CN101420976A - 用于产生免疫应答的组合方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码免疫原性HIV多肽的方法、多核苷酸和多肽，所述HIV免疫原性多肽来源于HIV亚型内的不同毒株和/或不同亚型的免疫原性HIV多肽。描述了多核苷酸和多肽在产生免疫应答的组合方法中的应用。本文所述的组合方法显示诱导抗给定亚型内多种毒株的各种HIV毒株和抗各种亚型的广泛且强有力的中和活性。也公布了用于产生免疫应答的组合物的制剂和使用这种组合物的方法。

Description

用于产生免疫应答的组合方法

技术领域

本发明涉及含有用于在对象中产生免疫应答的多核苷酸组分和多肽组分的组合物。一方面，本发明组合物用于在组合物所给予的对象中产生免疫应答的方法。另一方面，本发明组合物用于产生抗多种毒株的广泛免疫应答的方法，所述毒株来源于选择的微生物，例如人免疫缺陷病毒(HIV)的单一亚型或血清型，或多种亚型或血清型。

发明背景

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)被认为是当代医药领域面临的最大健康威胁之一。然而现在对该疾病还没有医治方法。

在1983-1984年，三个研究团体独立鉴定了可疑的AIDS病原学因子。参见，例如Barre-Sinoussi等，(1983)Science 220：868-871；Montagnier等，在《人T-细胞白血病病毒》(Human T-Cell Leukemia Viruses)中所述，(Gallo，Essex和Gross编，1984)；Vilmer等，(1984)The Lancet 1：753；Popovic等，(1984)Science 224：497-500；Levy等，(1984)Science 225：840-842。这些分离物具有各种名称，淋巴结病相关病毒(LAV)、III型人T-细胞亲淋巴细胞病毒(HTLV-III)或AIDS相关逆转录病毒(ARV)。所有这些分离物是同一病毒的毒株，后来统一命名为人免疫缺陷病毒(HIV)。随着导致AIDS的相关病毒的分离，起初称为HIV的毒株现在命名为HIV-1，相关的病毒称为HIV-2。参见，例如Guyader等，(1987)Nature 326：662-669；Brun-Vezinet等，(1986)Science 233：343-346；Clavel等，(1986)Nature 324：691-695。

已收集了大量有关HIV病毒的信息，然而迄今为止未鉴定到有效的疫苗。已检测了用于疫苗开发的几种靶位，包括HIV编码的env和Gag基因产物。Gag基因产物包括(但不限于)Gag-聚合酶和Gag-蛋白酶。Env基因产物包括(但不限于)单体gp120多肽、寡聚gp140多肽和gp160多肽。

Haas等(《当代生物学》(Current Biology)6(3)：315-324，1996)提示HIV-1的选择性密码子使用似乎可解释病毒蛋白质合成低效的实质性原因。Andre等(J.ViroL 72(2)：1497-1503，1998)描述了使用具有改变的密码子使用的合成gp120序列的DNA疫苗引发了增加的免疫应答。Schneider等，(J Virol.71(7)：4892-4903，1997)讨论了位于Gag编码序列和Gag蛋白酶编码序列内的抑制(或不稳定)元件(INS)的失活。

HIV-1的Gag蛋白是装配病毒样颗粒所需。HIV-1Gag蛋白参与病毒生命周期的许多阶段，包括装配、颗粒释放后的病毒体成熟与病毒复制中的早期进入后步骤。HIV-1Gag蛋白具有多种且复杂的作用(Freed，E.O，Virology251：1-15，1998)。

Wolf等(PCT国际公布号WO 96/30523，1996年10月3日公布；欧洲专利申请，公布号0 449 116 A1，1991年10月2日公布)描述了改变的HIV-1的pr55 Gag作为非感染性逆转录病毒样颗粒运载体的用途，特别是用于呈递免疫学上重要的表位。Wang等(Virology 200：524-534，1994)描述了用于研究HIV Gag-β-半乳糖苷酶融合蛋白装配进病毒体的系统。他们描述了编码HIV Gag-β-半乳糖苷酶融合蛋白的序列的构建，这些序列在有HIV Gag蛋白存在时的表达与这些蛋白质装配进病毒颗粒。

Shiver等(PCT国际公布号WO 98/34640，1998年8月13日公布)描述了改变HIV-1(CAM1)Gag编码序列来产生编码HIV Gag的合成DNA分子与HIV Gag的修饰物。合成分子的密码子是预定的宿主细胞的优选密码子。

近来，在免疫原性组合物中使用HIV Env多肽已见描述。参见，1998年12月8日颁发给Hurwitz等的美国专利号5,846,546，该专利描述了含有至少4种不同的重组病毒的免疫原性组合物，每种病毒表达一种不同的HIVene变体；与1998年11月24日颁发给Vahlne等的美国专利号5,840,313，该专利描述对应于HIV-1 gp120蛋白的表位的肽。此外，1999年3月2日颁发给Sia等的美国专利号5,876,731，该专利描述了抗HIV的候选疫苗，所述疫苗含有Gag的T细胞表位的氨基酸序列，而该氨基酸序列直接连接于HIV-1分离物的V3环蛋白的B细胞表位的氨基酸序列，该分离物含有序列GPGR。

PCT国际公布号WO/00/39302、WO/00/39303、WO/00/39304、WO/02/04493、WO/03/004657、WO/03/004620和WO/03/020876描述许多密码子优化的HIV多肽以及一些天然HIV序列。此外，描述了各种含有突变的HIV多肽。也描述了这些HIV多肽在疫苗组合物和免疫方法中的应用。

本发明提供用于产生抗选择的微生物，例如一种病毒(如HIV-1)的多种亚型、血清型或毒株的免疫应答的改进组合物和方法。

发明概述

本发明涉及用于在对象中产生免疫应答的组合物和方法。本发明的组合物含有至少两种组分，其中每种组分提供一种不同但类似的多肽免疫原。多肽免疫原可直接以多肽的形式(包括多肽片段、修饰的形式、包囊的形式等)提供，或者在一优选的实施方案中可以多核苷酸免疫原(包括编码多肽免疫原的DNA和/或RNA)的形式间接提供。本发明的组合物可用在给予组合物的对象中产生免疫应答的方法，其中免疫应答直接抗一种选择的微生物，例如病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV))的多种亚型、血清型或毒株。在一优选的实施方案中，本发明涉及含有可用于在对象中产生免疫应答(例如，产生中和抗体)的多核苷酸组分和多肽组分的组合物。本发明也考虑了含有至少两种多核苷酸组分的其它实施方案，其中每种组分提供不同但类似的多肽免疫原；或者含有至少两种多肽组分的其它实施方案，其中每种组分提供不同但类似的多肽免疫原。本发明的组合物可用于在给予组合物的对象中产生免疫应答的方法，其中免疫应答直接抗一种选择的微生物，例如病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV))的第一亚型或血清型，或抗多种亚型或血清型。在另一个实施方案中，每种免疫原可与一种病毒载体一起递送，该载体可是相同或不同的载体。例如，作为免疫原的第一种类似的多肽可在多核苷酸中编码，该多核苷酸由腺病毒载体递送至对象。然后或同时，作为免疫原的第二种类似的多肽可由另一种腺病毒或甲病毒载体递送。免疫原的递送形式可变，前提是第一和第二种类似的免疫原来自同一亚型或不同HIV亚型的不同HIV毒株。本发明组合物和方法的多肽成分也可由病毒载体递送。

本发明的第一个方面包括用于在哺乳动物中产生免疫应答的组合物。这些组合物通常含有

多核苷酸组分和多肽组分，其中

所述多核苷酸组分基本上由编码来源于第一血清型的第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸构成；

所述多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的HIV免疫原性多肽，前提是该多肽成分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于第二种HIV毒株，其中所述第一种HIV毒株和所述第二种HIV毒株不同。该组合物的另一实施方案包括的前提是(i)多核苷酸组分不编码来源于除第一亚型以外任何亚型的类似HIV免疫原性多肽，和(ii)多肽组分不含有来源于除第一亚型以外的任何亚型的类似HIV免疫原性多肽。其它实施方案考虑了第一和第二HIV毒株可来自不同亚型。

这两方面的多核苷酸组分均可含有至少一种天然多核苷酸。或者，多核苷酸组分可含有至少一种合成的多核苷酸。合成的多核苷酸可含有优化用于在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中表达的密码子。多核苷酸组分可含有一种多核苷酸分子，或两种或多种不同的多核苷酸分子，每种编码一种或多种HIV多肽。多核苷酸组分可含有DNA或RNA或二者。

HIV免疫原性多肽(多核苷酸组分编码和/或含有多肽组分的)可是HIV包膜多肽。与野生型(即，天然存在的)HIV多肽相比，该HIV多肽可含有一个或多个突变，例如，就包膜蛋白而言，至少一种包膜多肽可在切割位点或糖基化位点中含有一个突变(在V1区域含有缺失或修饰，在V2区域含有缺失或修饰，在V3区域含有缺失或修饰，修饰以暴露与CCR5趋化因子共同受体结合的包膜结合区域，和它们的组合)。其它免疫原性HIV多肽包括(但不限于)Gag、Env、Pol、Prot、Int、RT、vif、vpr、vpu、tat、rev和nef多肽。

HIV免疫原性多肽及其编码序列的第一亚型可选自(但不限于)亚型A、亚型B、亚型C、亚型D、亚型E、亚型F、亚型G和亚型O以及任何已鉴定的CRF。

除了免疫原性HIV多肽及其编码序列，多核苷酸组分可编码并且多肽组分可含有一种或多种抗原多肽，该抗原多肽包括并非来源于HIV-1编码序列的抗原多肽。

多核苷酸组分还可含有编码一种或多种与在选择的宿主细胞中表达相容的控制元件的序列，其中所述控制元件操作性连接于编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸。示范性控制元件包括(但不限于)转录启动子(例如，CMV、CMV+内含子A、SV40、RSV、HIV-Ltr、MMLV-ltr和金属硫蛋白)、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列、用于优化翻译启动的序列、内部核糖体进入位点和翻译终止序列。

多核苷酸组分可含有本文所述的其它成分(例如，运载体、载体序列、控制序列等)。多肽组分可含有本文所述的其它成分(例如，运载体、佐剂、免疫增强剂等)。

本发明也包括在对象中产生免疫应答的方法。方法的一个实施方案提供了用于在哺乳动物中产生免疫应答的本发明组合物，例如上述的。在与多核苷酸在对象中表达相容的条件下，将一种或多种基因递送载体给予对象来产生编码的HIV免疫原性多肽，所述载体含有组合物的多核苷酸组分的多核苷酸。或者，给予对象产生免疫应答的组合物的多肽组分。

所述一种或多种基因递送载体和多肽组分，例如可同时给予或依次给予。

多核苷酸组分可含有本文所述的其它成分(例如，运载体、载体序列、控制序列等)。多肽组分可含有本文所述的其它成分(例如，运载体、佐剂、免疫增强剂等)并且可以是可溶或颗粒状的。

一种或多种基因递送载体可含有，例如非病毒和/或病毒载体。示范性非病毒载体包括(但不限于)质粒或表达盒。示范性病毒载体包括(但不限于)逆转录病毒、慢病毒、甲病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺伴随病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腺病毒载体或其它已知的病毒载体。病毒载体可是不同的血清型亚型或种类。一种或多种基因递送载体可使用颗粒载体，例如包被在金或钨颗粒上递送，或者包被颗粒可使用基因枪递送至对象，或者PLG颗粒可经电穿孔或其它方式递送。或者，一种或多种基因递送载体包囊在脂质体制剂中。一种或多种基因载体可经，例如肌肉内、粘膜内、鼻内、皮下、真皮内、经皮、阴道内、直肠内、口服、静脉内或这些方法的组合来给予。

本发明方法的对象通常是哺乳动物，例如人。

本发明方法产生的免疫应答可是体液和/或细胞的。在一个实施方案中，免疫应答导致在对象中产生抗来源于第一HIV亚型的抗多种毒株或多种亚型的广泛中和抗体。在另一个实施方案中，免疫应答产生了抗来源于不同亚型的多种毒株的广泛中和抗体。

鉴于本文的内容，本领域的普通技术人员易于实施本发明的这些和其它实施方案。

附图简述

图1A-1D描述了HIV亚型C8_5_TV1_C.ZA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1；本文称为TV1)。各种区域示于表1。

图2A-2E描述了各种HIV分离物(B型-SF162、亚型C-TV1.8_2、亚型C-TV1.8_5、亚型C-TV2.12-5/1、亚型C-MJ4、印度亚型C-93IN101、亚型A-Q2317、亚型D-92UG001、亚型E-cm235和共有序列)的Env多肽的对比情况。箭头表示在β和/或桥连片层区域中的缺失和/或截短的示范性区域。“*”表示N-连接的糖基化位点，其中一个或多个该位点可修饰(例如，缺失的和/或突变的；一个这种可能的突变是N→O的突变)。

图3是显示HIV Env多肽的以下形式之间关系的示意图：gp160、gp140、gp120和gp41。

图4表示抗HIV-1亚型B毒株SF162的中和抗体活性数据，该数据通过许多不同的免疫方法在家兔中获得。

图5表示抗HIV-1亚型C毒株TV1的中和抗体活性数据，该数据通过许多不同的免疫方法在家兔中获得。

图6表示命名为gp140.modSF162.delV2的多核苷酸的核苷酸序列。

图7表示命名为gp140.mut7.modSF162.delV2的多核苷酸的核苷酸序列。

图8表示命名为gp140mod.TV1.delV2的多核苷酸的核苷酸序列。

图9表示命名为gp140mod.TV1.mut7.delV2的多核苷酸的核苷酸序列。

图10表示命名为gp160mod.Q23-17的多核苷酸的核苷酸序列(基于来自肯尼亚GenBank登录AF004885的HIV-1亚型A的分离物Q23-17的优化序列)。

图11表示命名为gp160mod.98UA0116的多核苷酸的核苷酸序列(基于来自乌克兰GenBank登录AF413987的HIV-1亚型A的分离物98UA0116的优化序列)。

图12表示命名为gp160mod.SE8538的多核苷酸的核苷酸序列(基于来自坦桑尼亚GenBank登录AF069669的HIV-1亚型A的分离物SE8538的优化序列)。

图13表示命名为gp160mod.UG031的多核苷酸的核苷酸序列(基于亚型A人免疫缺陷病毒1的原病毒DNA，完全基因组，克隆：pUG031-A1，GenBank登录AB098330的优化序列，)。

图14表示命名为gp160mod.92UG001的多核苷酸的核苷酸序列(基于亚型D人免疫缺陷病毒1型的完全原病毒基因组，毒株92UG001，GenBank登录AJ320484的优化序列，)。

图15表示命名为gp160mod.94UG114的多核苷酸的核苷酸序列(基于来自乌干达GenBank登录U88824的HIV-1亚型D的分离物94UG114的优化序列)。

图16表示命名为gp160mod.ELI的多核苷酸的核苷酸序列(基于亚型D人免疫缺陷病毒1型的分离物ELI，GenBank登录K03454的优化序列)。

图17表示命名为gp160mod.93IN101的多核苷酸的核苷酸序列(基于印度亚型C人免疫缺陷病毒1型亚型C基因组RNA，GenBank登录AB023804的优化序列)。

图18表示命名为gp160mod.cm235.V3con的多核苷酸的核苷酸序列(基于HIV-1亚型E分离物的优化序列)。

图19表示命名为gp160partialmod.cm235.V3con的多核苷酸的核苷酸序列(基于HIV-1亚型E分离物的优化序列)。

图20表示SF162Env蛋白在免疫的黑猩猩中产生的结合抗体滴度的ELISA数据。

图21表示用HIV_MN env DNA(作为引发)和HIV_SF162env蛋白(作为加强)免疫的黑猩猩的淋巴增殖数据。

图22表示用不同的亚型B毒株成分(腺病毒和HIV-MN的env/rev)和SF162的gpΔ140V2的本发明所述引发加强方案的图示。

图23(A-B)表示针对HIV-1SF162Env蛋白的血清结合抗体滴度与针对HIVIIIB env的血清结合抗体的动力学。

图24(A-D)表示诱导针对HIVgp120的交叉进化支结合抗体的数据。

图25(A-B)表示用复制型和非复制型腺病毒引发后诱导中和抗体的结果。

图26表示用进化支B成分免疫后诱导针对进化支C的中和抗体的数据。

图27表示用复制型和非复制型腺病毒作为引发成分诱导交叉反应性ADCC活性的数据。

图28表示诱导针对亚型B HIV包膜的抗原特异性淋巴增殖应答的数据。

图29表示用复制型或非复制型腺病毒引发后诱导IFN-γ分泌细胞的数据。

发明详述

除非另有指出，实施本发明要采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。这种技术完整地解释于参考文献。参见，例如《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；《酶学方法》(Methods In Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；《免疫学实验手册》(Handbook of Experimental Immunology)，I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，Blackwell Scientific Publications)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)(第二版，1989)；《精编分子生物学实验指南》(Short Protocols inMolecular Biology)，第四版(Ausubel等，1999，John Wiley & Sons)；《分子生物学技术：实验室精读课程》(Molecular Biology Techniques：AnIntensive Laboratory Course)，(Ream等编，1998，Academic Press)；《PCR(生物技术丛书导论)》PCR(Introduction to Biotechniques Series)，第二版，(Newton和Graham编，1997，Springer Verlag)。

如同每份单独的专利、出版物、序列引用或专利申请特别且独立地出于所有目的全文纳入引为参考一样，本说明书中引用的所有专利、出版物、序列引用和专利申请均引入本文作为参考。

除非文中另有明确指出，本说明书中使用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”均包括其复数形式。因此，例如“一个抗原”包括两个或多个这种物质的混合物。

1.0.0定义

以下术语将用于描述本发明并如下定义。

本文使用的“合成的”序列指其表达如本文所述，例如通过密码子取代、改变活性和/或抑制序列的失活来修饰的编码HIV多肽的多核苷酸。本文使用的“野生型”或“天然”序列指基本上是天然发现的编码多肽的多核苷酸，例如在HIV分离物中发现的Gag、Pol、Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu、Env和/或Nef编码序列，如SF162；SF2；AF110965；AF110967；AF110968；AF110975；MJ4(亚型C，Ndung′u等，(2001)J.Virol.75：4964-4972)；亚型B-SF162；亚型C-TV1.8_2(8_2_TV1_C.ZA)；亚型C-TV1.8_5(8_5_TV1_C.ZA)；亚型C-TV2.12-5/1(12-5_1_TV2_C.ZA)；亚型C-MJ4；印度亚型C-93IN101；亚型A-Q2317；亚型D-92UG001；亚型E-cm235；来自肯尼亚的HIV-1亚型A分离物Q23-17，GenBank登录AF004885；来自乌克兰的HIV-1亚型A分离物98UA0116，GenBank登录AF413987；来自坦桑尼亚的HIV-1亚型A分离物SE8538，GenBank登录AF069669；亚型A人免疫缺陷病毒1的原病毒DNA，完全基因组，克隆：pUG031-A1，GenBank登录AB098330；亚型D1型人免疫缺陷病毒的完全原病毒基因组，毒株92UG001，GenBank登录AJ320484；来自乌干达的HIV-1亚型D的分离物94UG114，GenBank登录U88824；亚型D人免疫缺陷病毒1型的分离物ELI，GenBank登录K03454与印度亚型C人免疫缺陷病毒1型的亚型C基因组RNA，GenBank登录AB023804。

HIV基因组的各种区域及相对于8_5_TV1_C.ZA(图1-A-1D)的编号示于表1。因此，术语“pol”指一种或多种以下多肽：聚合酶(p6Pol)；蛋白酶(prot)；逆转录酶(p66RT或RT)；RNA酶(p15RNAseH)和/或整合酶(p31Int或Int)。鉴定任何选择的HIV分离物(例如，一种亚型中的毒株，或来源于不同亚型的毒株)的基因区域可由本领域的普通技术人员基于本文提供的指导和本领域已知的信息来进行，例如通过进行相对于8_5_TV1_C.ZA(图1A-1D所示的多核苷酸序列)的核苷酸和/或多肽对比，或对比其它已知的HIV分离物，例如亚型B分离物与基因区域(例如，SF2，GenBank登录号K02007；SF162，GenBank登录号M38428)和亚型C分离物与基因区域(例如，GenBank登录号AF110965和GenBank登录号AF110975)。

本文使用的术语“病毒样颗粒”或“VLP”指来源于以下要讨论几种病毒的任一种的非复制型病毒壳。VLP一般由一种或多种病毒蛋白组成，例如(但不限于)称为衣壳、包被、壳、表面和/或包膜蛋白的蛋白，或是来源于这些蛋白的形成颗粒的多肽。蛋白在合适的表达系统中重组表达后VLP可自发形成。产生特定VLP的方法是本领域已知的，下文将更完全地讨论。病毒蛋白重组表达后可使用本领域已知的常规技术，例如电子显微镜、X-射线晶体学等检测VLP的存在。参见，例如Baker等，Biophys.J.(1991)60：1445-1456；Hagensee等，J.Virol.(1994)68：4503-4505。VLP可通过密度梯度离心和/或特征性密度显带来鉴定。或者，可在待检测VLP制剂的玻璃化含水样品上进行冷冻电子显微术并在合适的曝光条件下记录图像。

来源于特定病毒蛋白的“颗粒形成多肽”指能在有利于VLP形成的条件下形成VLP的全长或接近全长的病毒蛋白及其片段，或具有内部缺失的病毒蛋白。因此，多肽可含有全长序列、片段、截短的和部分序列以及该参考分子的类似物和前体形式。因此只要多肽保留形成VLP的能力，该术语可指序列的缺失、添加和取代。由于包被蛋白在病毒分离物之间经常改变，所以该术语包括特定多肽的天然变体。如果蛋白保留形成VLP的能力，则该术语也包括在参考蛋白质中非天然存在的缺失、添加和取代。

优选的取代是在本质上保守性的，即发生在与其侧链相关的氨基酸家族内的取代。具体地说，氨基酸通常分为4个家族：(1)酸性—天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性—赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不荷电的极性(氨基酸)—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时也分类为芳族氨基酸。

术语“HIV多肽”指表现出与天然HIV多肽(例如，Gag、Env、Prot、Pol、RT、Int、vif、vpr、vpu、tat、rev、nef和/或其组合)具有序列同源性和/或是功能性的氨基酸序列。HIV多肽表现出的功能的非限制性例子包括：用作免疫原(例如，产生体液和/或细胞的免疫应答)，用于诊断(例如，与合适的抗体结合用于ELISA或其它免疫测定)和/或表现出一种或多种与野生型或合成HIV多肽相关的生物活性的多肽。例如，本文使用的术语“Gag多肽”可指结合一种或多种抗Gag抗体；引发体液和/或细胞免疫应答和/或表现出形成颗粒能力的多肽。

