CN101437989A - 用于鉴定抗原的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了具有处在规定位置的不连续成员的可复制的库，用于筛选病原生物的抗原。还提供的是使用这种库的方法以及特异性抗原CT788，其在衣原体感染期间诱导T细胞活化。

Description

用于鉴定抗原的组合物和方法

关于联邦政府赞助的研究的声明

美国政府在本发明中具有已付清的许可(paid-up license)和在有限情况下要求专利所有人根据国家卫生研究院给予的拨款AI039558和AI055900的条款所规定的合理的条件来许可他人的权利。

发明背景

受到对人类的新疾病威胁的出现、在西方世界早先可医治的疾病的再度出现例如TB、生物恐怖主义的威胁，以及只要发现合适的抗原，癌症可以通过疫苗接种来治疗的不断增多的证据的驱动，关于疫苗技术的令人兴奋的事件在过去几年中已经更新了。传染性疾病仍然是世界范围内发病和死亡的主要原因之一，每年杀死超过1千3百万青年和儿童。TB本身对每年的2百万例死亡负责，而估计每年总体超过3百万个体死于疟疾和AIDS。传染性疾病的新出现或再度出现，也形成了对全世界健康的持续不断的威胁。许多传染性疾病，例如疟疾、TB、AIDS、SARS和流感由能够直接在人类细胞内生长和传播的细胞内病原体引起。因为细胞内病原体在宿主细胞内隔离生长，在产生保护性免疫方面，体液(抗体)免疫反应常常是无效的。

当它们有作用时，疫苗是预防和治疗疾病的最有效的方式之一。不幸的是，许多研究和临床疫苗计划具有很低的成功概率，因为在本发明之前，尚没有方法来筛选所有可能的抗原或预测哪些抗原将是有效的。因而，对于开发用于传染性疾病和癌症的治疗的有效疫苗的新策略存在着需要。

发明概述

在第一个方面，本发明提供了可复制的库，其包括处在规定位置的至少20(例如，30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1500、2000、2500、3000、4000或5000)个不连续的成员(discrete members)，其中(a)所述库的成员各自包括细胞或病毒，所述细胞或病毒包括编码多肽的至少一部分的第一多核苷酸，所述多肽由所述细胞或病毒以外的病原生物的基因组编码，所述第一多核苷酸可操作地连接到启动子，和(b)所述库包括多核苷酸，该多核苷酸编码由所述病原生物的基因组(即，蛋白质组)编码的多肽的至少10％(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％)的一部分。

在相关的第二个方面，本发明提供了可复制的库，其包括处在规定位置的至少10(例如，15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1500、2000、2500、3000、4000或5000)个不连续的成员，其中(a)所述库的成员各自包括细胞或病毒，所述细胞或病毒包括编码多肽的至少一部分的第一多核苷酸，所述多肽由所述细胞或病毒以外的病原生物的基因组编码，所述第一多核苷酸可操作地连接到启动子，(b)所述成员各自包括少于24(例如，23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2)个不同的多核苷酸，每个所述多核苷酸编码病原生物的基因组编码的多肽的至少一部分，和(c)所述库包括多核苷酸，该多核苷酸编码由所述病原生物的基因组(即，蛋白质组)编码的多肽的至少部分的至少10％(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％)。

在本发明的前两个方面的任一个中，所述多肽的部分可以具有与所述病原生物的基因组编码的多肽的相应部分至少50％、60％、70％、80％、90％、93％、95％、98％或99％的序列同一性。进一步的，所述库的每个成员可以包括由所述病原生物的基因组编码的单个多核苷酸。最后，所述病原生物可以是细菌、病毒或真菌。

在第三个方面，本发明提供了可复制的库，其包括至少10(例如，15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1500、2000、2500、3000、4000或5000)个不连续的成员，其中所述成员各自包括第一细胞或病毒，所述第一细胞或病毒包括编码多肽或其部分或片段的多核苷酸，与相应的正常细胞相比在赘生性细胞内所述多肽是差异表达的，所述多核苷酸可操作地连接到启动子，和所述库包括多核苷酸，该多核苷酸编码与所述相应的正常细胞相比在赘生性细胞内差异表达的多肽的至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％)的部分。所述多肽的部分可以具有与在赘生性细胞中表达的多肽的相应部分至少50％、60％、70％、80％、90％、93％、95％、98％或99％的序列同一性。所述库的每个成员可以含有少于50、40、30、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个多核苷酸，每个多核苷酸编码在所述赘生性细胞中差异表达的不同多肽的一部分。

在上述三个方面的任一个中，所述病毒可以是噬菌体。所述细胞或第一细胞可以是细菌(例如，E.coli)。所述细菌或病毒可以进一步包括编码在细菌中不天然地表达的多肽，例如孔洞形成蛋白(例如，LLO)的第二多核苷酸。做为选择，所述第一多核苷酸可以进一步编码第二多肽，例如孔洞形成蛋白(例如，LLO)。第一多核苷酸的每一个可以进一步包括第一标签序列，其中每个所述多核苷酸编码包括第一标签和所述多肽的部分的融合蛋白。每个多核苷酸可以进一步包括第二标签序列。所述启动子可以是可诱导启动子(例如，T7启动子)。

在第四个方面，本发明提供了测定多肽是否是免疫原性的方法，其包括步骤(a)用第二细胞(例如，巨噬细胞)分别地接触以上方面的任一个的库的每个成员，所述第二细胞能够(i)内吞每个成员中的所述细胞或病毒，和(ii)通过I类MHC途径在它的表面展示肽，其中所述库的每个成员包括由所述多核苷酸编码的多肽，(b)用CTL细胞(例如，多种CTL细胞)分别地接触步骤(a)的每个成员，所述CTL细胞来自早先被所述病原生物感染的哺乳动物或者具有或早先具有赘生物(neoplasm)的哺乳动物；和(c)检测所述CTL细胞是否被活化，其中所述CTL细胞的活化确定了所述成员中含有的多肽是否是免疫原性的。所述库的每个成员可以包括编码孔洞形成蛋白(例如，LLO)的多核苷酸。所述库的每个成员可以在所述接触步骤(a)之前被杀死。在接触步骤(b)之前，所述第二细胞可以被杀死。所述方法可以进一步包括步骤(d)从所述库的复制拷贝(replica copy)中回收编码步骤(c)中鉴定的多肽的多核苷酸，或者在接触步骤(a)之前包括步骤，产生所述库的复制品。所述方法可以进一步包括使用所述库进行方法步骤(b)和(c)再至少一(例如，2、3、4、5、7、10或15)次，每次进行步骤(b)和(c)时其可以包括使用不同的CTL(例如，多种CTL细胞)。在另一个实施方式中，所述方法可以包括步骤(d)鉴定在步骤(c)中被确定为免疫原性的多肽之内足够CTL活化的表位。

在第五个方面中，本发明还提供了包括使用本发明的第四个方面鉴定的至少一个(例如，2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、40或50个)表位或多肽的组合物(例如，药物组合物或疫苗)。所述组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。

在第六个方面，本发明描述了与在衣原体感染中作为免疫原性蛋白的CT788多肽(SEQ ID NO：1)的发现以及作为抗原表位的CT788133-152(SEQ ID NO：2)的鉴定相关的组合物和方法。根据这个发现，本发明描述了包括CT788多肽的纯化的或重组的多肽(例如，CT788多肽或包括CT788多肽的融合蛋白)，包括包含CT788多肽的多肽(例如，CT788多肽或包括CT788多肽的融合蛋白)的组合物，以及包括CT788多肽的片段(例如，当所述片段是免疫原性的时，或所述片段的融合蛋白)例如KGIDPQELWVWKKGMPNWEK(SEQ ID NO：2)、或包括具有选自由表1中所列序列构成的组的氨基酸序列的片段(例如，表1中所列的免疫原性片段)的纯化的或重组的多肽。还描述的是包括多肽的组合物，所述多肽包括CT788多肽的片段(例如，免疫原性片段)如KGIDPQELWVWKKGMPNWEK(SEQ ID NO：2)、或包括具有选自由表1中所列序列构成的组的氨基酸序列的片段(例如，表1中所列的免疫原性片段)。CT788多肽或其片段可以在分子的N-末端或C-末端含有至少1、2、3、4、5、8、10、15或更多其他的氨基酸。

表1：Cta1_133-152的片段(包括SEQ ID NO：3-154)

本发明还描述了药物和疫苗组合物。在一个实施方式中，本发明描述了包括多肽和药学上可接受的载体的药物组合物，所述多肽包括CT788多肽或包括CT788多肽的片段(例如，免疫原性片段，如以上描述的那些)。药物组合物可以被配制用于通过本领域已知的任何方式、例如在此描述的那些(例如，口服或胃肠外的)施用。在另一个实施方式中，本发明描述了包括多肽和药学上可接受的载体的疫苗，所述多肽包括CT788多肽或包括CT788多肽的片段(例如，免疫原性片段，如以上描述的那些)。所述疫苗可以进一步包括佐剂(例如，在此描述的那些)，并且可以被配制用于通过本领域已知的任何方式、例如在此描述的那些(例如，口服或胃肠外的)施用。在第六个方面的上述实施方式的任一种中，所述多肽可以具有CT788多肽的序列或CT788片段的序列(例如，在表1中和在表2中显示的那些)。本发明的多肽可以是融合蛋白。融合蛋白可以包括在纯化中有用的标签，例如GST、His或myc，或可以包括来自免疫分子的蛋白(例如，Ig蛋白，如IgG、IgM、IgA或IgE，或Ig蛋白的Fc区域)，或在此描述的或本领域已知的任何标签。

本发明还描述了在个体(例如，需要这种治疗的个体)中治疗或预防感染(例如，细菌性感染，如衣原体感染)的方法。所述方法包括向个体施用(例如，以足够预防或治疗所述细菌性感染的数量)CT788多肽或其片段(例如，免疫原性片段，如以上描述的那些)。施用的CT788多肽或其片段可以是纯化的多肽或其片段。

多肽的“部分”或“片段”意思是所述多肽的至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、100、200、300或500个氨基酸。片段或部分可以包括全长多肽(例如，生物体的基因组编码的多肽)的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。

“可操作连接的”意思是核酸分子和一个或更多个调节序列(例如，启动子)以这样的方式连接，以允许当合适的分子(例如，转录活化物蛋白)结合到调节序列时所述核酸分子的产物(即，多肽)的表达和/或分泌。

“病原生物的基因组编码的多肽”意思是与所述病原生物编码的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或甚至100％的同一性的多肽。

“病原生物”意思是能够感染哺乳动物的任何生物体。示范性的病原生物是细菌、病毒、原生动物和真菌，包括在此描述的生物体。在本发明的上下文中，“病原生物”另外指包括在本发明的库中的细胞或病毒以外的生物体。

“孔洞形成蛋白”(pore-forming protein)意思是任何多肽，当与脂双层膜接触时，其能够在膜中形成通道或孔洞。所述孔洞或通道可以容许分子例如离子、多肽或其片段、或多核苷酸的通过，以穿过所述膜。

“LLO”意思是李斯特菌素O(listeriolysin O)，或能够在真核膜中形成孔洞的其任何片段或变体(例如，与LLO序列基本上相同的多肽)。

“能够内吞的细胞”是指具有将颗粒例如细胞、病毒或大分子内在化到膜结合区室之内的能力的细胞。

“差异表达的”是指与相应的对照细胞相比，在测试细胞(例如，赘生性细胞)中表达的至少5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、250％、500％或1000％的表达提高。

“CT788多肽”意思是与附图14中所示序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％的同一性，并具有在早先被衣原体感染的生物体中刺激免疫反应的能力的多肽。

“标签序列”意思是用于融合蛋白的形成的任何序列(例如，包括在此描述的多肽的片段或部分)。示范性的标签包括FLAG、His(例如，His6)、血球凝集素(HA)、Myc、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、或任何其他本领域已知的标签。标签序列可以存在于蛋白质的N-或C-末端。

“纯化的多肽”或“分离的多肽”意思是已经与天然地伴随它的成分分离开的多肽。一般地，当多肽按重量计算至少30％没有(30％，byweight，free from)与之天然相关的蛋白质和天然发生的有机分子时，多肽是基本上纯的。在某些实施方式中，制品是按重量计算至少50％、60％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％没有与之天然相关的分子。例如，通过从天然来源提取；通过表达编码这种多肽的重组多核苷酸；或通过化学合成所述多肽，可以获得纯化的多肽。可以通过任何适当的标准方法，例如，通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过HPLC分析来测量纯度。

“基本上相同的”意思是多肽或核酸展现与参考氨基酸(例如，CT788)或核酸序列至少50％、75％、85％、90％、95％或甚至99％的同一性。对于多肽，比较序列的长度一般将是至少7个氨基酸(例如，20个氨基酸)，优选的至少30个氨基酸，更优选的至少40个氨基酸，最优选的50个氨基酸，或全长。对于核酸，比较序列的长度一般将是至少20个核苷酸(例如，60个核苷酸)，优选的至少90个核苷酸，更优选的至少120个核苷酸，或全长。

