CN101426460A - 从角蛋白生物材料形成的涂料和生物医学植入物 - Google Patents
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Abstract
提供了有优异生物医学活性的带电荷角蛋白的最佳级分的生产方法。也提供涂布了这些角蛋白制剂的医学植入物。进一步提供的是有其需要的患者中血液凝结的治疗方法。
Description
相关专利申请
本申请要求2006年2月17日提交的美国临时专利申请序号60/774,442、2006年2月17日提交的美国临时专利申请序号60/774,587、和2006年2月17日提交的美国临时专利申请序号60/774,920的35U.S.C.§119(e)规定权益,这些临时专利申请每一份的公开文书都全文列为本文参考文献。
本申请涉及2005年8月17日提交的Mark E.Van Dyke美国专利申请序号11/205,800,题为Ambient Stored Blood Plasma Expanders;2007年2月9日提交的Mark E.Van Dyke美国专利申请(序号待定),题为Nerve Regeneration Employing Keratin Biomaterials;和2007年2月16日提交的MarkE.Van Dyke美国专利申请和PCT申请(序号待定),题为Clotting and Healing Compositions Containing Keratin Biomaterials。
政府支持
本发明是在政府支持下完成的,与美国陆军的合同号为W81XWH-04-1-0105。美国政府对本发明享有某些权利。
发明领域
本发明一般地涉及角蛋白生物材料及其在生物医学应用上的用途。
发明背景
最早文献记载的角蛋白医学用途来自一位名为李时珍的中草药医生(《本草纲目》(Materia Medica),即一部由李时珍(1518-1593)著述的中草药辞典)。在为期38年里,他著述了一部以《本草纲目》闻名的800卷书文集。这些书出版于1596年,即他死后3年。在这些卷中所述的11000多种处方当中,有一种名为血余炭(又名CrinisCarbonisatus)的物质由来自热解人发的研磨灰分构成。所述血余炭指征是加速伤口愈合和血液凝固。
在1800年代初期,当蛋白质还被称为类清蛋白(清蛋白是当时一种众所周知的蛋白质)时,很多不同种类的蛋白质正在被发现。1849年左右,“角蛋白”(Keratin)这个词在文献上出现,以描述构成硬组织例如动物角和蹄的材料(keratin来自希腊语“kera”,系指角)。这种新蛋白质引起科学家相当大兴趣,因为它没有表现出与其它蛋白质一样的行为。例如,用于使蛋白质溶解的通常方法对角蛋白没有效果,尽管燃烧和研磨等方法已经知道了一段时间,但很多科学家和发明家对使发和角溶解更感兴趣,以期制造更好的产品。
这个不溶性问题的解决方案来自一个700多年历史的行业—制革工业。在第一次世界大战进行的岁月里,将石灰应用于角蛋白凝胶的制造。在1905年公布的一项美国专利中,John Hoffmeier描述了一种用石灰从动物角提取角蛋白的方法(德国专利No.184,915,1905年12月18日)。然后,他使用所提取的角蛋白制造可以通过添加甲醛增强的凝胶(甲醛“交联”是使这样的凝胶增强的一种普遍采用方法,而且今天仍用来“固定”含有角蛋白等结构蛋白和胶原蛋白的组织)。
在1905年~1935年期间,发展了利用氧化化学和还原化学提取角蛋白的很多方法(Breinl F and Baudisch O,Z physiol Chem1907;52:158-69;Neuberg C,U.S Pat.No.926,999,July 6,1909;Lissizin T,Biochem Bull 1915;4:18-23;Zdenko S,Z physiol Chem 1924;136:160-72;Lissizin T,Z physiol Chem 1928;173:309-11)。到1920年代晚期,已经发展了使发、角、蹄的结构破坏的很多技术,但科学家被其中一些精制蛋白质的行为弄混淆了。科学家们很快就断言,很多不同形式的角蛋白存在于这些提取物中,而且断言发纤维一定是一种复杂结构,而不只是一种蛋白质线材。1934年,发表了一篇关键研究论文,该论文描述了不同类型的角蛋白,其主要区别在于有不同分子量(Goddard DR andMichaelis L,J Biol Chem 1934;106:605-14)。这篇研讨会论文证实,有很多不同的角蛋白同系物,而且每一种都在毛囊的结构和功能方面发挥不同的作用。
就在第二次世界大战年代期间和此后,立即开展了关于发纤维的结构和化学的最具综合性研究项目之一。受到尼龙和聚酯等合成纤维的商业化驱动,澳大利亚科学家肩负着保护该国庞大毛工业的责任。合成纤维被视为对澳大利亚毛生产优势的威胁,而且科学与工业研究理事会(后来的联邦科学与工业研究组织或CSIRO)于1940年建立了蛋白质化学部(Division of Protein Chemistry)。这项基础研究的目标是更好地理解纤维的结构和化学,使得可以扩大毛和角蛋白的潜在应用。
CSIRO科学家发展了关于角蛋白提取、分离、和鉴定的很多方法。1965年,CSIRO科学家W.Gordon Crewther及其同事发表了关于角蛋白化学的定义性论文(Crewther WG et al.,The Chemistry of Keratins.Anfinsen CB Jr et al.,editors.Advances in Protein Chemistry 1965.Academic Press New York:191-346)。《蛋白质化学进展》(Advances inProtein Chemistry)中的这一章含有640多项公开的角蛋白研究的参考文献。一旦科学家知道了如何从毛发纤维提取角蛋白、将其精制和表征,用角蛋白可以生产的衍生材料的数目就成指数增长。在1970年开始的10年中,全世界若干个研究群体发展并公布了使所提取的角蛋白变成粉末、薄膜、凝胶、涂料、纤维、和泡沫体的方法(Anker CA,U.S.Pat.No.3,642,498,February 15,1972;Kawano Y and Okamoto S,Kagaku ToSeibutsu 1975;13(5):291-223;Okamoto S,Nippon Shokuhin KogyoGakkaishi 1977;24(1):40-50)。所有这些方法都利用了此前数十年发展的氧化化学和还原化学。