“抗原”指一种或多种刺激宿主的免疫系统产生体液和/或细胞的抗原特异性应答的表位(线形的、构象的或二者)。该术语与术语“免疫原”可互换使用。B-细胞表位通常含有至少约5个氨基酸，但也可少达约3-4个氨基酸。T-细胞表位，例如CTL表位可含有至少约7-9个氨基酸，辅助T-细胞表位至少约12-20个氨基酸。一种表位通常含有约7-15个氨基酸，例如9、10、12或15个氨基酸。术语“抗原”指两种亚单位抗原(即，从与抗原天然相连的完整生物体分开和离散的抗原)以及杀死的、减毒的或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它微生物。本文使用的抗原定义也可包括抗体，例如抗独特型抗体或其片段与模拟抗原或抗原决定簇的合成肽模拟表位。类似地，在体内表达抗原或抗原决定簇的寡聚核苷酸或多核苷酸，例如在基因治疗或DNA免疫应用中的，也包括在本文抗原的定义内。此外，表达抗原或免疫原的寡聚核苷酸或多核苷酸可由病毒载体递送。

出于本发明的目的，抗原(例如多核苷酸编码抗原和多肽包含抗原)可来源于具有多种亚型、血清型或菌株变异的任何微生物(例如，病毒、细菌、寄生虫、真菌等)。该术语也包括任何各种肿瘤抗原。此外，出于本发明的目的，“抗原”指相比天然序列含有修饰的蛋白质，所述修饰例如缺失、添加和取代(一般本质上是保守的)，前提是该蛋白质保留引发本文定义的免疫应答的能力。这些修饰可是有意为之，例如通过定点诱变，或可是随机的，例如通过产生抗原的宿主的突变。

针对抗原或组合物的“免疫应答”是对象中产生的针对感兴趣组合物中存在的抗原的体液和/或细胞免疫应答。出于本发明的目的，“体液免疫应答”指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及细胞溶解性T-细胞(“CTL”)介导的抗原特异性免疫应答。CTL具有肽抗原特异性，该肽抗原的存在与主要组织相容性复合体(MHC)编码并表达在细胞表面的蛋白质相关。CTL协助诱导和促使胞内微生物的破坏或使受这种微生物感染的细胞裂解。细胞免疫的另一方面涉及辅助T-细胞介导的抗原特异性应答。辅助T-细胞协助刺激功能物对准非特异性效应物细胞的活性，该效应物细胞抗在其表面展示MHC分子相关肽抗原的细胞。“细胞免疫应答”也指细胞因子、趋化因子和其它这种分子的产生，这些分子由激活的T-细胞和/或其它白细胞，包括来源于CD4+和CD8+T-细胞的细胞产生。

引发细胞免疫应答的组合物或疫苗可通过将MHC相关抗原呈递到细胞表面来致敏脊椎动物对象。细胞介导的免疫应答直接位于或接近在其表面呈递抗原的细胞。此外，可产生抗原特异性T-淋巴细胞来进一步保护免疫的宿主。

特定抗原刺激细胞介导的免疫应答的能力可通过许多试验测定，例如通过淋巴增殖(淋巴细胞激活)试验、CTL细胞毒性细胞试验或通过测定对致敏对象中的抗原特异的T-淋巴细胞。这种试验是本领域熟知的。参见，例如Erickson等，J.Immunol.(1993)151：4189-4199；Doe等，Eur.J.Immunol.(1994)24：2369-2376。检测T-细胞介导的免疫应答的最新方法包括检测T-细胞群产生的胞内细胞因子或细胞因子分泌，或通过检测表位特异性T-细胞(例如，通过四聚物技术)(McMichael，A.J.和O′Callaghan，C.A的综述，J.Exp.Med.187(9)1367-1371，1998；Mcheyzer-Williams，M.G.、等，Immunol.Rev.150：5-21，1996；Lalvani，A等，JExp.Med.186：859-865，1997)。

所以，本文使用的免疫应答可是刺激抗体产生的应答(例如，通过与毒素和病原体结合阻断细菌毒素和病原体，如病毒进入细胞和复制的中和抗体，通常是保护细胞免遭感染和破坏)。感兴趣的抗原也可引发CTL的产生。因此，免疫应答可包括以下一种或多种作用：通过B-细胞产生抗体；和/或激活直接特异性针对抗原或存在于感兴趣组合物或疫苗中的抗原的抑制T-细胞和/或记忆细胞和/或效应T-细胞。这些应答可用于中和传染性，和/或介导抗体-补体，或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来为免疫的宿主提供保护。这种应答可使用本领域熟知的标准免疫测定和中和试验来确定。(参见，例如Montefiori等，(1988)J.Clin Microbiol.26：231-235；Dreyer等，(1999)AIDS Res Hum Retroviruses(1999)15(17)：1563-1571)。哺乳动物的先天免疫系统也通过激活Toll样受体和免疫细胞上的类似受体分子来识别并响应于病原生物体的分子特征。先天免疫系统激活后，各种非适应性免疫应答细胞得到激活，例如产生各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子。由先天免疫应答激活的细胞包括单核细胞和浆细胞样谱系(MDC，PDC)的不成熟和成熟树突细胞，以及γ、δ、α和βT细胞和B细胞等。因此，本发明也考虑了涉及先天和适应性应答的免疫应答。

“免疫原性HIV多肽”是当将免疫原性多肽给予实验室测试动物(例如，小鼠、豚鼠、恒河猴、黑猩猩、狒狒等)时，能引发抗一种或多种天然HIV多肽的免疫应答的多肽。

“免疫原性组合物”是含有免疫原性分子的组合物，当将该组合物给予对象可导致在对象中产生针对感兴趣的抗原分子的体液和/或细胞免疫应答。免疫原性组合物可直接引入受体，例如通过注射、吸入、口服、鼻内和粘膜(例如，直肠内或阴道内)给药。

“亚单位疫苗”指包含一种或多种选择的抗原(但不是全部抗原)来源于感兴趣病原体的抗原或与之同源的组合物，所述病原体例如是病毒、细菌、寄生虫或真菌。这种组合物基本上不含完整的病原体细胞或病原性颗粒，或这种细胞或颗粒的裂解物。因此，“亚单位疫苗”可从至少部分纯化(优选基本上纯化的)的病原体的免疫原性多肽或其类似物制备。因此，获得亚单位疫苗中的抗原的方法包括标准纯化技术、重组产生或合成产生。

“基本上纯化的”通常指分离一种物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物)，使得该物质占其所处样品的大多数百分比。样品中基本上纯化的组分通常包含样品的50％、优选80％-85％、更优选90-95％。纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术是本领域熟知的，例如包括离子交换层析、亲和层析和按照密度沉降。

“多核苷酸编码序列”或“编码”选择的多肽的多核苷酸序列是当置于合适的调节序列(或“控制元件”)控制下可在体内转录(就DNA而言)并翻译(就mRNA而言)为多肽的核酸分子。编码序列的边界由起始密码子(例如，在或接近5’末端)和转录终止密码子(例如，在或接近3’末端)决定。编码序列可含有(但不限于)病毒的cDNA、原核生物或真核生物mRNA、病毒的基因组DNA序列或原核生物DNA和甚至合成的DNA序列。示范性编码序列是用于本发明的密码子优化的病毒多肽编码序列。本发明的多核苷酸序列的编码区域可由本领域技术人员鉴定，例如可通过翻译多核苷酸的所有3个框和鉴定对应于所编码多肽的框(例如，本发明合成的nef多核苷酸编码nef衍生的多肽)容易地鉴定。转录终止序列可位于编码序列的3’端。

典型的“控制元件”包括(但不限于)转录调节子，例如启动子、转录增强子元件、转录终止信号和聚腺苷酸化序列；与翻译调节子，例如优化翻译起始的序列，如Shine-Dalgarno(核糖体结合位点)序列、内部核糖体进入位点(IRES)(例如ECMV IRES)、Kozak-型序列(即，例如位于编码序列的5’端用于优化翻译的序列，如位于起始ATG前(5′)的GCCACC)、前导序列、翻译起始密码子(例如，ATG)和翻译终止序列(例如，位于编码序列后(3’)的TAA或优选TAAA)。在某些实施方案中，一种或多种翻译调节或起始序列(例如，前导序列)来源于野生型翻译起始序列，即调节天然状态中编码区域的翻译的序列。使用本文所述方法修饰的野生型前导序列也可用于本发明。启动子包括诱导型启动子(操作性连接于启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、阻抑型启动子(操作性连接于启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)和组成型启动子。

“核酸”分子或“多核苷酸”可含有(但不限于)原核生物序列、真核生物mRNA、真核生物mRNA的cDNA、真核生物(例如，哺乳动物)的基因组DNA序列和甚至合成的DNA序列。该术语也包括含有任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列。在提及本发明的多核苷酸时，在特别述及“DNA”的例子中，应该明白许多这种实施方案同样需要RNA。

“操作性连接”指元件的排列，其中所述成分的配置使得可行使其正常功能。因此，当存在合适的酶时，操作性连接于编码序列的给定启动子能实现编码序列的表达。启动子无需与编码序列毗连，只要其指导该序列表达的作用。因此，例如启动子序列和编码序列之间可存在插入的未翻译但转录的序列，该启动子序列仍认为是“操作性连接”于编码序列。

按照其来源或操作，本文用于描述核酸分子的“重组体”表示基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，所述多核苷酸：(1)不与其天然相连的多核苷酸的全部或部分相连；和/或(2)与除和其天然相连的多核苷酸以外的多核苷酸相连。用于蛋白质或多肽的术语“重组体”指经重组多核苷酸表达产生的多肽。“重组宿主细胞”、“宿主细胞”“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其它表示作为单细胞实体培养的原核微生物或真核细胞系的术语可互换使用，表示可用作或已用作重组载体或其它转移DNA受体的细胞，并且包括感染的原始细胞的后代。由于随机或有意的突变，应该理解的是单一亲代细胞的后代在形态、基因组或总DNA补体上无需与原始亲代完全相同。该定义所指的后代包括由相关特性，例如编码所需肽的核苷酸序列的存在表征为与亲代足够相似的亲代细胞的后代，并且上述术语包括这些后代。

测定氨基酸序列“相似性”的技术是本领域熟知的。总体上，“相似性”表示在适当位置两个或多个多肽的确切的氨基酸对氨基酸比较，所述位置的氨基酸相同或具有相似的化学和/或物理特性，例如荷电或疏水性。然后可确定所比较的多肽序列之间称为“相似性百分比”的术语。测定核酸和氨基酸序列同一性的技术也是本领域熟知的并且包括测定编码氨基酸序列(通常经cDNA中间体)的基因的mRNA的核苷酸序列，测定所编码的氨基酸序列与将其与第二条氨基酸序列比较。总体上，“同一性”指两条多核苷酸或多肽序列各自精确的核苷酸-对-核苷酸或氨基酸-对-氨基酸的对应性。

两条或多条多核苷酸序列可通过测定它们的“同一性百分比”来比较。同样，两条或多条氨基酸序列通过测定它们的“同一性百分比”来比较。无论核酸或肽序列，两条序列的同一性百分比通常描述为两条对比序列之间确切的匹配数除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似对比由Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法提供。使用Dayhoff(“蛋白质序列和结构图谱集”(Atlas of ProteinSequences and Structure)，M.O.Dayhoff编，增刊5.3：353-358，NationalBiomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA)开发、Gribskov(Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986))标准化的评分矩阵可拓展该算法用于肽序列。Genetics Computer Group(Madison，WI)在他们的BestFit实用程序应用软件执行该算法用于核酸和肽序列。该方法的默认参数描述于《威斯康星序列分析软件包程序手册》(Wisconsin Sequence AnalysisPackage Program Manual)，第8版(1995)(来源于Genetics Computer Group，Madison，WI)。其它用于计算序列之间同一性或相似性百分比的合适程序通常是本领域已知的。

例如，特定核苷酸序列与参考序列的同一性百分比可使用默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分的Smith和Waterman同源性算法来确定。本发明内容中建立同一性百分比的另一种方法是使用John F.Collins和ShaneS.Sturrok开发的、爱丁堡大学版权所有、IntelliGenetics，Inc.(MountainView，CA)分销的MPSRCH程序包。这套程序包可使用Smith-Waterman算法，其中计分表使用默认参数(例如，间隔开放罚12分、间隔延伸罚1分、一个间隔罚6分)。产生的“匹配值”数据反映了“序列同一性”。其它计算序列间同一性或相似性百分比的合适程序一般是本领域公知的，例如也可以默认参数使用的对比程序BLAST。例如，在一个优选的实施方案中，可用使用以下核酸检索的默认参数的BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截断值＝60；预期值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50条序列；排序＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR；(ii)多肽检索。这些程序的细节参见以下因特网的网址：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。

例如，可使用Smith-Waterman相似性检索算法(例如，位于网址www.ncbi.nlm.gov，或商业来源，例如TimeLogic Corporation，Crystal Bay，NV)进行蛋白质相似性和同一性百分比序列检索。例如，在一个优选的实施方案中，Smith-Waterman相似性检索可使用以下默认参数，例如权重矩阵＝BLOSUM62.MAA；开放间隔罚分＝-12；延伸间隔罚分＝-2；框架罚分＝0；查询形式＝FASTA/PEARSON；查询类型＝AA；查询检索＝1；查询设置＝CGI_1d82ws301bde.seq；目标类型＝AA；目标设置＝NRPdb gsaa；显著性＝GAPPED；最大评分＝30；最大对比＝20；报道阈值＝评分＝1；对比阈值＝20。

本领域的技术人员可容易地确定用于给定序列的合适检索参数，基于Smith Waterman的示范性优选参数如上所示。例如，检索参数可依所研究的序列而变。因此，就本发明的多核苷酸序列而言，本文公布的多核苷酸序列的长度对选择的数据库进行检索并与基本上相同长度的序列作比较来确定同一性百分比。例如，本发明的一个代表性实施方案包括含有X毗连核苷酸的分离的多核苷酸，其中(i)相对于本文所述的一条或多条序列或其片段的Y毗连核苷酸，X毗连核苷酸具有至少约一个选择的同一性百分比水平，和(ii)出于检索的目的，使X＝Y，其中Y是长度确定的选择的参考多核苷酸(例如，长度从15个核苷酸到选择的全长序列中存在的核苷酸数目)。

本发明的序列可包括序列的片段，例如约15个核苷酸到本文所述全长序列中存在的核苷酸数目，包括上述范围内的所有整数值。例如，本发明多核苷酸序列的片段可为30-60个核苷酸、60-10个核苷酸、120-240个核苷酸、240-480个核苷酸、480-1000个核苷酸，和在其间的所有整数值。

当本发明的序列用作对，例如序列数据库的检索序列时，本文所述合成的多核苷酸包括与本文公布的合成的多核苷酸序列具有约80％-100％、大于80-85％、优选大于90-92％、更优选大于95％、最优选大于98％到100％序列同一性(包括所述范围内的所有整数值)的相关多核苷酸序列。

两个核酸片段被认为进行本文所述的“选择性杂交”。两个核酸分子之间的序列同一性的程度影响这种分子之间杂交的效率和强度。部分相同的核酸序列至少可部分抑制完全相同的序列与靶分子的杂交。对完全相同的序列杂交的抑制可使用本领域熟知的杂交试验(例如，Southern印迹、Northern印迹、溶液杂交等，或者参见Sambrook等，同上或Ausubel等，同上)来评估。这种试验可使用各种选择性程度来进行，例如使用从低到高的严谨性条件。如果使用低严谨性条件，可使用二级探针来评估非特异性结合的缺乏，该探针缺乏甚至是部分程度的序列同一性(例如，与靶分子具有小于约30％序列同一性的探针)，以致无非特异性结合时，二级探针不与靶杂交。

当使用基于杂交的检测系统时，选择与靶核酸序列互补的核酸探针，然后通过选择合适的条件使探针与靶序列互相“选择性杂交”或结合以形成杂交分子。能在“中等严谨性”条件下与靶序列选择性杂交的核酸分子通常在可检测靶核酸序列的条件下杂交，该靶核酸序列至少约10-14个核苷酸长，与选择的核酸探针具有至少约70％的序列同一性。严谨性杂交条件通常可检测至少约10-14个核苷酸长，与选择的核酸探针的序列具有大于约90-95％序列同一性的靶核酸序列。如本领域已知的，可确定用于探针/靶(序列)杂交的杂交条件，其中探针和靶具有一定程度的序列同一性(参见，例如《核酸杂交：一种实用方法》(Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach)，B.D.Hames和S.J.Higgins编，(1985)Oxford；Washington，D C；IRL Press)。

就杂交的严谨性条件而言，本领域熟知利用许多等价条件通过改变，例如以下因素来建立特定的严谨性：探针和靶序列的长度与性质、各种序列的碱基组成、盐和其它杂交溶液成分的浓度、在杂交溶液中存在或不存在阻断剂(例如，甲酰胺、葡聚糖硫酸酯和聚乙二醇)、杂交反应温度和时间参数以及不同的洗涤条件。按照以下的本领域标准方法选择特定杂交条件(参见，例如Sambrook等，同上或Ausubel等，同上)。

如果第一多核苷酸具有与第二多核苷酸的一个区域、其cDNA、其补体相同的碱基对序列，或者如果第一多核苷酸与第二多核苷酸的一个区域、其cDNA、其补体表现出实质性序列同一性，其中序列同一性如上述确定，则第一多核苷酸“衍生自”第二多核苷酸。实质性的序列同一性通常约90％或更大，优选约95％或更大，更优选约98％或更大。

如果第一多肽由衍生自第二多核苷酸的第一多核苷酸编码，或者第一多肽具有与第二多肽或其部分相同的氨基酸序列，或者第一多肽与第二多肽或其部分表现出上述确定的实质性的序列同一性，则第一多肽“衍生自”第二多肽。实质性的序列同一性通常约90％或更大，优选约95％或更大，更优选约98％或更大。

总体上，如果一个病毒多肽(i)由某病毒的一个多核苷酸(病毒多核苷酸)的相同开放读框编码，或者(ii)与上述该病毒的一个肽表现出实质性的序列同一性，则这个病毒多肽“衍生自”该病毒的特定多肽(病毒多肽)。

如果一个多肽衍生自HIV亚型成员中的多肽，衍生自该亚型成员中的多核苷酸编码的多肽，由该亚型成员中的多核苷酸衍生而来的多核苷酸编码，或者衍生自由该亚型成员中的多核苷酸衍生而来的多核苷酸编码的多肽，则该多肽“衍生自”该HIV亚型。

如果一条多肽衍生自HIV毒株成员中的多肽，衍生自该毒株成员中的多核苷酸编码的多肽，由该毒株成员中的多核苷酸衍生而来的多核苷酸编码，或者衍生自由该毒株成员中的多核苷酸衍生而来的多核苷酸编码的多肽，则该多肽“衍生自”该HIV毒株。

“类似多肽”指由来自不同多核苷酸来源的同一生物体的同一基因编码的多肽，或衍生自由它们编码的多肽。在本发明内容中，不同的多核苷酸来源可是不同的亚型、不同的血清型或不同的毒株。因此，例如B亚型HIV的Gag多肽或许是亚型C HIV的Gag多肽的类似多肽，或者来源于第一HIV-1亚型、血清型或毒株的包被多肽是来源于第二HIV-1亚型、血清型或毒株的包被多肽的类似多肽。可来源于不同HIV-1亚型或毒株的类似多肽类型的例子包括均被认为是类似多肽的包被多肽gp41、gp120、gp140和gp160。此外，这种类似多肽的每一种可含有不同的改变或突变，例如来源于HIV-1包被基因的类似多肽包括(但不限于)：gp41多肽、gp120多肽、gp140多肽、gp160多肽、缺失V1环一部分的gp140、缺失V2环一部分的gap140多肽、缺失V3环一部分的gap140多肽、具有突变的蛋白酶切割位点的gp140多肽、缺失V1环一部分的gp160、缺失V2环一部分的gp160多肽、缺失V3环一部分的gp160多肽和具有突变的蛋白酶切割位点的gp160多肽。

本发明内容中使用的“基因”是与遗传功能相关的遗传核酸(病毒基因组、染色体、质粒等)中的核苷酸序列。基因是在生物体的基因组中占据特定物理位置(“基因座”或“遗传座”)的遗传单位，例如一种含有多核苷酸序列(如，HIV-1的RNA序列或原病毒HIV-1的DNA序列)的生物体。基因可编码所表达的产物，例如多肽或多核苷酸(如，tRNA)。或者，基因可限定用于特定情况/功能的基因组位置，例如蛋白质和/或核酸(例如，5’LTR)的结合，其中基因不编码表达的产物。HIV-1基因的例子包括(但不限于)：Gag、Env、Pol(prot、RNA酶、Int)、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu。基因可含有编码序列，例如多肽编码序列，与非编码序列，例如启动子序列、聚腺苷酸化序列、转录调节序列(如增强子序列)。许多真核生物基因具有被“内含子”间断的“外显子”(编码序列)。在某些情况中，一种基因可与另一基因分享序列(例如，重叠基因)。应该注意到在常见的群体中，野生型基因可含有多种普遍的形式，这些普遍的形式在互相有关的序列中具有改变。这些变异称为“多态性”或“等位变异”。

“纯化的多核苷酸”指基本上不含该多核苷酸天然相连的蛋白质的感兴趣多肽或其片段，例如含有少于约50％、优选少于约70％、更优选少于约90％的天然相连的蛋白质。纯化感兴趣的多肽的技术是本领域熟知的，包括例如用破膜试剂破坏含有多核苷酸的细胞并通过离子交换层析、亲和层析和依密度沉降分离多核苷酸和蛋白质。

“核酸免疫”指为了体内表达抗原、多种抗原、表位或多种表位而将编码一种或多种选择的抗原的核酸分子引入宿主细胞。核酸分子可直接引入对象，例如通过注射、吸入、口服、鼻内和粘膜施用等；或者可离体引入取自宿主的细胞。后一种情况中，转化的细胞再次引入对象从而在那里引发抗核酸分子编码的抗原的免疫应答。

“基因转移”或“基因递送”指可靠地将感兴趣的核酸(即，DNA或RNA)插入宿主细胞的方法或系统。这种方法可导致非整合转移的DNA的瞬时表达、转移的复制子(例如，附加体)的染色体外复制和表达。或转移的遗传物质整合入宿主细胞的基因组DNA。基因递送表达载体包括(但不限于)来源于以下病毒的载体：腺病毒、腺伴随病毒、甲病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、水疱病毒和牛痘病毒。当用于免疫时，这种基因递送表达载体可称为疫苗或疫苗载体。

