the receptor binding and HERG channel affinities for a series of antipsychotic drugs，Eur J Pharmacol，2002年8月，450卷(1)：37-41页。

15)Ekins S，Crumb WJ，Sarazan RD，Wikel JH，Wrighton SA，Three-dimensional quantitative structure-activity relationship for inhibition of human ether-a-go-go-related gene potassium channel，J Pharmacol，2002年5月，301卷(2)：427-34页。

匹莫齐特

12)Kongsamut S，Kang J，Chen XL，Roehr J，Rampe D，Acomparison of the receptor binding and HERG channel affinities for a series of antipsychotic drugs，Eur J Pharmacol，2002年8月，450卷(1)：37-41页。

16)Finlayson K，Turnball L，January CT，Sharkey J，Kelly JS，[3H]dofetilide binding to HERG transfected membranes：a potential high throughput preclinical screen，Eur J Pharmacol，2001年10月，430卷(1)：147-8页。

17)Osypenko VM，Degtiar Vie，Shuba IaM，Naid′onov V，Testosterone modulation of HERG potassium channel blockade induced by neuroleptics.Fiziol Zh，2001年，47卷(3)：11-8页。

18)Shuba M，Degtiar VE，Osipenko VN，Naidenov VG，WoosleyRL，Testosterone-mediated modulation of HERG blockade by proarrhythmic agents，Biochem Pharmacol，2001年7月，62卷(1)：41-9页。

19)Osypenko VM，Degtiar Vie，Naid′onov V，Shuba IaM，Blockade of HERG K+Channels expressed in Xebopus oocytes by antipsychotic agents，Fiziol ZhJ，2001年，47卷(1)：17-25页。

20)Kang J，Wang L，Cai F，Rampe D，High affinity blockade of the HERG cardiac K(+)channel bv the neuroleptic pimozide.Eur JPharmacol，2000年3月，392卷(3)：137-40页。

氟哌啶醇

21)CNRS-UPR 411，Valbonne-France，Cardiac K+channels and drug-acquired long OT syndrome，Therapie，2000年1-2月，55卷(1)：185-93页。

22)Suessbrich H，Schonherr R，Heinemann SH，Attali B，Lang F，Busch AE，The inhibitory effect of the antipsychotic drug haloperidol on HERG potassium channels expressed in Xenopus oocytes，Br JPharmacol，1997年3月，120卷(5)：968-74页。

氯氮平

23)Buckley NA，Sanders P，Cardiovascular adverse effects of antipsychotic drugs.Drug Saf，2000年9月，23卷(3)：215-28页。

红霉素

24)Volberg WA，Koci BJ，Su W，Lin J，Zhou J，B l ockade of human cardiac potassium channel human ether-a-go-go-related gene (HERG)by macrolide antibiotics，J Pharmacol Exp Ther，2002年7月，302卷(1)：320-7页。

25)Bell IM等人，3-Aminopyrrolinone farnesyltransferase inhibitors：design of macrocyclic compounds with improved pharmacokinetics and excellent cell potency.J Med Chem，2002年6月，45卷(12)：2388-409年。

26)Butrous G，Siegel RL，Sildenafil(Viagra)prolongs cardiac repolarization by blocking the rapid component of the delayed rectifier potassium current.Circulation.2001年6月，103卷(23)：119-20页。

27)Henz BM，The pharmacologic profile of desloratadine，Allergy，2001年，65卷：7-13页。

特非那定

28)Scherer Cr，等人，The antihistamine fexofenadine does not affect I(Kr)currents in a case report of drug-induced cardiac arrhythmia，Br J Pharmacol，2002年11月，137(6)：892-900页。

29)Rajamani S，Anderson，CL，Anson BD，January CT，Pharmacological rescue of human K(+)channellong-OT2 mutations： human ether-a-go-go-related gene rescue without block.Circulation.2002年6月，105卷(24)：2830-5页。

30)TaglialatelaM等人，Inhibition of depolarization-induced [3H]noradrenaline release from SH-SY5Y human neuroblastoma cells by some second-generation H(I)receptor antagonists through blockade of store-operated Ca( ²⁺ )channels(SOCs)，Biochem Pharmacol，2001年11月，62卷(9)：1229-38页。

31)DucicI，Ko CM，ShubaY，MoradM，Comparative effects of loratadine and terfenadine on cardiac K+ channels.J CardiovascPharmacol，1997年7月，30卷(1)：42-54页。