1982年日本科学家发表了描述血管移植时使用角蛋白涂料作为消除血液凝固的一种途径的第一项研究(Noishiki Y et al.,KobunshiRonbunshu 1982;39(4):221-7)以及关于角蛋白的生物兼容性的实验(ItoH et al.,Kobunshi Ronbunshu 1982;39(4):249-56)。此后不久,在1985年,英国的2位研究者发表了一篇思考使用角蛋白作为新型生物材料发展的结构单元的前景的综述文章(Jarman T and Light J,World BiotechRep1985;1:505-12)。1992年,角蛋白系生物材料主体的发展和试验成为法国研究生Isabelle Valherie的博士论文的主题(Valherie I andGagnieu C.Chemical modifications of keratins:Preparation of biomaterialsand study of their physical,physiochemical and biological properties.Doctoral thesis.Inst Natl Sci Appl Lyon,France 1992)。此后不久,日本科学家发表了1993年关于角蛋白在生物材料发展前沿可能占有突出位置的评论(Various Authors,Kogyo Zairyo 1993;41(15)Special issue2:106-9)。
总而言之,以上提到的公开著作总体是角蛋白的独特化学性能、物理性能、和生物性能的说明。然而,目前仍然需要创造有优异生物医学活性的角蛋白的最佳组分。
发明概要
本发明提供通过诸如用色谱法使一种级分与其它级分分离、和任选地进一步加工或精制其余一种或多种级分来制作有电荷(即酸性和碱性)角蛋白的方法。在一些实施方案中,按酸性分级的角蛋白基本上α-角质骨骼、γ-角质骨骼、或其混合物组成。在其它实施方案中,该分级的角蛋白基本上由α-还原角蛋白、γ-还原角蛋白、或其混合物组成。
本发明的另一个方面是一种可植入生物医学器件,包含:一种基材和该基材上的一种角蛋白衍生物,其中该角蛋白衍生物是以能有效地降低细胞和组织对该基材的粘合的数量存在的。在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为碱性α-角质骨骼、碱性γ-角质骨骼、碱性α-还原角蛋白、碱性γ-还原角蛋白、或其组合。
本发明的一个进一步方面是一种可植入抗粘组织屏障,包含:一种固体、生理上可接受基材;和该基材上的一种角蛋白衍生物。在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为碱性α-角质骨骼、碱性γ-角质骨骼、碱性α-还原角蛋白、碱性γ-还原角蛋白、或其组合。
本发明的又另一方面是有其需要的患者中血液凝固的处理方法,包含对所述患者给药能有效抑制所述患者中血液凝固的数量的角蛋白衍生物,其中所述角蛋白衍生物基本组成的碱性角质骨骼、碱性还原角蛋白、或其组合。
本发明的另一方面是本文中所述角蛋白衍生物用于制备一种本文中所述处理方法实施用组合物或药剂或用于制造本文中所述制品的用途。
较好实施方案详细描述
角蛋白亚家族的独特性能可以通过更精细的精制手段来揭示和利用。
要用本文中所述方法和组合物处理的“对象”(或“患者”)既包括人体对象,也包括兽医用途动物对象(尤其其它哺乳动物对象例如狗、猫、马、猴等)。该对象可以是雄性的或雌性的,而且可以有任何年龄,包括新生儿、婴儿、少年、青年、成人、和老年人对象。
本文中引用的美国专利参考文献的公开文书全部列为本文参考文献。
所提取的角蛋白溶液在微米规模上自发自组装的能力是在1986年和1987年的2篇论文中公布的(Thomas H et al.,Int J Biol Macromol1986;8:258-64;van de M,Melliand Textilberichte 1987;10:780-6)。这种现象并不令人惊讶,因为无论从何处得到毛发角蛋白都有高度控制的超级结构。当正确地处理时,这种自组装能力就会得到保全和用来在有益于细胞浸润的尺寸规模上产生有规则结构。当角蛋白(例如用酸或碱)水解时,其分子量降低了,而且它们丧失了自组装能力。因此,能使水解降到最低限度的处理条件是较好的。
这种自组装能力是“脚手架”工程组织的一个特别有用的特征,这有2个理由。第一,自组装能力导致一种有可再现构造、维数、和孔隙率的高度规则结构。第二,这些构造在良性条件下能一致地自己形成,这一事实使得细胞能像基体形成那样掺入。这两个特色对于试图模仿原始细胞外基体(ECM)的任何系统来说是至关重要的。
细胞认知也是力求模仿ECM的生物材料的一个重要特征。这样的认知因细胞表面整合蛋白(integrins)对ECM蛋白质这一组分所提供的特定氨基酸图案的结合而受到促进。主导的蛋白质包括胶原蛋白和纤连蛋白,已经对这两种蛋白进行了关于细胞结合的广泛研究。这两种蛋白都含有若干个能支持种类繁多的细胞类型的附着的区域。已经显示的是,除广泛知道的精氨酸甘氨酸-天冬氨酸(RGD)图案外,纤连蛋白上的“X”-天冬氨酸-“Y”图案也是整合蛋白α4β1所认知的,其中X等于甘氨酸、亮氨酸、或谷氨酸,而Y等于丝氨酸或缬氨酸。从人发衍生的角蛋白生物材料含有这些相同的结合图案。NCBI蛋白质数据库的检索揭示了71种分立、独特的人发角蛋白蛋白质序列。这些当中,55种来自高分子量、低硫、α-螺旋家族。这一群蛋白质通常简称为α-角蛋白,而且负责赋予人发纤维以韧性。这些α-角蛋白有>40kDa的分子量和4.8mol%的平均光胱氨酸(负责分子间和分子内蛋白质粘合的主要氨基酸)含量。进而,这些α-角蛋白蛋白质的氨基酸序列的分析显示78%含有至少一种纤连蛋白样整合蛋白受体结合图案,而25%含有至少2种或更多种。2篇最近的论文强调了如下事实:这些结合部位可能存在于角蛋白生物材料的表面上,显示出对所处理角蛋白泡沫体的优异细胞粘合(Tachibana A et al.,J Biotech 2002;93:165-70;Tachibana A et al.,Biomaterials 2005;26(3):297-302)。
可以以类似方式用于所公开的角蛋白制剂的天然聚合物的其它实例包括但不限于胶原、明胶、纤连蛋白、玻连蛋白、昆布蛋白、纤维蛋白、粘蛋白、弹性蛋白、巢蛋白(触角蛋白)、蛋白多糖等(见例如Katsuen等的美国专利No.5,691,203)。
人发提取物的生物活性有2种理论。第一种是,人发角蛋白(“HHKs”)本身是生物活性的。70多种人发角蛋白是已知的,而且公布了它们的cDNA衍生序列。然而,HHKs的全家福还不知道,有人提出了100多种的估计值(Gillespie JM,The structural proteins of hair:isolation characterization,and regulation of biosynthesis.Goldsmith LA(editor),Biochemistry and physiology of the skin(1983),Oxford UniversityPress.New York;475-510)。在HHKs的全部范围内,有少数已被显示参与了伤口挛缩和细胞迁移(Martin,P.,Science 1997;276:75-81)。具体地说,角蛋白K-6和K-16在伤口愈合期间表达于表皮中,而且也在毛囊的外根鞘中被找到(Bowden PE,Molecular Aspects ofDermatology(1993),John Wiley & Sons,Inc.,Chichester:19-54)。这些HHKs在人发提取物中的存在及其随后对伤口床的直接药物作用,可能成为本来漫长的分化、迁移、和增殖过程的捷径,或可能缓解某种生物化学上的不足,从而加速组织修复和再生过程。