核苷酸序列是基本上相同的另一个指标是两个分子在严格条件下是否相互杂交。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中是不同的。一般地，选择严格条件为约5℃到约20℃，通常约10℃到约15℃，在规定的离子强度和pH值下低于特定序列的热熔点(Tm)。Tm是50％的目标序列与匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH值下)。一般地，严格条件将是其中盐浓度是约0.02摩尔(molar)、pH7和温度是至少约60℃的那些条件。例如，在标准的Southern杂交过程中，严格条件将包括在6×SSC在42℃中的起始洗涤，随后是在0.2×SSC在至少约55℃、一般约60℃以及常常约65℃的温度下的一次或多次另外的洗涤。

对于本发明来说，当核苷酸序列编码的多肽和/或蛋白质是基本上相同的时，核苷酸序列也是基本上相同的。因而，当一个核酸序列与第二核酸序列编码基本上相同的多肽时，两个核酸序列是基本上相同的，即使由于遗传密码允许的简并性，它们在严格条件下不杂交(对于密码子简并性和遗传密码的说明，参见，Darnell et al.(1990)Molecular CellBiology，Second Edition Scientific American Books W.H.Freeman andCompany New York)。蛋白质纯度或均质性可以通过本领域已知的许多方式来表明，例如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在染色时可视化。对于某些目的，高分辨率可能是需要的，可以利用HPLC或相似的纯化方式。

“免疫原性”意思是化合物(例如，多肽或其片段)具有在生物体(例如，早先感染衣原体的生物体)中刺激免疫反应的能力。

具有处在规定位置的不连续成员的库提供了相比集中库的几个优点，包括对每个单独的抗原的提高的敏感性以及快得多的筛选过程。

根据以下的详细说明、附图和权利要求，本发明的其他特征和益处将是明显的。

附图的简要描述

附图1是显示常规的MHC I类抗原呈递的示意图。

附图2是显示在Listeria monocytogenes(单核细胞增多性李斯特杆菌)感染期间CD8⁺效应物T细胞反应的刺激的示意图。

附图3是显示在感染期间李斯特菌素O(LLO)介导的L.monocytogenes从液泡的逃避的示意图。

附图4是显示在E.coli中表达的多肽向能够内吞细菌的细胞的胞质液的LLO介导的递送的示意图。

附图5是一组图像，显示了表达GFP和LLO的E.coli向细胞的细胞质的递送。

附图6是显示抗原向I类MHC途径的E.coli/LLO介导的递送的示意图。

附图7是在C.trachomatis库的克隆中使用的修改的Gateway系统。

附图8是显示任何感兴趣的病原体的抗原鉴定的表达克隆策略的示意图。

附图9是使用B3Z T细胞的所采用的库的验证策略的示意图，其使用在此描述的修改的Gateway载体识别在表达的蛋白质上存在的SIINFEKL标签(SEQ ID NO：155)。

附图10是显示通过成功地确定库中哪些蛋白质被表达而理论化的库验证策略可行的图像。

附图11是显示筛选乳腺癌抗原的策略的示意图。

附图12是显示利用衣原体特异性T细胞系筛选C.trachomatis库的阳性结果的图像。

附图13A是显示利用与未感染的或衣原体感染的BMM细胞混合的CD4⁺T细胞克隆、来自流式细胞计的CD4和IFNγ表达的结果的图表。结果根据活细胞来门选。

附图13B是显示在感染后72小时检测的衣原体IFU的数量的图表。早先感染的(免疫)小鼠和具有在此鉴定的CD4⁺T细胞克隆的幼稚小鼠显示了与没有CD4⁺T细胞克隆的幼稚小鼠相比低的感染水平。

附图14是CT788(Cta1)蛋白(SEQ ID NO：1)和CT788_133-152(Cta1_133-152)(SEQ ID NO：2)的肽序列。

附图15是显示用BMM培养、然后与T细胞克隆NR9.2孵育的、表达单独的C.trachomatis ORF的E.coli克隆的图像。这个附图显示了平板，其中来自相应的分析孔的上清液在ELISA分析中测试IFNγ。表达Cta1(由ORF CT788编码)的E.coli诱导NR9.2分泌高水平的IFNγ(>370ng/ml)，而表达库中的其他衣原体蛋白质的E.coli仅诱导背景水平的IFNγ分泌(<26ng/ml)。标记为Cta1和ELISA Standards的反应孔是黄色的；其他反应孔是无色的。在附图中显示的与Cta1或标准物不相应的反应孔的比色强度是库中所有其他E.coli克隆所见的结果中典型的。标明了相应于高数量的IFNγ的ELISA标准物。

附图16A是显示对T细胞克隆NR9.2表达的Vα2和Vβ8.3TCR元件染色的、来自非转基因和NR1转基因小鼠的CD4⁺外周血淋巴细胞的标绘图。结果根据活的CD4⁺细胞来门选。

附图16B是显示响应于标明浓度的Cta1_133-152(SEQ ID NO：2)的、来自NR1转基因或非转基因小鼠的脾细胞的增殖的图表。增殖通过[3H]胸腺嘧啶核苷掺入细胞来测量。这些结果表明，NR1 TCR tg细胞识别Cta1_133-152(SEQ ID NO：2)。

附图17是显示注射到幼稚小鼠中的CD4⁺T细胞克隆(NR9.2)在衣原体感染之后增殖的图表。观察到CFSE标记的TCR转基因T细胞的增殖，作为转移的群体向左进入任意设置的门的移动。CFSE标记的NR1或OTII细胞被转移到C57BL/6接受者中。一天之后，小鼠用标明的病原体静脉内地感染。在三天之后收获脾脏。对活的CD4⁺Vα2⁺细胞门选结果，以检测NR1 TCR tg细胞。

附图18A是一组标绘图，显示了在导液淋巴结中增殖的转基因T细胞上CD69和CD44被增量调节，CD62L被减量调节。转移到幼稚小鼠中的CFSE标记的CD4⁺TCR转基因细胞的增殖(反映为群体向左的移动)在用C.trachomatis血清型L2感染接受者小鼠之后5-7天测量。如从图表的底部到顶部的群体移动中所反映的，CD69在增殖的细胞上增量调节。如在图表的顶部向底部的群体移动中所反映的，CD62L在增殖的细胞上减量调节。结果根据活的Thy1.2⁺CD4⁺细胞来门选。

附图18B是一对图表，显示转移的TCR转基因细胞在感染后四天在导向生殖道的淋巴结中广泛地增殖，而在导向其他位点的淋巴结中不增殖。点线代表未感染的小鼠；实线代表感染的小鼠。结果根据活的Thy1.2⁺(CD90.2)⁺CD4⁺细胞来门选(gated)。

附图18C是一组标绘图，显示了转移的TCR转基因T细胞在衣原体的子宫内感染之后被征募到小鼠的生殖道中。CFSE标记的NR1细胞被转移到CD90.1接受者中，然后用10⁶IFU的C.trachomatis血清型L2在子宫中模拟感染或感染。在感染后七天，从小鼠中取出生殖道，分析转移的NR1细胞的存在。比较模拟感染的和感染的接受者的生殖道中CD90.2⁺CD4⁺ NR1细胞的存在。结果根据活细胞来门选。方框显示了在小鼠的生殖组织中继承性地转移的(adoptively transferred)T细胞。

附图19是一组图表，显示了NR1细胞在C.trachomatis的子宫内感染之后在ILN中优先地增殖。CFSE标记的NR1细胞被转移到CD90.1接受者中，其然后用10⁶IFU的C.trachomatis血清型L2在子宫中模拟感染或感染。在感染后标明的时间收获ILN和NDLN，检查CD4⁺NR1细胞的增殖。结果根据活的CD90.2⁺CD4⁺Vα2⁺细胞门选来特异性地检测NR1 TCR tg细胞。

附图20是一组图表，显示了NR1细胞分化成Th1细胞。CFSE标记的NR1细胞被转移到CD90.1接受者中，其然后用10⁶ IFU的C.trachomatis血清型L2在子宫中感染。六天后，来自ILN的细胞用PMA/离子霉素刺激，通过流式细胞计检查细胞内IFNγ。Cta1特异性T细胞(CD90.2⁺CD4⁺)根据CFSE^lo和CFSE^hi细胞来门选，比较这两个群体中细胞内IFNγ水平。实线代表同种型对照；灰色填充的直方图代表IFNγ。

附图21A是一组图表，显示了在模拟感染和感染的小鼠的生殖道中NR1细胞上CD62L、CD44和CFSE的水平。结果根据活的CD90.2⁺CD4⁺细胞门选来特异性地检测NR1 TCR tg细胞。

附图21B是图表，显示了来自生殖道的NR1细胞用PMA/离子霉素刺激，并通过流式细胞计分析来检测IFNγ的产生。结果根据活的CD90.2⁺CD4⁺细胞门选来特异性地检测NR1 TCR tg细胞。实线代表同种型对照；填充的直方图代表IFNγ。

附图22是图表，显示了T细胞克隆NR9.2识别新的T细胞抗原Cta1_133-152(SEQ ID NO：2)。通过测试重叠的20-mer合成肽刺激NR9.2分泌IFNγ的能力来绘制来自Cta1的抗原性肽。在IFNγELISA分析中，仅Cta1_133-152刺激NR9.2分泌显著水平的IFNγ。以下显示的是Cta1的蛋白质序列(SEQ ID NO：1)，Cta1_133-152(SEQ ID NO：2)是下划线的。

详细说明

在一个方面，本发明允许证实的人类免疫效应物的体外筛选，以从完整的蛋白质组或其部分、从任何引发疾病的病原体、以及从赘生性细胞中差异表达的多肽中鉴定它们的关键目标抗原。在另一个方面，本发明提供了组合物，包括纯化的蛋白质和疫苗，以及涉及使用CT788多肽或其片段作为抗原治疗或预防衣原体感染的方法。

本发明的第一个方面的技术允许研究人员预测哪种表位混合物将作为预防性或治疗性疫苗在体内被证实有效。重要地，它体外模拟了哺乳动物免疫系统并用每个抗原来呈递它，从而给定的引发疾病的病原体可以在受感染宿主中表达。在几天之内，有可能从引发疾病的病原体或其部分的完整蛋白质组中鉴定将在体内最有效地刺激免疫系统的特定抗原，这是早先不可能的任务。

本发明的核心是快速地鉴定引起保护性细胞毒T淋巴细胞的体内刺激的抗原的能力，容许鉴定将被直接包括入现有抗原递送系统的免疫靶标，以产生具有最高概率产生保护性细胞介导的免疫的多价疫苗制剂。

保护性细胞介导的免疫反应的关键元件之一是CD8⁺细胞毒T淋巴细胞(CTL)，其可以识别并消灭病原体感染的宿主细胞，防止病原体在宿主内的传播。在自然感染期间CTL的产生常常需要在宿主细胞的胞质液中产生病原体特异性抗原性蛋白。在细胞内感染期间，在宿主细胞胞质液内存在的抗原性蛋白质被蛋白水解降解为肽。这些肽随后与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子相缔合地显示在宿主细胞的表面(附图1和2)。在宿主细胞表面的肽/MHC复合物被CTL识别，引起受感染宿主细胞的CTL介导的杀伤和保护性T细胞记忆的发展。然而，在开发策略来有效地鉴定用作I类MHC途径的靶标的病原体特异性抗原方面，获得了相对较少的进展。这样的靶标是第一线的材料，用于掺入成分疫苗中来刺激保护性CTL记忆并预防侵入微生物的感染。因而，开发有效的的方法来鉴定病原体特异性抗原性蛋白并将它们靶向MHC I类呈递途径，在针对细胞内病原体的疫苗的合理设计中有基本的重要性。虽然几种当前的疫苗策略处于开发中用于体内抗原递送，在本发明之前，不存在策略，用于传染性疾病病原体的完整抗药分布型的快速确定，以确定最合适的抗原决定簇来包括在疫苗制剂中。

本发明允许传染性病原体的全部蛋白质成分的有效的体外表达，伴随着将表达的蛋白质靶向宿主抗原呈递细胞(APC)用于CTL反应的产生。通过这种靶向的表达系统递送给宿主细胞的抗原被I类MHC途径加工(附图1)来呈递给CTL。通过使用从早先感染的个体产生的病原体特异性CTL系，照这样鉴定候选疫苗抗原。

如下文所述，本发明已经应用于沙眼衣原体，一种细胞内细菌性病原体，是在美国最常见的性传染的疾病病原体。C.trachomatis也是在世界范围内可预防的失明的主要原因，当前没有可用的疫苗。在继承转移研究中提供保护性免疫的C.trachomatis特异性CTL系从小鼠模型获得，并用于鉴定CTL引发抗原。相应于894个可能的C.trachomatis开放阅读框的独特成员的一个抗原，从针对C.trachomatis表达库筛选的每个CTL系中鉴定出来。鉴定的抗原在C.trachomatis感染期间刺激保护性CTL。在此描述了产生本发明的库和进行筛选分析的方法。