赛庚啶

32)Grzelewska-Rzymowska I，Pietrzkowicz M，Gorska M，The effect of secondgeneration histamine antagonists on the heart，PneumonolAlergol，2001年，69卷(2-4)：217-26页。

33)Kreutner W，Hey JA，Chiu P，BarnettA，Preclinical pharmacology of desloratadine，a selective and nonsedating histamine Hl receptor antagonist.2＂communication：lack of central nervous system and cardiovascular effects，Arzneimittelforschung，2000年5月，50卷(5)：441-8页。

34)Crumb WJ Jr.，Loratadinebl ockadeof K(+)channels in human heart：comparison with terfenadine under physiological conditions，JPharmacol Exp Ther，2000年1月，292卷(1)：261-4页。

35)Hey JA，Affrime M，Cobert B，Kreutner W，Cuss FM，Cardiovascular profile of loratadine，Clin Exp Allergy，1999年7月，29卷(3)：197-9页。

36)TaglialatelaM等人，Molecular basis for the lack of HERG K+ channel block-related cardiotoxicity by the H1 receptor blocker cetirizine compared with other second-generation antihistamines，MoIPharmacol，1998年7月，54卷(1)：113-21页。

西沙必利

37)WangJ，Delia Penna K，Wang H，Karczewski J，Connolly TM，Koblan KS，Bennett PB，Salata JJ，Functional and pharmacological properties of canine ERG potassium channels.Am J Physiol Heart CircPhysiol，2003年1月，284卷(1)：256-67页。

38)Paulussen A，Raes A，Matthijs G，Snyders DJ，Cohen N，Aerssens J，A novel mutation(T65P)in the PAS domain of the human potassium channel HERG results in the long QT syndrome by trafficking deficiency，J Biol Chem，2002年12月，277卷(50)：48610-6页。

39)Chen J，Seebohm G，Sanguinetti MC，Position of aromatic residues in the S 6 domain，not inactivation，dictates cisapride sensitivity of HERG and eag potassium channels，Proc Natl Acad Sci USA，2002年9月，99卷(19)：12461-6页。

40)Paakkari I，Cardiotoxicity of new antihistamines and cisapride，Toxicol Lett，2002年2月，127卷(1-3)：279-84。

41)Benatar A，Cools F，Decraene T5 Bougatef A，Vandenplas Y，The T wave as a marker of dispersion of ventricular repolarization in premature infants before and while on treatment with the KKr)channel blocker cisapride.Cardiol Young，2002年1月，12卷(1)：32-6页。

42)Potet F，Bouyssou T，Escande D，Baro I，Gastrointestinal prokinetic drugs have different affinity for the human cardiac human ether -a-gogo K(+)channel，J Pharmacol Exp Ther，2001年11月，299卷(3)：1007-12页。

可卡因

43)Zhang S等人.，Cocaine blocks HERG，but not KvLOT 1+mink，potassium channels，MoI Pharmacol，2001年5月，59卷(5)：1069-76。

44)O′Leary ME，Inhibition of HERG potassium channels by cocaethylene：a metabolite of cocaine and ethanol，Cardiovasc Res.，2002年1月，52卷(1)：6-8页。

45)Ferriera S，Crumb WJ Jr，Carlton CG，Clarkson CW，Effects of cocaine and its major metabolie on the HERG-encoded potassium channel.J Pharmacol Exp Ther，2001年10月，299卷(1)：220-6页。

酮康唑

46)Dumaine R，Roy M-L，Brown AM，Blockade of HERG and KvI，5 bv ketoconazole.J Pharmacol Exp Ther，1998年286卷(2)：727-35页。

丙米嗪

47)Teschemacher AG，Seward EP，Hancox JC，Witchel HJ，Inhibition of the current of heterologously expressed HERG potassium channels by imipramine and amitriptyline，Br J Pharmacol，1999年9月，128卷(2)：479-85页。

胺碘酮

48)Kiehn J，Thomas D，Karle CA，Schols W，Kubler W，Inhibitory effects of the class III antiarrhythmic drug amiodarone on cloned HERG potassium channels，Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，1999年5月，359卷(3)：212-9页。

49)Kamiya K，等人，Short-and long-term effects of amiodarone on the two components of cardiac delayed rectifier K(V)current.Circulation，2001年3月，103卷(9)：1317-24页。

奎尼丁

50)Paul AA，Witchel HJ，Hancox JC，Inhibition of the current of heterologously expressed HERG potassium channels by flecainide and comparison with quinidine，propafenone and lignocaine.Br J Pharmacol，2002年7月，136卷(5)：717-29页。