十多年来已经知道,在毛囊的发育中存在着生长因子例如骨形态发生蛋白-4(BMP-4)和转化生长因子-β(TGF-β)超级家族的其它成员(Jones CM et al.,Development1991;111:531-42;Lyons KM et al.,Development 1990;109:833-44;Blessings M et al.,Genes and Develop1993;7:204-15)。事实上,30多种生长因子和胞质分裂素参与环化毛囊的生长(Hardy MH,Trends Genet 1992;8(2):55-61;Stenn KS et al.,J Dermato Sci 1994;7S:S109-24;Rogers GE,Int J Dev Biol 2004;48(2-3):163-70)。这些分子中很多在各种各样组织的再生中发挥枢纽性作用。高度可能的是,当胞质分裂素与干细胞结合而导致该毛囊的膨胀区域时有很多生长因子夹带于人发内(Panteleyev AA et al.,J Cell Sci2001;114:3419-31)。这些生长因子大多数肯定会连同角蛋白一起从末端切割人发中提取出来。这种观察并非没有先例,因为以前已经显示很多不同类型的生长因子存在于各种组织的提取物中,而且显示它们的活性即使在化学提取之后也被保持。诸如此类的观察显示出如下确凿证据:许多生长因子可能存在于末端切割的人发中,而且角蛋白可能充当这些生长因子等的高度有效输送基体。
角蛋白是在脊椎动物的毛发、皮肤、及其它组织中发现的一个蛋白质家族。毛发是人角蛋白的一个独特来源,因为它是容易得到且不昂贵的少数人体组织之一。尽管角蛋白的其它来源是本发明的可接受原料(例如毛、毛皮、角、蹄、喙、羽、鳞等),但人发因其生物兼容性对于对人体对象的使用来说是较好的。
角蛋白可以通过使用业内已经公开的方法的氧化或还原而从人发纤维中提取(见例如Crewther WG et al.The chemistry of keratins,inAdvances in protein chemistry 1965;20:191-346)。这些方法典型地采用一种两步法,从而使角蛋白的交联结构通过要么氧化要么还原破坏。在这些反应中,使半胱氨酸氨基酸残基中的二硫化物键裂解,从而使角蛋白变得可溶(流程1)。角质层基本上不受这种处理影响,因而该角蛋白的大部分仍截留在该角质层的保护结构内。为了提取这些角蛋白,必须采用一种使用变性溶液的第二步。替而代之,在还原反应的情况下,这些步骤可以组合。业内已知的变性溶液包括脲、过滤金属氢氧化物、表面活性剂溶液、及其组合。较好的方法使用浓度为0.1~1.0M的Tris水溶液和浓度的0.1~10M的脲溶液分别进行氧化反应和还原反应。
流程1 角蛋白中二硫化物交联键的(a)氧化和(b)还原的一般表述。这些反应使光胱氨酸残基中的硫-硫键断裂,从而破坏该超级结构并使该角蛋白变得可溶于该反应介质中。所得到的级分是角质骨骼(keratose)(a)和还原角蛋白(kerateine)(b)。
若人们采用氧化处理,则所得到的角蛋白简称“角质骨骼”。若使用还原处理,则所得到的角蛋白简称为“还原角蛋白”(见流程1)。
角蛋白的粗提取物,无论氧化还原状态如何,都可以诸如用等电沉淀法进一步精制成“γ”级分和“α”级分。高分子量角蛋白或“α角蛋白”(α螺旋)可认为衍生自毛囊的微原纤维区域,且分子量范围典型地为约40~85kD。低分子量角蛋白或“γ角蛋白”(球状)可认为衍生自毛囊的胞外基体区域,且分子量范围典型地为约10~15kD(千道尔顿)(见Crewther WG et al.The chemistry of keratins,in Advances inProtein Chemistry 1965;20:191-346)。
尽管α和γ角蛋白具有独特的性能,α角蛋白和γ角蛋白这两个亚家族的性能只能通过更精细的精制手段来揭示。例如,角蛋白可以分级成“酸性”和“碱性”蛋白质级分。较好的分级方法是离子交换色谱法。这些级分具有独特性能,例如它们对血细胞的不同影响(见以下表1;也见美国专利申请公报No.2006/0051732)。
本文中使用的“角蛋白衍生物”系指任何角蛋白级分、衍生物、亚家族等或其混合物单独或与其它角蛋白衍生物或其它组分的组合,包括但不限于α-角质骨骼、γ-角质骨骼、α-还原角蛋白、γ-还原角蛋白、介角蛋白、角蛋白中间体长丝、及其组合,包括其酸性成分和碱性成分,除非另有说明;以及其对于业内技术人员从本公开文书的观点来看显而易见的各种变异。在一些实施方案中,角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为角蛋白的一种特定级分或亚级分。该衍生物可以包含、组成为、或基本组成为至少80、90、95或99wt%(或以上)所述级分或亚级分。
在一些实施方案中,角蛋白衍生物包含、组成的、或基本组成为酸性α-角质骨骼。
在一些实施方案中,角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为α-角质骨骼,其中该α-角质骨骼包含、组成为、或基本组成为至少80、90、95或99wt%(或以上)酸性α-角质骨骼,且其中该α-角质骨骼包含、组成为、或基本组成为不多于20、10、5或1wt%(或以下)碱性α-角质骨骼。
在一些实施方案中,角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为碱性α-角质骨骼。
在一些实施方案中,角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为α-角质骨骼,其中该α-角质骨骼包含、组成为、或基本组成为至少80、90、95或99wt%(或以上)碱性α-角质骨骼,且其中该α-角质骨骼包含、组成为、或基本组成为不多于20、10、5或1wt%(或以下)酸性α-角质骨骼。
在一些实施方案中,角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为酸性α-还原角蛋白。
在一些实施方案中,角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为α-还原角蛋白,其中该α-还原角蛋白包含、组成为、或基本组成为至少80、90、95或99wt%(或以上)酸性α-还原角蛋白,且其中该α-还原角蛋白包含、组成为、或基本组成为不多于20、10、5或1wt%(或以下)碱性α-还原角蛋白。
在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为碱性α-还原角蛋白。
在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为α-还原角蛋白,其中该α-还原角蛋白包含、组成为、或基本组成为至少80、90、95或99wt%(或以上)碱性α-还原角蛋白,且其中该α-还原角蛋白包含、组成为、或基本组成为不多于20、10、5或1wt%(或以下)酸性α-还原角蛋白。