来自病原生物的库的产生

为了产生本发明的库，来自病原生物(例如，病毒或细菌)的基因组的开放阅读框或其部分被克隆到能够在所述库的成员所包括的细胞或病毒中表达(例如，与启动子可操作地连接)的载体中。这可以通过本领域已知的任何方式来实现。在一个实施方式中，设计PCR引物来扩增在病原生物的基因组中鉴定的开放阅读框。引物的集合可以被设计以从病原生物的基因组扩增开放阅读框或其部分的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％98％、99％或甚至100％。引物设计可以使用计算机程序进行，例如，GAP(Genome-wide Automated Primerfinder server)计算机程序，可以从Irvine的加州大学获得，其容许靶向来自病原体的基因组的大量开放阅读框的引物的设计。在一个实施方式中，设计引物，使得来自病原生物的蛋白质的分泌信号序列被除去。其基因组已经被测序或正在被测序的病原细菌和病毒可以在例如基因组联机数据库(GOLD)(Liolios K et al.，Nucleic Acids Res.34(Databaseissue)：D332-334，2006)中找到。其基因组被完全测序的病原生物(例如，细菌性病原体)在本发明中是特别有用的。

做为选择，mRNA的逆转录可以用于产生本发明的库。与靶向特定mRNA序列的引物一起的逆转录酶可以用于将mRNA内含有编码区或其部分转录成DNA序列。通过PCR(例如，在此描述的)的随后的扩增可以用于产生足够数量的DNA用于将期望的多核苷酸克隆到表达载体中。

为了产生库的不连续的成员，含有特异于开放阅读框或其部分的引物的每个PCR反应可以在独立的反应体积(例如，在96孔平板中)中进行。在一个实施方式中，使用两步骤PCR过程。第一组引物被用于扩增期望的开放阅读框，第二组引物被用于将其他的序列附加到扩增的序列上用于克隆。这种其他的序列可以包括限制性内切酶的位点或用于克隆的重组序列(例如，来自Invitrogen的Gateway系统或MAGIC系统(Liet al.Nat.Genet.7(3)：311-9，2005))，或本领域已知的任何序列标签(例如，His₆标签，myc标签，或SIINFEKL表位(SEQ ID NO：155))。

如本领域已知的的，对于所使用的系统，视情况将PCR产物导入克隆载体中。如果克隆载体缺乏能够驱动在库的细胞或病毒中的表达的启动子，随后必须的是将ORF或其片段克隆到含有启动子的载体中。在任何克隆步骤期间，肽标签，例如在此描述的那些，可以被添加到多肽克隆物或其部分的N-末端或C-末端。

一旦编码多肽的至少部分的多核苷酸被克隆到能够表达的载体中，它们可以各自被导入合适的宿主细胞或病毒中，从而形成本发明的库。在此描述的方法已经用于产生表达C.trachomatis基因组中发现的894种多肽的888种的库。

在本发明中有用的病原生物包括，例如，腺病毒、Ascarislumbricoides、星病毒、Bacteroidesspp.、beta-溶血性链球菌、BK病毒、Blastocystis hominis、Blastomyces dermatitidis、Bordetella pertussis、Bunyavirus、Campylobacter fecalis、Candidaspp.、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia psittaci、Chlamydia trachomatis、Clonorchis sinensis、Clostridium difficile、Clostridium spp.、Coagulase-negative staphylococci、Coccidoides immitis、Cornybacterium diphtheriae、Cornybacterium spp.、冠状病毒、柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、Cryptococcus neoformans、Cryptosporidium、细胞巨化病毒、艾柯病毒、Entamoeba histolytica、Enterbater spp.、Enterobius vermicularis、Enterococcus spp.、Epstein-Barr病毒、马脑炎病毒、Escherichia coli、Escherichia spp.、真菌、Giardialamblia、Haemophilus influenzae、肝炎病毒、肝炎C病毒、单纯性疱疹病毒、Histoplasma capsulatum、HIV、Hymenolepis nana，流感病毒、JC病毒、Klebsiella spp.、Legionella spp.、Leishmania donovani、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、微丝蚴、微孢子虫、Mycobacterium tuberculosis、Mycoplasma pneumoniae、粘病毒、Necator americanus、Nocardia spp.、Norwalk病毒、Opisthorchis viverrini、副流感病毒、副粘病毒、Plasmodiumspp.、Pneumocystis carinii、Proteus spp.、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas spp.、狂犬病病毒、呼吸道合胞体病毒、鼻病毒、轮状病毒、沙门氏菌、志贺氏菌、圣路易脑炎病毒、Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumoniae、Strongyloides stercoralis、介体病毒、Toxoplasma spp.、Trichuris trichiura、Varicella-Zoster病毒、弧菌属霍乱、Viridans streptococci和Yersinia enterocolitica。

本发明特别有用的是专性的细胞内病原体。细胞内细菌包括、例如、Anaplasma bovis、A.caudatum、A.centrale、A.marginale A.ovis、A.phagocytophila、A.platys、Bartonella bacilliformis、B.clarridgeiae、B.elizabethae、B.henselae、B.henselae phage、B.quintana、B.taylorii、B.vinsonii、Borrelia afzelii、B.andersonii、B.anserina、B.bissettii、B.burgdorferi、B.crocidurae、B.garinii、B.hermsii、B.japonica、B.miyamotoi、B.parkeri、B.recurrentis、B.turdi、B.turicatae、B.valaisiana、Brucella abortus、B.melitensis、Chlamydia pneumoniae、C.psittaci、C.trachomatis、Cowdria ruminantium、Coxiella burnetii、Ehrlichia canis、E.chaffeensis、E.equi、E.ewingii、E.muris、E.phagocytophila、E.platys、E.risticii、E.ruminantium、E.sennetsu、Haemobartonella canis、H.felis、H.muris、Mycoplasma arthriditis、M.buccale、M.faucium、M.fermentans、M.genitalium、M.hominis、M.laidlawii、M.lipophilum、M.orale、M.penetrans、M.pirum、M.pneumoniae、M.salivarium、M.spermatophilum、Rickettsia australis、R.conorii、R.felis、R.helvetica、R.japonica、R.massiliae、R.montanensis、R.peacockii、R.prowazekii、R-rhipicephali、R.rickettsii、R.sibirica和R.typhi。示范性的细胞内原生动物有Brachiola vesicularum、B.connori、Encephalitozoon cuniculi、E.hellem、E.intestinalis、Enterocytozoon bieneusi、Leishmania aethiopica、L.amazonensis、L.braziliensis、L.chagasi、L.donovani、L.donovani chagasi、L.donovani donovani、L.donovani infantum、L.enriettii、L.guyanensis、L.infantum、L.major、L.mexicana、L.panamensis、L.peruviana、L.pifanoi、L.tarentolae、L.tropica、Microsporidiumcey lonensis、M.africanum、Nosemaconnori、Nosemaocularum、N.algerae、Plasmodiumberghei、P.brasilianum、P.chabaudi、P.chabaudiadami、P.chabaudichabaudi、P.cynomolgi、P.falciparum、P.fragile、P.gallinaceum、P.knowlesi、P.lophurae、P.malariae、P.ovale、P.reichenowi、P.simiovale、P.simium、P.vinckeipetteri、P、vinckei vinckei、P.vivax、P.yoelii、P.yoeliinigeriensis、P.yoeliiyoelii、Pleistophora anguillarum、P.hippoglossoideos、P.mirandellae、P.ovariae、P.typicalis、Septataintestinalis、Toxoplasmagondii、Trachipleistop horahominis、T.anthropophthera、Vittaforma corneae、Trypanosomaavium、T.brucei、T.bruceibrucei、T.brucei gambiense、T.brucei rhodesiense、T.cobitis、T.congolense、T.cruzi、T.cyclops、T.equiperdum、T.evansi、T.dionisii、Tgodfreyi、T.grayi、T.lewisi、T.mega、T.microti、T.pestanai、T.rangeli、T.rotatorium、T.simiae、T.theileri、T.varani、T.vespertilionis和T.vivax。

可以在本发明中使用的传染性的真菌包括酵母，例如Candidaalbicans、Candida stellatoidea、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida krusei、Candida pseudotropicalis、Candida quillermondii、Candidaglabrata、Candida lusianiae和Candida rugosa。其他真菌包括Microsporum canis和其他M.spp.，Trichophyton spp.(例如T.rubrum和T.mentagrophytes)，Torulopsis glabrata、Epidermophytonfloccosum、Malassezia furfur、Pityropsporon orbiculare、P.ovale、Cryptococcusneoformans、Aspergillus fumigatus和其他Aspergi llusspp.，Zygomycetes(e.g.，Rhizopus，Mucor)，Paracoccidioides brasiliensis、Blastomycesdermatitides、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis和Sporothrixschenckii。

对于细菌宿主中库的产生，能够表达克隆的多核苷酸的任何载体可以在宿主细菌中使用。在一个实施方式中，使用E.coli的实验室菌株；用于在E.coli中表达的合适的载体是本领域公知的，包括载体例如pET表达载体系统(EMD Biosciences，San Diego，Calif.)、pDESTSL8(在此描述)和pDEST17(Invitrogen)。载体可以被修饰以包括N-或C-末端标签，如所希望的，例如，用于库的验证(例如，如在此描述的)。这种载体也可以含有可诱导启动子(例如，T7聚合酶启动子)，这是本领域公知的，其容许在应用外源化学物质(例如，IPTG(异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷)或在应用噬菌体(例如，CE6噬菌体)时的表达，取决于所使用的细菌菌株。

对于病毒库(例如，噬菌体展示库)的产生，形成库的多核苷酸被克隆到噬菌体载体中。这种载体和载体系统是本领域公知的，包括Novagen T7

噬菌体展示载体(EMD Biosciences)。

在某些实施方式中，本发明的细菌库，除了含有来自病原生物的第一多核苷酸之外，可以含有第二多核苷酸序列，作为第一多核苷酸的部分(除了来自病原生物的序列之外)或作为第二表达载体的部分。这种第二多核苷酸序列可以编码第二蛋白质，例如，李斯特菌素O(LLO)。E.coli/LLO系统

E.coli/LLO系统提供了一种方式，用于在E.coli中表达的蛋白质在内吞到细胞之后逃脱内吞它的液泡，并接触细胞的胞质液(附图3)。LLO通过穿孔液泡来起作用，从而允许它的内容物逃脱进入细胞质。李斯特菌素O在中度酸性pH值下(液泡内的pH条件)展现了更好的孔洞形成能力，因而非常适合于这个目的。这容许表达的蛋白质通过I类MHC途径的增强的加工(参见附图4-6)。这种系统在美国专利6,004,815中广泛地描述了，其通过引用合并在此。除了LLO之外，本发明的库和方法可以采用具有相似活性的其他蛋白质；可以采用促进潜在抗原性蛋白向细胞的细胞质递送的任何蛋白质(例如，孔洞形成蛋白)，所述细胞能够内吞本发明的库的细菌或病毒。E.coli/LLO系统对于筛选活化CD8⁺CTL细胞的抗原是特别有用的。没有LLO而制备的本发明的库可以用于筛选CD4⁺CTL细胞活化。

在此呈现的实施例意图是说明而不是限制本发明。

实施例1

克隆Chlamydia trachomatis(沙眼衣原体)基因组

沙眼衣原体血清型D/UW-3/Cx基因组中的每个ORF通过2步骤PCR过程来扩增。第一个步骤使用了对每个ORF特异的引物来以96孔形式扩增每个序列。所述引物被设计以除去ORF中存在的任何分泌信号序列，以防止当它们被表达时在E.coli中的分泌并最小化毒性。第二PCR步骤被用于向每个PCR产物的5′和3′末端添加需要的重组序列。

一旦ORF被扩增和添加了重组序列，PCR产物被重组到DONR载体中。这可以使用Gateway系统或MAGIC系统来进行。对于这个库，使用Gateway系统。在存在Gateway BP重组酶的情况下将最终的PCR产物于pDONR221质粒孵育。在过夜孵育之后，反应溶液直接转化到E.coli中，其然后平铺在含有卡那霉素的LB琼脂平板上来选择DONR质粒的存在。生长的任何细菌必须含有已经与PCR产物重组的DONR载体，因为由于质粒中毒素基因的存在，如果没有重组，DONR质粒对于E.coli是有毒的。当DONR质粒与PCR产物重组时，这个毒素基因丧失了，容许细菌支持质粒的存在。

MAGIC重组系统非常类似地工作，只是PCR产物被直接转化到已经含有MAGIC1供体载体的E.coli中。重组步骤在细菌内发生。然后通过将细菌平铺在含有氯苯丙氨酸的平板上来选择成功的重组事件。由于载体中pheS基因的存在，这种化学物质对于含有没与PCR产物重组的magic供体载体的E.coli是有毒的，所述基因在成功的重组期间丧失。仅仅含有已经与PCR产物重组的供体载体的E.coli存活。两种系统中的完整转化过程以96孔形式来进行，包括打板步骤来确保在琼脂平板上的任何孔中的所有的菌落是仅仅单个ORF序列的成功重组的结果，所述序列在PCR步骤期间在相应的反应孔中被扩增。这容许克隆群体中每个ORF的克隆。