51)Po SS等人，Modulation of HERG potassium channels by extracellular magnesium and quinidine，J Cardiovasc Pharmacol，1999年2月，33卷(2)：181-5。

索他洛尔

52)Numaguchi H，等人，Probing the interaction between inactivation gating and Dd-sotalol block of HERG.Circ Res，2000年11月，87卷(11)：1012-8页。

E-4031

53)Spector PS，Curran ME，Keating MT，Sanguinetti MC，Class III antiarrhythmic drugs block HERG，a human cardiac delayed rectifier K+channel.Open-channel block by methanesulfonanilides.Circ Res，1996年3月，78卷(3)：499-503页。

54)Wang S，Morales MJ，Liu S，Strauss HC，Rasmusson RL，Modulation of HERG affinity for E-4031 by[K+]o and C-type inactivati on，FEBS，1997年11月，417卷(1)：43-7页。

舍吲哚

55)Kang J，Chen XL，Wang L，Rampe D，Interactions of the antimalarial drug mefloquine with the human cardiac potassium channels KvLQT 1/minK and HERG，J Pharmacol Exp Ther.2001年10月，299卷(1)：290-6页。

阿司咪唑

56)Taglialatela M，Pannaccione A，Castaldo P，Giorgio G，Annunziato L，Inhibition of HERG Kf+)channels by the novel second -generation antihistamine mizolastine.Br J Pharmacol，2000年11月，131卷(6)：1081-8页。

57)Suessbrich H，Waldegger S，Lang F，Busch AE5 Blockade of HERG channels expressed in Xenopus oocytes by the histamine receptor antagonists terfenadine and astemizole.FEBS Lett.，1996年4月，385卷(1-2)：77-80页。

58)Zhou Z，Vorperian VR，Zhang S，January CT，Block of HERG potassium channels by the antihistamine astemizole and its metabolites desmethylastemizole and norastemizole.J Cardiovasc Electrophysiol，1999年6月，10卷(6)：836-43页。

59)Taglialatela M，等人，Cardiac ion channels and antihistamines： possible mechanisms of cardiotoxicity，Clin Exp Allergy，1999年7月，Suppl 3：182-9页。

氯非铵

60)Suessbrich H等人，Specific block of cloned Herg channels by clofilium and its tertiary analog LY97241，FEBS Letter，1997年，414卷(2)：435-8。

其他

61)Finlayson K，Pennington AJ，Kelly JS，[ ³ H]-dofetilide binding in SHSY5Y and HEK293 cells expressing aHERG-like K+channel？，EurJ Pharmacol，2001年2月，412卷(2)：203-12页。

62)Yu SP，Kerchner GA，Endogenous voltage-gated potassium channels in human embryonic kidney(HEK293)cells.J Neurosci Res，1998年52卷：612-7页。

63)Tang W，等人，Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel J Biomol Screen，2001年10月，6卷(5)：325-31页。

64)Cui J，Melman Y，Palma E，Fishman GI，McDonald TV，Cyclic AMP regulates the HERG KC+)channel by dual pathways，CurrBiol，2000年6月，10卷(11)：671-4页。

65)Lees-Miller JP，Duan Y，Teng GQ，Thorstad K，Duff HJ，Novel gain-of-function mechanism in KC+)channel-related long- QT syndrome：altered gating and selectivity in the HERG1 N629D mutant，Circ Res，2000年3月，86卷(5)：507-13页。

66)Cavalli A，Poluzzi E，DePonti F，Recanatini M，Toward a pharmacophore for Drugs Inducing the Long QT Syndrome：Insights fraom a CoMFA Study of HERG K+Channel Blockers，J Med Chem，2002年7月，45：3844-53页。

67)Catterall W.A.，From ionic currents to molecular mechanisms： The structure and function of voltage-gated sodium channels.Neuron2000年，26卷：13-25。

68)BelelliD.等人，General anaesthetic action at transmitter-gated inhibitory amino acid receptors，Trends Pharmaol.Sci.1999年，20卷：496-502页。

69)Sigel E.，Buhr A.，The benzodiazepine binding site of GABA _A receptors，Trends Pharmocol.Sci.1997年，18卷：425-429页。

70)Maelicke A.，Allosteric modulation ofnicotinic receptors as a treatment strategy for Alzheimer′s disease，Dement GeriatrCogn Disord2000年9月，Suppl.1：11-8页。