术语“转染”用来指细胞摄入外来DNA。当外源性DNA引入细胞膜内，则该细胞被“转染”。许多转染技术是本领域公知的。参见，例如Graham等，(1973)Virology，52：456；Sambrook等，(1989)《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，a laboratory manual)，冷泉港实验室，纽约；Davis等，(1986)“分子生物学基础方法”(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevier和Chu等，(1981)Geng 13：197。这种技术可用于将一种或多种外源性DNA部分引入合适的宿主细胞。该术语指稳定的与瞬时的摄入遗传物质，并且包括摄入肽或抗体连接的DNA。

“载体”能转移基因序列至靶细胞(例如，病毒载体、非病毒载体、颗粒载体和脂质体)。“载体构建物”、“表达载体”和“基因转移载体”指能引导感兴趣的基因表达并可用于将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建物。因此，该术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。

“慢病毒载体”和“重组慢病毒载体”指携带并且在某些实施方案中能引导感兴趣的核酸分子表达的核酸构建物。慢病毒载体含有至少一个转录启动子/增强子或基因座定义元件，或通过其它方式，例如交替剪接、核RNA输出、信使的转录后修饰或蛋白质的转录后修饰来控制基因表达的其它元件。这种载体构建物也必须含有包装信号，长末端重复序列(LTRS)或其部分，适合于所用逆转录病毒的正链和负链引物结合位点(如果这些在逆转录病毒载体中已不存在)。重组慢病毒载体也可任选含有引导聚腺苷酸化、选择标记(例如Neo、TK、潮霉素、腐草霉素、组氨醇或DHFR)以及一个或多个限制性位点和翻译终止序列的信号。例如，这种载体通常含有5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链RNA合成的起点和3′LTR或其部分。

本发明使用的“慢病毒载体颗粒”指携带至少一种感兴趣基因的慢病毒。逆转录病毒也可含有选择标记。重组慢病毒能将其遗传物质(RNA)逆转录为DNA并在感染时将该遗传物质掺入宿主细胞的DNA。慢病毒载体颗粒可具有慢病毒包膜、非慢病毒包膜(例如，ampho或VSV-G包膜)或嵌合包膜。

“甲病毒载体”、“重组甲病毒载体”和“甲病毒复制子载体”指携带在某些实施方案中能引导感兴趣的核酸分子表达的核酸构建物。甲病毒载体含有至少一个转录启动子/增强子或通过其它方式，例如交替剪接、核RNA输出、信使的转录后修饰或蛋白质的转录后修饰来控制基因表达的其它元件。这种载体构建物也必须含有包装信号和甲病毒复制识别序列。重组甲型病毒载体也可任选含有引导聚腺苷酸化、选择标记(例如Neo、TK、潮霉素、腐草霉素、组氨醇或DHFR)以及一个或多个限制性位点和翻译终止序列的信号。甲病毒载体通常含有甲病毒非结构蛋白的编码序列、包装位点、复制识别序列和能引导感兴趣的核酸分子表达的序列。

“表达盒”指能引导感兴趣的序列或基因表达的组件。表达盒通常含有操作性连接于感兴趣的多核苷酸或基因的启动子。也可有其它控制元件。本文所述的表达盒可包含于质粒构建物中。除了表达盒的组分以外，质粒构建物也可含有细菌的复制起点、一个或多个选择标记、允许质粒构建物以单链DNA存在的信号(例如，M13的复制起点)、多克隆位点和“哺乳动物”的复制起点(例如，SV40或腺病毒的复制起点)。

“包装细胞”指含有生产感染性重组病毒载体所需的元件，但缺少重组病毒载体的细胞。这种包装细胞通常含有能表达引入载体的复制和包装所需蛋白质的一个或多个表达盒，例如就慢病毒载体而言，表达盒编码Gag、pol和env蛋白，就甲病毒载体而言，表达盒编码甲病毒结构蛋白。

“产生细胞”或“载体生产细胞”指含有产生重组病毒载体颗粒所需的所有元件的细胞。

将“自杀基因”(例如，药物敏感性基因)转移至靶细胞使得该细胞对相对正常细胞无毒的化合物或组合物敏感。Moolten，F.L.(1994)Cancer Gene Ther.1：279-287。自杀基因的例子是单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)、细胞色素P450(Manome等，(1996)Gene Therapy 3：513-520)、人脱氧胞苷激酶(Manome等，(1996)Nature Medicine 2(5)：567-573)和细菌酶胞嘧啶脱氨酶(Dong等，(1996)Human Gene Therapy 7：713-720)。表达这些基因的细胞被赋予对相对无毒前体药物的作用的敏感性，所述物质有：更昔洛韦(HSV-tk)、环磷酰胺(细胞色素P4502B1)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(人脱氧胞苷激酶)或5-氟胞苷(细菌胞嘧啶脱氨酶)。Culver等，(1992)Science 256：1550-1552；Huber等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8302-8306。

“选择标记”或“报道标记”指包含于基因转移载体中，无治疗活性的核苷酸序列，而是含有这些标记更便于制备、生产、鉴定或测试基因转移载体。

“特异性结合剂”指一对特异性结合分子的一员，其中一个分子通过化学和/或物理方式特异地结合第二个分子。特异性结合剂的一个例子是直接抗选择的抗原的抗体。

“对象”指脊索动物亚门的任一成员，包括(不限于)人和其它灵长类，包括非人灵长类，如狒狒、恒河猴、黑猩猩和其它猿类和猴类；农畜，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验室动物，如小鼠、大鼠、兔和豚鼠；鸟，包括家养、野生和狩猎野禽，如鸡、火鸡和其它家禽，鸭、鹅等。该术语不指明具体的年龄。所以，包括了成年的和新生的个体。由于所有这些脊椎动物的免疫系统相似地操作，上述系统可用于以上任一种脊椎动物种类。

“亚型”指基于遗传水平(即，核酸序列)的相似性将类似的生物体系统发生分类成组。这种组称为“亚型”。在HIV领域中，Los Alamos国家实验室是确定具体病毒分离物的这种类似性和分类成亚型的著名且广为接受的中心组织。本文所指的HIV亚型由Los Alamos国家实验室确定。(参见，例如Myers等，Los Alamos数据库，Los Alamos国家实验室，Los Alamos，新墨西哥；Myers等，“人逆转录病毒与艾滋病”(Human Retroviruses andAids)，1990，Los Alamos，新墨西哥：Los Alamos国家实验室)。一种亚型也可称为一种“进化支”。

“血清型”指基于抗体交叉反应性的类似生物体的分类。

“菌株”指基于核酸序列的差异来自该亚型中但分化自同一亚型的其它成员的生物体。

“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”指非生物的或其它不理想的材料，即材料可以制剂或组合物给予个体而不会导致任何不理想的生物学效应或以有害的方式与该组合物所含的任何组分相互作用。

“生理pH”或“生理范围内的pH”指约7.0-8.0范围的pH(包括端点)，更常见的是约7.2-7.6的范围(包括端点)。

本文使用的“治疗”指以下任一种情况：(i)以常规疫苗的形式来预防感染或再次感染，(ii)缓解或消除症状，或(iii)基本上或完全消除可疑的病原体。治疗可是预防性(感染前)或治疗性(感染后)地施行。

“共同给药”指给予多种组合物、组合物的组分或分子。因此，共同给药包括经同一或不同给药途径同时给予或依次给予。共同给药方案的非限制性例子包括核酸和多肽的共同给药；不同核酸的共同给药(例如，本文所述的不同表达盒和/或不同的基于递送载体)；和不同多肽的共同给药(例如，不同HIV多肽和/或不同的佐剂)。该术语也包括共同给予的分子或组合物中的一种的多次给药(例如，多次给予一种或多种本文所述的表达盒，然后一次或多次给予含有多肽的组合物)。当分子或组合物依次递送时，本领域的技术人员根据本文的指导可容易地确定每次给药之间的时间。

“T淋巴细胞”或“T细胞”是不产生抗体的淋巴细胞，该细胞构成免疫系统的细胞介导臂的一部分。T细胞来源于从骨髓迁移至胸腺的不成熟的淋巴细胞，在那里该不成熟的淋巴细胞在胸腺激素的引导下经历成熟过程。成熟的淋巴细胞在胸腺中快速大量分裂。基于其识别和结合特异性抗原的能力，成熟的T细胞成为免疫活性的。但抗原与淋巴细胞表面受体结合时触发免疫活性T细胞的激活。

2.0.0  实施本发明的方式

在详细描述本发明之前，应该理解的是本发明不受具体制剂或方法参数的限制，因为这些参数当然是可变的。也应该理解的是，本文使用的术语仅是出于说明本发明的具体实施方案并非限制性的。

虽然许多类似的或等价于本文所述的方法和材料可用于实践本发明，但本文所述的方法和材料最佳。

2.1.0  发明概述

本发明涉及使用包含免疫原性多核苷酸和多肽的组合物在对象中产生免疫应答的组合方法。

在本发明一个总的方面，本发明的多核苷酸组分基本上由一种编码来源于一种微生物(例如，病毒、细菌、真菌等)的免疫原性多肽的多核苷酸组分和多肽组分组成，该多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的免疫原性多肽，前提是该多肽组分的至少一种免疫原性多肽所衍生自微生物的亚型、血清型或菌株不同于该多核苷酸组分编码的免疫原性多肽的编码序列。在本文中，基本上由编码免疫原性多肽的一种多核苷酸组成的多核苷酸组分指在组合物中存在一种编码免疫原性多肽的多核苷酸。该多核苷酸组合物可含有其它组分，例如免疫增强子、免疫调节组分、载体序列(例如，病毒的或非病毒的)、运载体、颗粒、赋形剂、表达控制序列等。此外，多核苷酸组分可含有其它组分，例如增强免疫应答的分子(如，脂质体、PLG、颗粒、明矾等)。此外，多肽组分可含有其它组分，例如免疫增强剂、免疫调节组分、佐剂、运载体、颗粒、赋形剂等。在该组合物的其它实施方案中，多核苷酸组分不编码来源于除第一亚型以外任何亚型的类似HIV免疫原性多肽，多肽组分不含有来源于除第一亚型以外任何亚型的类似HIV免疫原性多肽。

在本发明第二个总的方面，多核苷酸组分含有两种或多种多核苷酸序列，该序列含有两种或多种来源于一种微生物(例如，病毒、细菌、真菌等)的类似免疫原性多肽的编码序列，其中该免疫原性多肽中至少两种的编码序列来源于该微生物的不同亚型、血清型或菌株，多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的免疫原性多肽，前提是(i)如果该多肽组分提供少于该多核苷酸组分编码的类似免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的免疫原性多肽可来源于与该多核苷酸组分提供的免疫原性多肽相同和/或不同的亚型、血清型或菌株，或(ii)如果该多肽组分提供相同或大于该多核苷酸组分编码的类似免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的免疫原性多肽可来源于至少一种与该多核苷酸组分提供的免疫原性多肽不同的亚型、血清型或菌株。多核苷酸组合物可含有其它组分，例如免疫增强子、免疫调节组分、载体序列(例如，病毒的或非病毒的)、运载体、颗粒、赋形剂、表达控制序列等。此外，多核苷酸组分可含有其它组分，例如增强免疫应答的分子(如，脂质体、PLG、颗粒、明矾等)。此外，多肽组分可含有其它组分，例如免疫增强剂、免疫调节组分、佐剂、运载体、颗粒、赋形剂等。

本文参考人免疫缺陷病毒1(HIV-1)来举例说明本发明。根据说明书的指导，本领域的普通技术人员可将本发明的指导应用于其它合适的生物体，例如微生物。例如，本发明的组合物和方法可利用编码HIV包膜多肽的多核苷酸以及HIV包膜多肽(如，类似于该多核苷酸编码的HIV包膜蛋白)来诱导广泛和/或强烈的抗各种HIV毒株的中和活性。虽然参考HIV病毒进行了描述，本发明的组合物和方法可应用于具有各种亚型、血清型和/或毒株变异的其它病毒科，例如包括(但不限于)其它非-HIV逆转录病毒(如HTLV-1，2)、嗜肝DNA病毒(如HBV)、疱疹病毒(如HSV-1、2、CMV、EBV、水痘带状疱疹病毒等)、黄病毒(如HCV、黄热、蜱传性脑炎、圣路易斯脑炎、西尼罗河病毒等)、冠状病毒(如SARS)、副粘病毒(如PIV、RSV、麻疹病毒等)、流感病毒、细小RNA病毒、呼肠孤病毒(如轮状病毒)、沙粒病毒、弹状病毒、乳多空病毒、细小病毒、腺病毒、等革热病毒、布尼亚病毒(如汉坦病毒)、杯状病毒(如诺沃克病毒)、丝状病毒(如埃博拉病毒、马尔堡病毒)。

HIV病毒的多样性和可突变性是对HIV疫苗开发的挑战。HIV持续在全球蔓延，高达4千2百万的人受HIV感染(“UNAIDS有关全球HIV/AIDS流行的报道”(UNAIDS Report on the global HIV/AIDS epidemic)，UNAIDS，日内瓦，瑞士(2002年12月))。这些人受到不同的HIV亚型(和/或毒株)感染。感染性HIV亚型(和/或毒株)通常是地域依赖性的。本发明一方面涉及提供能诱导广泛且强烈的抗各种HIV亚型、血清型和/或毒株的中和抗体来治疗感染、降低感染风险、减少传播、减少疾病的表现和/或预防不同地区出现的HIV感染的组合物和方法。

所进行的支持本发明的实验证实了本文所述组合方法诱导强烈而广泛HIV中和活性的用途。这些方法包括联合用各种编码来源于不同亚型、血清型或毒株的HIV多肽的多核苷酸来免疫和用来源于不同亚型、血清型或毒株的HIV多肽来免疫。本发明还包括用这种多核苷酸和多肽的各种剂量和免疫方案来免疫。

因此，在本发明的第一具体方面，本发明的多核苷酸组分基本上由一种编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸和多肽组分组成，该多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的免疫原性多肽，前提是该多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽所衍生自的亚型、血清型或菌株不同于该多核苷酸组分编码的免疫原性多肽的编码序列。在本文中，“基本上由...组成“指在多核苷酸组合物中存在一种编码一种HIV免疫原性多肽的多核苷酸序列。该多核苷酸组合物可含有其它组分，例如免疫增强子、免疫调节组分、载体序列(例如，病毒的或非病毒的)、运载体、颗粒、赋形剂、表达控制序列等。在本发明的一个实施方案中，该多核苷酸组分编码的HIV免疫原性多肽来源于亚型B，该多肽组分的至少一种编码HIV免疫原性多肽的序列来源于亚型C。在另一个实施方案中，该多核苷酸组分编码的HIV免疫原性多肽来源于第一亚型的第一毒株(例如，第一亚型B毒株)，该多肽组分的至少一种编码HIV免疫原性多肽的序列来源于第一亚型的第二毒株(例如，第二亚型B毒株)。

在一个实施方案中，来源于不同HIV亚型、血清型或毒株的多核苷酸和多肽用于引发和加强，即编码免疫原性HIV多肽的多核苷酸经多核苷酸递送用于免疫(例如，引发)，来源于不同HIV亚型、血清型或毒株的类似的免疫原性HIV多肽用于免疫(例如，加强)。例如，一种多核苷酸分子用于核酸免疫，其中该多核苷酸分子编码一种HIV gp140包膜多肽，该多肽(i)来源于南非HIV亚型C分离物/毒株，(ii)为在哺乳动物细胞中表达而优化的密码子，和(iii)通过删除V2环而突变的(例如，PCT国际公布号WO/02/04493的实施例所述的gp140mod.TV1.delV2)。该核酸免疫之后使用一种HIV gp140包膜蛋白进行蛋白质加强免疫，该蛋白(i)来源于北美HIV亚型B分离物/毒株，和(ii)通过删除V2环而突变的(例如，PCT国际公布号WO/00/39302的实施例所述的gp140mut7.modSF 162.delV2的蛋白质产物)。可使用寡聚形式的包膜蛋白(例如，PCT国际公布号WO/00/39302和美国专利号6,602,705中所述的o-gp140)。本发明在该方面的一个实施方案含有用于在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，该组合物包含：含有编码第一HIV免疫原性多肽的第一多核苷酸的多核苷酸组分；和含有第二HIV免疫原性多肽的多肽组分，其中所述第一和第二免疫原性HIV多肽来源于不同的HIV亚型、血清型或毒株，和(ii)所述第一和第二免疫原性多肽编码类似的HIV多肽。在本发明的一个实施方案中，含有多核苷酸组合物的类似的HIV免疫原性多肽编码序列与含有本发明多肽组分的HIV免疫原性多肽可来源于HIV的不同亚型，在另一个实施方案中，它们可来源于同一HIV亚型的不同HIV毒株。本发明在这方面的另一个实施方案中，本发明的多核苷酸和多肽组分用于广泛地产生抗用CCR5共同受体进入细胞的病毒毒株的中和抗体。例如，用于在哺乳动物中产生中和抗体的组合物可含有基本上由一种编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸组成的多核苷酸组分，该免疫原性多肽来源于使用CCR5共同受体进入细胞的HIV毒株；和含有一种或多种HIV免疫原性多肽的多肽组分，该免疫原性多肽来源于使用CCR5共同受体进入细胞的HIV毒株且类似于所述多核苷酸组分编码的多肽；前提是(i)如果该多肽组分仅有一种HIV免疫原性多肽，则该多肽组分的HIV免疫原性多肽的编码序列来源于不同于该多核苷酸组分编码的免疫原性多肽的编码序列的HIV毒株，该毒株用CCR5共同受体进入细胞，或(ii)如果该多肽组分含有多种HIV免疫原性多肽，则该多肽组分的多肽的编码序列来源于多种用CCR5共同受体进入细胞的HIV毒株。

在本发明的第二个具体方面，多核苷酸组分含有两种或多种多核苷酸序列，这些序列含有两种或多种类似的HIV免疫原性多肽的编码序列，其中该HIV免疫原性多肽的至少两种的编码序列来源于不同的HIV亚型、血清型或毒株，该多肽组分含有一种或多种类似于所述多核苷酸组分编码的多肽的HIV免疫原性多肽，前提是(i)如果该多肽组分提供少于该多核苷酸组分编码的类似HIV免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的HIV免疫原性多肽可来源于与该多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽相同和/或不同的亚型、血清型或毒株，或(ii)如果该多肽组分提供相同或大于该多核苷酸组分编码的类似HIV免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的HIV免疫原性多肽中的至少一种来源于与该多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV亚型、血清型或毒株。

在本发明的一个实施方案中，混合编码免疫原性HIV多肽的、来源于至少两种不同亚型、血清型或毒株的两种或多种多核苷酸(例如，以等量)用于引发。然后，来源于用于引发的亚型、血清型或毒株之一的单一、类似的免疫原性HIV多肽用于加强免疫。更常见的实施方案包括用于在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，所述组合物包含：含有两种或多种多核苷酸的多核苷酸组分，其中每种多核苷酸编码类似的HIV免疫原性多肽，前提是每种HIV免疫原性多肽的编码序列来源于不同的HIV亚型、血清型或毒株；和含有一种或多种HIV免疫原性多肽的多肽组分，前提是所述多肽组分含有的HIV免疫原性多肽比所述多核苷酸组分编码的至少少一种。例如，两种DNA分子用于核酸免疫，其中第一DNA分子编码一种HIV gp140包膜多肽，该多肽(i)来源于南非HIV亚型C分离物/毒株，(ii)为在哺乳动物细胞中表达而优化的密码子，和(iii)通过删除V2环而突变的(例如，PCT国际公布号WO/02/04493的实施例所述的gp140mod.TV1.delV2)，第二DNA分子编码一种HIV gp140包膜蛋白，该蛋白(i)来源于北美HIV亚型B分离物，(ii)为在哺乳动物细胞中表达而优化的密码子，和(iii)通过删除V2环而突变的(例如，PCT国际公布号WO/00/39302的实施例所述的gp140.modSF162.delV2)。该DNA免疫之后使用一种单一的HIV gp140包膜多肽进行蛋白质加强免疫，该多肽(i)来源于北美HIV亚型B分离物，和(ii)通过删除V2环而突变的(例如，PCT国际公布号WO/00/39302的实施例所述的gp140mut7.modSF162.delV2的蛋白质产物)。可使用寡聚形式的包膜蛋白(例如，PCT国际公布号WO/00/39302中所述的o-gp140)。用于在哺乳动物中产生免疫应答的组合物的一个实施方案包括：含有编码第一免疫原性HIV多肽的第一多核苷酸和编码第二免疫原性HIV多肽的第二多核苷酸的多核苷酸组分，其中(i)所述第一和第二免疫原性HIV多肽来源于不同的HIV亚型、血清型或毒株，和(ii)所述第一和第二免疫原性多肽编码类似的HIV多肽；和含有所述第一HIV免疫原性多肽或所述第二HIV免疫原性多肽的多肽组分，前提是所述多肽组分含有的HIV免疫原性多肽比所述多核苷酸组分编码的至少少一种。在一个优选实施方案中，编码来源于各种不同的HIV亚型、血清型或毒株的类似免疫原性HIV多肽的多核苷酸用于引发免疫，使用一种单一类似的免疫原性HIV多肽进行一次或多次加强免疫。

在另一个实施方案中，混合编码免疫原性HIV多肽的、来源于至少两种不同亚型、血清型或毒株的两种或多种多核苷酸(例如，以等量)用于引发。然后，来源于至少两种不同亚型、血清型或毒株的一种或多种类似的免疫原性HIV多肽用于加强免疫，其中至少一种该免疫原性HIV多肽来源于在该多核苷酸组分中没有显示的亚型、血清型或毒株。例如，该多核苷酸组分含有编码3种免疫原性HIV多肽的3种多核苷酸，一种编码序列来源于亚型B毒株，一种来源于亚型C毒株，一种来源于亚型E毒株；该多肽组分含有3种免疫原性HIV多肽，一种编码序列来源于亚型B毒株，一种编码序列来源于亚型C毒株，一种编码序列来源于亚型O毒株。本发明在这方面的另一个实施方案中，该多核苷酸组分的多核苷酸含有编码类似的HIV免疫原性多肽的多核苷酸，所述免疫原性多肽来自不同于该多肽组分的多肽的亚型、血清型或毒株。例如，用两种或多种编码HIV gp140多肽的DNA分子(其中两种或多种gp140编码序列来源于两种或多种HIV-1亚型、血清型或毒株)进行DNA免疫。用于蛋白免疫的多肽组分含有两种或多种gp140多肽(其中两种或多种gp140编码序列来源于两种或多种HIV-1亚型、血清型或毒株，前提是该多肽序列的至少一种来源于DNA组分中没有显示的HIV-1亚型、血清型或毒株)。