每个ORF的克隆被接种到96深孔平板中含有卡那霉素的LB中。来自每个克隆的质粒DNA通过96孔迷你制备操作来分离。与克隆的ORF序列的DONR载体5′和3′中的序列互补的引物被用于PCR扩增重组到载体中的序列。PCR产物在琼脂糖凝胶上跑动，产物的大小与预测的大小进行比较。与预测的大小显著不同的、含有重组序列的任何克隆被放弃，选择该ORF的新的克隆并对适当的大小进行测试。含有正确长度的序列的所有克隆移动到克隆操作的下一步骤。

对于MAGIC系统，供体载体可以用于表达ORF；因而，不再需要进一步的克隆。然而在Gateway系统中，ORF序列被穿梭到含有容许ORF的表达的启动子的第二载体中。通过将分离的DONR质粒DNA与目的地载体pDESTSL8在存在Gateway LR重组酶的情况下孵育来实现这一点。pDESTSL8通过添加含有SIINFEKL表位(SEQ ID NO：155)的C-末端融合物在我们的实验室中从pDEST17(附图7)构建。在18小时的孵育之后，反应溶液直接转化到E.coli中，其然后以96孔形式平铺在含有羧苄青霉素的LB琼脂平板上。每个ORF的克隆接种到96孔平板中含有羧苄青霉素的LB中，来选择接受了已经重组在ORF序列中的pDESTSL8的细菌。分离每个克隆的质粒DNA，与重组的ORF的pDESTSL85′和3′的序列互补的引物被用于PCR扩增重组的序列。这些PCR扩增的产物通过琼脂糖凝胶电泳来分析；具有不正确大小的插入物的任何克隆被放弃，测试该ORF的新的克隆。具有正确大小的插入物的每个克隆被认为是正确的，并继续来测试表达。

来自赘生性细胞的库的产生

在本发明的另一个实施方式中，提供了包括编码至少多肽的片段的多核苷酸的可复制的库，与相应的正常细胞相比在赘生性细胞例如癌细胞(例如，乳腺癌细胞)中所述多肽的表达被提高(例如，至少1.05、1.1、1.2、1.4、1.5、1.75、2、3、4、5、7、10、25、50或100倍的因数)。在赘生性细胞中具有提高的表达的一组多核苷酸的鉴定可以通过本领域已知的任何方法来进行。一般地，使用表达阵列，例如可以从Affymetrix获得的那些，来对表达进行剖绘。因而，其表达在赘生性细胞中增加的多核苷酸使用这种表达阵列被鉴定出，然后可以用于产生本发明的库。

其表达在赘生物中增加的多核苷酸的克隆可以通过逆转录从鉴定为具有提高的表达的每个多核苷酸转录的单独的mRNA来进行。选择对每个mRNA特异的引物，并用于单独地将mRNA序列转录到DNA序列中。DNA序列然后可以克隆到合适的载体中，所述载体含有能够在所述库的细胞或病毒中表达的启动子，一般是在通过PCR扩增每个DNA序列之后。一旦每个多核苷酸被克隆到载体中，多核苷酸可以被导入在此描述的细胞或病毒。

与正常细胞相比在赘生性细胞中过量表达的多核苷酸液可以通过使用cDNA减法库来鉴定。产生这种库的方法是本领域已知的，并且是商业上可获得的，例如，Clonetech PCR-Select产品(ClonetechLaboratories，Inc.，Mountain View，Calif.)。

多核苷酸的表达

为了在本发明的方法中使用，形成库的成员的细胞或病毒可以表达编码来自病原生物的多肽的至少一部分的多核苷酸。在具有可诱导启动子的细菌系统中，这伴随着施用合适的物质(例如，化学物质或噬菌体)来诱导蛋白质表达。对实施例1中描述的C.trachomatis库来说，如下进行这一点。

实施例2

C.trachomatis多核苷酸的表达

含有ORF的每个表达质粒被转化到已经含有质粒的E.coli中来表达李斯特菌素O(cLLO)的细胞胞浆形式。细菌平铺在含有羧苄青霉素和氯霉素的LB琼脂平板上来选择两个质粒。挑选每个ORF的菌落，接种到96孔平板中含有羧苄青霉素和氯霉素的LB中，并生长18小时。然后将稳定期培养物稀释到含有0.2％麦芽糖、羧苄青霉素和氯霉素的新鲜LB中。在4小时生长之后，对每个反应孔采集OD₆₀₀来确定每个孔中的细菌数目。添加MgSO₄来在每个培养物中得到10mM的浓度。然后，在其基因组中含有处在组成型启动子之下的T7聚合酶的基因的复制缺陷的λ噬菌体，CE6噬菌体以12:1的MOI添加。一旦噬菌体感染了细菌，T7聚合酶被表达，其然后能够在T7启动子的控制下转录衣原体ORF。轻轻地混合培养物，在37℃没有摇动地孵育20分钟。20分钟后，摇动孵育培养物另外1小时40分钟，以允许ORF的表达。然后测量每个反应孔的OD₆₀₀来确定每个培养孔中细菌的浓度。从每个反应孔收获1×10⁸个细菌，团化并重悬浮在1mL的0.5％多聚甲醛中。培养物在室温下孵育30分钟。培养物然后团化，用PBS洗涤三次。在最后的洗涤之后，细胞进行团化，重悬浮在1mL的PR-10培养基中。培养物然后按20μl的体积等分到96孔平板中，并在-80℃冷冻。这个操作可以产出超过50个独立的库等分量来筛选不同的T细胞系。

库的表达的验证

本领域已知的任何方法可以用于确定库的每个成员是否能够表达来自病原生物或赘生性细胞的多核苷酸(例如，western印迹)。在此描述的C.trachomatis库中，表达的证实如下实现。

实施例3

测试表达

我们利用融合到每个ORF的C-末端的SIINFEKL表位(SEQ ID NO：155)开发出蛋白质表达的高通量测试，用于蛋白质表达的验证(附图8-10)。为了进行这种分析，库的冷冻等分量被解冻，添加到H2b单体型的巨噬细胞，所述巨噬细胞在前一天播种到96孔平板中。赋予巨噬细胞/细菌混合物一小时，在这期间，细菌被巨噬细胞吞噬。在吞噬泡这，细菌被裂解，将E.coli表达的所有蛋白质释放到液泡中，包括衣原体蛋白质和cLLO。cLLO然后穿孔吞噬泡膜，容许衣原体蛋白质进入巨噬细胞的胞质液，在其中它可以被加工，来自蛋白质的肽可以呈递在MHC I类分子上。如果衣原体蛋白质被表达为全长的，它具有融合到它的C-末端的SIINFEKL表位(SEQ ID NO：155)。这个表位将与衣原体蛋白质一起被递送，将被加工并呈递在巨噬细胞表面的MHC I类分子上。通过在小时孵育的结束时添加B3Z T细胞杂交瘤细胞来探试这种MHC-肽复合物。当它们识别MHCSIINFEKL复合物时，B3Z细胞变为活化的(附图9)。当它们变为活化的时，β-半乳糖苷酶表达被诱导。B3Z细胞与巨噬细胞孵育15-20小时以容许B3Z细胞有时间扫描所述的MHC-肽复合物，并且如果存在复合物时增量调节β-半乳糖苷酶。在15-20小时之后，添加LacZ缓冲液来检测平板的每个反应孔中β-半乳糖苷酶活性的量。LacZ缓冲液含有洗涤剂来裂解巨噬细胞，以及β-半乳糖苷酶底物、氯苯红-β-D-半乳吡喃糖苷(CPRG)，当被β-半乳糖苷酶裂解时其从黄色变为紫色。裂解的产物的数量通过在分光光度计中测量每个反应孔的OD_570nm来确定。因而，570nm处的强信号表明在该反应孔中表达的衣原体蛋白质被表达为全长并且被递送给I类MHC途径。

确定来自病原体或赘生性细胞的多肽是否是免疫原性的

细胞或病毒的库含有编码来自病原生物或来自赘生性细胞的多肽的多核苷酸，可以被筛选来确定所述多核苷酸编码的哪些多肽是免疫原性的。这可以通过用第二细胞(例如，巨噬细胞)接触库的每个成员来实现，所述第二细胞能够内吞库的细胞或病毒，并且在所述第二细胞的表面展示所述库的表达的多肽的部分。例如，在美国专利No.6,008,415中描述了这个过程。第二细胞然后与来自早先感染上病原生物的生物体的CTL细胞、来自具有赘生物的生物体的CTL细胞、或来自早先具有赘生物的生物体的CTL细胞接触。与CTL细胞接触可以通过例如使用多聚甲醛固定第二细胞来进行。能够结合呈递的抗原/蛋白质部分的CTL将引起细胞因子的分泌。细胞因子分泌(例如，IFNγ、IL-2或TNF的分泌)可以如本领域已知的来分析，例如，使用ELISA分析。在工作实施例中，如以下实施例4中所描述的筛选在此描述的C.trachomatis库。细胞毒T淋巴细胞

用于本发明的方法中的CTL细胞的库可以通过本领域已知的任何方法来得到。一般地，在筛选针对病原生物的抗原时，从早先被病原体感染的哺乳动物制备CTL细胞。这种制品将含有对来自病原体的抗原特异的CTL细胞。

C.trachomatis特异性CTL可以如下从小鼠中引发。用10⁷ IFU的C.trachomatis注射小鼠。14天后，小鼠被安乐死，收获脾脏。脾脏通过70μm筛子来碎化，产生脾细胞的单细胞溶液。利用本领域中标准的MACS分离方案，使用结合到MACS磁性珠子的α-CD8抗体从脾细胞中分离CD8⁺ T细胞(参加，例如，可从Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，Calif.获得的MACS技术)。分离的CD8⁺细胞添加到24孔平皿中相同单体型的巨噬细胞，所述巨噬细胞在18小时之前用C.trachomatis感染。在含有IL-2的培养基中添加来自幼稚小鼠的照射的脾细胞作为饲养细胞。细胞孵育10天，在这期间，C.trachomatis特异性T细胞被感染的巨噬细胞刺激并复制。在第10天，利用在18小时前C.trachomatis感染的巨噬细胞和照射的脾细胞再次刺激T细胞。重复这个过程，直到存在足够数量的T细胞来筛选整个库。

对于用于针对赘生性细胞例如乳腺癌细胞的抗原的筛选的CTL细胞的制备，使用完整的肿瘤RNA产生特异于乳腺癌的多克隆CTL库。然后使用已知的肿瘤相关抗原验证CTL库(附图11)。

例如，如Hassell et al.(Immunology 79：513-519，1993)所描述的，CTL细胞可以从人类受试者克隆。

实施例4

未知抗原的筛选

库的冷冻等分量(总共10个96孔平板)被解冻，添加到巨噬细胞，所述巨噬细胞在前一天播种到10个96孔平板中。平板孵育2小时，洗涤并用1％多聚甲醛固定来杀死巨噬细胞并稳定任何I类MHC-肽相互作用。然后再次洗涤细胞来除去多聚甲醛。未知特异性的C.trachomatis特异性CD8⁺T细胞然后添加到每个反应孔中。如果T细胞识别的表位被呈递在给定的反应孔中，T细胞将变为活化的。通过使用IFNγELISA试剂盒策略18-20小时培养后每个反应孔的上清液中存在的IFNγ的数量，检测T细胞活化(参见附图12)。这也可以伴随着测试活化的T细胞释放的其他细胞因子例如IL-2。含有比所有其他反应孔高得多浓度的IFNγ的任何反应孔暗示了库中的相应衣原体蛋白质是可能的抗原。对于任何可能的抗原，重复该过程来确保命中不是假阳性的。如果在第二次筛选中抗原活化了T细胞，ORF被认为是抗原，并且继续进行表位鉴定。

表位鉴定

一旦鉴定了多肽抗原，常常希望的是鉴定CTL细胞应答的所述多肽内的表位。这可以通过使用本领域已知的的克隆技术重复地分析多肽的每个部分来实现，或可以使用系统如Erase-a-Base试剂盒(Promega)来实现。如在此描述的针对CTL细胞来筛选截断的多肽，以确定多肽的哪些部分是产生免疫原性反应所需的。

在一个实施方式中，T细胞系所识别的特定肽表位通过使用来自Promega的Erase-a-Base试剂盒产生完整抗原序列的嵌套删除来鉴定。含有抗原序列的质粒克隆首先用NheI和AatII消化。NheI切割产生靠近ORF的3′末端的适当的5′突出，以容许Erase-a-Base试剂盒中的核酸酶沿抗原序列裂解3′-5′，而AatII切割位点的3′突出防止核酸酶从另一个方向上消化并且除去药物抗性盒的序列。一旦使用限制性内切酶切割了质粒，根据试剂盒所提供的方案，Erase-a-Base试剂盒被用于在编码抗原的序列中产生一系列3’截断物。这些截断物被连接并转化到含有质粒的E.coli中来表达cLLO。然后如上所述用CE6噬菌体诱导蛋白质表达。当表达时，截断物将产生缺少它们C-末端肽序列的不断增加的数量的蛋白质。然后使用以上阐述的原始的T细胞系重新筛选不同的截断物克隆。不再活化T细胞系的克隆丧失了T细胞系识别的表位的序列。确定了不再含有表位的最大的截断物克隆以及仍然含有表位的最短的截断物克隆的序列。