71)Gray PW，Glaister D，Seeburg PH，Guidotti A，Costa E，Cloning and expression of a cDNA for human diazepam binding inhibitor，a natural ligand of an allosteric regulatory site of the gamma-aminobutyric acid type A receptor，Proc Natl Acad Sci USA 1986年10月，83卷(19)：7547-51页。

72)Roche O等人，A Virtual Screening Method for Prediction of the hERG Potassium Channel Liability of Compound Libraries，ChemBioChem 2002年，3：455-459页。

73)Ekins S，等人，Three-Dimensional Quantitative Structure- Activity RelationshiD for Inhibition of Human Ether-a-Go-Go- Related Gene Potassium Channel.Jrnl Pharmacol Expl Ther.2002年，301：427-434页。

普萘洛尔

74)Kawakami K，Nagatomo T，Abe H，Kikuchi K，Takemasa H， Anson BD.Delisle BP，January CT.Nakashima Y.Compari son of HERGchannel blocking effects of various beta-blockers-implication forclinical strategy.Br J Pharmacol.2005年11月，28；[Epub ahead of print]

75)Yao X，Mclntyre MS，Lang DG，Song IH.Becherer JD.Hashim MA.Propranolol inhibits the human ether-a-go-go-related genepotassium channels.Eur J Pharmacol.2005年9月，20；519(3)：208-11页。

76)Dupuis DS.Klaerke DA，Olesen SP Effect of beta-adrenoceptorblockers on human ether-a-go-go-related gene(HERG)potassiumchannels Basic Clin Pharmacol Toxicol.2005年2月，96卷(2)：123-30页。

77)Chatrath R，Bell CM，Ackerman MJ.Beta-blocker therapyfailures in symptomatic probands with genotyped long-QT syndrome.Pediatr Cardiol.2004年9-10月；25(5)：459-65。Epub2004年7月30日。

78)Imai T.Okamoto T.Yamamoto Y.Tanaka H.Koike K，Shigenobu K.Tanaka Y Effects of different types of K+ channel modulators on thespontaneous myogenic contraction of guinea-pig urinary bladder smoothmuscle.Acta Physiol Scand.2001年11月；173卷(3)：323-33页。

实施例2参考

Angelo K，等人，A radiolabeled peptide ligand of the hERGchannel，[¹²⁵I]-BeKm-I，Eur.J.Physiol 2003年；447：55-63页。

Barnard E.A.，Langer S.Z.，GABAA receptors；The IUPHAR Compendium of Receptor Characterization and Classification，2 ^th  edition，IUPHAR Media，London UK，2000年，104-110页。

Berul CI，Morad M，Regulation of potassium channels by nonsedating antihistamines.Circulation 1995年4月15日；91卷(8)：2220-5页。

Cavalli A，Poluzzi E，DePonti F，Recanatini M，Toward a Pharmacophore for Drugs Inducing the Long OT Syndrome：Insights from a CoMFA Study of HERG K+Channel Blockers.2002年；45：3844-3853页。

Cheng Y，Prusoff WH，Relationship between the inhibition constant (K1)and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition(I50)of an enzymatic reaction.Biochem Pharmacol 1973年12月1日；22卷(23)：3099-108页。

Cui J，Kagan A，Qin D，Mathew J，Melman YF，McDonald TV，Analysis of the Cyclic Nucleotide binding domain of the HERG Potassium Channel and Interactions with KCNE2.J.Biol Chem 2001年5月18日；276卷(20)：17244-51页。

Drici MD3 Barhanin J，Cardiac K+channels and drugg-acquired long QT syndrome.Therapie 2000年1-2月；55卷(1)：185-93页。

Ekins S，Crumb W1 Sarazan RD，Wikel JH，Wrighton SA，Three -Dimensional Quantitative Structure-Activity Relationship for Inhibition of Human Ether-a-Go-Go-Related Gene Potassium Channel，J.Pharmacol Exp Ther，2002年；310：427-434页。

Finlayson K，Pennington AJ，Kelly JS，[H]-dofetilide binding in SHSY5Y and HEK293 cells expressing a HERG-like K+channel？.Eur.J.Pharmacol 2001年2月。2；412(3)：203-212。

Heylen L，等人，Development of[alpha]HERG channel binding assayPoster#2534，2002年，Society for Biomolecular Screening。

Isbrandt D，Friederich P，Solth A，Haverkamp W，Ebneth A，Borggrefe M，Funke M，Sauter K，Breithardt G，Pongs O，Schulze-Bahr E，Identification and functional characterization of a novel KCNE2 (MiRP I)mutation that alters HERG channel kinetics.J Mol Med 2002年8月；80(8)：524-32页。