在另一个实施方案中，多核苷酸组分含有两种或多种多核苷酸序列，这些序列含有两种或多种类似HIV免疫原性多肽的编码序列，其中至少两种该HIV免疫原性多肽的编码序列来源于用CCR5共同受体进入细胞的不同HIV毒株，多肽组分含有一种或多种类似于所述多核苷酸组分编码的多肽的HIV免疫原性多肽，前提是(i)如果该多肽组分提供的多肽少于该多核苷酸组分所编码的类似HIV免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的HIV免疫原性多肽可来源于与该多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽相同和/或不同的、用CCR5共同受体进入细胞的HIV毒株，或(ii)如果该多肽组分提供相同或大于该多核苷酸组分所编码的类似HIV免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的HIV免疫原性多肽中的至少一种来源于与该多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽不同的、用CCR5共同受体进入细胞的HIV毒株。

另一方面，本发明还涉及各种剂量的多核苷酸和多肽在引发/加强免疫方法，特别是本文所述方法中的用途。在任何免疫方法中，例如使用混合的多核苷酸引发(即，两种或多种编码来源于两种或多种HIV亚型、血清型或毒株的免疫原性HIV多肽的多核苷酸)结合多肽加强的方法，本发明包括使用剂量降低的每种单一组分以提供与使用全剂量的每种组分相等的免疫应答。在一个实施方案中，DNA的高阈值是DNA的最大可耐受剂量(例如，约5-10mg总DNA)，DNA的低阈值是最低有效剂量(例如，约2-10μg的总DNA)，蛋白质的高阈值是蛋白质的最大可耐受剂量(例如，约1mg总蛋白)，蛋白质的低阈值是最低有效剂量(例如，约2μg总蛋白)。所进行的支持本发明的实验证实总DNA剂量可在多核苷酸组分的多核苷酸中分配(例如，就使用4个多核苷酸构建物而言，所有4个的总DNA小于或等于高阈值)(例如，实施例4)。此外，总多肽剂量可在含有多肽组分的多肽中分配(例如，就使用4个多肽构建物而言，所有4个的总蛋白质小于或等于高阈值)(例如，实施例4)。总的DNA和总的蛋白质通常均高于低阈值。

在一个优选的实施方案中，一给定的DNA免疫中DNA的总量具有小于或等于约10mg总DNA和大于或等于1mg总DNA的高阈值，一给定的多肽加强免疫中蛋白质的总量具有小于或等于约200μg的总蛋白产物和大于或等于10μg的总蛋白的高阈值。例如，在使用多核苷酸组分的实施方案中，该组分具有两种DNA分子，各自编码一种免疫原性HIV多肽，每位对象的每种DNA分子的剂量可是：就两种DNA分子的总量是2mg而言，编码免疫原性HIV多肽的每种DNA分子是1毫克，或者就两种DNA分子的总量是1mg而言，编码免疫原性HIV多肽的每种DNA分子是0.5毫克。使用多肽组分的剂量也可类似地变化，例如，使用具有两种免疫原性HIV多肽的多肽组分，每位对象的每种多肽剂量可是：就两种多肽的总量是200μg而言，每种免疫原性HIV多肽是100微克，就两种多肽的总量是100μg而言，每种免疫原性HIV多肽是50微克，或者就两种多肽的总量是50μg而言，每种免疫原性HIV多肽是25微克。如上所述，两种以上的多肽可包含于本发明的多肽组分中。

本发明在这方面的一个实施方案中，多核苷酸组分的多核苷酸编码来自与该多肽组分的多肽同一亚型、血清型或毒株的类似HIV免疫原性多肽。例如，两种DNA分子用于核酸免疫，其中第一DNA分子编码一种HIV gp140包膜多肽，该多肽(i)来源于南非HIV C亚型分离物，(ii)为在哺乳动物细胞中表达而优化的密码子，(iii)通过删除V2环而突变的(例如，PCT国际公布号WO/02/04493的实施例所述的gp140mod.TV1.delV2)，和(iv)以0.5mg递送，第二DNA分子编码一种HIV gp140包膜多肽，该多肽(i)来源于北美HIV亚型B分离物，(ii)为在哺乳动物细胞中表达而优化的密码子，和(iii)通过删除V2环而突变的(例如，PCT国际公布号WO/00/39302的实施例所述的gp140.modSF162.delV2)，和(iv)以0.5mg递送。该DNA免疫之后使用一种HIVgp140包膜多肽和另一种HIV gp140包膜多肽进行蛋白质加强免疫，前者是(i)来源于南非HIV亚型C分离物，(ii)通过删除V2环而突变的(例如，PCT国际公布号WO/02/04493的实施例所述的gp140mod.TV1.mut7.delV2的蛋白质产物)，和(iii)以50μg蛋白递送，后者是(i)来源于北美HIV亚型B分离物，(ii)通过删除V2环而突变的(例如，PCT国际公布号WO/00/39302的实施例所述的gp140.mut7.modSF162.delV2的蛋白质产物)，和(iii)以50μg蛋白递送。此外，可使用寡聚形式的包膜蛋白(例如，PCT国际公布号WO/00/39302中所述的o-gp140)。

在其它实施方案中，本发明的多核苷酸组分可含有一种或多种基因递送载体，这些载体含有编码免疫原性HIV多肽的多核苷酸。本文描述了可包含于多核苷酸组分中的其它组分。除了免疫原性多肽之外，本发明的多肽组分可含有佐剂。本文描述了可包含于多肽组分中的其它组分。

本发明也包括在对象中产生免疫应答的方法。该方法总的方面包括给予对象以提供免疫原性多肽的第一组分和给予对象以提供不同但类似的免疫原性多肽的第二组分。第一组分和第二组分可是多核苷酸组分或多肽组分。免疫原性多肽可直接提供(以多肽组分的形式)或间接提供(以多核苷酸组分的形式)。在一个优选的实施方案中，一种组分(第一或第二组分)是多核苷酸组分，而另一组分(第一或第二组分)是多肽组分。第一或第二组分提供的多肽免疫原优选是类似的HIV免疫原性多肽。第一和第二组分可同时给予或可在不同的时间给予。第一和第二组分优选用引发-加强方案给予。各种引发-加强方案已在本领域描述并且为普通技术人员所熟知。在一个典型的引发-加强方案中，将提供多肽免疫原的第一组分给予对象，通过测定所述对象中针对多肽免疫原的结合抗体的产量来跟踪初次免疫应答直至结合抗体的滴度开始降低，将提供不同但相关的多肽免疫原的第二组分给予对象。

第一和第二组分可作为一种组合物提供。在特定的方面，该方法包括提供在哺乳动物中产生免疫应答的本发明组合物，在与多核苷酸在对象中表达来产生编码的HIV免疫原性多肽相容的条件下将一种或多种含有该组合物的多核苷酸组分的多核苷酸的基因递送载体施用给对象，和将多肽组分施用给对象。多核苷酸和多肽组合物可同时或依次给予。在优选的实施方案中，用多核苷酸组分免疫先于用多肽组分免疫。此外，单次引发后可进行多次加强，多次引发后可进行单次加强，多次引发后可进行多次加强，或者可采用一系列引发和加强。多核苷酸组分可含有其它组分(例如，用于增强免疫应答的组分、运载体等)。多肽组分可含有其它组分(例如，用于增强免疫应答的组分、运载体等)。

示范性的多核苷酸构建物、制备多核苷酸构建物的方法、相应的多肽产物、和制造用于HIV免疫的多肽的方法以前已描述于，例如以下PCT国际公布号：WO/00/39302、WO/00/39303、WO/00/39304、WO/02/04493、WO/03/004657、WO/03/004620和WO/03/020876。

虽然参考亚型B和C HIV作为示范性亚型进行了总体的描述，本发明的组合物和方法可应用于各种HIV亚型、血清学或毒株和藉此编码的免疫原性多肽，包括(但不限于)以前已鉴定的亚型A-K、N和O的HIV-1、已鉴定的CRF(循环重组形式)和HIV-2毒株及其亚型。参见，例如，Myers等，Los Alamos数据库，Los Alamos国家实验室，Los Alamos，新墨西哥；Myers等，“人逆转录病毒和艾滋病”(Human Retroviruses and Aids)，1990，Los Alamos，新墨西哥：Los Alamos国家实验室。此外，本发明的组合物和方法可用于产生抗使用CCR5共同受体进入细胞的病毒毒株和亚型的广泛反应性的中和抗体(例如，TV1和SF162均使用CCR5共同受体(实施例4))。

本发明的多肽组分可含有免疫原性多肽的片段，例如其中多肽序列或其部分含有核酸序列编码的多肽的至少3-5个氨基酸的氨基酸序列，更优选至少8-10个氨基酸，甚至更优选至少15-20个氨基酸。还包含由该序列编码的多肽免疫鉴定的多肽序列。此外，可通过框内融合编码多肽或肽产物的两种或多种多核苷酸序列构建多蛋白。

此外，本发明的多核苷酸组分可包含一个或多个含有编码免疫原性HIV多肽的多核苷酸的单顺反子表达盒，或一个或多个含有编码免疫原性HIV多肽的多核苷酸的多顺反子表达盒或其组合。多顺反子编码序列一般在一个启动子的控制下通过，例如两条或多条编码相互毗连的多肽产物的多核苷酸序列产生，其中可修饰每条多肽编码序列以包括内部核糖体结合位点的序列。

编码免疫原性多肽(例如，HIV免疫原性多肽)的多核苷酸和免疫原性多肽或其片段(例如，HIV免疫原性多肽)的各种组合可用于实践本发明。编码免疫原性多肽的多核苷酸序列可包含在本发明组合物的多核苷酸组分中，例如作为含有如下成分的DNA免疫构建物：合成的Env表达盒、合成的Gag表达盒、合成的pol-衍生的多肽表达盒、含有编码一种或多种附加或调节基因(例如，tat、rev、nef、vif、vpu、vpr)的合成表达盒。本发明组合物的多肽组分中可含有作为纯化的多肽的免疫原性多肽。免疫原性多肽可是合成或野生型的。在优选的实施方案中，免疫原性多肽是抗原性病毒蛋白或其片段。

2.2.0  鉴定类似的多肽和编码这种多肽的多核苷酸

参考示范性HIV-1序列描述本发明的组合物和方法。本发明不限于本文所述的序列。以前描述了用于实践本发明的许多序列(参见，例如，PCT国际公布号WO/00/39302、WO100/39303、WO/00/39304、WO/02/04493、WO/03/004657、WO/03/004620和WO/03/020876)。用于实践本发明的多核苷酸序列通常编码来自病毒来源(例如，HIV-1)的多肽。多肽通常来源于抗原性病毒蛋白，特别是，群特异性抗原多肽、包膜多肽、衣壳多肽和其它结构性和非结构性多肽。特别参考包膜多肽和其修饰物(和编码该多肽的多核苷酸)描述了本发明，所述多肽来源于HIV-1病毒的不同亚型、血清型或毒株。其它HIV-1多肽和编码这种多肽的多核苷酸可用于实践本发明，包括(但不限于)Gag、Pol(包括蛋白酶、逆转录酶和整合酶)、Tat、Rev、Nef、Vif、Vpr和Vpu。

HIV基因组和各种多肽编码区域示于表1。相对于南非毒株8_5_TV1_C.ZA的亚型C HIV-1分离物(图1A-1D)给出核苷酸位置。然而，根据本文的指导，本领域的普通技术人员可容易地理解如何确定其它HIV毒株(来自相同或不同的亚型)或变体(例如，分离物HIV_IIIb、HIV_SF2、HIV-1_SF162、HIV-l_SFI70、HIV_LAV、HIV_LAI、HIV_MN、HIV-1_CM235、HIV-1_US4)、来自不同亚型的其它HIV-1毒株(例如，亚型A-K、N和O)、已鉴定的CRF(循环重组形式)、HIV-2毒株和各种亚型和毒株(例如，HIV-2_UC1和HIV-2_UC2)、和猿免疫缺陷病毒(SIV)中的相应区域。参见，例如，《病毒学》(Virology)，第三版，(W.K.Joldik编，1988)；《基础病毒学》(Fundamental Virology)，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)；《病毒学》(Virology)，第三版，(Fields，BN，DM Knipe，PM Howley编，1996，Lippincott-Raven，Philadelphia，PA；为描述这些和其它相关的病毒，例如使用序列比较程序(如BLAST和其它本文所述的程序)或鉴定和对比结构特征的程序(例如，本文所述可鉴定各种区域的“ALB”程序)。

表1

相对于8_5_TV1_C.ZA的序列的HIV基因组的区域

 

区域	核苷酸序列中的位置
		5’LTR	1-636

 

U3	1-457
		R	458-553
U5	554-636
		NFkB II	340-348
NFkB I	354-362
		Spl III	379-388
Spl II	390-398
		Spl I	400-410
TATA盒	429-433
		TAR	474-499
Poly A信号	529-534
PBS	638-655
		p7结合区域，包装信号	685-791
Gag：	792-2285
		p17	792-1178
p24	1179-1871
		亲环蛋白A bdg	1395-1505
MHR	1632-1694
		p2	1872-1907
p7	1908-2072
		移码滑动	2072-2078
p1	2073-2120
		p6Gag	2121-2285
Zn-基序I	1950-1991
		Zn-基序II	2013-2054

 

Pol：	2072-5086
		p6Pol	2072-2245
Prot	2246-2542
		p66RT	2543-4210
p15RNA酶H	3857-4210
		p31Int	4211-5086
		Vif：	5034-5612
亲水区域	5292-5315
Vpr：	5552-5839
		寡聚化	5552-5677
两性a-螺旋	5597-5653
Tat：	5823-6038和8417-8509
		Tat-1外显子	5823-6038
Tat-2外显子	8417-8509
		N-末端结构域	5823-5885
反式激活域	5886-5933
		转导结构域	5961-5993
		Rev：	5962-6037和8416-8663
Rev-1外显子	5962-6037
		Rev-2外显子	8416-8663
高亲和力bdg.位点	8439-8486
		富含Leu的效应子结构域	8562-8588

 

Vpu：	6060-6326
		跨膜结构域	6060-6161
胞质结构域	6162-6326
Env(gp160)	6244-8853
		信号肽	6244-6324
gp120	6325-7794
		V1	6628-6729
V2	6727-6852
		V3	7150-7254
V4	7411-7506
		V5	7663-7674
C1	6325-6627
		C2	6853-7149
C3	7255-7410
		C4	7507-7662
C5	7675-7794
		CD4结合	7540-7566
gp41	7795-8853
		融合肽	7789-7842
寡聚化结构域	7924-7959
		N-末端七残基重复序列	7921-8028
C-末端七残基重复序列	8173-8280
		免疫优势区域	8023-8076
		Nef：	8855-9478
豆蔻酰化	8858-8875

 

SH3结合	9062-9091
		聚嘌呤段	9128-9154
SH3结合	9296-9307

易于理解的是，本领域的技术人员可对比表1所示的任何HIV序列来确定任何特定HIV基因的相对位置。例如，使用本文所述的对比程序之一(例如，BLAST)来对比其它HIV基因组序列与8_5_TV1_C.ZA(表1)并确定基因的位置。可类似地对比多肽序列。例如，图2A-2E显示各种毒株的Env多肽序列与SF-162的对比。如PCT国际公布号中所详述的，Env多肽(例如，gp120、gp140和gp160)含有“桥连片层”，该桥连片层由4条形成β片层的反平行β链(β-2、β-3、β-20和β-21)组成。两个环，V1和V2从一对β-链(β-2和β-3)中伸出。相对于SF-162，β-2片层出现于约氨基酸残基113(Cys)-氨基酸残基117(Thr)，而β-3片层出现于约氨基酸残基192(Ser)-氨基酸残基194(Ile)，相比于SF-162。“V1/V2”区域出现于约氨基酸位置120(Cys)-残基189(Cys)，相比于SF-162。“小环”结构从第二对β-链(β-20和β-21)中伸出，本文也将该结构称为“桥连片层小环”。按照本文的指导和PCT国际公布号WO/00/39303所述，小环和桥连片层小环的位置可对应于HXB-2确定。β片层区域的缺失序列的大概位置见图2A-2E中的箭头所示。“*”表示可按照本说明书的指导进行突变的N-糖基化位点。

2.3.0含有多核苷酸序列、载体、多肽、其它组分的表达盒与用于实践本发明的制剂

用于产生免疫应答的本发明组合物含有多核苷酸组分和多肽组分。该多肽组分可含有一种或多种编码免疫原性病毒多肽的多核苷酸。这种多核苷酸可含有编码免疫原性病毒多肽的天然病毒序列或编码免疫原性多肽的合成多核苷酸。相比于天然的类似多核苷酸序列，为提高编码的多肽表达，合成的多核苷酸可含有优化序列。此外，相比于对应的野生型序列，合成的多核苷酸可含有突变(单点和多点突变、错义突变、无义突变、缺失、插入等)。

本发明组合物的多肽组分可含有一种或多种免疫原性病毒多肽。这种多肽可含有天然免疫原性病毒多肽或修饰的免疫原性多肽。相比于类似的天然多核苷酸序列，为提高多肽表达，修饰的多肽可含有优化序列。此外，相比于对应的野生型序列，修饰的多肽可含有突变(单点和多点突变、错义突变、无义突变、缺失、插入等)。

参考HIV-1衍生的序列描述了含有多核苷酸组分和多肽组分的本发明组合物。然而，本发明的组合物和方法也可应用于其它类型的病毒，其中这种病毒具有多种亚型、血清型和/或毒株变异，例如包括(但不限于)其它非-HIV逆转录病毒(如HTLV-1，2)、嗜肝DNA病毒(如HBV)、疱疹病毒(如HSV-1、2、CMV、EBV、水痘带状疱疹病毒等)、黄病毒(如HCV、黄热、蜱传性脑炎、圣路易斯脑炎、西尼罗河病毒等)、冠状病毒(如SARS)、副粘病毒(如PIV、RSV、麻疹病毒等)、流感病毒、细小RNA病毒、呼肠孤病毒(如轮状病毒)、沙粒病毒、弹状病毒、乳多空病毒、细小病毒、腺病毒、等革热病毒、布尼亚病毒(如汉坦病毒)、杯状病毒(如诺沃克病毒)、丝状病毒(如埃博拉病毒、马尔堡病毒)。

2.3.1修饰多核苷酸编码序列

相比于对应的天然野生型序列，可修饰HIV-1编码序列及相关序列提高其在靶细胞中表达。以下是一些可对这种序列作出的示范性修饰。

首先，可修饰HIV-1密码子使用模式从而使得到的核酸编码序列与在高度表达的人基因中发现的密码子使用相差不大。HIV密码子使用反映了密码子-三联体的核苷酸A或T的含量高。HIV-1密码子使用的效果是DNA序列中的AT含量高，这导致mRNA的翻译能力降低和不稳定性。比较起来，高度表达的人密码子优选核苷酸G或C。可修饰HIV编码序列使之与在高度表达的人基因中发现的密码子使用相差不大。

第二，抑制性(或不稳定)元件(INS)位于编码序列，例如Gag编码序列中。RRE是与HIV编码的Rev蛋白相互作用以克服INS的表达下调作用的二极RNA结构。为克服RRE和Rev的转录后激活机理，可通过引入多个不改变编码的蛋白质的读码框的点突变来失活不稳定元件。

第三，就一些基因而言，改变编码序列使得多核苷酸编码序列编码失活的或非功能性的基因产物(例如，失活的聚合酶、蛋白酶、tat、rev、nef、vif、vpr和/或vpu基因产物)。实施例1描述了一些示范性的突变。

按照本说明书的指导，通过本领域已知的方法，例如由Midland CertifiedReagent Company(Midland，Texas)等公司来装配合成的编码序列。

例如，PCT公布号WO/00/39303、WO/00/39302、WO00/39304、WO/02/04493、WO/03/020876、WO/03/004620和WO/03/004657描述了一些用于本发明方法中的示范性编码免疫原性HIV多肽的合成多核苷酸序列及其所编码的多肽。

在一优选的实施方案中，本发明涉及编码Env多肽的多核苷酸及相应的Env多肽。例如，可修饰Env的密码子使用模式从而使得到的核酸编码序列与在高度表达的人基因中发现的密码子使用相差不大。这种合成的Env序列能产生蛋白质的水平高于天然Env序列(参见，例如PCT国际公布号WO/00/39302)。与野生型编码序列相比，修饰Env多肽编码序列提高了在许多哺乳动物细胞系(以及其它类型的细胞系，包括，但不限于昆虫细胞)中的表达。可获得相似的Env多肽编码序列，修饰和测试一提高来自多种分离物的表达。

Env的其它修饰包括(但不限于)产生编码其中具有突变和/或缺失的Env多肽的多核苷酸。例如，可删除本文所述的高变区，V1和/或V2。此外，可修饰或删除可变区V3、V4和/或V5。(参见，例如美国专利6,602,705)此外，例如也可按照本说明书的指导对Env内的桥连片层区域和/或N-糖基化位点进行其它修饰。(参见，图2A-2E以及PCT国际公布号WO/00/39303、WO/00/39302、WO00/39304、WO/02/04493、WO/03/020876和WO/03/004620)。其它有用的env修饰是熟知的并且包括以下文献所述：Schulke等，(J.Virol.2002 76：7760)，Yang等，2002，(J.Virol.2002 76：4634)，Yang等，2001(J.Virol.2001 75：1165)，Shu等，(Biochem.1999 38：5378)，Farzan等，(J.Virol.1998 72：7620)和Xiang等，(J.Virol.2002 76：9888)。这些修饰的各种组合可用于产生合成的表达盒与本文所述相应的多肽。

本发明也包括含有来源于除Env以外HIV基因的合成序列的表达盒，包括(但不限于)Gag、Env、Pol以及tat、rev、nef、vif、vpr和vpu内的区域。此外，本发明包括含有两种或多种抗原多肽的合成多核苷酸和/或表达盒(以及其编码的多肽)。例如，这种序列可全部使用，或者可按照本说明书的指导和本领域已知的信息从合成的编码序列中选择编码特定表位或抗原的序列。例如，多核苷酸编码的多肽序列可经计算机分析来预计全长序列中的抗原肽片段。然后，相应的多核苷酸编码片段可用于本发明的构建物。用于这种分析的示范性算法包括(但不限于)：

AMPHI.该算法已用于预计T-细胞表位(Gao等，(1989)J.Immunol.143：3007；Roberts等，(1996)AIDS Res Hum Retrovir 12：593；Quakyi等，(1992)Scand J Immunol增刊11：9)。DNASTAR，Inc.(Madison，WI，USA)的Protean软件包中的AMPHI算法是可用的。