在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为未分级α+γ-还原角蛋白。在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为酸性α+γ-还原角蛋白。在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为碱性α+γ-还原角蛋白。
在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为未分级α+γ-角质骨骼。在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为酸性α+γ-角质骨骼。在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为碱性α+γ-角质骨骼。
在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为未分级β-角质骨骼(例如衍生自角质层)。在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为碱性β-角质骨骼。在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为酸性β-角质骨骼。
该碱性α-角质骨骼较好是通过诸如用离子交换色谱法从一种包含酸性和碱性α-角质骨骼的混合物中分离碱性α-角质骨骼产生的,且任选地该碱性α-角质骨骼的平均分子量为10~100或200kD(千道尔顿)。更好,该平均分子量为30或40~90或100kD。任选地但较好地该方法进一步包含下列步骤:使所述碱性α-角质骨骼再溶解于变性和/或缓冲溶液中,该步骤任选地在一种螯合剂的存在下进行以络合痕量金属,然后使该碱性α-角质骨骼从该变性溶液中再沉淀出来。要知道的是,该组合物较好含有不多于5、2、1、或0.1wt%(或以下)酸性α-角质骨骼。
该酸性α-角质骨骼较好是用上述技术的相反方向制备的:即诸如用离子交换色谱法从酸性和碱性α-角质骨骼的混合物中分离和保留酸性α-角质骨骼,且任选地该酸性α-角质骨骼的平均分子量为10~100或200kD。更好,该平均分子量是30或40~90或100kD。任选地但较好地,该方法进一步包含下列步骤:使所述酸性α-角质骨骼再溶解于变性溶液和/或缓冲溶液,该步骤任选地在一种螯合剂的存在下进行以络合痕量金属,然后使该酸性α-角质骨骼从该变性溶液中再沉淀出来。要知道的是,该组合物较好含有不多于5、2、1、或0.1wt%(或以下)碱性α-角质骨骼。
其它角质骨骼的碱性级分和酸性级分可以以与以上为碱性和酸性α-角质骨骼所述的相同方式制备。
碱性α-还原角蛋白较好是通过诸如用离子交换色谱法从酸性和碱性α-还原角蛋白的混合物从分离碱性α-还原角蛋白产生的,且任选地该碱性α-还原角蛋白的平均分子量为10~100或200kD。更好,该平均分子量是30或40~90或100kD。任选地但较好地是,该方法进一步包含下列步骤:使所述碱性α-还原角蛋白再溶解于一种变性溶液和/或缓冲溶液中,该步骤任选地在一种螯合剂的存在下进行以络合痕量金属,然后,使该碱性α-还原角蛋白从该变性溶液中再沉淀出来。要知道的是,该组合物较好含有不多于5、2、1、或0.1wt%(或以下)酸性α-还原角蛋白。
该酸性α-还原角蛋白较好是用上述技术的相反方向制备的:即,用诸如离子交换色谱法从酸性和碱性α-还原角蛋白的混合物中分离并保留酸性α-还原角蛋白,且任选地该酸性α-还原角蛋白的平均分子量为10~100~200kD。任选地但较好地,该方法进一步包含下列步骤:使所述酸性α-还原角蛋白再溶解于一种变性和/或缓冲溶液中,该步骤任选地在一种螯合剂的存在下进行以络合痕量金属,然后,使该酸性α-还原角蛋白从该变性溶液中再沉淀出来。要知道的是,该组合物较好含有不多于5、2、1、或0.1wt%(或以下)碱性α-还原角蛋白。
其它还原角蛋白的碱性级分和酸性级分可以以与以上为碱性和酸性α-还原角蛋白所述的类似方式制备。
角蛋白材料是从任何适用来源包括但不限于毛和人发衍生的。在一些实施方案中,角蛋白是从得自理发店和美发厅的末端切割人发衍生的。该材料用热水和温和洗涤剂洗涤、干燥、用非性有机溶剂(典型地己烷或醚)提取,以在使用前去除残油。
角质骨骼(Keratoses) 角质骨骼级分是用任何适用技术得到的。在一种实施方案中,它们是使用Alexander和同事的方法得到的(P.Alexander et al.,Biochem.J.46,27-32(1950))。基本上,该发是在室温与浓度<10%的过乙酸水溶液反应24h。将该溶液过滤、通过添加无机酸达到pH为约4而使该α-角质骨骼级分沉淀出来。将该α-角质骨骼用过滤法分离、用另外的酸洗涤、随后用醇脱水、然后冷冻干燥。通过使该角质骨骼再溶解于一种变性溶液例如7M脲、氢氧化铵水溶液、或20mM Tris碱缓冲溶液(例如 base)中、再沉淀、再溶解、对去离子水渗析、和在pH4再沉淀,可以达到提高的纯度。
角质骨骼的较好生产方法是用过氧化氢、过乙酸、或过甲酸氧化。最好的氧化剂是过乙酸。较好的浓度范围为1~10w/v%、最好是约2w/v%。业内技术人员要认识到,可以对该浓度进行稍微调整,以达到不同的氧化程度,以及反应时间、温度、液体/固体比的伴随性改变。Crewther等也已经讨论了过甲酸提供与过乙酸相比微不足道肽键断裂的优点。然而,过乙酸提供成本和可得性的优点。较好的氧化温度是0~100摄氏度(℃)。最好的氧化温度是37℃。较好的氧化时间是0.5~24h。最好的氧化时间是12h。较好的液体/固体比是5~100:1。最好的比例是20:1。氧化后,该发用大量蒸馏水漂洗至无残留氧化剂。
该角质骨骼可以使用一种变性剂水溶液从氧化的发中提取。蛋白质变性剂是业内众所周知的,但较好的溶液包括脲、过渡金属氢氧化物(例如氢氧化钠和钾)、氢氧化铵、和三(羟甲基)胺基甲烷(Tris碱)。较好的溶液是浓度范围为0.01~1M的碱(Tris碱的一种品牌)。最好的浓度是0.1M。业内技术人员要认识到,可以对该浓度进行稍微调整以达到不同的提取程度,以及反应时间、温度、和液体/固体比的伴随性改变。较好的提取温度是0~100摄氏度(℃)。最好的提取温度是37℃。较好的提取时间是0.5~24h。最好的提取时间是3h。较好的液体/固体比是5~100:1。最好的比值是40:1。随后用Tris碱稀溶液或去离子(DI)水的萃取可以达到追加产率。提取后可以用离心法和/或过滤法去除溶液中的残留固体。
粗提取物可以通过先使该溶液中和到pH7.0~7.4来分离。最好的pH是7.4。残留变性剂是通过对DI水渗析去除的。将渗析保留物浓缩、随后冻干或喷雾干燥,得到γ-和α-角质骨骼两者的干粉末混合物。替而代之,通过滴加酸直至该溶液的pH达到近似4.2,从提取物溶液中分离出α-角质骨骼。较好的酸包括硫酸、盐酸、和乙酸。最好的酸是浓盐酸。α-级分的沉淀始于pH6.0左右,并继续直至近似pH4.2。分级沉淀可以用来分离有不同等电性能的不同蛋白质范围。固体α-角质骨骼可以用离心法或过滤法回收。
该α-角质骨骼可以通过使该固体再溶解于一种变性溶液中进一步精制。可以使用与用于提取的那些相同的变性溶液,然而,一种较好的变性溶液是Tris碱。可以添加乙二胺四乙酸(EDTA)以络合和去除发中存在的痕量金属。较好的变性溶液是20mM Tris碱与20mM EDTA或DI水与20mM EDTA。若痕量金属的存在不危害意向应用,则EDTA可以省略。通过滴加盐酸达到近似4.2的最终pH,使α-角质骨骼从这种溶液中再沉淀出来。该固体的分离是用离心法或过滤法。这一过程可以重复若干次,以进一步精制该α-角质骨骼。