表位的3′边缘的位置存在于最短的阳性克隆含有的以及最大的阴性克隆不含有的肽序列中。合成了这个序列的重叠的8-10mer肽。肽然后在巨噬细胞上脉冲，筛选它们活化T细胞系的能力。能够活化T细胞系的肽被认为是表位。

CT788

本发明特征还在于CT788(Cta1)多肽和其片段(例如，包括CT788蛋白质的氨基酸133-152的免疫原性片段(SEQ ID NO：2)和在表1中列出的那些(SEQ ID NO：3-154)(例如，表1中列出的免疫原性片段))，包括CT788蛋白质或其片段的药物和疫苗组合物(例如，在此描述的那些)，以及通过施用CT788或其片段(例如，免疫原性片段)(例如，在此描述的片段)用于治疗或预防细菌感染(例如，衣原体感染)的方法。

CT788作为C.trachomatis的抗原性代表的鉴定

虽然病原体特异性TCR tgT细胞早先已经在其他传染性疾病模型中使用(Butz et al.，Immunity 8：167-75，1998；Sano et al.，J.E.xp.Med.194：173-80，2001；Roman et al.，J.Exp.Med.196：957-68，2002；Coles et al.，J.Immunol.168：834-838，2002；McSorley et al.，Immunity 16：365-377，2002)，以下描述的NR1小鼠是具有特异于感染生殖道的病原体的T细胞的第一种TCR tg小鼠。早先，不可能的是检查对生殖器病原体例如C.trachomatis的T细胞反应，因为难以在体内鉴定和跟踪特异于生殖器抗原的幼稚T细胞。特别是，不能够遗传地修饰C.trachomatis来表达异源T细胞表位，以及缺乏明确定义的衣原体特异性CD4⁺T细胞抗原，使得难以研究对这种生殖器病原体的T细胞反应。

由于在衣原体感染期间识别的鼠CD4⁺T细胞抗原早先没有被定义，原始的衣原体特异性T细胞反应的分析限于检查对未确定的抗原的多克隆T细胞反应(Cain et al.，Infect.Immunol.63：1784-1789，1995)。在这些早先的实验中，研究人员不能够区分真正的衣原体特异性T细胞反应和旁观者T细胞活化，旁观者T细胞活化已经显示了在许多其他的传染性疾病模型中促进总体响应(Yang et al.，J.Immunol.136：1186-1193，1986；Tough et ah，Immunol.Rev.150：129-142，1996)。如以下描述的，我们鉴定了CD4⁺T细胞抗原Cta1(CT788)，其容许检测C.trachomatis感染期间刺激的抗原特异性T细胞反应。由于N-末端信号序列，这种抗原预计是细胞周质蛋白，但是它的功能是未知的(Stephens et al.，Science 282：754-759，1998)。Cta1在所有已经测序的C.trachomatis血清型中是保守的，包括引起生殖道感染、眼睛感染和LGV的那些血清型。Cta1在自然感染后刺激保护性T细胞，表明这个蛋白质可能在针对C.trachomatis的免疫中起到重要作用。在研究T细胞与抗原的起始遭遇中的另一个困难是在未免疫的动物中病原体特异性T细胞的低的前体频率。其他研究人员试图通过将未知特异性的T细胞克隆转移到衣原体感染的小鼠中来提高衣原体特异性T细胞的频率(Hawkins et al.，Infect.Immunol.68：5587-5594，2000；Hawkins et al.，Infect.Immunol.70：5132-5139，2002)。因为转移的T细胞是经历了抗原的，并已经通过多轮的重新刺激来增殖，这些T细胞的反应不能被用于模拟幼稚T细胞与C.trachomatis的起始遭遇。为了克服早先的方法的局限性以及研究初始的衣原体特异性T细胞反应，我们开发了NR1，一种特异于Cta1的TCR tg小鼠系。在此，NR1细胞向未免疫的小鼠中的继承转移被用于提高幼稚的、衣原体特异性T细胞的频率，而仍然维持接受者动物中的多克隆T细胞环境(Pape et al.，Immunol.Rev.156：67-78，1997)。

然后检查衣原体特异性T细胞对感染的鼠生殖道的反应。采用了感染模型，其中用人类C.trachomatis血清型L2接种小鼠的子宫。这种传染途径早先已经用于初免衣原体特异性T细胞，其随后可以从脾脏培养(Starnbach et al.，Infect.Immunol.63：3527-3530，1995)，还展现了在小鼠中引起输卵管炎(Tuffrey et al.，Br.J.Exp.Pathol.67：605-16，1986；Tuffrey et al.，J.Exp.Pathol.(Oxford)71：403-10，1990)。其他研究使用了不同的衣原体物种Chlamydia muridarum作为感染的小鼠模型。已知C.muridarum不感染人类，但是当接种到雌性小鼠的阴道穹顶中时引起上行性感染。然而，我们不能使用这种模型，因为我们的Cta1特异性T细胞不识别C.muridarum感染的细胞(数据未显示)，表明C.trachomatis中的Cta1表位在C.muridarum中的Cta1同源物中可能不是保守的。

利用C.trachomatis的人类血清型的子宫内感染，衣原体特异性T细胞在生殖道中展现了响应于感染的Th1反应。当仍处于ILN中时这些细胞分泌IFNγ，在迁移到感染的生殖道中之后继续分泌。IFNγ长期被暗示作为衣原体清除中的关键效应物，但是也可能是与感染相关的组织病理的原因。在体外，IFNγ增强吞噬细胞控制衣原体复制的能力(Rottenberg et al.，Curr.Opin.Immunol.14：444-451，2002)。在体内，对衣原体感染的敏感度在IFNγ-/-小鼠中增加，转移到小鼠中的衣原体特异性T细胞如果分泌IFNγ仅仅看起来是保护性的(Loomis et al.，Curr.Opin.Microbiol.5：87-91，2002)。除了它在保护中的作用之外，IFNγ在体外诱导衣原体发展成持续状态(Rottenberg et al.，Curr.Opin.Immunol.14：444-451，2002；Hogan et al.，Infect.Immunol.72：1843-1855，2004.)，有证据的是，生物体在某些人类感染中存留(Villareal et al.，Arthritis.Res.4：5-9，2002)。衣原体的存留或重复感染可能促进体内的组织结疤(Beatty et al.，Microbiol.Rev.58：686-699，1994)。根据IFNγ促进组织病理的假说，相对于来自对照患者的淋巴细胞，来自患有与Chlamydia相关的输卵管因素不育的患者的淋巴细胞响应于衣原体分泌高水平的IFNγ(Kinnunen et al.，Clin.Exp.Immunol.131：299-303，2003)。

在我们的模型中，在ILN中NR1T细胞上CD69的增量调节不会发生，直到生殖器感染之后三天，增殖不会发生，直到感染后四天。在子宫内衣原体接种和NR1细胞的活化之间的时期可以确定衣原体抗原移动进入导液淋巴结所需的时间量，在导液淋巴结中抗原可以活化幼稚T细胞。这个时间显著地晚于全身感染之后在脾脏中诱导的增殖(数据未显示)。生殖器组织中免疫系统的元件与肠组织中的那些相比是较少被表征的，但尽管如此这两种粘膜表面之间的差异是明显的。不同意肠腔，生殖器粘膜缺少有组织的淋巴元件(Parr et al.，Biol.Reprod.44：491-498，1991；Nandi et al.，Reg.Immunol.5：332-338，1993)。虽然肠腔具备可以直接采样腔内容物的Peyer′s膜片，T淋巴细胞针对生殖器病原体的淋巴细胞的起始必须在生殖器粘膜外部发生，也许是在ILN中，ILN将抗原从生殖道中导出(Parr et al.，J.Reprod.Immunol.17：101-14，1990；Cain et al.，Infect.Immunol.63：1784-9，1995；Hawkins et al.，Infect.Immunol.68：5587-94，2000；Nandi et al.，Reg.Immunol.5：332-338，1993)。例如，对肠的病原体S.enterica特异性的T细胞已经被证明在口腔感染后几个小时在Peyer′s膜片中活化，这些淋巴结中的T细胞直到感染后两天广泛地增殖(McSorley et al.，Immunity 16：365-377，2002)。衣原体抗原从生殖器表面迁移到ILN所需的时间量可以解释在感染后三天之前NR1活化的缺乏。生殖器和肠粘膜也在对征募淋巴细胞负责的细胞表面粘附分子方面不同。淋巴细胞上的α4β7整联蛋白与肠内皮上的MAdCAM-1粘附分子之间的相互作用介导T淋巴细胞向肠粘膜的征募，这样的相互作用看起来在向生殖器粘膜的征募中不起到重要作用(Rottet al.，J.Immunol.156：3727-2736，1996；Perry et al.，J.Immunol.160：2905-2914，1998)。

早先展现的是，T细胞可以保护小鼠免于衣原体感染(Starnbach etal.，J.Immunol.，153：5183-9，1994；Starnbach et al.，J.Immunol.，171：4742-9，2003)。然而，早先不可能的是确定幼稚的衣原体特异性T细胞首先遭遇抗原的时间和地点，它们在活化之后如何运输，以及它们增殖的时间和地点。分析这些早期事件方面的主要局限是幼稚衣原体特异性T细胞的低的前体频率。然而，我们现在产生了第一种研究衣原体特异性幼稚T细胞的反应的工具——T细胞受体(TCR)转基因小鼠。

衣原体特异性CD4⁺T细胞克隆为了鉴定衣原体特异性TCR用于TCR转基因小鼠的创造，我们产生了衣原体特异性CD4⁺T细胞克隆，称为NR9.2。当在细胞内细胞因子染色分析中与衣原体感染的巨噬细胞共培养时，这个克隆特异性地分泌IFNγ(附图13A)。此外，这个克隆的继承转移保护幼稚小鼠免于衣原体感染(附图13B)。筛选了基因组数据库中含有的C.trachomatis ORF表达的蛋白质的库。在我们筛选的894个ORF中，仅表达由CT788编码的蛋白质的E.co li(附图14)刺激NR9.2分泌显著性水平的IFNγ(附图15)。CT788在公开的C.trachomatis基因组中被注释为未知功能的预测的周质蛋白质(Stephens et al.，Science 282：754-759，1998)，它的序列与衣原体属之外的蛋白质具有微小的同源性。CT788被称为Cta1(衣原体特异性T细胞抗原1)。

来自NR9.2克隆的表达TCR的小鼠我们然后产生了来自NR9.2克隆的表达TCR的小鼠。来自所产生的TCR转基因小鼠的外周血单核细胞表达与衍生它们的T细胞克隆一样的相同的可变链元件(Vα2、Vβ8.3)。我们将来自NR9.2的重排的基因组TCRα和TCRβ序列克隆到表达载体中，并将这些构建体注射到C57BL/6受精的卵母细胞中。假孕的雌性接受者然后植入所述卵母细胞，使用对NR9.2TCR特异的引物筛选出自寄母的单独的幼仔。鉴定出TCR tg创立者系，称为NR1。为了确认NR9.2 TCR在NR1中的转基因细胞上表达，测试了来自这些动物的外周血的细胞的Vα2和Vβ8.3 TCR元件的表达。Vα2和Vβ8.3是原始的NR9.2T细胞克隆表达的可变链(数据未显示)。显著百分比的来自转基因小鼠的外周血的CD4⁺T细胞的表达Vα2和Vβ8.3(附图16A)，表明来自NR9.2的TCRα和TCRβ转基因被有效地表达。转基因细胞也是CD69^lo、CD25^lo、CD62^Lhi、CD44^lo和CTLA4^lo，表明它们是幼稚的T细胞(数据未显示)。

为了确定NR1转基因T细胞是否对Cta1是特异性和反应性的，我们测试了转基因的脾脏细胞响应于Cta_133-152(参见附图14，SEQ ID NO：2)的增殖。来自幼稚NR1小鼠的脾脏细胞显示了对Cta1_133-152的强的增殖反应(附图16B)。NR1脾脏细胞也响应于这种肽分泌高水平的IFNγ(数据未显示)。相比之下，来自NR1的脾脏细胞不响应于来自卵清蛋白的对照肽OVA_323-336增殖(数据未显示)。

为了确定NR1转基因T细胞是否在体内响应衣原体，来自NR1小鼠的脾脏和外周淋巴结的三千万个细胞用荧光染料羰基荧光素双醋酸琥珀酰亚胺基酯(CFSE)来标记并继承性地转移到C57BL/6接受者中。大约10％的NR1细胞是表达Cta1特异性TCR的CD4⁺T细胞(数据未显示)，转移的群体含有大约3×10⁶个Cta1特异性T细胞。