抗原性索引(ANTIGENIC INDEX).该算法用于预计抗原性决定簇(Jameson与Wolf，(1998)CABIOS 4：181：186；Sherman，KE等，Hepatology1996年4月，23(4)：688-94；Kasturi，KN等，J Exp Med1995年3月1日，181(3)：1027-36；van Kampen V等，Mol Immunol 1994年10月，31(15)：1133-40；Ferroni P等，J Clin Microbiol 1993年6月，31(6)：1586-91；Beattie J等，Eur J Biochem 1992年11月15日，210(1)：59-66；Jones GL等，Mol Biochem Parasitol 1991年9月，48(1)：1-9)。

亲水性(HYDROPHILICITY).一种Hopp和Woods(1981)(PNAS USA78：3824-3828)公布的用于确定氨基酸序列的抗原决定簇的算法。

以上列举的算法可使用默认参数来确定抗原位点。此外，可结合两种或多种以上分析的结果来鉴定特别优选的片段。

2.3.2  多核苷酸序列及其编码的多肽的进一步修饰

本文所述免疫原性病毒的编码多肽的表达盒也可含有一种或多种其它编码序列，例如一种或多种转基因。在本发明的一个实施方案中，多核苷酸组分可含有一种或多种HIV免疫原性多肽的编码序列。此外，多肽组分可含有一种或多种HIV免疫原性多肽。在本发明另一个实施方案中，多核苷酸组分可含有一种或多种HIV免疫原性多肽的编码序列，其中该多核苷酸组分还含有编码其它抗原性多肽的序列，前提是所述其它的抗原性多肽不是来源于HIV-1毒株的免疫原性多肽。此外，多肽组分可含有一种或多种HIV免疫原性多肽，其中该多肽组分还含有其它抗原性多肽，前提是所述其它的抗原性多肽不是来源于HIV-1毒株的免疫原性多肽。

用于实践本发明的其它序列(例如，转基因)包括，但不限于编码以下物质的其它序列：病毒表位/抗原(包括但不限于HCV抗原(例如，E1，E2；Houghton，M等，1998年2月3日颁发的美国专利号5,714,596；Houghton，M等，1998年1月27日颁发的美国专利号5,712,088；Houghton，M等，1997年11月4日颁发的美国专利号5,683,864；Weiner，A.J.等，1998年3月17日颁发的美国专利号5,728,520；Weiner，A.J.等，1998年6月16日颁发的美国专利号5,766,845；Weiner，A.J.等，1997年9月23日颁发的美国专利号5,670,152)、HIV抗原(例如，来源于一种或多种HIV分离物)；和编码肿瘤抗原/表位的序列。其它序列也可来源于非病毒来源，例如编码以下细胞因子的序列，如白介素-2(IL-2)、干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、G-CSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-1α(IL-1α)、白介素-11(IL-11)、MIP-1、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞抑制因子(LIF)、c-kit配体、血小板生成素(TPO)和flt3配体，这些序列可购自几个厂家，如Genzyme(Framingham，MA)、Genentech(SouthSan Francisco，CA)、Amgen(Thousand Oaks，CA)、R&D Systems andImmunex(Seattle，WA)。其它序列描述于下文。

HIV多肽编码序列可获得自其它HIV分离物，参见，例如Myers等，LosAlamos数据库，Los Alamos国家实验室，Los Alamos，新墨西哥，(1992)；Myers等，“人逆转录病毒和艾滋病”(Human Retroviruses and Aids)，1997，Los Alamos，新墨西哥：Los Alamos国家实验室。可按照本说明书的指导用这种编码序列作为起始材料来产生合成的表达盒。

此外，本发明的合成表达盒包含与本文所述合成表达盒序列编码的多肽具有大于85％、优选大于90％、更优选大于95％、最优选大于98％序列同一性的相关多肽序列。

示范性表达盒与修饰见实施例1并在下文进一步讨论。

此外，本发明的多核苷酸可含有其它聚合物骨架结构，例如(但不限于)聚乙烯骨架(Pitha，Biochem Biophys Acta，204：39，1970a；Pitha，Biopolymers，9：965，1970b)和吗啉代骨架(Summerton，J等，08/25/92颁发的美国专利号5,142,047；Summerton，J等，02/09/93颁发的美国专利号5,185,444)。报道了各种其它荷电与未荷电的多核苷酸类似物。本领域已知许多骨架修饰，包括(但不限于)未荷电的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物和氨基甲酸酯)与荷电的键(例如，硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯)。

2.3.3  与编码免疫原性多肽的多核苷酸序列一起使用的示范性克隆载体和系统

用于本发明的组合物和方法的多核苷酸序列可使用重组技术获得，例如通过从表达基因的细胞中筛选cDNA文库和基因组文库或通过从已知含有该基因的载体中取得。此外，可使用标准技术，例如苯酚提取和cDNA或基因组DNA的PCR从含有基因的细胞和组织中直接分离所需基因。为描述用于获得和分离DNA的技术可参见，例如Sambrook等，同上。除了克隆，感兴趣的基因也可合成产生。可用特定的所需氨基酸序列的合适密码子来设计核苷酸序列。一般可选择序列将在其中表达的宿主的优选密码子。完整的序列从用标准方法制备的重叠寡核苷酸装配并装配成完整的编码序列。参见，例如Edge，Nature(1981)292：756；Nambair等，Science(1984)223：1299；Jay等，JBiol.Chem.(1984)259：6311；Stemmer，W.P.C.，(1995)Gene164：49-53。

然后，编码所需抗原的基因序列可插入含有本发明的合成表达盒的载体中。在一个实施方案中，编码选择的抗原的多核苷酸单独克隆入表达载体(例如，第一Env编码多核苷酸克隆入第一载体，第二类似的Env编码多核苷酸克隆入第二载体)。在某些实施方案中，抗原插入或毗连合成的Gag编码序列，从而使得当组合序列表达时可产生含有Gag肽和感兴趣抗原(例如来源于HIV的Env(天然或修饰的)或其它抗原(天然或修饰的))的VLP。可在编码序列内或编码序列的任一末端插入(5′，表达的Gag多肽的氨基末端；或3′，表达的Gag多肽的羧基末端)(Wagner，R.等，Arch Virol.127：117-137，1992；Wagner，R.等，Virology 200：162-175，1994；Wu，X.等，J Virol.69(6)：3389-3398，1995；Wang，C-T.等，Virology 200：524-534，1994；Chazal，N.等，Virology 68(1)：111-122，1994；Griffiths，J.C.等，J.Virol.67(6)：3191-3198，1993；Reicin，A.S.等，J Virol.69(2)：642-650，1995)。可删除高达50％的p55Gag编码序列而不影响病毒样颗粒的装配与表达效率(Borsetti，A.等，J.Virol.72(11)：9313-9317，1998；Gamier，L等，J Virol72(6)：4667-4677，1998；Zhang，Y.等，J Virol 72(3)：1782-1789，1998；Wang，C.等，J Virol 72(10)：7950-7959，1998)。当在Gag的氨基末端加上序列时，多核苷酸可在5’端含有编码用于给含有Gag的多肽加上肉豆蔻部分的信号的编码序列(例如，编码Met-Gly的序列)。

用于实践本发明的表达盒也可含有操作性连接于编码序列的控制元件，该控制元件允许基因在对象种类的体内表达。例如，典型的哺乳动物细胞表达的启动子包括SV40早期启动子、CMV启动子，如CMV立即早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)和单纯疱疹病毒启动子等。其它非病毒启动子，例如来源于鼠金属硫蛋白基因的启动子也发现可用于哺乳动物表达。通常也存在位于翻译终止密码子的3’的转录终止和聚腺苷酸化序列。也优选在位于编码序列的5’存在用于优化翻译启动的序列。转录终止子/聚腺苷酸化信号的例子包括来源于如Sambrook等所述(同上)的SV40以及牛生长激素终止子序列。

本文也可使用增强子元件来增加哺乳动物构建物的表达水平。例子包括如Dijkema等，EMBO J.(1985)4：761中所述SV40早期基因增强子，如German等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79：6777中所述来源于Rous肉瘤病毒的长末端重复(LTR)的增强子/启动子和如Boshart等，Cell(1985)41：521中所述来源于人CMV的元件，如包含于CMV内含子A序列中的元件。

此外，可构建包含嵌合的抗原编码基因序列的质粒，所述序列编码，例如多种感兴趣的抗原/表位，如来源于多种病毒分离物。

抗原编码序列通常在合成的编码序列之前或之后，嵌合的转录单元具有单个编码感兴趣的抗原和合成编码序列的开放读框。或者，可构建允许使用EMCV IRES等表达单个mRNA的多种抗原的多个顺反子盒(例如，二-顺反子盒)。

在本发明的一个实施方案中，免疫产生组合物的多核苷酸组分可含有，例如以下：含有第一Env表达盒的第一表达载体，其中Env编码序列来源于第一HIV亚型、血清型或毒株，和含有第二Env表达盒的第二表达载体，其中Env编码序列来源于第二HIV亚型、血清型或毒株。含有本发明的编码序列的表达盒可以任何组合数量组合，这取决于待产生所需免疫应答的编码序列产物(例如HIV多肽)。在另一个实施方案中，多种HIV衍生多肽的合成的编码序列可构建入单个启动子控制下的多顺反子信息，其中IRES置于毗连每种编码多肽的编码序列。

用于本发明的示范性的感兴趣多核苷酸序列可来源于以下毒株，包括(但不限于)：亚型B-SF162，亚型C-TV1.8_2(8_2_TV1_C.ZA)，亚型C-TV1.8_5(8_5_TV1_C.ZA)，亚型C-TV2.12-5/1(12-5_1_TV2_C.ZA)，亚型C-MJ4，印度亚型C-93IN101，亚型A-Q2317，亚型D-92UG001，亚型E-cm235，肯尼亚的亚型A HIV-1分离物Q23-17、GenBank登录号AF004885，乌克兰的亚型A HIV-1分离物98UA0116、GenBank登录号AF413987，坦桑尼亚的亚型A HIV-1分离物SE8538、GenBank登录号AF069669，亚型A人免疫缺陷病毒1原病毒DNA的完全基因组、克隆：pUG031-A1、GenBank登录号AB098330，亚型D人免疫缺陷病毒1型的完全原病毒基因组、毒株92UG001、GenBank登录号AJ320484，乌干达的亚型D HIV-1分离物94UG114、GenBank登录号U88824，亚型D人免疫缺陷病毒1型、分离物ELI、GenBank登录号K03454和印度亚型C人免疫缺陷病毒1型亚型C基因组RNA、GenBank登录号AB023804。

用于本发明的多核苷酸编码序列可编码功能性基因产物或使之突变以降低(与野生型相比)、减毒、失活、消除或给予合成多核苷酸编码的基因产物的非功能活性。

一旦完成，表达盒一般用于使用标准基因递送方案的核酸免疫的构建物中。基因递送的方法为本领域已知。参见，例如美国专利号5,399,346；5,580,859；5,589,466。基因可直接递送至脊椎动物对象，或者可离体递送至来源于对象的细胞再将细胞植入对象。

已开发了许多将基因转移入哺乳动物细胞的基于病毒的系统。使用本领域已知的技术选择的载体可插入载体并包装入逆转录病毒颗粒中。然后，可分离重组病毒并体内或离体递送至对象的细胞中。已开发了许多用作哺乳动物宿主细胞基因转移载体的基于病毒的系统。例如，逆转录病毒(特别是慢病毒载体)提供了基因递送系统的便利平台。使用本领域已知的技术可将感兴趣的编码序列(例如，用于基因治疗领域的序列)插入基因递送载体并包装入逆转录病毒颗粒中。然后，可分离重组病毒并体内或离体递送至对象的细胞中。已描述了许多逆转录病毒系统，包括例如描述于以下文献的：美国专利号5,219,740；Miller等，(1989)BioTechniques 7：980；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 1：5；Scarpa等，(1991)Virology 180：849；Burns等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sei.USA 90：8033；Boris-Lawrie等，(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3：102；GB2200651；EP0415731；EP0345242；PCT国际公布号WO 89/02468；PCT国际公布号WO 89/05349；PCT国际公布号WO 89/09271；PCT国际公布号WO 90/02806；PCT国际公布号WO90/07936；PCT国际公布号WO 90/07936；PCT国际公布号WO 94/03622；PCT国际公布号WO 93/25698；PCT国际公布号WO 93/25234；PCT国际公布号WO 93/11230；PCT国际公布号WO 93/10218；PCT国际公布号WO91/02805；U.S.5,219,740；U.S.4,405,712；U.S.4,861,719；U.S.4,980,289和U.S.4,777,127；美国系列号07/800,921和Vile(1993)Cancer Res53：3860-3864；Vile(1993)Cancer Res 53：962-967；Ram(1993)Cancer Res53：83-88；Takamiya(1992)J Neurosci.Res 33：493-503；Baba(1993)JNeurosurg 79：729-735；Mann(1983)Cell 33：153；Cane(1984)Proc Natl AcadSci USA 81：6349和Miller(1990)Human Gene Therapy 1。

一种类型的逆转录病毒，鼠白血病病毒或“MLV”广泛用于基因治疗领域(一般可参见Mann等，(Cell33：153，1993)；Cane和Mulligan(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6349，1984)和Miller等，(Human Gene Therapy1：5-14，1990)。

可容易地从各种慢病毒中构建慢病毒载体(参见《RNA肿瘤病毒》(RNATumor Viruses)，第二版，冷泉港实验室，1985)。慢病毒的代表性例子包括HIV、HIV-1、HIV-2、FIV和SIV。这种慢病毒可获得自患者分离物，或者更优选获得自保藏机构或保藏所，如美国模式培养物保藏所，或者用可用的技术从已知来源分离。慢病毒基因递送载体(或运载体)的部分可来源于不同的病毒。例如，在给定的重组慢病毒载体中，LTR可来源于HIV，包装信号可来自SIV，第二链合成的起点可来自HrV-2。慢病毒载体构建物可含有5’慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、一种或多种异源序列、第二链DNA合成的起点和3’LTR。慢病毒载体具有核转运元件，该元件在优选的实施方案中不是RRE。合适的核转运元件的代表性例子包括Rous肉瘤病毒中的元件(Ogert等，J ViroL 70，3834-3843，1996)、Rous肉瘤病毒中的元件(Liu和Mertz，Genes & Dev.，9，1766-1789，1995)和猿逆转录病毒1型基因组中的元件(Zolotukhin等，J Virol.68，7944-7952，1994)。其它可能的元件包括以下基因中的元件：组蛋白基因(Kedes，Annu.Rev.Biochem.48，837-870，1970)、干扰素基因(Nagata等，Nature 287，401-408，1980)、肾上腺素能受体基因(Koilka等，Nature 329，75-79，1987)和c-Jun基因(Hattorie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，9148-9152，1988)。

也描述了许多腺病毒载体。与整合入宿主基因组的逆转录病毒不同，腺病毒持续存在于染色体外，从而使与插入性诱变相关的危险降至最低程度(Haj-Ahmad和Graham，J.Virol.(1986)57：267-274；Bett等，J.Viral(1993)67：5911-5921；Mittereder等，Human Gene Therapy(1994)5：717-729；Seth等，J.Virol(1994)68：933-940；Ban等，Gene Therapy(1994)1：51-58；Berkner，K.L.BioTechniques(1988)6：616-629和Rich等，Human Gene Therapy(1993)4：461-476)。

此外，已开发了用于基因递送的各种腺伴随病毒(AAV)载体系统。可用本领域熟知的技术容易地构建AAV载体。参见，例如美国专利号5,173,414和5,139,941；PCT国际公布号WO 92/01070(1992年1月23日公布)和WO 93/03769(1993年3月4日公布)；Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.(1988)8：3988-3996；Vincent等，Vaccines 90(1990)(冷泉港实验室出版社)；Carter，B.J.Current Opinion in Biotechnology(1992)3：533-539；Muzyczka，N.Current Topics in Microbiol.and Immunol.(1992)158：97-129；Kotin，R.M.Human Gene Therapy(1994)5：793-801；Shelling和Smith，Gene Therapy(1994)1：165-169和Zhou等，J.Exp.Med.(1994)179：1867-1875。

用于递送本发明多核苷酸的另一种载体系统是Small，Jr.，P.A.等，(1997年10月14日颁发的美国专利号5,676,950)所述的肠给予的重组痘病毒疫苗。

用于递送编码感兴趣抗原的核酸分子的其它病毒载体包括来源于痘病毒科的病毒，包括牛痘病毒和鸟痘病毒。例如，可按以下方式构建表达基因的牛痘病毒重组体。首先，将编码特定的免疫原性HIV多肽编码序列的DNA插入合适的载体，使得其接近牛痘病毒启动子并且两侧是牛痘病毒DNA序列，例如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后，用该载体转染同时用牛痘病毒感染的细胞。同源重组用于将牛痘病毒启动子加上编码感兴趣的编码序列的基因插入病毒基因组。可通过在有5-溴脱氧尿苷存在时培养细胞并检得抵抗该物质的病毒噬斑来选择得到的TK重组体。

或者，禽痘病毒，例如禽痘病毒和金丝雀痘病毒(canarypox)病毒也可用于递送基因。当将表达哺乳动物病原体的免疫原的重组禽痘病毒给予非禽类物种时，已知可赋予保护性免疫力。由于禽痘病毒属的成员仅能在易感禽类中生产性地复制，因此不感染哺乳动物细胞，所以使用禽痘病毒载体在人类和其它哺乳动物种类中特别理想。产生重组禽痘病毒的方法是本领域已知的并且采用上述关于产生牛痘病毒的遗传重组方法。参见，例如，PCT国际公布号WO 91/12882、WO 89/03429和WO 92/03545。

分子偶联载体也可用于基因递送，例如Michael等，J.Biol.Chem.(1993)268：6866-6869h和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6099-6103所述的腺病毒嵌合载体。

甲病毒属的成员，例如(但不限于)辛德毕斯、塞姆利基森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒也发现可用作递送本发明的多核苷酸的病毒载体(例如，第一和第二合成的gp140-多肽的编码表达盒，其中第一和第二gp140多肽是类似的并且来源于不同的HIV亚型、血清型或毒株)。为描述用于实践本方法的辛德毕斯病毒衍生的载体，参见Dubensky等，J.Virol.(1996)70：508-519和PCT国际公布号WO 95/07995和WO 96/17072；以及Dubensky，Jr.，T.W.等，1998年12月1日颁发的美国专利号5,843,723和Dubensky，Jr.，T.W.，1998年8月4日颁发的美国专利号5,789,245。优选的表达系统包括(但不限于)真核生物分层载体起始系统(例如，美国专利号6,015,686；美国专利号5,814,482；美国专利号6,015,694；美国专利号5,789,245；EP1029068A2；PCT国际公布号WO 9918226A2/A3；EP 00907746A2；PCT国际公布号WO 9738087A2)。示范性表达系统包括(但不限于)嵌合型甲病毒复制子颗粒，例如形成VEE和SIN的颗粒(参见，例如Perri等，“来源于委内瑞拉马脑炎病毒和辛德毕斯病毒的甲病毒复制子颗粒嵌合体是基于基因的强有力疫苗递送载体”(An alphavirus replicon particle chimera derivedfrom Venezuelan equine encephalitis and Sindbis viruses is a potent gene-basedvaccine delivery vector)，J.Virol 2003，77(19)，印刷中；PCT WO02/099035；2002年12月4日提交的USSN 10/310734)。这种基于甲病毒的载体系统可用于引发或在DNA引发的对象中作为加强免疫或能作为独立应用的免疫方法使用本文所述多价方法来诱导中和抗体。

表达盒递送载体也可包括组织特异性启动子来驱动一种或多种感兴趣的基因或序列的表达。

可产生表达盒递送载体构建物，以致可表达多种感兴趣的基因。这可通过使用二-或寡聚-顺反子盒(例如，当编码区域被80个或更少的核苷酸分开时，一般参见Levin等，Gene108：167-174，1991)或通过内部核糖体进入位点(IRES)来实现。

合成的感兴趣表达盒也可不用病毒载体递送。例如，可使用含有CMV-衍生元件的真核生物表达载体来递送本发明的表达盒，这种载体包括(但不限于)以下：pCMVKm2、pCMV-link、pCMVPLEdhfr和pCMV6a(参见实施例)。例如，本发明的合成DNA表达盒(如编码gp140多肽的表达盒)可克隆入以下真核生物载体：用于瞬时表达测定和DNA免疫研究的pCMVKm2，该pCMVKm2载体来源于pCMV6a(Chapman等，Nuc.Acids Res.(1991)19：3979-3986)并且含有卡那霉素选择位点、复制的ColE1起点、CMV启动子增强子和内含子A，接着是用于下述合成序列的插入位点，然后是来源于牛生长激素的聚腺苷酸化信号—pCMVKm2载体与pCMV-link载体的唯一区别在于pCMVKm2中插入了多接头位点以产生pCMV-link；用于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的pESN2dhfr和pCMVPLEdhfr；和用于杆状病毒表达系统中的穿梭载体pAcC13(如Munemitsu S.等，MolCell Bio.10(11)：5977-5982，1990所述pAcC13来源于pAcC12)。

此外，本发明的表达盒在递送至对象或从其中得到的细胞之前可包装在脂质体中。一般使用能稳定结合或截获和保留核酸的脂质体实现脂质包囊化。浓缩的DNA与脂质制剂之比可变，但通常在约1：1(mgDNA：微摩尔脂质)或更多脂质。为综述使用脂质体作为递送核酸的运载体，参见，Hug和Sleight，Biochim.Biophys.Acta.(1991)1097：1-17；Straubinger等，《酶学方法》(Methods of Enzymology)，(1983)，第101卷，512-527页。

用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(带正电)、阴离子(带负电)和中性制剂，特别优选阳离子脂质体。阳离子脂质体显示以功能性形式介导质粒DNA(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84：7413-7416)、mRNA(Malone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86：6077-6081)和纯化的转录因子(Debs等，J.Biol.Chem.(1990)265：10189-10192)的胞内递送。

阳离子脂质体可容易地获得。例如脂质体N[1-2，3-二油酰氧基]丙基]-N，N，N-三乙基铵(DOTMA)以商品名Lipofectin来源于GIBCO BRL，GrandIsland，NY。(也参见，Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84：7413-7416)。其它市售可得的脂质包括(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它阳离子脂质体可用本领域熟知的技术从易得的材料制备。参见，例如描述DOTAP(1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基氨基)丙烷)脂质体合成的Szoka等，Proe.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75：4194-4198；PCT国际公布号WO 90/11092。

类似地，阴离子和中性脂质体可容易地获得，例如来源于Avanti PolarLipids(Birmingham，AL)，或者可用易得的材料容易地制备。这种材料包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。这些材料也可以合适的比例DOTMA与DOTAP起始材料混合。用这些材料制造脂质体的方法是本领域熟知的。