该γ-角质骨骼级分在pH4时仍留在溶液中,而且是通过添加到一种水可混溶有机溶剂例如醇中、随后过滤、用另外醇脱水、和冻干分离的。通过使该角质骨骼再溶解于一种变性溶液例如7M脲、氢氧化铵水溶液、或20mM Tris缓冲剂溶液中,通过添加一种无机酸使pH降到4、去除所形成的任何固体、中和上清液、用醇使该蛋白质再沉淀、再溶解、对去离子水渗析、和通过添加到醇中再沉淀,可以达到提高的纯度。通过先用蒸馏法浓缩该角质骨骼溶液,可以最大限度降低这些步骤中醇的消耗量。
α-角质骨骼脱除之后,来自典型提取溶液的γ-角质骨骼的浓度是近似1~2%。通过添加到一种水可混溶非溶剂中,就可以分离γ-角质骨骼级分。为了进行沉淀,可以通过蒸发过量水而使该γ-角质骨骼溶液浓缩。这种溶液可以通过去除该水的90%而浓缩到近似10~20%。这可以使用真空蒸馏或降膜蒸发法进行。浓缩后,将该γ-角质骨骼溶液滴加到过量冷非溶剂中。适用的非溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮等。最好的非溶剂是乙醇。最好的方法是将该γ-角质骨骼溶液浓缩到近似10w/v%蛋白,并将其滴加到8倍过量冷乙醇中。沉淀的γ-角质骨骼可以用离心法或过滤法分离、干燥。适用的干燥方法包括冷冻干燥(冻干)、风干、真空干燥、或喷雾干燥。最好的方法是冷冻干燥。
还原角蛋白(Kerateines) 还原角蛋白级分可以使用Bradbury与Chapman(J.Bradbury et al.,Aust.J.Biol.Sci.17,960-72(1964))和Goddard和Michaelis(D.Goddard et al.,J.Biol.Chem.106,605-14(1934))的方法的组合得到。基本上,发纤维的角质层用超声波法去除,以期避免过度水解和使得能在第二步高效率还原皮层二硫化物键。将该发置于一种二氯乙酸溶液中并进行超声波探头处理。这种方法的进一步优化指出,使用80%二氯乙酸、1:16的固/液比、和180瓦的超声波功率的条件是最佳的(H.Ando et al.,Sen′I Gakkaishi 31(3),T81-85(1975))。将固体碎片用过滤法从溶液中脱除、漂洗、风干、随后筛分,以从所脱除角质细胞中分离出发纤维。
在一些实施方案中,在该角质层的超声波法脱除之后,通过该变性纤维与巯基乙醇的反应,得到α-和γ-还原角蛋白。具体地说,使用一种在酸性pH进行的低水解方法(E.Thompson et al.,Aust.J.Biol.Sci.15,757-68(1962))。在一种典型反应中,用一种在含有0.02M乙酸盐缓冲剂和0.001M表面活性剂的脱氧水中添加少量氢氧化钾调整到pH5的4M巯基乙醇对发提取24h。
将该溶液过滤、通过添加无机酸达到约4的pH使α-还原角蛋白级分沉淀出来。该α-还原角蛋白用过滤法分离、用另外的酸洗涤、随后用醇脱水、然后真空干燥。更高的纯度是这样达到的:使该还原角蛋白再溶解于一种变性溶液例如7M脲、氢氧化铵水溶液、或20mM Tris缓冲剂溶液中,再沉淀,再溶解,对去离子水渗析,和在pH4再沉淀。
γ-还原角蛋白级分仍留在pH4的溶液中,是通过添加到一种水可混溶有机溶剂例如醇中、随后过滤、用另外的醇脱水、和真空干燥分离的。更高的纯度可以这样达到:使该还原角蛋白再溶解于一种变性溶液例如7M脲、氢氧化铵水溶液、或20mM Tris缓冲剂溶液中,添加一种无机酸使pH降到4,脱除所形成的任何固体,中和该上清液,用醇使该蛋白再沉淀,再溶解,对去离子水渗析、和通过添加到醇中再沉淀。通过先用蒸馏法使该角蛋白溶液浓缩,可以最大限度降低这些步骤中醇的消耗量。
在一种替代的方法中,该还原角蛋白级分是通过使该发与巯基乙酸钠反应得到的。
还原角蛋白的一种较好生产方法是该发用巯基乙酸或β-巯基乙醇还原。最好的还原剂是巯基乙酸(TGA)。较好的浓度范围是1~10M,最好的是近似1.0M。业内技术人员将认识到,可以对该浓度进行稍微调整以达到不同的还原程度,以及pH、反应时间、温度、和液体/固体比的伴随性改变。较好的pH是9~11。最好的pH是10.2。该还原溶液的pH是通过添加碱改变的。较好的碱包括过渡金属氢氧化物、氢氧化钠、和氢氧化铵。最好的碱是氢氧化钠。pH调整是通过向该还原溶液中滴加氢氧化钠饱和水溶液进行的。较好的还原温度是0~100℃。最好的还原温度是37℃。较好的还原时间是0.5~24h。最好的还原时间是12h。较好的液/固比是5~100:1。最好的比例是20:1。与以上所述的氧化反应不同,还原是在碱性pH进行的。正是这种情况,角蛋白高度可溶于该还原介质中而且可望被提取出来。因此,该还原溶液与随后的提取溶液合并、因而进行加工。
还原的角蛋白不像它们的氧化对等物那样亲水。因此,还原的发纤维不会像氧化的发那样溶胀和裂开,从而导致相对较低的产率。影响该还原/提取过程的动力学的另一个因素是还原角蛋白的相对可溶性。水中的相对可溶性排序,从最大可溶到最小可溶为:γ-角质骨骼>α-角质骨骼>γ-还原角蛋白>α-还原角蛋白。因此,还原发纤维的提取产率没那么高。正因为如此,随后的提取是用另外的还原剂加变性剂溶液进行的。随后提取用较好溶液包括TGA加脲、TGA加Tris碱、或TGA加氢氧化钠。提取之后,α-和γ-还原角蛋白的粗级分可以使用为角质骨骼所述的程序分离。然而,γ-和α-还原角蛋白的沉淀物当暴露于氧时重新形成其胱氨酸交联键。因此,必须将沉淀物迅速再溶解,以避免精制阶段期间的不可溶性,或者在氧不存在下沉淀。
残留的还原剂和变性剂可以用渗析法从溶液中脱除。典型的渗析条件是1~2%还原角蛋白溶液对DI水渗析24~72小时。业内技术人员会认识到,除渗析外,还存在着用于脱除低分子量污染物的其它方法(例如微过滤、色谱法等)。Tris碱的使用只是还原角蛋白的初步增溶所要求的。一旦溶解,该还原角蛋白就稳定于溶液中而无需变性剂。因此,该变性剂无需导致还原角蛋白沉淀就能脱除,只要该pH仍在中性或以上即可。这些精制溶液中还原角蛋白的最终浓度可以通过水的添加/脱除来调整。
无论该角蛋白的形式(即角质骨骼或还原角蛋白)如何,都可以对角蛋白溶液采用若干种不同的进一步精制思路。然而,必须小心选择那些求助于角蛋白独特溶解度特征的技术。最简单的分离技术之一是等电沉淀。在这种方法中,不同等电点的蛋白质可以通过调整该溶液的pH和去除沉淀出来的材料来分离。在角蛋白的情况下,γ-形式和α-形式在pH>6.0都是可溶的。然而,随着pH降到6以下,α-角蛋白开始析出沉淀。通过使该沉淀停止于某一给定pH和用离心法和/或过滤法分离沉淀物,就可以分离各角蛋白级分。在近似4.2的pH,基本上全部α-角蛋白就都已经沉淀出来。这些分离的级发可以再溶解于中性pH的水中、渗析、浓缩、和用冻干法或喷雾干燥法还原成粉末。然而,各还原角蛋白级分必须在氧不存在下或以稀溶液贮存,以避免交联。