CFSE标记的NR1转基因细胞在转移到未感染的接受者小鼠中之后保持了高水平的CFSE，表明转基因细胞在没有感染的情况下不分裂。

在接受CFSE标记的转基因细胞的其他C57BL/6动物中，用107IFU的C.trachomatis静脉内地感染动物。用于感染的C.trachomatis生物体是血清型L2，其与人类中性病性淋巴肉芽肿(LGV)相关，或是血清型D，其与典型的人类生殖道感染相关。在用C.trachomatis血清型感染三天之内，转基因细胞广泛地增殖(附图17)。我们还观察到NR1细胞的增殖特异于C.trachomatis感染。当接受NR1细胞的动物用Salmonellaenterica或Listeria monocytogenes静脉内地感染时，转基因的T细胞不被刺激增殖。由于其他的对照展现了具有其他特异性的TCR tg T细胞在接受者小鼠中不会响应C.trachomatis感染，我们显示了卵清蛋白特异性OTII转基因T细胞响应于具有佐剂的卵清蛋白增殖(数据未显示)但是不响应于C.trachomatis感染(附图17)。

为了研究在粘膜感染的环境中CD4⁺T细胞对C.trachomatis的反应，用CFSE标记的转基因细胞继承性地转移的Thy1.1(CD90.1)接受者小鼠用C.trachomatis L2在子宫角中感染。使用Thy1.1接受者小鼠，供体转基因细胞容易地区分于接受者动物中的内源细胞。转基因细胞的活化状态通过检查早期活化标记物CD69以及来自髂淋巴结(ILN)的T细胞上幼稚T细胞标记物CD62L的细胞表面表达来评定，ILN将来自生殖道的抗原导出(Parr et al.，J.Reprod.Immunol.17：101-14，1990；Cainet al.，Infect.Immunol.63：1784-9，1995；Hawkins et al，Infect.Immunol.68：5587-94，2000)。在感染后五天除去ILN，检查淋巴结中的NR1T细胞的CD69增量调节和CFSE荧光的损失。未感染的小鼠中的转基因细胞主要时未活化的(CD69^lo)并且是幼稚表型的(CD62^Lhi)。在感染之后，CD69在经历了几轮细胞分裂的细胞上增量调节，在经历了进一步轮数的分裂后的细胞上减量调节。CD62L在广泛地分裂的转基因细胞的亚群上减量调节(附图18A)。而T细胞增殖在非导液淋巴结中是弱的，在导液淋巴结中感染后四天观察到广泛的T细胞增殖(附图18B)。在活化和增殖之后，转基因细胞也被征募到感染的小鼠中的生殖器粘膜上(附图18C)。

如附图18A所示，来自感染的动物的显著数量的NR1T细胞显示了CFSE的渐进性的稀释，表明发生了广泛的增殖。此外，新近分裂的(CFSE^med)NR1T细胞表达高水平的CD69，表明这些细胞新近也已经被活化。一旦NR1细胞经历了广泛的增殖(CFSE^lo)，它们表达更低水平的CD69。这些结果与CD69作为早期T细胞活化标记物一致，其仅在抗原遭遇之后短暂地增量调节(Ziegler et al.，Stem Cells 12：456-65，1994；Cochran et al.，Immunity 12：241-50，2000)。来自模拟感染的接受者的ILN的细胞是CFSE^hi的，并且不增量调节CD69，表明它们没有被活化。有趣地，在感染的接受者中存在着相似的CFSE^hiCD69^lo NR1细胞群体。这些可以是不遭遇抗原的细胞，或者它们可以是由于内源的TCR重排不表达合适的Cta1特异性TCR的细胞(von Boehmer，Annu.Rev.Immunol.8：531-556，1990；Balomenos et al.，J.Immunol.i55：3308-3312，1995)。

活化的T细胞的其他特征包括幼稚标记物CD62L的减量调节和活化分子CD44的增量调节。为了确认NR1细胞在衣原体生殖器感染之后被活化，分析了CD62L和CD44在来自接受者小鼠的ILN的转移的CFSE标记的NR1T细胞上的表达。感染后七天，广泛地增殖的NR1T细胞的子集(CFSE^lo)降低了CD62L的表达(附图18A)。相反，在模拟感染的和感染的接受者中未分裂的(CFSE^lo)NR1细胞主要是CD62L^hi。除了显示CD62L^lo表型之外，效应物T细胞一般表达高水平的活化标记物CD44。

来自感染的接受者的ILN的增殖的NR1T细胞完全地是CD44^hi(附图18A)。因而，NR1细胞在衣原体的生殖器感染之后的小鼠的ILN中被活化并增殖。

NR1细胞的广泛的增殖在ILN中优先地发生。为了确认在ILN中NR1细胞的活化和增殖由生殖道向这些淋巴结的抗原导引所引起，在ILN中NR1细胞的反应与不导引生殖道的淋巴结(非导引淋巴结，NDLN)中的反应比较。长时间监视T细胞活化和增殖来确保在观察倒感染的过程时在NDLN中出现了任何活性。3×10⁷个CFSE标记的NR1细胞转移到CD90.1小鼠中。小鼠然后在子宫中用10⁶IFU的C.trachomatis血清型L2感染。然后在感染后不同的时间收获淋巴结。在ILN中，在感染后三天开始在NR1细胞上见到CD69的增量调节。感染后四天，观察到CD62L的减量调节和CD44的增量调节。活化标记物的获得在来自ILN的NR1细胞中优先地发生，在来自NDLN的NR1细胞中不发生(数据未显示)。因而，NR1细胞在衣原体的生殖器感染之后的ILN中被特异性地活化。通过在感染后各个时间监视转移的NR1细胞的增殖，我们确认了NR1细胞在ILN中优先地遭遇抗原。在ILN中感染后两天和三天NR1细胞主要时CFSE^hi的，表明这些细胞在这些早期时间点没有增殖(附图19)，但是ILN中的NR1细胞在感染后四天内广泛地增殖。虽然NR1细胞在感染的四天也在NDLN中增殖，数量显著地低于在ILN中见到的。相对于在ILN中，在NDLN中的增殖NR1细胞含有更低水平的CFSE，并且不表达显著性水平的CD69(数据未显示)，表明这些细胞在活化之后从其他位点迁移到NDLN。NR1T细胞在NDLN中的显著扩展甚至在感染后一周也不发生(数据未显示)，再一次表明细胞的增殖优先地在ILN中发生。

ILN中的NR1细胞发展了分泌IFNγ的能力。为了检查抗原活化的NR1细胞成为效应物T细胞的分化，我们确定了增殖的NR1细胞响应于C.trachomatis感染分泌效应物细胞因子。3×10⁷CFSE标记的NR1细胞转移到CD90.1同基因小鼠中，然后这些小鼠在子宫中用10⁶IFU的C.trachomatis血清型L2感染。六天后除去ILN，通过流式细胞计分析NR1T细胞的细胞因子的产生。增殖的NR1细胞(CFSE^lo)分泌IFNγ，而非增殖的细胞(CFSE^hi)不分泌IFNγ(附图20)。NR1细胞不分泌IL-4(数据未显示)。因而，在衣原体的生殖器感染之后，NR1细胞优先地分化成Th1表型的效应物T细胞。

经历了抗原的NR1细胞移动到生殖道。在活化之后，效应物T细胞一般被征募到感染的位点，在此它们促进病原体的消除(Swain et al.，Adv.Exp.Med.Biol.512：113-120，2002；Gallichan et al.，J.Exp.Med.184：1879-1890，1996)。为了确定衣原体特异性NR1细胞是否迁移到小鼠中生殖器感染的位点，3×10⁷CFSE标记的NR1细胞转移到CD90.1同基因小鼠中。这些接受者在子宫中用10⁶IFU的C.trachomatis血清型L2感染。然后分离生殖道组织，测定转移的衣原体特异性T细胞的存在。与模拟感染的动物中相比，在C.trachomatis感染的动物的生殖器粘膜中观察到显著更多的NR1细胞(附图18C)。征募到生殖道中的转基因细胞具有经历了抗原的细胞的表型(CFSE^loCD62L^loCD44^hi)并且分泌IFNγ(附图21A和21B)。概括地说，分泌IFNγ的活化的NR1TCRtg T细胞响应于C.trachomatis感染被征募到生殖器粘膜中。

Cta1的抗原性片段

为了更精密地绘制NR9.2T细胞所识别的Cta1内的表位，筛选了覆盖Cta1序列的一系列重叠20-mer肽刺激NR9.2分泌IFNγ的能力(表2)。20-mer肽Cta1_133-152(KGIDPQELWVWKKGMPNWEK；SEQ ID NO：2)诱导NR9.2分泌显著性水平的IFNγ(附图22)，确认了这些C.trachomatis特异性T细胞对这20个氨基酸内的表位的特异性。

表2：抗原/T细胞系、肽和策略的IFNγ(ng)(SEQ ID NO：2和156-171)

 

Cta1/NR9.2

LESTSLYKKAGCANKKNRNLGCANKKNRNLIGWFLAGMFFIGWFLAGMFFGIFAIIFLLIGIFAIIFLLILPPLPSSTQDLPPLPSSTQDNRSMDQQDSENRSMDQQDSEEFLLQNTLEDEFLLQNTLEDSEIISIPDTMSEIISIPDTMNQIAIDTEKWNQIAIDTEKWFYLNKDYTNVFYLNKDYTNVGPISIVQLTAGPISIVQLTAFLKECKHSPEFLKECKHSPEKGIDPQELWVKGIDPQELWVWKKGMPNWEKWKKGMPNWEKVKNIPELSGTVKNIPELSGTVKDESPSFLVVKDESPSFLVQSGVAGLEQLQSGVAGLEQLESI

0.4(±0.2)0.5(±0.3)0.6(±0.3)0.4(±0.2)0.6(±0.2)0.6(±0.3)0.6(±0.2)0.6(±0.2)0.5(±0.2)0.7(±0.4)0.5(±0.3)0.5(±0.4)58.0(±14.0)1.4(±0.2)0.8(±0.1)0.7(±0.2)0.8(±0.2)

通过筛选这个20-mer的删除肽，可以鉴定NR9.2的活化所需的最小序列。表位序列可以包括Cta1_133-152的3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18和19个氨基酸片段，可以包括Cta1_133-152片段的N-末端或C-末端删除，或N-和C-末端删除的组合(参见，例如，表1)。进一步的，也可以类似地鉴定在Cta1的其他区域的抗原性肽或使用其他T细胞克隆。本发明的组合物和方法可以包括或采用在此描述的表位片段的组合。Cta1片段的抗原性可以使用本领域已知的方法和在此描述的方法来测定。

如下地进行如上所述的实验。

小鼠.C57BL/6J(H-2^b)、B6.PL-thyl^a0Cy(CD90.1同基因的)和OTII小鼠获自Jackson Laboratory。

组织培养.骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)和骨髓衍生的巨噬细胞(BMM)如早先描述的培养(Steele et al.，J.Immunol.173：6327-6337，2004；Shaw et al.，Infect.Immunol 74：1001-1008，2006)。

细菌的生长、分离和检测。C.trachomatis血清型L2434/Bu和C.trachomatis血清型D(UW-3/Cs)的基本体(EB)如早先描述的增殖和定量(Starnbach et al.，J.Immunol.171：4742-4749，2003)。Salmonellaenterica血清型Typhimurium(ATCC 14028)在Luria-Bertani(LB)培养基中在37℃生长。单核细胞增多性李斯特杆菌10403s生长在30℃的脑心浸液(BHI)培养基(Difco/Becton Dickinson，Sparks，MD)中。

NR9.2T细胞克隆的产生.来自小鼠的脾细胞在用C.trachomatis血清型L2感染后21天分离，与照射的(2,000rads)BMDC、UV失活的C.trachomatis血清型L2和幼稚的同基因脾细胞在RP-10(添加10％FCS、L-谷氨酰胺、HEPES，50μM 2-βME、50U/ml的青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640)中与α-甲基甘露糖苷和来自伴刀豆凝集素A刺激的大鼠脾脏细胞的5％上清液培养。使用Dynabeads Mouse CD8(Invitrogen)从培养物中耗尽CD8⁺T细胞。用C.trachomatis脉冲的BMCD每七天重复刺激CD4⁺T细胞。一旦建立了C.trachomatis特异性CD4⁺T细胞，通过限制稀释分离T细胞克隆NR9.2。

T细胞抗原Cta1的鉴定.来自C.trachomatis血清型D的基因组序列的表达库被插入到pDEST17载体(Invitrogen)的修改的形式中，并转化到E.coli的Stbl2菌株(Invitrogen)中。在蛋白质表达的诱导之后，细菌固定在0.5％多聚甲醛中并与BMM孵育。然后添加NR9.2细胞，在24h之后，通过ELISA(Endogen，Rockford，IL)测试上清液的IFNγ水平。为了见到Cta1内的反应性肽表位，在IFNγELISA(Endogen)中以25μM的浓度使用合成的20-mer肽(MIT Biopolymers Lab，Cambridge，Mass.)。