脂质体可含有多层脂泡(MLV)，单层小脂泡(SUV)或单层大脂泡(LUV)。用本领域已知的方法可制备各种脂质体-核酸复合物。参见，例如Straubinger等，《免疫学方法》(METHODS OF IMMUNOLOGY)(1983)，第101卷，512-527页；Szoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75：4194-4198；Papahadjopoulos等，Biochim.Biophys.Acta(1975)394：483；Wilson等，Cell(1979)17：77；Deamer和Bangham，Biochim.Biophys.Acta(1976)443：629；Ostro等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1977)76：836；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76：3348；Enoch和Strittmatter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76：145；Fraley等，J.Biol.Chem.(1980)255：10431；Szoka和Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75：145和Schaefer-Ridder等，Science(1982)215：166。

DNA和/或蛋白质抗原也可以类似于Papahadjopoulos等，Biochem.Biophys.Acta.(1975)394：483-491所述的螺旋形脂质组合物的形式递送。也参见，美国专利号4,663,161和4,871,488。

感兴趣的表达盒也可包囊入、吸附入颗粒运载体或与之相连。这种运载体具有针对免疫系统的选择抗原的多份拷贝并促进抗原在局部淋巴节中的捕获和保留。这些颗粒可由巨嗜细胞吞噬并能通过细胞因子释放来增强抗原呈递。具体运载体的例子包括来源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物以及来源于聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，称为PLG的微粒。参见，例如Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10：362-368；McGee JP等，J Microencapsul.14(2)：197-210，1997；O′Hagan DT等，Vaccine11(2)：149-54，1993。合适的微粒也可在荷电洗涤剂存在时生产以得到表面带净负电荷或净正电荷的微粒。例如，用阴离子洗涤剂生产的微粒，如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，即CTAB-PLG微粒吸附负电荷的大分子，如DNA(参见，例如，国际申请号PCT/US99/17308)。

此外，其它具体的系统和聚合物可用于体内或离体递送感兴趣的基因。例如，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺等聚合物以及这些分子的偶联物可用于转移感兴趣的核酸。类似地，DEAE葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀或使用其它不溶的无机盐，例如磷酸锶、硅酸铝(包括膨润土、高岭土、氧化铬、硅酸镁、滑石粉)等沉淀可用于本方法。用于基因转移的递送系统的综述参见，例如Felgner，P.L.，Advanced Drug DeliveryReviews(1990)5：163-187。拟肽(Zuckerman，R.N.等，1998年11月3日颁发的美国专利号5,831,005)也可用于递送本发明的构建物。

在本发明的一些实施方案中，明矾和PLG是提高多核苷酸疫苗(例如，DNA疫苗)的免疫力的有用递送佐剂。其它实施方案包括(但不限于)类毒素、细胞因子，共刺激分子也可作为遗传佐剂与多核苷酸疫苗一起使用。

此外，使用颗粒运载体，例如金和钨的生物射弹递送系统特别适用于递送本发明的合成表达盒。用待递送的合成表达盒包被颗粒并通常在减压条件下用从“基因枪”发射出的“火药”加速至高速度。对这种技术和有用设备的描述参见，例如美国专利号4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,179,022；5,371,015和5,478,744。也使用无针头注射系统(Davis，H.L.等，Vaccine 12：1503-1509，1994；Bioject，Inc.，Portland，OR)。

携带本发明的合成表达盒的重组载体配制入用于递送至脊椎动物对象的组合物。这些组合物可是预防性(防止感染)或治疗性的(感染后治疗疾病)。如果需要预防疾病，这些组合物一般在感兴趣病原体的初次感染之前给予。如果需要治疗，例如减少症状或复发，这些组合物一般在初次感染后给予。这些组合物含有“治疗有效量”的感兴趣基因，从而可在体内产生一定量的抗原进而在所给予的个体内产生免疫应答。确切的所需量视以下因素而变：治疗的对象、待治疗对象的年龄和一般情况、对象的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、治疗的疾病的严重性、选择的具体抗原及其给药方式等。本领域的技术人员可容易地确定合适的有效量。因此，可通过常规试验确定范围较宽的“治疗有效量”。

这些组合物一般可含有一种或多种“药学上可接受的赋形剂或载体”，例如水、盐水、甘油、聚乙二醇、透明质酸、乙醇等。此外，这种载体中可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。某些核酸摄取和/或表达的易化剂，例如(但不限于)布比卡因、心毒素和蔗糖也可包含于这些组合物中或共同给予。

一旦配制好，本发明的组合物可直接给予对象(例如，上述的)或者使用例如上述的方法离体递送至来源于对象的细胞。例如，将转化的细胞离体递送并再植入对象的方法是本领域已知的，包括，例如葡萄糖介导的转染、磷酸钙沉淀、多聚季铵盐介导的转染、脂转染胺(lipofectamine)和LT-1介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸(有或没有相应的抗原)包囊在脂质体中与将DNA直接微注射入核。

合成表达盒组合物的直接体内递送一般可在有或没有病毒载体时，用常规注射器或基因枪，例如

基因递送系统(PowderJect Technologies，Inc.，牛津，英格兰)通过注射来实现。这些构建物可通过皮下、表皮、表皮内、粘膜内(例如鼻、直肠和阴道)、腹膜内、静脉内、口服或肌肉内注射。特别优选将DNA递送入表皮细胞的给药方式，因为这种方式可接近皮肤相关的淋巴样细胞并使得DNA瞬时存在于接受者中。其它给药方式包括口服和肺部给药、栓剂、无针头注射、经皮和透皮应用。剂量治疗可是单剂量方案或多剂量方案。编码免疫原性多肽的多肽可按照本发明的方法与类似的免疫原性多肽联合给予。

2.3.4  编码HIV-1多肽和相关多肽的合成序列的表达

本发明的免疫原性病毒多肽编码序列可克隆入许多不同的表达载体/宿主细胞系统以提供产生免疫应答的本发明组合物的多肽组分中的免疫原性多肽。例如，编码HIV多肽的DNA片段可克隆入真核表达载体，包括瞬时表达载体、基于CMV-启动子的哺乳动物载体和用于杆状病毒表达系统的穿梭质粒。合成的多核苷酸序列(例如，密码子优化的多核苷酸序列)和野生型序列一般可克隆入同一载体。许多克隆载体是本领域技术人员已知的，选择合适的克隆载体是选择的问题。一般参见Sambrook等，同上。然后，该载体用于转化合适的宿主细胞。合适的重组表达系统包括(但不限于)本领域熟知的细菌、哺乳动物、杆状病毒/昆虫、牛痘病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)、甲病毒(例如辛德毕斯病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE))、哺乳动物、酵母和非洲爪蟾表达系统。特别优选的表达系统是哺乳动物细胞系、牛痘病毒、辛德毕斯病毒、真核分层载体起始系统(例如，美国专利号6,015,686；5,814,482；6,015,694；5,789,245；EP 1029068A2；PCT国际公布号WO 9918226A2/A3；EP 00907746A2；PCT国际公布号WO9738087A2)、昆虫和酵母系统。

许多这种表达系统的宿主细胞也是本领域已知的。例如，哺乳动物细胞系是本领域已知的，包括获得自美国模式培养物保藏所(A.T.C.C.)的无限增殖细胞系，例如(但不限于)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)以及其它细胞。类似地，细菌宿主细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌和链球菌中发现可与本发明构建物一起使用。用于本发明的酵母宿主尤其包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯特毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂亚罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)等。与杆状病毒表达载体一起使用的昆虫细胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等。参见，例如Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。

病毒载体可用于表达真核细胞中的多肽，例如来源于痘病毒科，包括牛痘病毒和禽痘病毒。如Tomei等，J.Virol.(1993)67：4017-4026和Selby等，J.Gen.Virol.(1993)74：1103-1113所述基于牛痘病毒的感染/转染系统也发现可用于本发明。基于牛痘病毒的感染/转染系统可容易地用于提供感兴趣的编码序列在宿主细胞中可诱导地瞬时表达。在该系统中，首先用编码细菌噬菌体T7RNA聚合酶的牛痘病毒重组体在体外感染细胞。该聚合酶显示精细的特异性在于它仅转录携带T7启动子的模板。感染后，由T7启动子驱动用感兴趣的多核苷酸转染细胞。表达于细胞质中的牛痘病毒重组体的聚合酶将转染的DNA转录为RNA，然后RNA通过宿主的翻译装置翻译为蛋白质。该方法提供高水平、瞬时、细胞质产生的大量RNA及其翻译产物。参见，例如Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：6743-6747；Fuerst等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：8122-8126。

用牛痘病毒或禽痘病毒重组体感染的另一种方法可使用扩增系统，该系统在引入宿主细胞后导致高水平表达。特别是T7RNA聚合酶编码区域之前的T7RNA聚合酶启动子可改造。翻译来源于该模板的RNA产生T7RNA聚合酶，进而转录更多模板。同时存在T7启动子控制下表达的cDNA。因此，从扩增模板RNA的翻译产生的一些T7RNA聚合酶导致所需基因的转录。由于启动扩增需要一些T7RNA聚合酶，可将T7RNA聚合酶与模板一起引入细胞以引发转录反应。聚合酶可以蛋白质或编码RNA聚合酶的质粒引入。为进一步讨论用于转化细胞的T7系统及其用途，参见，例如PCT国际公布号WO94/26911；Studier和Moffatt，J.Mol.Biol.(1986)189：113-130；Deng和Wolff，Gene(1994)143：245-249；Gao等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1994)200：1201-1206；Gao和Huang，Nuc.Acids Res.(1993)21：2867-2872；Chen等，Nuc.Acids Res.(1994)22：2114-2120和美国专利号5,135,855。

这些载体转染入合适的宿主细胞。然后在合适的条件下培养该细胞系并在上清液中评估任何合适的多肽产物的水平。例如，p24可用于评估Gag表达；gp160、gp140或gp120可用于评估Env表达；p6pol可用于评估Pol表达；prot可用于评估蛋白酶；p15用于RNA酶H；p31用于整合酶；其它合适的多肽用于Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu和Nef。

此外，修饰的多肽也可用于，例如其它Env多肽，包括(但不限于)如天然gp160、寡聚gp140、单体gp120以及这些多肽的修饰和/或合成的序列。

Western印迹分析可用于显示含有合成的表达盒的细胞产生期望的蛋白质，该蛋白质的每个细胞的浓度一般高于含有天然表达盒的细胞。细胞裂解物和上清液中均可见HIV蛋白质。

与野生型序列相比，用合成的表达盒转染的哺乳动物细胞的上清液分级显示该表达盒提供产生较多的HIV蛋白质。

这些含有HIV的多肽在哺乳动物细胞系中的有效表达具有以下好处：多肽不含杆状病毒污染物；用已建立方法进行的生产由FDA批准；纯度增加；产量更高(与天然编码序列相比)；与一种在CHO细胞中产生含有SubHIV的多肽的新颖方法，这在没有用本发明构建物获得表达增加的情况下是做不到的。示范性的哺乳动物细胞系包括(但不限于)BHK、VERO、HT1080、293、293T、RD、COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、MOLT4/克隆8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM和CEMX174(例如这种细胞系可获得自A.T.C.C.)。

所需的多肽编码序列可克隆入任何数量的可市售载体以在合适的宿主系统中表达多肽。这些系统包括(但不限于)：杆状病毒表达{Reilly，P.R.等，《杆状病毒表达载体：实验室手册》(BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL)，(1992)；Beames等，Biotechniques11：378(1991)；Pharmingen；Clontech，Palo Alto，CA}，牛痘表达{Earl，P.L.等，“使用牛痘在哺乳动物细胞中表达蛋白质”(Expression of proteins inmammalian cells using vaccinia)，《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，(F.M.Ausubel等编)，Greene PublishingAssociates & Wiley Interscience，New York(1991)；Moss，B.等，1992年8月4日颁发的美国专利号5,135,855}，在细菌中表达{Ausubel，F.M.等，《新编分子生物学实验指南》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY)，John Wiley and Sons，Inc.，Media PA；Clontech}，在酵母中表达{Rosenberg，S.和Tekamp-Olson，P.，1998年3月17日颁发的美国专利号RE35,749；Shuster，J.R.，1997年5月13日颁发的美国专利号5,629,203；Gellissen，G.等，Antonie Van Leeuwenhoek，62(1-2)：79-93(1992)；Romanos，M.A.等，Yeast8(6)：423-488(1992)；Goeddel，D.V.，Methods in Enzymology185(1990)；Guthrie，C.和G.R.Fink，Methods in Enzymology 194(1991)}，在哺乳动物细胞中表达{Clontech；Gibco-BRL，Ground Island，NY；例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(Haynes，J.等，Nul.Acid.Res.11：687-706(1983)；1983，Lau，Y.F.等，Mol.Cell.Biol.4：1469-1475(1984)；Kaufman，R.J.，“异源基因在哺乳动物细胞中的选择和共同扩增”(Selection and coamplificationof heterologous genes in mammalian cells)，《酶学方法》(Methods inEnzymology)，185卷，537-566页，Academic Press，Inc.，San DiegoCA(1991))，和在植物细胞中表达{植物克隆载体，Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA和Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.，Pistcataway，NJ；Hood，E.等，J.Bacteriol.168：1291-1301(1986)；Nagel，R.等，FEMSMicrobiol.Lett.67：325(1990)；An等，“二员载体”(Binary Vectors)，《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology Manual)A3：1-19(1988)；Miki，B.L.A.等，249-265页所述的其它载体，与《植物DNA感染剂》(Plant DNAInfectious Agents)，(Hohn，T.等编)Springer-Verlag，Wien，Austria，(1987)所述的其它载体；《植物分子生物学：基本技术》(Plant Molecular Biology：Essential Techniques)，P.G.Jones和J.M.Sutton，New York，J.Wiley，1997；Miglani，《Gurbachan植物遗传学和分子生物学词典》(Gurbachan Dictionaryof Plant Genetics and Molecular Biology)，New York，Food Products Press，1998；Henry，R.J.，《植物分子生物学实践应用》(Practical Applications ofPlant Molecular Biology)，New York，Chapman & Hall，1997}。

除了哺乳动物、昆虫和酵母载体以外，本发明的合成表达盒可用选择的表达控制元件掺入各种表达载体中。本领域的普通技术人员可根据本说明书的指导和本领域关于表达载体的已知信息来选择任何给定细胞的合适载体和控制元件。

例如，合成的编码序列可插入含有操作性连接于所需编码序列的控制元件的载体，这些元件允许编码序列在选择的细胞类型中表达。例如，典型的哺乳动物细胞表达的启动子含有SV40早期启动子，CMV启动子，如CMV立即早期启动子(可含有内含子A的CMV启动子)，RSV，HIV-Ltr，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子(MMLV-ltr)，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和单纯疱疹病毒启动子等。其它非病毒启动子，例如来源于鼠金属硫蛋白基因的启动子也发现可用于哺乳动物表达。转录终止和聚腺苷酸化序列一般也存在于翻译终止密码子的3’。用于优化翻译起始的序列也优选存在于编码序列的5’。转录终止子/聚腺苷酸化信号的例子包括如Sambrook等，同上所述来源于SV40的以及牛生长激素终止子序列。本发明使用的构建物也可设计有包含剪接供体和受体位点的内含子(Chapman等，Nuc.AcidsRes.(1991)19：3979-3986)。

本文也使用增强子元件来增加哺乳动物构建物的表达水平。例子包括Dijkema等，EMBO J.(1985)4：761所述的SV40早期基因增强子，Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79：6777所述来源于Rous肉瘤病毒的长末端重复(LTR)的增强子/启动子和Boshart等，Cell(1985)41：521所述的来源于人CMV的元件，例如包含于CMV内含子A序列中的元件(Chapman等，Nuc.AcidsRes.(1991)19：3979-3986)。

本发明也包括含有编码序列和允许编码区域在合适宿主中表达的表达控制元件的表达盒。控制元件一般包括启动子、翻译起始密码子与翻译和转录终止序列，与用于将插入物引入载体的插入位点。用于表达本发明多肽的翻译控制元件见M.Kozak的综述(例如，Kozak，M.，Mamm.Genome7(8)：563-574，1996；Kozak，M.，Biochimie 76(9)：815-821，1994；Kozak，M.，J Cell Biol 108(2)：229-241，1989；Kozak，M.和Shatkin，A.J.，Method.Enzymol 60：360-375，1979)。

在酵母系统中表达具有商业生产的优点。由牛痘和CHO细胞系生产重组蛋白具有用哺乳动物表达系统的优点。此外，牛痘病毒表达具有以下几个优点：(i)宿主范围广；(ii)重组蛋白质的精确转录后修饰、加工、折叠、转运、分泌和装配；(iii)相对可溶溶重组蛋白质的表达水平高；和(iv)容纳外来DNA的能力高。

免疫原性HIV多肽编码表达盒的重组表达的多肽一般从裂解的细胞或培养基中分离。可用本领域已知的方法，包括分级盐析、离子交换层析、凝胶过滤、体积排阻层析、大小分级和亲和层析来纯化。可利用基于，例如HIV抗原产生的抗体来进行免疫亲和层析。分离寡聚形式的HIV包膜蛋白已见描述(参见，例如PCT国际申请号WO/00/39302)。

使用哺乳动物细胞表达本发明的蛋白质的优点包括(但不限于)：良好建立的用于按比例放大生产的方法；符合优质生产规范(GMP)标准的细胞系；哺乳动物细胞的培养条件本领域已知。

2.3.5与本发明的多肽组分一起使用的免疫原性增强组分

在哺乳动物中产生免疫应答含有多核苷酸组分和多肽组分的本发明组合物可含有各种赋形剂、佐剂、运载体、辅助物质、调节剂等。本发明组合物的多肽组分含有的多肽量足以引起免疫应答。本领域的技术人员可确定合适的有效量。

多肽组分可含有运载体，其中所述运载体是本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的分子。合适的运载体一般是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(例如油滴或脂质体)和灭活的病毒颗粒。颗粒运载体的例子包括来源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的颗粒以及来源于聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，称为PLG。参见，例如Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10：362-368；McGee JP等，J Microencapsul.14(2)：197-210，1997；O′HaganDT等，Vaccine  11(2)：149-54，1993。这种运载体是本领域的普通技术人员已知的。此外，这些运载体可起到免疫刺激剂的作用(“佐剂”)。抗原还可与细菌类毒素，例如来源于白喉、破伤风、霍乱等的类毒素以及来源于大肠杆菌的毒素偶联。

也可使用佐剂来增强组合物的效力。这种佐剂包括(但不限于)：(1)铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳剂(有或没有其它免疫刺激剂，例如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁组分)，例如(a)使用微流化器，例如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制进亚微米颗粒，含有5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选含有各种量的MTP-PE(见下文)，但不是必需的)的MF59(PCT国际公布号WO 90/14837)，(b)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克-阻断的聚合物L121和thr-MDP(见下文)，微流化入亚微米乳剂或涡流以产生较大粒径乳剂的SAF，和(c)含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和选自单磷酸脂质A(MPL)、岩藻糖二分支菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，优选MPL+CWS(Detox^TM)的Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)；(3)可使用皂苷佐剂，例如Stimulon^TM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或从中产生颗粒，例如ISCOM(免疫刺激复合物)；(4)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(5)细胞因子，例如白介素(IL-1、IL-2等)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)编码免疫刺激CpG基序的寡核苷酸或聚合分子(Davis，H.L.等，J.Immunology160：870-876，1998；Sato，Y.等，Science 273：352-354，1996)或抗原/寡核苷酸复合物(聚合分子含有双链或单链RNA和DNA，其骨架修饰物，例如甲基膦酸酯键)；或(7)细菌ADP-核糖基化毒素的解毒突变体，例如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)、特别是LT-K63(其中赖氨酸取代63位的野生型氨基酸)、LT-R72(其中精氨酸取代72位的野生型氨基酸)、CT-S109(其中丝氨酸取代109位的野生型氨基酸)和PT-K9/G129(其中赖氨酸取代9位的和甘氨酸取代129位的野生型氨基酸)(参见，例如PCT国际公布号WO/93/13202和WO/92/19265)；(8)胞壁酰肽包括(但不限于)N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1-2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酸氧基)-乙胺(MTP-PE)等；(9)Iscomatrix(CSLLimited，Victoria，Australia；也参见，例如Morein B，Bengtsson KL，“由iscom，免疫刺激复合物进行的免疫调节”(Immunomodulation by iscoms，immune stimulating complexes)，Methods.9月；19(1)：94-102，1999)和(10)作为免疫刺激剂增强组合物效力的其它物质(例如，明矾和CpG寡核苷酸)。

优选的佐剂包括(但不限于)MF59和Iscomatrix。

用本发明的免疫刺激组合物的多肽组分进行的剂量治疗可是单剂量方案或多剂量方案。多剂量方案是其中接种疫苗的基础过程为1-10份单独剂量，然后以后续时间间隔给予其它剂量，来维持和/或加强免疫应答，例如以1-4个月的间隔给予第二剂量，如果需要几个月后给予后续剂量。剂量方案至少部分由对象的需要来确定并取决于医师的判断。

直接递送本发明的产生免疫应答组合物的多肽组分一般可在有或没有佐剂时，用常规注射器或基因枪，例如Accell

基因递送系统(PowderJectTechnologies，Inc.，牛津，英格兰)通过注射来实现。这些多肽可通过皮下、表皮、皮内、粘膜内(例如鼻、直肠和阴道)、腹膜内、静脉内、口服或肌肉内注射。其它给药方式包括口服和肺部给药、栓剂、无针头注射。剂量治疗方案可是单剂量方案或多剂量方案。多肽可与佐剂或其它物质联合给予。

2.3.6免疫调节分子

在本发明的一些实施方案中，基于转移载体可构建为编码细胞因子或其它免疫调节分子。例如，编码天然IL-2和γ干扰素的核酸序列可分别如美国专利号4,738,927和5,326,859所述获得，而这些蛋白质的有用突变蛋白可如美国专利号4,853,332所述获得。编码短和长形式的mCSF的核酸序列可分别如美国专利号4,847,201和4,879,227所述获得。本发明的具体方面可产生表达细胞因子或免疫调节基因的逆转录载体(例如，题为“用于癌症免疫治疗的组合物和方法”(Compositions and Methods for CancerImmunotherapy)的PCT国际公布号WO/94/02951)。