角蛋白的另一种通用分离方法是色谱法。可以采用若干种类型的色谱法给角蛋白溶液分级,包括尺寸排阻或凝胶过滤色谱法、亲和色谱法、等电点聚焦、凝胶电泳、离子交换色谱法、和免疫亲和色谱法。这些技术是业内众所周知的,能借助于分子量、化学官能度、等电点、电荷、或与特定抗体的相互作用等特征分离包括蛋白质在内的化合物,而且可以单独或以任何组合使用,以实现高度分离和所得到纯度。
一种较好的精制方法是离子交换(IEx)色谱法。由于一般而言的蛋白质和具体而言的角蛋白的两亲性质,IEx色谱法特别适合于蛋白质分离。因该溶液的起始pH以及准备要保留的所希望级分而异,可以使用要么阳离子型要么阴离子型IEx(分别为CIEx或AIEx)技术。例如,在pH6或以上,γ-角蛋白和α-角蛋白都是可溶的而且都在它们的等电点以上。因此,它们是阴离子型的而且可以结合到阴离子交换树脂上。然而,已经发现,角蛋白的一个亚级分没有结合到弱阴离子交换树脂上,而是通过填充了此类树脂的柱。AIEx色谱法的一种较好溶液是精制水中像以上所述那样分离的精制或分级角蛋白,浓度为0~5w/v%。较好的浓度是0~4w/v%。最好的浓度是大约2w/v%。较好的是,使所述溶液的离子强度保持得起初相当低,以便利结合到AIEx柱上。这是通过使用少量酸滴定该角蛋白的精制水溶液至pH6~7实现的。最好的pH是6。这种溶液可以加到一种AIEx柱例如DEAE-树脂柱或Q-树脂柱上。较好的柱树脂是DEAE-树脂。通过该柱的溶液可以收集起来并像以上所述那样处理,以分离出酸性角蛋白粉末级分。
在一些实施方案中,角蛋白基体的活性是通过使用一种AIEx柱提高的,从而产生除其它方面外可用于促进细胞粘合的角蛋白。不想受任何特定理论约束,但相信,能通过阴离子型柱的级分即酸性角蛋白能促进细胞粘合。
另一种级分容易结合,而且可以使用业内已知的盐化技术从柱上洗掉。较好的洗脱介质是氯化钠溶液。较好的氯化钠浓度是0.1~2M。最好的浓度是2M。该溶液的ph较好是6~12。最好的pH是12。为了保持洗脱过程稳定的pH,可以添加一种缓冲剂盐。较好的缓冲剂盐是碱。业内技术人员将认识到,可以对盐浓度和pH进行稍微改变,以实现不同性能角蛋白级分的洗脱。也可以使用一系列不同的盐浓度和pH或者采用盐和/或pH梯度来产生不同级分。然而,无论采取的思路如何,都可以像以上所述那样将柱洗脱剂收集和进一步处理,来分离各碱性角蛋白粉末级分。
使用CIEx技术的互补性程序也是可行的。即,可以将角蛋白溶液添加到阳离子交换树脂例如Sp 树脂(强阳离子型)或CM树脂(弱阳离子型),并收集通过的碱性级分。所保留的酸性角蛋白级分可以像以上所述那样用盐化法分离。
中位角蛋白(Meta Keratins) 中位角蛋白是使用实质上相同的程序从α-和γ-还原角蛋白级分合成的。基本上,将还原角蛋白溶解于一种变性溶液例如7M脲、氢氧化铵水溶液、或20mM Tris缓冲剂溶液中。让纯氧通过该溶液鼓泡,以引发半胱氨酸基团的氧化偶合反应。该反应的进展是由使用SDS-PAGE测定的分子量增大监测的。让氧连续地通过该反应溶液鼓泡,直至达到2倍或3倍分子量。该变性溶液的pH可以通过添加无机酸调整到中性,以避免该蛋白质的水解。
角蛋白中间体丝(Keratin intermediate filaments) 人发纤维的IFs是使用Thomas及其同事的方法得到的(H Thomas et al.,Int.J.Biol.Macromol.8,258-64(1986))。这基本上是一种化学蚀刻方法,该方法让用来使IFs“胶合”到位的角蛋白基体反应掉,而该IFs留下来。在典型的提取过程中,角质层的溶胀和基体蛋白质的亚硫酸盐解是使用0.2M Na2SO3、0.1M Na2O6S4/8M脲和0.1M Tris-HCl缓冲剂在pH9实现的。该提取在室温进行24h。在浓缩之后,溶解的基体角蛋白和IFs是通过添加乙酸锌溶液达到约6的pH而沉淀出来的。然后,通过对0.05M四硼酸盐溶液渗析,使IFs与基体角蛋白分离。通过用乙酸锌使渗析的溶液沉淀出来、使IFs再溶解于柠檬酸钠中、对蒸馏水渗析、然后使该样品冻干,得到了提高的纯度。
角蛋白制剂的进一步讨论见美国专利申请公报2006/0051732(VanDyke),该专利申请列为本文参考文献。
配方 如上所述角蛋白衍生物的干粉末可以按照已知技术例如冷冻干燥(冻干)形成。在一些实施方案中,本发明的组合物可以通过使这样一种干粉末组合物形式与一种水溶液混合产生,从而产生一种包含有所述角蛋白衍生物溶解于其中的电解质溶液的组合物。该混合步骤可以在任何适当温度、典型地在室温进行,而且可以用任何适当技术例如搅拌、振荡、搅动等进行。该电解质溶液的盐及其它构成组分(例如,除角蛋白衍生物和水外的所有组分)可以全部含于该干粉末中、全部含于该水性组合物内、或在该干粉末与该水性组合物之间分布。例如,在一些实施方案中,该电解质溶液的构成成分中至少一部分含于该干粉末中。
包含诸如以上所述的角蛋白材料的一种基体的形成可以按照本领域内早就确立的技术或其对于业内技术人员显而易见的各种变异进行。在一些实施方案,角蛋白制剂进行干燥并在使用之前重新水合。见Lustig等的美国专利No.2,413,983、Schollkipf等的美国专利No.2,236,921、和Anker的美国专利No.3,464,825。在较好的实施方案中,该基体或水凝胶是通过该冻干材料用适当溶剂例如水或磷酸盐缓冲食盐水(PBS)再水合形成的。该凝胶可以用一种Co60源γ-辐射(800krad)灭菌。角蛋白基体的其它适当形成方法包括但不限于美国专利Nos.6,270,793(Van Dyke et al.),6,274,155(van Dyke et al.),6,316,598(van Dykeet al.),6,461,628(Blanchard et al.),6,544,548(Siller-Jackson et al.),和7,01,987(Van Dyke)中列举的那些。
在一些组合物实施方案中,角蛋白衍生物(尤其α-和/或γ-还原角蛋白以及α-和/或γ-角质骨骼)的平均分子量为约10~70或85或100千道尔顿(kD)。其它角蛋白衍生物、尤其中位角蛋白,可以有更高的平均分子量,例如可高达200~300kD。一般来说,该角蛋白衍生物(这个术语包括衍生物的组合)可以包括在该组合物中,其数量为约0.1、0.5或1wt%~3、4、5、或10wt%。该组合物当混合时较好有约1或1.5~4、8、10或20厘泊(cP)的粘度。任何浓度时的粘度都可以通过改变α-/γ-角质骨骼的比例来调制。
该角蛋白衍生物或配方可以任选地含有一种或多种有效成分,例如一种或多种生长因子(例如,其数量范围为包含该角蛋白衍生物的组合物的0.0000001~1或5wt%),以便利生长或愈合、便利或抑制(血液)凝固、便利或抑制细胞或组织粘合等。适用有效成分的实例包括但不限于神经生长因子、血管内皮生长因子、纤连蛋白、血纤维蛋白、昆布蛋白、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、睾酮、神经节苷脂GM-1、过氧化氢酶、胰岛素类生长因子-I(IGF-I)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、神经元生长因子galectin-1,及其组合。见,例如,Hansson等的美国专利No.6,506,727、和Horie等的美国专利No.6,890,531。