Jones-Hertzog DK，Mukhopadhyay P，Keefer CE，Young SS，Use of recursive partitioning in the sequential screening of G-protein- coupled receptors，J Pharmacol Toxicol Methods 1999年12月；42(4)：207-15页。

Kang J，Wang L，Cai F，Rampe D，High affinity blockade of the HERG cardiac KC+)channel by the neuroleptic pimozide，Eur J.Pharmacol 2000年3月31日；392(3)：137-40页。

Kiehn J，Thomas D，Karle CA，Schols W，Kubler W，Inhibitory effects of the class III antiarrhythmic drug amiodarone on cloned HERG potassium channels，Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1999年3月；359(3)：212-9页。

Kiss L，Bennett P，Uebele V，Koblan K，Kane S，Neagle B，SchroederK，High Throughput Ion-Channel Pharmacology：Planar-Array- Based Voltage Clamp，Assay DrugDev.Tech 2003年；1(1-2)：127-135页。

Korolkova Y，Kozlov S，Lipkin A，Pluzhnikov K，Hadley J，FilippovA，Brown D，Angelo K，Strobaek D，Jespersen T，Olesen S，Jensen B，Grishin E，An ERG Channel Inhibitor from Scorpion Buthus euveus，J BiolChem 2001年3月；276(13)：9868-986页。

O′Leary ME，Inhibition of human ether-a-go-go potassium channels by cocaine，MoI Pharmacol 2001年2月；59(2)：269-277页。

Po SS，Wang DW，Yang IC，Johnson JP Jr，Me L，Bennett PB，Modulation of HERG potassium channels by extracellular magnesium and quinidine，J.Cardiovasc Pharmacol 1999年2月；33(2)：181-5页。

Rampe D，Murawsky MK，Grau J，Lewis EW，The Antipsychotic Agent Sertindole is a High Affinity Antagonist of the Human Cardiac Potassium Channel HERG，J.Pharmacol Exp Ther 1998年8月；286(2)：788-93页。

Rampe D，Roy ML，Dennis A，Brown AM，A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride(Propulsid)：high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG，FEBS Lett 1997年11月；417(1)：28-32页。

Smart T等人，The nature reviews drug discovery ion channel questionnaire participants.Nature Rev Drug Disc，2004年3月，3(3)，239-278页。

Suessbrich H，Schonherr R，Heinemann SH，Lang F，Busch AE，Specific block of cloned Herg channels by clofilium and its tertiary analog LY97241.FEBS Lett 1997年9月8日；414(2)：435-8页。

Tinel N，Diochot S，Borsotto M，Lazdunski M，Barhanin J，KCNE2 confers background current characteristics to the cardiac KCNQ1 potassium channel，EMBO J.2000年11月；19(23)：6326-30页。

Tseng G，Ikr：The hERG Channel.Jmol Cell Cardiol 2001年；33：835-849页。

Walker BD，Singleton CB，Bursill JA，Wyse KR，Valenzuela SM，Qiu MR，Breit SN，Campbell TJ，Inhibition of the human ether-a-go -go-related gene(HERG)potassium channel by cisapride：affinity for open and inactivated states，Br.J.Pharmacol 1999年9月；128(2)：444-50页。

Weerapura M，Nattel S，Chartier D，Caballero R，Hebert TE，A comparison of current carried by HERG，with and without coexpression of MiRP1，and the native rapid delayed rectifier current.Is MiRP1 the missing link？.J Physiol 2002年4月；540(Pt.1)15-27页。

Zhang S，Zhou Z，Gong Q，Makielski J，January C，Mechani sm of Block and Identification of the Verapamil Binding Domain to HERG Potassium Channels，Circ.Res.1999年2月.14；84(9)：989-998页。

以上描述和特别举例说明了本发明的确定优选的实施方案，不是意欲本发明限于这些实施方案。在不背离以下权利要求提出的范围和精神的情况下，可以进行多种改变。

Claims (28)