本文使用的合适的免疫调节分子的例子包括：IL-1和IL-2(Karupiah等，(1990)J Immunology144：290-298；Weber等，(1987)J.Exp.Med.166：1716-1733；Gansbacher等，(1990)J.Exp.Med.172：1217-1224和美国专利号4,738,927)；IL-3和IL-4(Tepper等，(1989)Cell 57：503-512；Golumbek等，(1991)Science 254：713-716和美国专利号5,017,691)；IL-5和IL-6(Brakenhof等，(1987)J Immunol.139：4116-4121和PCT国际公布号WO90/06370)；IL-7(美国专利号4,965,195)；IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12和IL-13(“细胞因子公报”(Cytokine Bulletin)，1994年夏)；IL-14和IL-15；α干扰素(Finter等，(1991)Drugs 42：749-765；美国专利号4,892,743和4,966,843；PCT国际公布号WO 85/02862；Nagata等，(1980)Nature284：316-320；Familletti等，(1981)Methods in Enz.78：387-394；Twu等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2046-2050和Faktor等，(1990)Oncogene5：867-872))；β-干扰素(Seif等，(1991)J Virol.65：664-671)；γ-干扰素(Radford等，(1991)The American Society of Hepatology 20082015；Watanabe等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9456-9460；Gansbacher等，(1990)CancerResearch 50：7820-7825；Maio等，(1989)Can.Immunol.Immunother.30：34-42和美国专利号4,762,791和4,727,138)；G-CSF(美国专利号4,999,291和4,810,643)；GM-CSF(PCT国际公布号WO 85/04188)。

免疫调节因子夜可是这些分子的激动剂、拮抗剂或配体。例如，由于可溶形式受体能改变因子本身的形状，它们经常可作为这些类型因子的拮抗剂。

编码上述物质的核酸分子以及有利于用于本发明的其它核酸分子可容易地从各种来源获得，包括例如保藏所，如美国模式培养物保藏所或来自商业来源，如British Bio-Technology Limited(Cowley，牛津，英格兰)代表性的例子包括BBG12(含有编码127个氨基酸的成熟蛋白的GM-CSF基因)、BBG6(含有编码γ干扰素的序列)、A.T.C.C.保藏号39656(含有编码TNF的序列)、A.T.C.C.保藏号20663(含有编码α干扰素的序列)、A.T.C.C.保藏号31902、31902和39517(含有编码β-干扰素的序列)、A.T.C.C.保藏号67024(含有编码白介素-1b的序列)、A.T.C.C.保藏号39405、39452、39516、39626和39673(含有编码白介素-2的序列)、A.T.C.C.保藏号59399、59398和67326(含有编码白介素-3的序列)、A.T.C.C.保藏号57592(含有编码白介素-4的序列)、A.T.C.C.保藏号59394和59395(含有编码白介素-5的序列)和A.T.C.C.保藏号67153(含有编码白介素-6的序列)。

含有细胞因子基因或免疫调节基因的质粒(PCT国际公布号WO94/02951和WO 96/21015)可用合适的限制性酶消化，含有特定的感兴趣基因的DNA片段可使用标准分子生物学技术插入基因转移载体(参见，例如Sambrook等，同上或Ausubel等编，《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Greene Publishing and Wiley-Interscience)。

编码上述分子的多核苷酸序列可用重组方法获得，例如通过从表达基因的细胞中筛选cDNA或基因组文库，或从含有该序列的已知载体中获得基因。例如，含有编码改变的细胞产物的序列的质粒可从保藏所获得，如A.T.C.C.或来自商业来源。含有感兴趣的多核苷酸序列的质粒可用合适的限制性酶消化，含有多核苷酸序列的DNA片段可用标准分子生物学技术插入基因转移载体。

或者，用于本发明的cDNA序列可用标准技术从表达或含有该序列的细胞中获得，所述技术例如cDNA或基因组DNA的苯酚提取和PCR。用于获得和分离DNA的技术描述于，例如Sambrook等，同上。简言之，可使用寡聚-dT或随机引物，用逆转录酶逆转录表达感兴趣基因的细胞的mRNA。然后可用与所需序列的任一侧上序列互补的寡核苷酸引物，通过PCR扩增单链cDNA(参见美国专利号4,683,202；4,683,195和4,800,159；也参见《PCR技术：DNA扩增的原理和应用》(PCR Technology：Principlesand Applications for DNA Amplification)，Erlich编，Stockton Press，1989)。

除了克隆以外，感兴趣的核苷酸序列也可使用DNA合成仪(例如，392型应用生物系统DNA合成仪，ABI，Foster City，California)来合成产生。可用表达产物所需的合适的密码子来设计核苷酸序列。完整的序列从用标准方法制备的重叠寡核苷酸装配并装配成完整的编码序列。参见，例如Edge，Nature(1981)292：756；Nambair等，Science(1984)223：1299；Jay等，JBiol.Chem.(1984)259：6311。

2.4.0在受治疗对象中产生免疫应答

为评价效力，可采用本发明多核苷酸组分进行的核酸免疫(例如，分别含有gp140编码序列的两个表达盒，其中每条编码序列来源于不同的HIV亚型、血清型或毒株)与用本发明多肽组分的抗原性免疫(例如，寡聚gp140，其中编码序列来源于多核苷酸组分中所代表的HIV亚型、血清型或毒株的一种)。

实施例2描述了在小鼠中评估用于诱导免疫应答的本发明组合物的免疫原性。所述多核苷酸组分含有两个pCMVKM2，每个携带具有delV2的gp140的密码子优化编码序列，第一编码序列来源于SF162、亚型B，第二编码序列来源于TV1、亚型C。然后用来源于SF162、亚型B、具有delV2的gp140密码子优化的寡聚多肽免疫小鼠。评估体液和细胞免疫应答。这些测定的结果用于显示在小鼠中产生免疫应答的本发明多核苷酸/多肽免疫方法的效力。

实施例3描述了可在各种实验室动物(包括小鼠、豚鼠、家兔、恒河猴和狒狒)中进行的体内免疫研究。这些研究的结果证实产生免疫应答，特别是产生广泛且强有力的抗各种HIV毒株的中和活性的本发明组合物和方法的有效性。

实施例4描述了支持本发明而进行的实验，这些实验评估了用作引发的各种HIV多肽编码质粒和用作加强的各种HIV多肽的免疫原性方案。该实施例使用以下编码gp140蛋白的载体：pCMV gp140 dV2 SF162 DNA和pCMV gp140 dV2 TV1 DNA。这些载体含有编码来源于两种不同HIV亚型，亚型B(SF162)和亚型C(TV1)的gp140蛋白的表达盒。两种构建物中均删除了V2环，编码序列是在人细胞中表达的优化密码子。特定的gp140多核苷酸已见描述(例如，gp140.modSF162.delV2、图6和gp140.mut7.modSF162.delV2、图7，也参见PCT国际公布号WO/00/39302；与gp140mod.TV1.delV2、图8和gp140mod.TV1.mut7.delV2、图9，也参见PCT国际公布号WO/02/04493)。评估了本发明组合物和方法产生中和抗体的能力。存在中和抗体的测定结果示于图4和图5。

图4总结的数据显示7个实验组之间抗HIV-1SF162的中和滴度。这些结果证实所有组均显示抗HIV-1 SF162分离物的强中和活性。此外，与第3次免疫后相比，中和活性在第4次免疫后显著增加。就混合的(B+C)DNA引发和单次蛋白质加强而言，B蛋白与C蛋白(B+C DNA+C蛋白)一样，得到针对混合的基因引发(B+C DNA+B蛋白)的高加强免疫。就混合的DNA引发和蛋白质加强而言，半剂量(50μg)的蛋白(B+C DNA和蛋白(1/2))诱导至少与全剂量(100μg)蛋白(B+C DNA和蛋白)一样的中和活性。

图5总结的数据显示7个实验组之间抗HIV-1TV1(南非亚型C)的中和滴度。这些结果证实所有组均显示抗HIV-1亚型C TV1分离物的中和活性(如预期一样，由于未使用亚型C DNA或蛋白，B DNA+B蛋白显示最低的中和活性)。就失配的单次DNA引发和单次蛋白质加强(C DNA+B蛋白)而言，用C基因引发和用B蛋白加强与用B基因和B蛋白(B DNA+B蛋白)一样显示高滴度。就混合的(B+C)DNA引发和单次蛋白质加强而言，使用B(B+C DNA+B蛋白)与C(B+C DNA+C蛋白)蛋白具有相似的加强作用。

比较图4和图5中的数据支持了在对象中产生免疫应答以及在免疫的对象中产生中和抗体的本发明组合方法，这些数据显示结合来源于不同亚型的DNA引发针对多种亚型的广泛应答。这可能是针对亚型和/或序列特异性连续和/或不连续免疫原性表位的组合应答以及针对本文所用寡聚V2缺失的Env免疫原中的共同保守表位呈递的应答的结果。此外，当免疫力是用多种亚型的DNA引发时，用单一亚型蛋白足以加强广泛的中和应答。这些结果也证实使用较低剂量蛋白质混合物也可提供强的免疫应答。

实施例5提供的数据证实可用某给定亚型的第一HIV毒株(例如，HIV-1MN)的包膜蛋白免疫对象(在该实施例中是黑猩猩)，用同一亚型的第二HIV毒株(例如，HIV-1 SF162)的包膜蛋白加强免疫并产生抗两种HIV毒株的中和抗体(例如参见，表11，实施例5)。实施例5的数据支持了本发明的组合方法可用于产生抗来自同一亚型的多种病毒毒株的广泛中和抗体。结合实施例4和实施例5所示的数据证实这种HIV毒株可在同一亚型内或来自不同的亚型。

这些研究的结果证实本发明组合物(例如，含有多核苷酸组分和多肽组分)和方法产生免疫应答，特别是产生广泛且强有力的抗各种HIV亚型和毒株的中和活性的有效性。本发明很明显可用于引发抗各种抗原的免疫应答从而治疗或预防感染，特别是HIV感染。

3.0.0将本发明应用于HIV

尽管不想受任何具体的模型、理论或假说的束缚，提供以下信息为了更完全地了解本发明。

抗HIV感染的保护作用可能需要在接触病毒侵袭的接种个体中预先存在强有力且广泛的反应性中和抗体。虽然需要细胞免疫应答来控制受感染个体中的病毒血症，但未证实仅依赖诱导这些应答的疫苗方法可提供保护作用。鉴于此，支持本发明而进行的实验使用组合引发-加强方法，该方法用多核苷酸组分和多肽组分，其中多肽组分编码，例如来自初级HIV分离物(例如，R5亚型B(HIV-1_SF162)和亚型C(HIV-1_TV1)毒株)的V缺失包膜抗原，多肽组分含有这些抗原中的至少一种。

本发明的多核苷酸组分可通过增强的DNA或RNA[聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)微粒制剂或电穿孔]、基于腺病毒的载体、甲病毒复制子或复制子颗粒、多核苷酸或基于颗粒的疫苗方法来递送。通过电透化作用在体内有效表达编码基因的质粒已见描述(参见，例如Zucchelli等，(2000)J.Virol.74：11598-11607；Banga等，(1998)Trends Biotechnol.10：408-412；Heller等，(1996)Febs Lett.389：225-228；Mathiesen等，(1999)Gene Ther.4：508-514；Mir等，(1999)Proc.Nat′lAcad Sci.USA 8：4262-4267；Nishi等，(1996)Cancer Res.5：1050-1055)。本发明的多肽组分可通过，例如以MF59或Iscomatrix佐剂配制的Env蛋白加强免疫而给予。

所有蛋白制剂均高度纯化并用生物物理和免疫化学方法全面鉴定。家兔免疫原性研究的结果表明可持续诱导抗各种HIV毒株的广泛中和抗体应答(实施例4)。此外，也可用组合引发-加强疫苗方案来产生强有力的HIV抗原特异性CD4+和CD8+T-细胞应答。

虽然任何病毒蛋白也可用于实践本发明，但在优选的实施方案中，V1-、V2-和/或V3-修饰/缺失的包膜DNA和相应的多肽是用于本发明组合物的良好候选对象。

本发明这方面的一个实施方案通常如下所述。选择用于疫苗组合物的抗原。编码Env多肽的多核苷酸和Env多肽一般用于产生免疫应答的组合物，该组合物含有多核苷酸组分和多肽组分。

核酸引发后通常有至少一次多肽加强。加强免疫可包括，例如辅助的HIV衍生多肽(例如，类似于用在DNA疫苗接种中的)、病毒载体编码的HIV衍生多肽的编码序列(例如，类似于用在DNA疫苗接种中的)。加强免疫还可包括DNA疫苗接种和/或上述的组合。

此外，相比于初始疫苗接种，不同多肽抗原可用于加强，反之亦然。另外，初始核酸疫苗接种可是含有DNA表达盒构建物的病毒载体。

设计HIV包膜疫苗要考虑的一些因素是：有效的HIV疫苗的基本标准是其诱导广泛且强有力的抗流行性HIV毒株的中和抗体应答的能力。中和抗体在预防HIV、SIV和SHIV感染的发生或延迟疾病发作中的重要作用是几项研究的重点。首先，中和耐受性病毒在受感染动物的疾病发生的同时或之前出现(Burns(1993)JVirol.67：4104-13；Cheng-Mayer等，(1999)J.Virol.73：5294-5300；Narayan等，(1999)Virology 256：54-63)。第二，在受HIV、SIV或SHIV病毒侵袭之前在弥猴、黑猩猩和SCID小鼠的血液循环系统中预先输注高浓度的强中和单克隆抗体(mAb)提供了保护作用或延迟疾病发生(Conley等，(1996)J.Virol.70：6751-6758；Emini等，(1992)Nature(London)355：728-730；Gauduin等，(1997)Nat Med.3：1389-93；Mascola等，(1999)JVirol.73：4009-18；Mascola等，(2000)Nature Med.6(2)：207-210；Baba等，(2000)Nature Med.6(2)：200-206)。类似地，给天然豚尾弥猴(pig-tailedmacaques)输注收集自HIV-1感染的黑猩猩血清中的中和抗体保护后者动物免受后来SHIV病毒的侵袭(Shibata等，(1999)Nature Medicine 5：204-210)。此外，基于包膜的疫苗证实在非人灵长类模型中有抗感染的保护作用。不含Env多肽的疫苗一般赋予较弱的保护效力(参见，例如Hu，S.L等，“作为研究抗灵长类慢病毒感染的相关方法的重组亚单位疫苗”(Recombinantsubunit vaccines as an approach tostudy correlates of protection againstprimate lentivirus infection)，Immunol Lett.6月；51(1-2)：115-9(1996)；Amara，R.R.等，“Env以及Gag-Pol在用DNA引发/重组修饰的牛痘病毒Ankara疫苗控制猿-人免疫缺陷病毒89.6P侵袭中的关键作用”(Critical rolefor Env as well as Gag-Pol in control of a simian-human immunodeficiencyvirus 89.6P challenge by a DNA prime/recombinant modified vaccinia virusAnkara vaccine)，J Virol.6月；76(12)：6138-46(2002))。

来源于SF2 lab毒株的单体gp120蛋白在灵长类模型中中和HIV-1lab毒株并防止病毒侵袭(Verschoor，E.J.等，(1999)，“比较核酸、MF59和ISCOM-配制的HIV-1 gp120疫苗在恒河猴中产生的免疫力”(Comparison ofimmunity generated by nucleic acid，MF59 and ISCOM-formulated HIV-1gp120 vaccines in rhesus macaques)，J.Virology 73：3292-3300)。来源于Thai E野外菌株的初级gp120蛋白提供lab毒株的交叉亚型中和作用(VanCott，T.C.等，(1999)“用基于R5 1型原始人免疫缺陷病毒包膜的亚型E gp 120免疫原在狒狒中诱导交叉亚型中和抗体”(Cross-subtype neutralizing antibodiesinduced in baboons by a subtype E gp120 immunogen based on an R5 primaryhuman immunodeficiency virus type 1 envelope)，J.Virology 73：4640-4650)。原始亚型B寡聚o-gp140蛋白提供对亚型B原始(野外)分离物的部分中和作用(Barnett，S.W.等，(2001)“部分删除第二超变区后提高了寡聚HIV-1包膜抗原引发抗原始HIV-1分离物的中和抗体的能力”(The ability of anoligomeric HIV-1envelope antigen to elicit neutralizing antibodies againstprimary HIV-1isolates is improved following the partial deletion of the secondhypervariable region)，J.Virology，75：5526-5540)。原始亚型B o-gp140 delV2DNA引发加上蛋白质加强在灵长类模型中提供强有力中和各种亚型B原始分离物并防止病毒侵袭(Cherpelis，S.等，(2000)“疫苗诱导的抗包膜抗体为CD8+T-细胞缺失恒河猴提供对SHIV感染的部分保护作用”(Vaccine-induced anti-envelope antibodies offer partial protection from SHIVinfection to CD8+T-cell depleted rhesus macaques)，J.Virology，75，1547-1550)。

可通过构建暴露保守的中和表位的包膜多肽结构来协助诱导强有力、广泛反应性中和抗体的疫苗方案，例如可变区的修饰/缺失和去糖基化、包膜蛋白受体复合物、基于晶体结构(例如，β-片层缺失)的合理设计和基于免疫原的gp41-融合结构域。

使用优化的包膜多肽编码序列开发了用于包膜蛋白生产的稳定CHO细胞系，所述序列包括(但不限于)：gp120、o-gp140、gp120delV2、o-gp140delV2、gp120delV1V2、o-gp140delV1V2。

示范性的抗原组合物和支持本发明组合物和方法的免疫原性研究示于实施例4。

在用于哺乳动物中产生免疫应答的本发明组合物的第一具体方面，本发明的多核苷酸组分基本上由编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸组成，多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的HIV免疫原性多肽，前提是多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于不同于多核苷酸组分编码的免疫原性多肽的编码序列的HIV亚型、血清型或毒株。在本文中，基本上由一种编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸组成的多核苷酸组分指在组合物中存在编码一种HIV免疫原性多肽的一种多核苷酸。除了HIV免疫原性多肽，多核苷酸组合物可含有其它组分，例如免疫增强子、免疫调节组分、载体序列(例如，病毒的或非病毒的)、运载体、颗粒、赋形剂、表达控制序列等。在本发明这方面的一个实施方案中，多核苷酸组分编码的HIV免疫原性多肽来源于亚型B毒株，多肽组分的HIV免疫原性多肽的至少一种编码序列来源于亚型C毒株。

在一个实施方案中，在哺乳动物中产生免疫应答的组合物含有基本上由编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸组成的多核苷酸组分，该HIV免疫原性多肽来源于第一亚型的第一HIV毒株；和含有一种或多种HIV免疫原性多肽的多肽组分，该HIV免疫原性多肽类似于该多核苷酸组分编码的多肽；前提是多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于第一亚型的第二HIV毒株，其中第一和第二毒株不同。在这方面的一些实施方案中，多核苷酸组分不编码来源于除第一亚型以外任何亚型的类似HIV免疫原性多肽，和多肽组分不含有来源于除第一亚型以外的任何亚型的类似HIV免疫原性多肽。

在用于哺乳动物中产生免疫应答的本发明组合物的第二具体方面，多核苷酸组分含有两种或多种多核苷酸序列，该序列含有两种或多种类似的HIV免疫原性多肽的编码序列，其中至少两种HIV免疫原性多肽的编码序列来源于不同亚型、血清型或毒株，多肽组分含有一种或多种类似于所述多核苷酸组分编码的多肽的HIV免疫原性多肽，前提是(i)如果该多肽组分提供的多肽少于该多核苷酸组分编码的类似HIV免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的HIV免疫原性多肽可来源于与该多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽相同和/或不同的HIV亚型、血清型或毒株，或(ii)如果该多肽组分提供的多肽相同或大于该多核苷酸组分编码的类似HIV免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的至少一种HIV免疫原性多肽来源于与该多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV亚型、血清型或毒株。

在一个实施方案中，本发明包括用于在对象中产生免疫应答的组合物，其中所述组合物含有编码免疫原性HIV多肽的多核苷酸和来源于不同HIV亚型、血清型或毒株的类似HIV免疫原性多肽。编码HIV免疫原性HIV多肽的多核苷酸用于经递送多核苷酸(例如，引发)来免疫，而来源于不同HIV亚型、血清型或毒株的类似免疫原性HIV多肽免疫用于免疫(例如，加强)。例如，一种DNA分子用于核酸免疫，其中所述DNA分子编码的HIV包膜多肽(i)来源于HIV亚型C分离物，和(ii)对密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。该DNA免疫之后用来源于HIV亚型B分离物的HIV包膜多肽进行蛋白质加强。示范性包膜多肽包括(但不限于)gp120、gp140、寡聚gp140和gp160，包括其突变形式(例如，缺失V2环)。本发明这方面的一个实施方案包括用于在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，所述组合物含有：具有编码第一HIV免疫原性多肽的第一多核苷酸的多核苷酸组分；和含有第二HIV免疫原性多肽的多肽组分，其中第一和第二免疫原性HIV多肽可来源于不同的HIV亚型、血清型或毒株，和(ii)第一和第二免疫原性多肽编码类似的HIV多肽。

本发明的第二个实施方案包括用于在对象中产生免疫应答的组合物，其中所述组合物包含：含有两种或多种编码免疫原性HIV多肽的多核苷酸的多核苷酸组分，所述多肽来源于至少两种不同的亚型、血清型或毒株；和具有单一、类似的免疫原性HIV多肽的多肽组分，该HIV免疫原性多肽来源于用于加强的亚型、血清型或毒株的一种。例如，两种DNA分子用于核酸免疫，其中第一DNA分子编码的HIV包膜多肽(i)来源于HIV亚型C分离物，和(ii)对密码子优化以在哺乳动物细胞中表达；第二DNA分子编码的HIV包膜多肽是(i)来源于HIV亚型B分离物，和(ii)对密码子进行优化以在哺乳动物细胞中表达。该DNA免疫之后用来源于(i)HIV亚型B分离物或HIV亚型C分离物的单一HIV包膜多肽进行蛋白质加强。示范性包膜多肽包括(但不限于)gp120、gp140、寡聚gp140和gp160，包括其突变形式(例如，缺失V2环)。本发明这方面的一个实施方案包括用于在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，所述组合物包含：含有编码第一免疫原性HIV多肽的第一多核苷酸和编码第二免疫原性HIV多肽的第二多核苷酸的多核苷酸组分，其中(i)第一和第二免疫原性HIV多肽可来源于不同的HIV亚型，和(ii)第一和第二免疫原性多肽编码类似的HIV多肽；和具有第一HIV免疫原性多肽或第二HIV免疫原性多肽的多肽组分，前提是该多肽组分含有的HIV免疫原性多肽至少比该多核苷酸组分编码的少一种。