本文中使用的“生长因子”包括能促进组织的再生、生长和存活的分子。本发明的一些实施方案中使用的生长因子可以是角蛋白提取物中天然存在的那些,也可以呈添加到角蛋白提取物或所形成的角蛋白基体中的添加剂的形式。生长因子的实例包括但不限于神经生长因子(NGF)及其它神经营养素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促红细胞生长素(EPO)、促血小板生长素(TPO)、myostatin(GDF-8)、生长分化因子-9(GDF9)、基础成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、粒细胞群刺激因子(G-CSF)、和粒细胞巨噬细胞群刺激因子(GM-CSF)。有构成生长因子大家族的很多结构上和进化上相关的蛋白质,还有众多生长因子家族例如神经营养素(NGF,BDNF、和NT3)。神经营养素(neurotrophins)是一种能促进神经组织等的生长和存活的分子家族。神经营养素的实例包括但不限于神经生长因子(NGF)、大脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养素3(NT-3)、和神经营养素4(NT-4)。见Johnson,Jr等的美国专利No.5,843,914;Persson等的美国专利No.5,488,099;Barde等的美国专利No.5,438,121;Collins等的美国专利No.5,235,043;和Burton等的美国专利No.6,005,081。
例如,神经生长因子(NGF)可以以能有效地促进各组织的再生、生长和存活的数量添加到角蛋白基体组合物中。NGF是以0.1ng/mL~1000ng/mL范围内的浓度提供。更好,NGF是以1ng/mL~100ng/mL范围内的浓度、最好10ng/mL~100ng/mL范围内的浓度提供的。见Urso的美国专利6,063,757。
可以以类似于所公开的角蛋白制剂的方式制备和利用的天然聚合物的其它实例包括但不限于胶原蛋白、明胶、纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白(见例如Katsuen等的美国专利No.5,691,203),并进行业内技术人员显而易见的必要改变。
该组合物较好是无菌的和非热解的。该组合物可以以预成形、尤其包装于适当容器例如可挠曲聚合物袋或瓶或箔容器中的形式提供,也可以以一个容器中无菌干粉末试剂盒或供临使用前混合的分开容器中无菌水溶液试剂盒形式提供。当以预成形和包装于无菌容器中的形式提供时,该组合物在粘度实质性丧失(例如10或20%以上)和/或角蛋白衍生物实质性沉淀(例如目视检查时有可检测沉降)之前在室温有至少4或6个月(或多达2或3年或以上)的货架寿命。
涂料和生物医学植入物 如以上所说明的,本发明提供一种可植入生长医学器件,包含:一种基材和该基材上的一种角蛋白衍生物,其中该角蛋白衍生物是以能有效降低细胞和/或组织对该基材的粘合的数量存在的。在一些实施方案中,该角蛋白包含、组成为、或基本组成为碱性α-角质骨骼、碱性α-还原角蛋白、或其组合。
角蛋白的化学可以用来优化角蛋白系涂料的性能。α-和γ-角质骨骼有惰性硫残基。氧化反应是一个终端步骤,并导致胱氨酸残基转化成2个非反应性磺酸残基。另一方面,还原角蛋白有不稳定硫残基。在还原角蛋白产生期间,胱氨酸转化成半胱氨酸,后者会成为一种进一步化学改性的源(见流程1)。一种这样的有用反应是氧化硫-硫偶合。这个反应简单地使该半胱氨酸转化回胱氨酸,并重新形成蛋白质之间的交联。这是一个有用的反应,可用于提高有益的γ-或α-级分的分子量,后者又能改进该材料的整体性能。提高分子量影响材料性能例如粘度、干薄膜强度、凝胶强度等。这样再形成的还原角蛋白简称为中位角蛋白。
中位角蛋白可以衍生自γ-级分或α-级分、或两者的组合。该还原角蛋白的氧化再交联受到氧化剂例如过乙酸或过氧化氢的添加影响。较好的氧化剂是氧。这个反应只需通过让氧经由还原角蛋白溶液鼓泡、要不然使该样品暴露于空气就能实现。通过使用中位角蛋白的分子量优化,使得能优化配方而得到各种各样性能,包括粘度、薄膜强度和弹性、纤维强度、和水解易感性。空气中交联因给生物材料提供最低限度外来组分而能改善生物兼容性。
任何适用的基材(典型地,一种意图植入或插入人体或动物对象中的器件)都可以用本文中所述的角蛋白材料或角蛋白衍生物涂布或处理,包括但不限于移植物例如血管移植物、血管斯坦特固定模、导管、导程、起搏器、心律转变器、瓣膜、持着器或门,例如心瓣膜等。
该基材可以从任何适用材料形成,包括但不限于有机聚合物(包括稳定的聚合物和可生物降解或可生物侵蚀的聚合物)、天然材料(例如胶原蛋白)、金属(例如铂、金、不锈钢等)、无机材料(例如硅、玻璃等)、及其组合。
该基材的涂布可以用任何适用手段例如喷涂、浸涂等进行。在一些实施方案中,可以采取一些步骤,诸如用一种甲硅烷偶合剂使该角蛋白偶合或共价偶合到该基材上,若希望如此的话。该角蛋白衍生物随后可以用另一种材料涂布,和/或可以使其它材料与该角蛋白衍生物共沉积,例如一种或多种另外的活性剂、稳定剂、涂料等。
本发明的另一个方面是一种可植入抗粘组织屏障,包含:一种固体、生理上可接受基材(典型地一种片材,包括但不限于薄膜,以及从有机聚合物或天然材料形成的织造和非织造片材);和该基材上的一种角蛋白衍生物。在一些实施方案中,该角蛋白衍生物包含、组成为、或基本组成为碱性α-角质骨骼、碱性α-还原角蛋白、或其组合。
本发明用以下非限定性实施例更详细地解释。
实施例1 粗角质骨骼样品
角质骨骼级分是使用一种以Alexander及其同事的方法为基础的方法得到的。然而,该方法进行实质性改进,以最大限度降低肽键水解。简而言之,让50g从当地理发店收集的清洁干燥头发与1000mL2w/v%过乙酸(PAA)水溶液在室温反应12h。氧化的头发用500μm筛回收、用充裕数量的DI水漂洗、脱除过量水。用1000mL100mM 碱从该氧化发纤维中提取角质骨骼。3小时后,用筛分离该发、通过滴加该盐酸使该液体中和。分别使用1000mL0.1M 碱和1000mL DI水的2次随后提取,从剩余头发中提取了另外的角质骨骼。每次该头发都是用筛分离的、而液体是用HCl中和的。将所有3次提取物合并、离心分离、用过滤法除去任何残存固形物。合并的提取物通过以1kDa标称低分子量截止膜对DI水的切向流渗析进行精制。将该溶液浓缩、冻干,以产生一种粗角质骨骼粉末。
实施例2 粗还原角蛋白样品
还原角蛋白级分是使用Goddard和Michaelis所述方法的改进方法得到的。简而言之,让头发与1M TGA水溶液在37℃反应24h。该TGA溶液的pH通过滴加饱和NaOH溶液调整到pH10.2。将提取物溶液过滤以脱除还原的发纤维并予以保留。用序列提取法从该纤维中提取另外的角蛋白:1000m L100mM TGA在pH10.2提取24h,1000m L10mMTGA在pH10.2提取24h,和DI水在pH10.2提取24h。每次提取之后,该溶液都进行离心、过滤、和添加到渗析系统中。最后,将所有提取物合并、用1kDa标称低分子量截止膜对DI水渗析。将该溶液浓缩、滴定到pH7、以大约5%总蛋白质浓度在4℃贮存。替而代之,该浓溶液可以冻干并在冷冻和氮气下贮存。