流式细胞计和抗体.特异于CD4、CD90.2、Vα2、Vβ8.3、CD69、CD25、CD44、CD62L、CTLA-4、IFNγ和IL-4的抗体购自BDBiosciences(San Diego，Calif)。数据在BD Biosciences FACSCalibur^TM流式细胞计(San Jose，Calif.)上收集，用CellQuest^TM软件分析。通过在存在GolgiPlug^TM试剂(BD Biosciences)的情况下与衣原体感染的BMM(MOI5:1)孵育NR9.2T细胞来进行细胞内细胞因子染色。通过在存在PMA(50ng/ml，MP Biomedicals，Solon，Ohio)、离子霉素(1μg/ml，Sigma，St.Louis，Mo.)和GolgiPlug^TM试剂(BD Biosciences)的情况下刺激细胞4小时，进行NR1转基因细胞的细胞内细胞因子染色。细胞用Cytofix/Cytoperm Plus试剂盒(BD Biosciences)渗透。PE结合的大鼠IgG1(BD Biosciences)被用在同种型对照抗体。

NR1TCR tg小鼠产生.来自NR9.2的重排的TCR使用了Vα2Jα16和Vβ8.3DJβ1.2受体链。基因组TCR序列被克隆并插入TCR载体pTα和pTβ的建议的限制性位点(Kouskoff et al.，J.Immunol Methods180：273-80，1995)。原核的DNA序列在注射到受精的C57BL/6J的生殖核中之前从两个载体中除去。TCR转基因创立者通过PCR来鉴定。通过用特异于Vα2和Vβ8.3的抗体染色来自小鼠的眼窝血液的样品，随后通过流式细胞计来进行常规筛选以鉴定转基因小鼠。

NR1细胞的继承转移、小鼠的感染和来自小鼠的组织的制备.脾脏和外周淋巴结分离自NR1 TCR tg小鼠并用染料CFSE(5μM，MolecularProbes，Eugene，Ore.)标记。用3×10⁷个NR1细胞i.v.注射接受者小鼠。在细胞的转移之后一天感染小鼠。在标明的地方，小鼠用10⁷IFU的C.trachomatis，3×10³CFU的L.monocytogenes、或5×10³CFU的S.enterica静脉内地感染。为了感染生殖道，在感染之前一周用2.5mg的安宫黄体酮皮下地处理小鼠以将小鼠同步到发情状态(Perry et al.，Infect.Immunol.67：3686-3689，1999；Ramsey et al.，Infect.Immunol.67：3019-3025，1999)。通过用10⁶IFU的C.trachomatis血清型L2接种子宫角来进行子宫内的感染。在感染后各个时间，制备脾脏、ILN或取自腋下和颈部淋巴结的NDLN的单细胞悬浮液，染色，如上所述通过流式细胞计分析。为了从生殖器粘膜分离淋巴细胞，从小鼠中取下生殖道(输卵管、子宫和宫颈)，用胶原酶(XI型，Sigma)消化一小时，之后染色和流式细胞计。

细胞内细胞因子染色.骨髓衍生的巨噬细胞用5:1 MOI的C.trachomatis L2感染16-18小时。以效应物比目标比例5:1添加T细胞，在存在布雷菲德菌素A(Pharmingen)的情况下孵育另外6小时。为了IFNγ的存在，对细胞进行渗透和染色。然后在FACScan流式细胞计上使用标准的流动细胞技术来分析细胞。

保护分析.在T细胞重新刺激后10天，10⁷个T细胞用PBS洗涤两次，继承性地转移到C57BL/6接受者小鼠中。然后小鼠用10⁷ IFU的C.trachomatis L2i.v.感染。三天后脾脏在McCoy细胞单层上滴定。作为对照，幼稚小鼠和衣原体免疫小鼠也用C.trachomatis L2感染，三天后滴定脾脏。

子宫内的感染.C.trachomatis的子宫内感染通过用10⁶ IFU的C.trachomatis L2的子宫角外科接种来进行。收获导液(骼的)和非导液(腋下的、子宫颈的、颚的)淋巴结，在FACScan流式细胞计上使用标准的流动细胞计技术分析单细胞悬浮液。

CT788多肽表达

CT788多肽或其片段可以通过用处在适合的表达媒介物中的多肽编码多核苷酸分子或其片段的全部或部分转化来产生。

分子生物学领域的技术人员将理解各种各样的表达系统的任何一种可以用于提供多肽CT788或其片段。所使用的确切宿主细胞对于本发明不是关键的。CT788多肽或其片段可以在原核宿主(例如，E.coli)中或在真核宿主(例如，酿酒酵母、昆虫细胞，例如Sf21细胞，或哺乳动物细胞，例如NIH3T3、HeLa或优选的COS细胞)中产生。这样的细胞可以从广泛的来源获得(例如，美国典型培养物保藏所，Rockland，Md.；还参见，例如，上文的Ausubel et al.)。转化或转染的方法和表达媒介物的选择将取决于选择的宿主系统。例如，在Ausubel et al.(上文)中描述了转化和转染方法；表达媒介物可以从例如Cloning Vectors：A Laboratory Manual(Pouwels，P.H.et al.，1985，Supp.1987)中所提供的那些中选择。一旦表达了重组CT788多肽或其片段，例如使用亲和层析来分离它。在一个实例中，针对CT788多肽或其片段产生的抗体可以附着于柱上，并用于分离重组多肽。在亲和层析之前携带多肽的细胞的裂解和分级可以通过标准方法来进行(参见，例如，Ausubel et al.，上文)。

一旦被分离，如果希望，重组CT788多肽或其片段可以被进一步纯化，例如，通过高效液相层析法(参见，例如Fisher，Laboratory TechniquesIn Biochemistry And Molecular Biology，eds.，Work and Burdon，Elsevier，1980)。

CT788的短的片段也可以通过化学合成产生(例如，通过Solid PhasePeptide Synthesis，2nd ed.，1984The Pierce Chemical Co.，Rockford，111.中所描述的方法)。

还包括在本发明中的时融合到异源序列的CT788蛋白或其片段，所述异源序列例如可检测标记物(例如，可以直接或间接地检测的蛋白质，例如绿色荧光蛋白，血球凝集素或碱性磷酸酶)、DNA结合结构域(例如，GAL4或LexA)、基因活化结构域(例如，GAL4或VP16)、纯化标签，或分泌信号肽。这些融合蛋白可以通过任何标准方法来产生。融合蛋白还可以包括与免疫原性蛋白的融合物，例如Ig蛋白质，例如，IgG、IgM、IgA或IgE或Ig蛋白的Fc区域。对于表达CT788融合蛋白的稳定的细胞系的产生，PCR扩增的CT788核酸可以克隆到哺乳动物表达载体的衍生物的限制性位点中。例如，pcDNA23(Invitrogen，Carlsbad，CA)的衍生物KA含有编码流感病毒血球凝集素(HA)的DNA片段。做为选择，可以使用编码其他标签例如c-myc或聚组氨酸标签的载体衍生物。可以融合到CT788的其他序列包括提供免疫刺激功能的那些，例如白细胞介素-2(Fan et al.，Acta Biochim.Biophys.Sin.38：683-690，2006)、Toll样受体-5鞭毛蛋白(Huleatt et al.，Vaccine 8：763-775，2007)、猿免疫缺陷病毒Tat(Chen et al.，Vaccine 24：708-715，2006)、或C组链球菌的纤维蛋白原-白蛋白-IgG受体(Schulze et al.，Vaccine23：1408-1413，2005)。此外，可以添加异源序列以增加溶解度或提高半衰期，例如，亲水性氨基酸残基(Murby et al.，Eur.J.Biochem.230：38-44，1995)、糖基化序列(Sinclair and Elliott，J.Pharm.Sd.94：1626-1635，2005)、或人绒毛膜促性腺激素或促血小板生成素的羧基末端(Lee et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.339：380-385，2006)。

疫苗产生

本发明还提供了包括CT788多肽、CT788的片段(例如，免疫原性片段)、在本发明的方法中鉴定的任何多肽、或其片段(例如，免疫原性片段)的疫苗组合物。疫苗可以进一步包括其他的抗原性肽片段(例如，2、3、4、5、6、10个或更多不同的片段)。本发明进一步包括在个体、特别是人类中诱导免疫学反应的方法，所述方法包括用CT788多肽或其片段(例如，免疫原性片段)接种个体，在适合的载体中，目的是诱导免疫反应以保护个体免于感染，特别是细菌性感染，最特别的是衣原体感染。这种免疫学组合物的施用可以在已经经历感染的个体中治疗性地使用，或可以预防性地使用来预防感染。

含有免疫原性多肽的疫苗的制备是本领域技术人员已知的。CT788多肽、CT788多肽的片段、本发明的方法中鉴定的多肽、或其片段可以充当疫苗接种的抗原，或者编码多肽的表达载体或其片段或变体可以被体内递送，以诱导免疫学反应，包括抗体的产生，特别是T细胞免疫反应。

CT788多肽、在本发明的方法中鉴定的多肽、或其片段或变体可以融合到重组蛋白质，所述重组蛋白质稳定所述多肽、帮助它的溶解、促进它的产生或纯化、或通过提供免疫系统的其他刺激来作为佐剂。在(Sato et al.，Science 273：352，1996)中描述了包含本发明的多肽或核苷酸和免疫刺激性DNA序列的组合物和方法。一般地，疫苗以可注射的形式制备，作为液体溶液或作为悬浮液。适合于注射的固体形式也可以被制备作为乳剂，或与密封在脂质体中的多肽一起制备。疫苗抗原通常与药学上可接受的载体组合，其包括任何载体，所述载体不诱导对接受所述载体的个体有害的抗体的产生。适合的载体一般包含缓慢代谢的大的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚合物、和无或许的病毒颗粒。这种载体是本领域技术人员公知的。这些载体也可以作为佐剂起作用。佐剂是增强疫苗有效性的免疫刺激试剂。

有效的佐剂包括但不限于，铝盐，例如氢氧化铝和磷酸铝、胞壁酰肽(例如，胞壁酰二肽)、细菌细胞壁成分、皂角苷佐剂、和作为免疫刺激试剂来增强组合物的有效性的其他物质。其他佐剂包括脂质体制剂、合成佐剂，例如皂角苷(例如，QS21)、单磷酰基脂质A和聚膦嗪。

本发明的免疫原性组合物，例如CT788多肽、CT788片段、在本发明的方法中鉴定的多肽、或其片段、药学上可接受的载体、和佐剂一般还含有稀释剂，例如水、盐水、甘油、乙醇。还可以存在辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质，等等。蛋白质可以被配制为中性或盐形式的疫苗。疫苗一般通过注射胃肠外地施用；这种注射可以是皮下的、皮内的、肌肉内的、静脉内的或腹膜内的。其他制剂适合于其他施用形式，例如通过栓剂或口服地。口服组合物可以作为溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、或持续释放制剂来施用。疫苗还可以通过眼睛、鼻内的、胃、肺部的、肠、直肠、阴道、或泌尿道途径来施用。施用可以以单剂量或间隔重复地施用。适合的剂量取决于本领域技术人员理解的各种的参数，例如，疫苗本身的性质、施用途径、以及要接种的哺乳动物的状况(例如，体质、年龄、哺乳动物的一般健康状态)。此外，疫苗也可以被施用给个体来产生多克隆抗体(使用标准方法从血清纯化的或分离的)，其可以用于被动免疫个体。这些多克隆抗体也可以充当免疫化学试剂。

抗原性肽(例如，CT788肽，如包括CT788_133-152或其任何片段的在此描述的那些)也可以作为融合肽来施用。例如，多肽或多肽衍生物可以融合到具有佐剂活性的多肽，例如，霍乱毒素的B亚单位，或E.coli热不稳定毒素。几种可能性可以用于实现融合。首先，北方面的多肽可以被融合到具有佐剂活性的多肽的N-或C-末端。第二，多肽片段可以融合在具有佐剂活性的多肽的氨基酸序列之内。

药物组合物

除了疫苗之外，本发明还提高了药物组合物，其包括使用本发明的方法鉴定的多肽或其片段，或包括CT788多肽或其片段(例如，免疫原性片段或在此描述的任何片段)的组合物。这种组合物可以掺入药物组合物中，分散在药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂中。在一个实施方式中，所述药物组合物包括药学上可接受的赋形剂。本发明的化合物可以根据当前的描述通过任何合适的方法施用，例如，取决于它们的预定用途、如本领域中公知的。例如，如果本发明的化合物将口服地施用，它们可以被配制为片剂、胶囊、微粒、粉剂或糖浆。做为选择，本发明的制剂可以作为注射(静脉内的、肌肉内的或皮下的)、滴注制品或栓剂胃肠外地施用。对于通过眼粘膜途径的应用，本发明的化合物可以被配制为滴眼剂或眼膏。这些制剂可以通过常规方法制备，如果希望，化合物可以与任何常规的添加剂，例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫正剂、增溶剂、悬浮助剂、乳化剂或包被剂混合。