1.一种鉴定调节钾通道活性的试验化合物的方法，所述方法包括：

a)汇编已知是调节钾通道活性的药物的数据集，其中该数据集包括该药物的生物物理学和结构的特征，包括观察的该药物对于钾通道活性的生物效应；

b)提供一系列算法，描述该结构特征和该钾通道的相互作用；

c)使用b)的算法评估试验化合物存在或不存在a)的结构特征，借此鉴定共享也调节钾通道活性的所述药物的结构特征的试验化合物。

2.通过权利要求1的方法鉴定的试验化合物。

3.权利要求1的方法，其中该钾通道是选自表4提供的通道。

4.权利要求1的方法，其中该药物是选自表5中所列出的药物。

5.权利要求1的方法，其中该钾通道是HERG蛋白质通道。

6.权利要求5的方法，其中该药物的生物物理学和结构的特征是选自分子量、对HERG的结合亲和力、该药物的化学描述符、溶解度、疏水性、亲水性、一级蛋白质结构、二级蛋白质结构、三级蛋白质结构及HERG表达水平上的改变的至少之一。

7.权利要求5的方法，其中该生物效应是选自钾流量的调节、膜去极化、HERG蛋白质相互作用的缺失、HERG通道阻断、激动活性、拮抗活性的至少之一。

8.权利要求5的方法，所述方法包括使HERG表达细胞与步骤c)中鉴定的化合物接触，并且确定试验化合物对于HERG通道功能的作用，对比

i)不表达HERG的细胞；

ii)没有接触该试验化合物的HERG表达细胞，和

iii)接触了已知是调节HERG的药物的HERG表达细胞。

9.权利要求8的方法，其中使用Rb+外向通量测定、膜电位染料测定、原子吸附功能测定及结合可探测地标记的放射性配体的整个细胞膜评估HERG功能。

10.权利要求5的方法，所述方法包括可探测地标记步骤c)中鉴定的化合物，在体外进行结合测定以确定该化合物对于该HERG蛋白质的结合亲和力。

11.权利要求1的方法，所述方法进一步包括把由对步骤c)中鉴定的试验化合物进行功能测定而得的数据加入步骤a)的数据集。

12.权利要求1的方法，所述方法进一步包括把由对步骤c)中鉴定的试验化合物进行体外结合测定而得的数据加入步骤a)的数据集。

13.权利要求8的方法，其中该HERG表达细胞是中国仓鼠的卵巢细胞。

14.权利要求9的方法，其中该放射性配体是选自表1中提供的配体。

15.权利要求14的方法，其中该放射性配体是[³H]-阿司咪唑。

16.权利要求14的方法，其中该放射性配体是[³H]-E4031。

17.权利要求1的方法，其中向患者给药该试验药物是伴随不利的生物效应。

18.权利要求1的方法，其中向患者给药该试验药物是伴随有益的生物效应。

19.权利要求1的方法，其中该试验化合物是从组合化学药物库得到。

20.权利要求19的方法，进一步包括优化在该组合化学药物库中鉴定的试验化合物的结合和调变活性。

21.实行权利要求1的方法的计算机系统。

22.权利要求21的计算机系统，其中该数据集合进一步包括药理学上的参考药物。

23.权利要求21的计算机系统，其进一步包括第二个数据库，该第二个数据库包括选自三维结构数据集、序列突变数据集、失败的药物数据集、天然产物数据集及化学药品登记数据集的至少一种数据集。

24.权利要求21的计算机系统，其含有包含至少一种执行硅内筛选方法的算法的程序。

25.基于细胞的功能测定方法，用于鉴定怀疑通过E4031位点上的相互作用来调节HERG蛋白质活性的试验化合物，所述测定方法包括：

a)使HERG表达细胞与该试验化合物接触，并确定试验化合物对于HERG通道功能的作用，对比

i)不表达HERG的细胞；

ii)没有接触该试验化合物的HERG表达细胞，和

iii)接触了E4031的细胞。

26.权利要求25的方法，其中使用Rb+外向通量测定、膜电位染料测定、原子吸附功能测定及结合可探测地标记的放射性配体的细胞膜评估HERG功能。

27.一种用于确定试验化合物对于HERG蛋白质或其片段上的E-4031位点的结合亲和力的体外测定方法，所述方法包括：

a)提供HERG蛋白质或其片段；

b)可探测地标记在该E4031位点上结合HERG的试验化合物；

c)在存在或不存在试验化合物时用该可探测地标记的试验化合物进行竞争性结合测定，所述试验化合物没有可探测地标记，借此确定该试验化合物对于HERG蛋白质上的该4031位点的结合亲和力。

28.一种进行权利要求25的方法的试剂盒，其包括：

a)HERG表达细胞；

b)非-HERG表达细胞；

c)适于在整个细胞中进行功能测定的试剂，

d)适于进行体外结合测定的试剂。

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