实施例3 离子交换色谱法
临分级前,将角质骨骼样品再溶解于超纯水中并通过添加稀HCl溶液滴定到pH6。将样品以微压加到含有要么DEAE-Sepharose(弱阴离子型)要么Q-Sepharose(强阴离子型)离子交换树脂(50~100目;Sigma-Aldrich公司,美国威斯康星州密尔沃基)的200mL闪急色谱柱中,并收集流出的级分(酸性角蛋白)。使用小体积10mM 碱(约200mL,pH6)充分洗涤该样品。用100mM Tris碱加2M NaCl在pH12从该柱洗脱碱性角蛋白。每个样品都分别中和,利用1kDa的LMWCO的切向流渗析法对DI水渗析、用旋转蒸发法浓缩、冷冻干燥。
实施例4 粘度和红血细胞凝聚的评估
如以上所述,将α-角质骨骼的样品产生、在DEAE-Sepharose IEx柱上分离成酸性级分和碱性级分、溶解于PBS、将ph调整到7.4。这些溶液是以5wt%浓度制备的,其RBC凝聚特征是以新鲜全人血按1∶1比例混合总体评估的。20min后取样、用光学显微镜法评估。离子交换色谱法在分离该凝聚现象时是高度有效的(数据未显示)。碱性α-角质骨骼基本上不与血细胞相互作用,而酸性α-角质骨骼则引起过度凝聚。
酸性和碱性α-角质骨骼、未分级的α+γ-还原角蛋白、未分级的α+γ-角质骨骼、和β-角质骨骼(衍生自角质层)是以大约4w/v%和pH7.4用磷酸盐缓冲食盐水(PBS)制备的。对样品进行粘度和红血细胞(RBC)凝聚试验。这些结果列于表1中:
以上是本发明的说明,而不是理解为其限制。本发明由以下权利要求书定义,其中包括该权利要求书的等效物。
Claims (28)
1.一种有电荷角蛋白级分的生产方法,包含:
提供一种包含酸性和/或碱性角蛋白的角蛋白溶液;
从所述角蛋白溶液中分离出所述酸性和/或碱性角蛋白的级分;和
收集所述级分中至少一种;
以产生至少一种带电荷角蛋白级分。
2.权利要求1的方法,其中所述分离步骤是用离子交换色谱法进行的。
3.权利要求1的方法,其中所述分离步骤是用阴离子交换色谱法进行的。
4.权利要求1的方法,其中所述分离步骤是用阴离子交换色谱法进行的,且其中所述阴离子交换色谱法是用弱阴离子交换树脂进行的。
5.权利要求1的方法,其中所述角蛋白溶液包含0~5w/v%角蛋白。
6.权利要求1的方法,其中所述角蛋白溶液的pH为6~7。
7.权利要求1的方法,其中所述角蛋白包含α-或γ-角蛋白。
8.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由α-角蛋白组成。
9.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由γ-角蛋白组成。
10.权利要求1的方法,其中所述角蛋白包含角质骨骼。
11.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由角质骨骼组成。
12.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由α-角质骨骼组成。
13.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由γ-角质骨骼组成。
14.权利要求1的方法,其中所述角蛋白包含还原角蛋白。
15.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由还原角蛋白组成。
16.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由α-还原角蛋白组成。
17.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由γ-还原角蛋白组成。
18.权利要求1的方法,进一步包含下列步骤:
使所述有电荷角蛋白再溶解于一种变性和/或缓冲溶液中,该步骤任选地在一种螯合剂的存在下进行以络合痕量金属;和
使所述有电荷角蛋白从所述变性和/或缓冲溶液中再沉淀出来。
19.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由角质骨骼组成,且其中所述提供步骤进行如下:
使人发与过乙酸反应;和
用一种包含Tris碱的溶液提取角质骨骼;
以提供一种基本上由角质骨骼组成的角蛋白溶液。
20.权利要求19的方法,其中所述角质骨骼基本上由α-角质骨骼组成,且其中所述提供步骤进一步包含下列步骤:
添加无机酸至pH为大约4,使α-角质骨骼从基本上由角质骨骼组成的所述角蛋白溶液中沉淀出来;
使沉淀的α-角质骨骼从溶液中分离出来;
收集沉淀的α-角质骨骼;和
任选地,使该α-角质骨骼在pH9再溶解和在pH4再沉淀,以进一步精制;
以提供基本上由α-角质骨骼组成的所述角质骨骼。
21.权利要求1的方法,其中所述角蛋白基本上由还原角蛋白组成,且其中所述提供步骤进行如下:
使人发与巯基乙酸反应;和
用一种包含Tris碱的溶液提取还原角蛋白;
以提供基本上由还原角蛋白组成的角蛋白溶液。
22.权利要求21的方法,其中所述还原角蛋白基本上由α-还原角蛋白组成,且其中所述提供步骤进一步包含下列步骤:
添加无机酸至pH为大约4,使α-还原角蛋白从基本上由还原角蛋白组成的所述角蛋白溶液中沉淀出来;
使沉淀的α-还原角蛋白从溶液中分离出来;
收集沉淀的α-还原角蛋白;和
任选地,使该α-还原角蛋白在pH9再溶解和在pH4再沉淀,以进一步精制;
以提供基本上由α-还原角蛋白组成的所述还原角蛋白。
23.一种可植入生物医学器件,包含:
一种基材和所述基材上的一种角蛋白衍生物,
其中所述角蛋白衍生物是以能有效地降低细胞和组织对所述基材的粘合的数量存在的;且
其中所述角蛋白衍生物基本上由碱性角质骨骼、碱性还原角蛋白、或其组合组成。
24.权利要求23的器件,其中所述器件是一种血管移植物、血管斯坦特固定模、导管、导程、起搏器、或心律转变器。
25.一种可植入抗粘合组织屏障,包含:
一种固体、生理上可接受基材;和
所述基材上的一种角蛋白衍生物;
其中所述角蛋白衍生物基本上由碱性角质骨骼、碱性还原角蛋白、或其组合组成。
26.有其需要的对象中血液凝固的治疗方法,包含:
对所述对象给药能有效地抑制所述对象中血液凝固的数量的角蛋白衍生物;
其中所述角蛋白衍生物基本上由碱性角质骨骼、碱性还原角蛋白、或其组合组成。
27.权利要求26的方法,其中所述对象患有血栓栓塞症。
28.权利要求26的方法,其中该血栓栓塞症选自:不稳定心绞痛、急性冠状综合征、原发心肌梗塞形成、再发心肌梗塞形成、局部缺血性猝死、短暂局部缺血性发作、中风、动脉粥样硬化、末梢闭塞性动脉病、静脉血栓形成、深处静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉血栓形成、脑动脉血栓形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞、和下列情况造成的栓塞:(a)修复阀或其它植入物,(b)内在导管,(c)斯坦特固定模,(d)心肺分流术,(e)血渗析,或(f)使血液暴露于能促进血栓形成的人工表面的其它程序。
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