受试者化合物可以适合于口服、鼻部、表面(包括口腔的和舌下的)、直肠、阴道、气雾剂和/或肠胃外的施用。制剂可以方便地以单位剂量形式存在，可以通过药学领域任何公知的方法来制备。与载体材料组合产生单剂量的试剂的数量可以取决于治疗的受试者和施用的特定模式而变化。

适合于肠胃外施用的本发明的药物组合物包括补充剂的一种或多种成分，和一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳剂，或可以在即将使用之前恢复成无菌可注射溶液的无菌粉末，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与期望的接受者的血液等渗的溶质，或悬浮或增稠剂。

治疗病原性疾病或赘生物的方法

在此描述的多肽、疫苗和药物组合物可以用于疾病包括病原性感染的多种治疗和用于赘生性失调的治疗。本领域技术人员将了解，在此描述的任何组合物的剂量将取决于症状、患者的年龄和体重、要治疗或预防的失调的性质和严重度、施用途径、以及补充剂的形式而变化。任何目标制剂可以以任何适合的剂量施用，例如，在单剂量中或在分开的剂量中。单独地或与本发明的任何其他化合物一起，或与被认为对要治疗的特定失调、疾病或状况有用的任何化合物组合，本发明的化合物的剂量可以通过本领域技术人员已知的技术容易地确定。并且，本发明提供了超过一种目标化合物以及其他治疗试剂的混合物。

本发明的几种化合物、或作为选择其他治疗试剂的组合使用，可以降低任何单一组分所需的剂量，因为不同成分的发作和效果的持续时间可能是互补的。在这种组合治疗中，不同的活性试剂可以一同地或单独地、同时地或在一天内的不同时间递送。

治疗性抗体和T细胞耗尽

做为选择，对衣原体而不是感染本身的免疫反应可能对伴随感染的症状，包括无菌性和骨盆炎症性疾病负责。在这种情况下，可能希望的是通过感染的个体内的CD4⁺或CD8⁺T细胞的子集限制免疫反应。在本发明的方法中鉴定的针对T细胞克隆的抗体(例如，特异于靶向CT788的CD4⁺细胞的抗体)因而在治疗或预防与衣原体感染相关的有害影响中是有用的。例如，在Weinberg et al.，Nat Med.2(2)：183-189，1996中描述了T细胞的特定群体的选择性耗尽的方法。

在本说明书中提及的所有专利、专利申请和公开物在此通过引用来合并，其程度与特定的或单独的指示通过引用来合并每个单独的专利、专利申请或公开物相同。

序列表

<110>President and Fellows of Harvard College et al.

<120>用于鉴定抗原的组合物和方法

<130>00742/192W03

<150>US60/817,471

<151>2006-06-29

<150>US60/775,462

<151>2006-02-21

<160>171

<170>PatentIn version 3.3

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<213>人工

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<223>tag

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Claims (80)

1.一种可复制的库，包含处在规定位置的至少20个不连续的成员，其中

(a)所述库的所述成员各自包含细胞或病毒，所述细胞或病毒包含编码多肽的至少一部分的第一多核苷酸，所述多肽由病原生物的基因组编码，所述第一多核苷酸可操作地连接到启动子，和

(b)所述库包含编码所述多肽的至少50％的部分的多核苷酸，所述多肽由所述病原生物的基因组编码。

2.一种确定库是否含有或编码免疫原性多肽的方法，所述方法包括：

(a)用第二细胞分别地接触权利要求1的库的每个成员，所述第二细胞能够(i)内吞每个成员中的所述细胞或所述病毒和(ii)通过I类MHC途径在它的表面展示肽，其中所述库的每个成员包含由所述多核苷酸编码的所述多肽；

(b)用来自早先被所述病原生物感染的哺乳动物的CTL细胞分别地接触步骤(a)的每个成员；和

(c)检测所述CTL细胞是否被活化，其中所述CTL细胞的活化表明所述多肽是免疫原性的，从而确定所述库是否含有或编码免疫原性多肽。

3.权利要求2的方法，其中所述库的所述每个成员进一步包含编码孔洞形成蛋白的多核苷酸。

4.权利要求3的方法，其中所述孔洞形成蛋白是LLO。

5.权利要求2的方法，其中所述第二细胞是巨噬细胞。

6.权利要求2的方法，其中所述库的所述每个成员在所述接触步骤(a)之前被杀死。

7.权利要求2的方法，其中在所述接触步骤(b)之前，所述第二细胞被杀死。

8.权利要求2的方法，进一步包括步骤：

(d)从所述库的复制物拷贝中回收编码步骤(c)中鉴定的所述多肽的多核苷酸。

9.权利要求2的方法，其中，在接触步骤(a)之前，产生所述库的复制物。

10.权利要求2的方法，进一步包括步骤：

(d)鉴定步骤(c)中被确定为免疫原性的所述多肽之内足够CTL活化的表位。

11.权利要求2的方法，其中所述库的所述成员包含来自所述病原生物的蛋白质组的至少75％的多肽。

12.权利要求11的方法，其中所述库的所述成员包含来自所述病原生物的蛋白质组的至少90％的多肽。

13.权利要求12的方法，其中所述库的所述成员包含来自所述病原生物的蛋白质组的至少95％的多肽。

14.权利要求11的方法，其中所述库的每个成员包含少于10个不同的编码来自所述病原生物的多肽的多核苷酸。

15.一种疫苗，包含权利要求10的方法鉴定的至少一个表位和药学上可接受的载体。

16.一种表位混合物，包含使用权利要求10的方法鉴定的至少5个表位。

17.一种组合物，包含权利要求2的方法鉴定的至少5种多肽。

18.一种疫苗，包含权利要求2的方法鉴定的至少一种免疫原性多肽和药学上可接受的载体。

19.权利要求2的方法，其中所述接触步骤(b)使用多种CTL细胞来进行。

20.权利要求2的方法，进一步包括使用所述库进行所述方法步骤(b)和(c)至少再一次。

21.权利要求20的方法，其中每次进行所述方法，在步骤(b)中接触不同的CTL细胞。

22.权利要求1的可复制的库，其中所述病毒是噬菌体。

23.权利要求1的可复制的库，其中所述细胞是细菌。

24.权利要求23的可复制的库，其中所述细菌是E.coli。

25.权利要求23的可复制的库，其中所述细菌进一步包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码在所述细菌中不天然地表达的多肽。

26.权利要求25的可复制的库，其中所述第二多核苷酸编码孔洞形成蛋白。

27.权利要求26的可复制的库，其中所述孔洞形成蛋白是LLO。

28.权利要求1的可复制的库，其中所述第一多核苷酸进一步编码第二多肽。

29.权利要求28的可复制的库，其中所述第二多肽是孔洞形成蛋白。

30.权利要求29的可复制的库，其中所述孔洞形成蛋白是LLO。

31.权利要求1的可复制的库，其中每个所述第一多核苷酸进一步包含第一标签序列，所述多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含所述第一标签和所述多肽的所述至少的部分。

32.权利要求31的可复制的库，其中所述多核苷酸进一步包含第二标签序列。

33.权利要求1的可复制的库，其中所述多肽的所述部分与所述病原生物的基因组编码的多肽的相应部分具有至少95％的序列同一性。

34.权利要求1的可复制的库，其中所述多肽的所述部分与所述病原生物的基因组编码的多肽的相应部分具有至少99％的序列同一性。

35.权利要求1的可复制的库，其中所述库的每个成员包含由所述病原生物的基因组编码的单个多核苷酸。

36.权利要求1的可复制的库，其中所述病原生物是细菌。

37.权利要求1的可复制的库，其中所述病原生物是病毒。

38.权利要求1的可复制的库，其中所述启动子是可诱导启动子。

39.权利要求1的可复制的库，其中所述集合包含编码多肽或其片段的至少75％的多核苷酸，所述多肽由所述病原生物的基因组编码。

40.权利要求1的可复制的库，其中所述集合包含编码多肽或其片段的至少90％的多核苷酸，所述多肽由所述病原生物的基因组编码。

41.权利要求1的可复制的库，其中所述集合包含编码多肽或其片段的至少95％的多核苷酸，所述多肽由所述病原生物的基因组编码。

42.一种可复制的库，包含处在规定位置的至少10个不连续的成员，其中

(a)所述库的所述成员各自包含细胞或病毒，所述细胞或病毒包含编码多肽的至少一部分的第一多核苷酸，所述多肽由病原生物的基因组编码，所述第一多核苷酸可操作地连接到启动子，

(b)所述成员各自包含少于24种不同的多核苷酸，每一种编码病原生物的基因组编码的多肽的至少一部分，和

(c)所述库包含编码多肽的至少部分的至少10％的多核苷酸，所述多肽由所述病原生物的基因组编码。

43.权利要求42的可复制的库，其中所述细胞是细菌。

44.权利要求43的可复制的库，其中所述细菌是E.coli。

45.权利要求42的可复制的库，其中所述病毒是噬菌体。

46.权利要求42的可复制的库，其中所述成员各自包含编码多肽的至少一部分的一个多核苷酸，所述多肽由病原生物的基因组编码。

47.一种可复制的库，包含至少20个不连续的成员，其中

(a)所述成员各自包含第一细胞或病毒，所述第一细胞或病毒包含编码多肽或其片段的多肽，与相应的正常细胞相比，所述多肽在赘生性细胞内是差异表达的，所述多核苷酸可操作地连接到启动子，和

(b)所述库包含编码多肽或其片段的至少30％的多核苷酸，与所述相应的正常细胞相比，所述多肽在所述赘生性细胞内差异表达。

48.权利要求47的可复制的库，其中所述赘生性细胞是癌细胞。

49.权利要求48的可复制的库，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。

50.权利要求47的可复制的库，其中所述第一细胞是细菌。

51.权利要求50的可复制的库，其中所述细菌是E.coli。

52.权利要求50的可复制的库，其中所述细菌进一步包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码在所述细菌中不天然地表达的多肽。

53.权利要求52的可复制的库，其中所述第二多核苷酸编码孔洞形成蛋白。

54.权利要求53的可复制的库，其中所述孔洞形成蛋白是LLO。

55.权利要求47的可复制的库，其中所述第一多核苷酸进一步编码第二多肽。

56.权利要求55的可复制的库，其中所述第二多肽是LLO。

57.权利要求47的可复制的库，其中每个所述多核苷酸进一步包含第一标签序列，所述多核苷酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含所述第一标签和所述多肽的所述至少的部分。

58.权利要求57的可复制的库，其中所述多核苷酸进一步包含第二标签序列。

59.权利要求47的可复制的库，其中所述多肽的所述部分与在所述赘生性细胞中差异表达的多肽的相应部分具有至少95％的序列同一性。

60.权利要求47的可复制的库，其中所述多肽的所述部分与在所述赘生性细胞中差异表达的多肽的相应部分具有至少99％的序列同一性。

61.权利要求47的可复制的库，其中所述库的每个成员包含所述赘生性细胞中差异表达的单个多核苷酸。

62.一种纯化的多肽，包含CT788多肽。

63.权利要求62的多肽，具有CT788多肽的序列。

64.权利要求62的多肽，其中所述多肽是融合蛋白。

65.一种包含多肽的组合物，所述多肽包含权利要求62的多肽。

66.一种纯化的多肽，包含CT788多肽的片段，其中所述片段是免疫原性的。

67.权利要求66的多肽，其中所述片段具有氨基酸序列KGIDPQELWVWKKGMPNWEK(SEQ ID NO：2)。

68.权利要求67的多肽，具有氨基酸序列KGIDPQELWVWKKGMPNWEK(SEQ ID NO：2)。

69.权利要求66的多肽，其中所述多肽是融合蛋白。

70.权利要求66的多肽，其中所述片段具有选自由表1中所列序列构成的组的氨基酸序列。

71.一种组合物，包含具有CT788多肽的片段的多肽。

72.权利要求71的组合物，其中所述片段具有氨基酸序列KGIDPQELWVWKKGMPNWEK(SEQ ID NO：2)。

73.权利要求71的组合物，其中所述片段具有选自由表1中所列序列构成的组的氨基酸序列。

74.一种包含多肽和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述多肽包含CT788多肽或包含所述CT788多肽的免疫原性片段。

75.一种包含多肽和药学上可接受的载体的疫苗，所述多肽包含含CT788多肽的多肽、或包含所述CT788多肽的免疫原性片段。

76.一种治疗或预防细菌性感染的方法，所述方法包括向个体施用多肽，所述多肽包含CT788多肽或包含所述CT788多肽的片段。

77.权利要求76的方法，其中所述多肽以足够预防或治疗所述细菌性感染的数量施用。

78.权利要求76的方法，其中所述多肽被纯化。

79.权利要求76的方法，其中所述多肽能够在所述个体中产生免疫反应。

80.权利要求76的方法，其中所述细菌性感染是衣原体感染。

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