在另一个实施方案中，在哺乳动物中产生免疫应答的组合物含有多核苷酸组分，该多核苷酸组分含有两种或多种多核苷酸序列，而这些序列含有两种或多种来源于第一HIV亚型的类似HIV免疫原性多肽的编码序列，其中至少两种该HIV免疫原性多肽的编码序列来源于第一亚型的不同HIV毒株；和含有一种或多种类似于该多核苷酸组分编码的多肽的HIV免疫原性多肽的多肽组分，前提是(i)如果该多肽组分含有的多肽少于该多核苷酸组分编码的类似HIV免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的HIV免疫原性多肽可来源于与该第一亚型相同和/或不同的HIV毒株，或(ii)如果该多肽组分包含的多肽相同或大于该多核苷酸组分编码的类似HIV免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的HIV免疫原性多肽中的至少一种来源于第一亚型的不同HIV毒株；前提是(i)该多核苷酸组分不编码来源于除第一亚型以外任何亚型的HIV免疫原性多肽，和(ii)多肽组分不含有来源于除第一亚型以外的任何亚型的HIV免疫原性多肽。

多核苷酸组分还可含有本文所述的组分(例如，运载体、载体序列、控制序列等)。多肽组分可含有本文所述的其它组分(例如，运载体、佐剂、免疫增强剂等)。

在第三方面，本发明涉及在免疫方法，特别是在本文所述的方法中使用剂量可变的多核苷酸和多肽(例如，引发/加强免疫方法)。因此，本发明另一方面提供在对象中产生免疫应答的方法，该方法包括在与所述多核苷酸在所述对象中表达以产生编码的HIV免疫原性多肽相容的条件下给予对象多核苷酸组分，该多核苷酸基本上由编码来源于第一亚型的第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的一种多核苷酸组成；和，给予含有一种或多种类似于所述多核苷酸组分编码的多肽的HIV免疫原性多肽的多肽组分，前提是该多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于第一亚型的第二毒株，其中所述所述第一HIV毒株和所述第二HIV毒株不同。在一个实施方案中，多核苷酸组分不编码来源于除第一亚型以外任何亚型的类似HIV免疫原性多肽，多肽组分不含有来源于除第一亚型以外任何亚型的类似HIV免疫原性多肽。

本发明另一方面提供在对象中产生免疫应答的方法，该方法包括在与所述多核苷酸在所述对象中表达以产生编码的HIV免疫原性多肽相容的条件下给予对象多核苷酸组分，而该多核苷酸组分含有的多核苷酸含有来源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的编码序列；和，给予含有一种或多种类似于所述多核苷酸组分编码的多肽的HIV免疫原性多肽的多肽组分，前提是如果该多肽组分含有的多肽相同或大于该多核苷酸组分编码的类似HIV免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的HIV免疫原性多肽中的至少一种来源于不同于多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽的第一(亚型)的HIV毒株。多核苷酸组分能编码来源于任何亚型的类似HIV免疫原性多肽，多肽组分可含有来源于该亚型或除第一亚型以外另一种亚型的任何其它毒株的类似HIV免疫原性多肽。

在另一方面，本发明提供一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括：

提供一种含有多核苷酸组分和多肽组分的组合物，

所述多核苷酸组分基本上由编码来源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸组成，

所述多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的HIV免疫原性多肽，前提是所述多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于第二HIV毒株，其中所述第一和第二毒株不同并且可来源于相同或不同亚型；

在与所述多核苷酸在所述对象中表达以产生编码的HIV免疫原性多肽相容的条件下，给予所述对象以含有所述组合物的所述多核苷酸组分的多核苷酸的基因递送载体；和

给予所述对象以所述多肽组分。

在另一个方面，本发明提供一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括：

提供一种含有多核苷酸组分和多肽组分的组合物，所述多核苷酸组分含有两种或多种多核苷酸序列，而所述序列含有来源于第一HIV亚型的两种或多种类似的HIV免疫原性多肽的编码序列，其中至少两种HIV免疫原性多肽的编码序列来源于第一亚型的不同HIV毒株，所述多肽组分含有一种或多种类似于所述多核苷酸组分编码的多肽的HIV免疫原性多肽，前提是如果该多肽组分含有的多肽相同或大于该多核苷酸组分编码的类似免疫原性多肽的数目，则该多肽组合物的至少一种HIV免疫原性多肽来源于不同于所述多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽的第一亚型的HIV毒株；

在与所述多核苷酸在所述对象中表达相容的条件下，将一种或多种基因递送载体给予对象来产生编码的HIV免疫原性多肽，所述载体含有该组合物的所述多核苷酸组分的多核苷酸；和

给予所述对象以所述多肽组分。

在使用，例如混合多核苷酸引发(即，编码来源于两种或多种HIV血清型、亚型或毒株的免疫原性HIV多肽的两种或多种多核苷酸)结合多肽加强的任何免疫方法中，本发明包括使用降低剂量的每种单一组分来提供与使用完全剂量的每种组分等效的免疫应答。在一个实施方案中，DNA的高阈值是DNA的最高耐受剂量(例如，约5mg-10mg总DNA)、DNA的低阈值是最低有效剂量(例如，约2μg-10μg总DNA)、蛋白质的高阈值是蛋白质的最高耐受剂量(例如，约1mg总蛋白质)、蛋白质的低阈值是最低有效剂量(例如，约2μg总蛋白质)。支持本发明进行的实验证实将总的DNA剂量分在多核苷酸组分的多核苷酸中的效力(例如，实施例4)。此外，支持本发明进行的实验(例如，实施例4)证实将总的多肽剂量分在含有多肽组分的多肽中的效力。总DNA和总蛋白质一般超过低阈值。

在优选的实施方案中，在给定的DNA免疫方案中的DNA总量具有低于或等于约10mg总DNA和大于或等于1mg总DNA的高阈值，在给定的多肽加强方案中的蛋白质总量具有低于或等于约200μg总蛋白质产物和大于或等于10μg总蛋白质的高阈值。例如，在使用具有两种DNA分子的多核苷酸组分的一个实施方案中，所述每种DNA分子编码免疫原性HIV多肽，就编码免疫原性HIV多肽的每种DNA分子而言，每位对象使用的每种DNA分子的剂量可是1mg，对于两种DNA分子而言总共是2mg，或是0.5mg编码免疫原性HIV多肽的每种DNA分子，对于两种DNA分子而言总共是1mg。使用多肽组分给药可类似地变化，例如，使用具有两种免疫原性HIV多肽的多肽组分，就每种多肽而言，每位对象使用的剂量可是100μg，对于两种多肽而言总共是200μg，或是50μg每种免疫原性HIV多肽，对于两种多肽而言总共是100μg，或是25μg每种免疫原性HIV多肽，对于两种多肽而言总共是50μg。如上所述，本发明的多肽组分可含有多于两种多肽。

在其它实施方案中，本发明的多核苷酸组分可含有一种或多种基因递送载体，所述基因递送载体含有编码免疫原性HIV多肽的多核苷酸。本发明的多肽组分可含有除免疫原性多肽以外的佐剂。本发明也包括用于在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括，在编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸与对象中表达相容的条件下，给予对象以多核苷酸组合物和多肽组合物。多核苷酸和多肽组合物可同时或依次给予。在一个优选的实施方案中，用多核苷酸组分免疫在用至少一种多肽组分免疫之前。此外，单次引发后可进行多次加强，或可使用一系列引发和加强。

用于本发明的示范性包膜蛋白和其编码序列包括(但不限于)gp120、gp140、寡聚gp140和gp160，包括其成熟或修饰的形式(例如，删除V2环、切割位点中突变或在糖基化位点中突变)。在一个实施方案中，修饰以暴露多肽与CCR5受体结合区域的HIV包膜多肽以及编码这种多肽的多核苷酸序列可用于实践本发明。从体液免疫的观点看，产生提供初级分离物的中和作用的免疫应答是有用的，所述初级分离物利用了据信对病毒进入重要的CCR5趋化因子共同受体(Zhu，T.等，(1993)Science 261：1179-1181；Fiore，J.等，(1994)Virology，204：297-303)。这些和其它用于HIV免疫的示范性多核苷酸构建物(例如，各种包膜蛋白编码序列)、制造多核苷酸构建物的方法、相应的多肽产物和制造多肽的方法已在，例如以下文献中描述：PCT国际公布号WO/00/39302；WO/00/39304；WO/02/04493；WO/03/004657；WO/03/004620和WO/03/020876；美国专利号6,602,705和美国公布专利申请号20030143248和20020146683。

虽然参考HIV亚型B和C作为示范性亚型描述了本发明，本发明的组合物和方法可应用于各种HIV亚型、血清型或毒株及其编码的免疫原性多肽，包括(但不限于)：HIV-1亚型A-K、N和O，已鉴定的CRF(循环重组形式)和HIV-2毒株及其亚型。参见，例如Myers等，Los Alamos数据库，Los Alamos国家实验室，新墨西哥；Myers等，“人逆转录病毒和艾滋病”(Human Retrovirusesand Aids)，1990，Los Alamos，新墨西哥：Los Alamos国家实验室)。

Env的进一步修饰包括(但不限于)产生编码其中具有突变和/或缺失的Env多肽的多核苷酸。例如，超变区V1、V2、V3、V4和/或V5的一些或全部可如本文所述删除或修饰，特别是V1、V2和V3区域。V1和V2区域可掩盖CCR5共同受体结合位点。(参见，例如Moulard等，(2002)Proc.Nat′1 Acad.Sci 14：9405-9416)。因此，某些实施方案中删除了一些或全部可变环区域，例如可能暴露保守的中和表位。此外，由于高度糖基化也遮蔽了蛋白质表面可能的中和表位，N-相连位点的去糖基化也是可能的修饰靶位。单用或与可变区删除和/或去糖基化修饰联用的其它任选的修饰作用包括对β-片层区域的修饰(例如，删除)(例如，WO00/39303所述)、对前导序列的修饰(例如，加入Kozak序列和/或用具有天然或序列修饰的tpa前导序列取代修饰的野生型前导序列)和/或对蛋白酶切割位点的修饰(例如，Chakrabarti等，(2002)J.Virol.76(11)：5357-5368描述了在切割位点、gp41的促融合区域和保留天然抗原性构象决定簇的gp41的七残基重复序列1和2的间距含有缺失的gp140δCFI，寡聚物的形成和体外的病毒中和作用，所述“保留天然抗原性构象决定簇”定义为与已知的单克隆抗体或CD4结合)。

这些修饰的各种组合可用于产生本文所述野生型或合成多核苷酸序列。

Env多肽编码序列的修饰可导致(1)相对于野生型编码序列，提高在许多哺乳动物细胞系中的表达(以及其它类型的细胞系，包括(但不限于)昆虫细胞))，和/或(2)提高中和表位的呈递。类似的Env多肽编码序列可从各种分离物中得到、修饰和测试以提高表达。

本文所述的任何多核苷酸(例如，表达盒)或多肽(由上述的任何方法递送)也可与其它DNA递送系统和/或蛋白质递送系统联用。非限制性的例子包括这些分子在，例如引发-加强方法中的共同给予，其中一种或多种分子在“引发”步骤中递送，随后在“加强”步骤递送一种或多种分子。在某些实施方案中，递送含有一种或多种核酸的组合物之后递送含有一种或多种核酸的组合物和含有一种或多种含有多肽的组合物(例如，含有HIV抗原的多肽)。在其它实施方案中，多次核酸“引发”(相同或不同的核酸分子)之后可进行多次多肽“加强”(相同或不同的多肽)。其它实施例包括多次给予核酸和多次给予多肽。

在任何涉及共同给药的方法中，各种组合物可以任何顺序递送。因此，在包括递送多种不同的组合物或分子的实施方案中，核酸无需全部在多肽之前递送。例如，引发步骤可包括递送一种或多种多肽，加强步骤可包括递送一种或多种核酸和/或一种或多种多肽。多次多肽给药之后可进行多次核酸给药，或者多肽与核酸给药可以任何顺序进行。因此，本文所述的一种或多种核苷分子(例如，表达盒)和本文所述的一种或多种多肽可经任何给药途径以任何顺序共同给药。所以，本文所述多核苷酸和多肽的任何组合可用于引发免疫反应。

此外，采用引发-加强方案(例如，本文所述的那些方案)可有益于降低受感染的对象中的病毒负荷以及可能减缓或防止HIV相关疾病的进展(相对于未治疗的对象)。

实验

以下是实施本发明的特定实施方案的实施例。提供这些实施例仅是为了说明性目的而决非要限制本发明的范围。

我们努力保证所用数值(例如，量、温度等)的精确，但也当然应该允许一些实验性误差和偏差。

实施例1

合成表达盒的产生

A.产生合成多核苷酸

用于实践本发明的多核苷酸序列通常经处理以在所需宿主或宿主细胞中最大地表达其基因产物。以下是有关密码子优化和HIV多肽的功能性变体的一些示范性指导。以下步骤的顺序可变。

首先，可修饰HIV-1密码子使用模式使得到的核酸编码序列与在高度表达的人基因中发现的密码子使用相差不大。HIV密码子使用反映了密码子-三联体的核苷酸A或T的高含量。HIV-1密码子使用的作用是在DNA序列中的高AT含量，这导致在RNA中的高AU含量以及降低mRNA的翻译能力和稳定性。比较起来，高度表达的人密码子优选核苷酸G或C。通常修饰编码多肽的野生型多核苷酸序列以使与在高度表达的人基因中发现的密码子使用相差不大。

其次，产生了一些基因变体(例如，野生型多肽的突变形式)。下表(表2)公布了影响几种HIV基因活性的突变。

表2

含有这些突变的示范性多核苷酸已见描述(参见，例如PCT国际公布号WO/00/39302；WO/00/39303；WO/00/39304；WO/02/04493；WO/03/004657；WO/03/004620和WO/03/020876)。鉴于本说明书的指导，采用上表所示的指导可降低或消除相关基因产物的功能。

本发明一方面包括Env编码序列，所述序列包括(但不限于)编码以下HIV所编码多肽的多核苷酸序列：gp160、gp140和gp120(参见，例如描述HIV-1_SF2(“SF2”)Env多肽的美国专利号5,792,459)。这些多肽之间的关系示于图3(在图中：多肽以直线表示，氨基和羧基末端示于gp160线上；开放的圆圈表示寡聚化结构域；开放的正方形表示跨膜结构域(TM)；“c”表示gp140.mut中切割位点的位置；“×”表示切割位点已突变不再作为切割位点)。多肽gp160包括gp120和gp41的编码序列。多肽gp41由包括寡聚化结构域(OD)和跨膜结构域(TM)的几个结构域组成。在天然包膜中，寡聚化结构域要与三个gp41多肽非共价结合以形成三聚物结构；通过与gp41三聚物(及自身)的非共价相互作用，gp120多肽也组成三聚结构。切割位点(或几个切割位点)约存在于gp120的多肽序列和对应于gp41的多肽序列之间。该切割位点(或几个切割位点)可突变以防止在该位点的切割。得到的gp140多肽对应于gp160的截短形式，其中删除了gp41的跨膜结构域。由于在gp41部分中存在寡聚化结构域，该gp140多肽可以单体和寡聚(即，3聚物)形式存在。当突变切割位点以防止切割以及删除gp41的跨膜部分时，得到的多肽产物命名为“突变的”gp140(例如，gp140.mut)。本领域的人员可明白，可以各种方式突变切割位点。(也参见，例如PCT国际公布号WO00/39302和WO/02/04493)。

可从任何已知的HIV分离物选择野生型HIV编码序列(例如，Gag、Env、Pol、tat、rev、nef、vpr、vpu、vif等)并且可根据本发明的指导对这些序列进行处理以最大表达它们的基因产物。野生型编码区域可以一种或多种以下方式来修饰：删除编码Env的超变区，特别是V1和/或V2的序列，和/或将突变引入，例如编码Env中切割位点的序列中以取消寡聚的gp140被酶切割成gp120单体。(参见，例如Earl等，(1990)PNAS USA 87：648-652；Earl等，(1991)J.Virol.65：31-41)。在又一实施方案中，删除了超变区、除去了糖基化位点和/或使切割位点突变。如上所述，可将不同的突变引入不同基因的编码序列(参见，例如表2)。

为产生本发明的合成非编码序列，设计含有完整的感兴趣编码序列的基因盒。通过寡核苷酸合成和PCR扩增构建合成的基因盒以产生基因片段。选择引物以提供用于亚克隆的方便的限制性位点。然后连接得到的片段以产生完整的所需序列，再将该序克隆入合适的载体。最终的合成序列是：(i)经限制性内切酶消化和分析筛选的，(ii)为确认得到所需序列而经DNA测序和(iii)通过SDS-PAGE和Western印迹确认所表达蛋白质的同一性和完整性。合成的编码序列由ChironCorp.(Emeryville，CA)或Midland Certified ReagentCompany(Midland，Texas)装配。

本发明的合成序列的同一性百分比可用，例如Smith-Waterman检索算法(Time Logic，Incline Village，NV)，按照以下示范性参数来确定：权重矩阵＝nuc4x4hb；间隔开放罚分＝20、间隔延伸罚分＝5、报道阈值＝1、对比阈值＝20。

可组合本发明不同实施方案的各种形式(例如构建物)。

一些用于实践本发明的合成多核苷酸的示范性实施方案讨论于实施例4并示于图6-19。

B.产生含有本发明的合成多核苷酸的表达盒

本发明的合成DNA片段可克隆入许多病毒或非病毒表达载体。例如，用于实践本发明的多核苷酸可克隆入以下非病毒表达载体：(i)用于瞬时表达测定和DNA免疫研究的pCMVKm2，该pCMVKm2载体来源于pCMV6a(Chapman等，Nuc.AcidsRes.(1991)19：3979-3986)并含有卡那霉素选择标记、ColE1复制起点、CMV启动子增强子和内含子A，然后是用于下述合成序列的插入位点，接着是来源于牛生长激素的聚腺昔酸化信号--该pCMVKm2载体与pCMV-link载体的区别仅在于pCMVKm2中插入多接头位点以产生pCMV-link；(ii)用于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的pESN2dhfr和pCMVPLEdhfr(也称为pCMVIII)；和(iii)用于杆状病毒表达系统的一种穿梭载体pAcC13(pAcC13来源于如Munemitsu S.等，Mol Cell Biol.10(11)：5977-5982，1990所述的pAcC12)。也参见描述这些载体的PCT国际公布号WO 00/39302、WO 00/39303、WO 00/39304、WO 02/04493。

简言之，pCMVPLEdhfr(pCMVIII)的构建如下。为构建DHFR盒，PCR扩增pCite-4a+(Novagen，Inc.，Milwaukee，WI)的EMCV IRES(内部核糖体进入位点)前导序列并将其作为Xba-Nco片段插入pET-23d(Novagen，Inc.，Milwaukee，WI)得到pET-EMCV。PCR扩增pESN2dhfr的dhfr基因得到具有替代翻译终止密码子的Gly-Gly-Gly-Ser间隔区的产物并作为Nco-BamH1片段插入得到pET-E-DHFR。其次，PCR扩增pSV2Neo(Clontech，Palo Alto，CA)衍生物的减毒neo基因并将其插入pET-E-DHFR的独特的BamH1位点得到pET-E-DHFR/Neo_(m2)。然后，在neo基因的下游插入pCDNA3(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的牛生长激素终止子得到pET-E-DHFR/Neo_(m2)BGHt。通过切割pET-E-DHFR/Neo_(m2)BGHt来制备EMCV-dhfr/neo选择标记盒片段。CMV增强子/启动子+内含子A作为HindIII-Sal1片段从pCMV6a(Chapman等，Nuc.Acids Res.(1991)19：3979-3986)转移入pUC19(New EnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA)。从Nde1到Sap1位点删除pUC19的载体骨架。上述DHFR盒加入构建物使得EMCV IRES在CMV启动子之后以产生最终构建物。该载体也含有amp^r基因和SV40复制起点。

本发明的表达载体可含有一种或多种编码免疫原性多肽的多核苷酸序列。当表达盒含有多条编码序列时，所述编码序列可全部在框内以产生一种多蛋白；或者，多条多肽编码序列可含有多顺反子信息，例如将IRES置于每条多肽编码序列的5’；此外，可存在多个启动子以引导多条编码序列的表达。

实施例2

合成的HIV表达盒以及所编码的多肽在小鼠中的体内免疫原性

A.免疫

为评价本发明的组合物用于诱导免疫应答的免疫原性，可进行小鼠研究。使用各种DNA剂量(0.02-200μg)的多核苷酸组分(例如，两种基于pCMVlink的质粒，每种携带具有delV2的gp140的密码子优化编码序列，第一种编码序列来源于SF162，亚型B；第二种编码序列来源于TV1，亚型C)稀释为总注射体积100μl。为克服稀释的DNA的可能的负稀释作用，每份样品中总的DNA浓度可单独使用载体(例如，pCMVlink)进行调整。组10-12只的Balb/c小鼠(Charles River，Boston，MA)使用各种剂量经肌肉内免疫(每条腿50μl，肌肉内注射入胫骨前)。

然后在DNA免疫一定间隔后以合适的多肽浓度，使用来源于SF162，亚型B，寡聚、密码子优化的具有delV2的gp140多肽免疫小鼠。

B.体液免疫应答

免疫后0和2-4周间隔的小鼠血清用合适抗-HIV抗体ELISA(酶联免疫吸附测定)检测体液免疫应答。

血清的抗体滴度通过抗-HIV抗体ELISA测定。简言之，筛选免疫小鼠的血清中直接抗HIV包膜蛋白的抗体。以每孔0.2μg HIV包膜gp140蛋白涂布ELISA微滴度板过夜并洗涤4次；然后用PBS-0.2％吐温(Sigma)封闭2小时。除去封闭溶液后，加入100μl稀释的小鼠血清。此后，以1/25稀释并通过连续的3倍稀释测试血清。洗涤微滴度板4次并与继发性、过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG抗体(Pierce，Rockford，IL)孵育。洗涤ELISA板并向每孔加入100μl3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB；Pierce)。15分钟后测量每孔的光密度。所报道的滴度是得到最大光密度(O.D.)一半的血清稀释度的倒数。

这些测定的结果用于显示本发明的多核苷酸/多肽免疫方法在小鼠中产生免疫应答的效力。

C.细胞免疫应答

特定的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)的频率通过肽脉冲Balb/c小鼠CD4细胞的标准铬释放测定来评价。HIV蛋白表达的牛痘病毒感染的CD-8细胞可用作阳性对照(vv-蛋白)。简言之，脾细胞(效应细胞，E)获得自BALB/c小鼠(如上所述免疫)。培养、再次刺激细胞并测定抗，例如包膜蛋白脉冲靶细胞的CTL活性(参见，例如一般描述该测定的Doe，B.和Walker，C.M.，AIDS10(7)：793-794，1996)。在标准⁵¹Cr释放测定中检测细胞毒性活性。靶细胞(T)与效应细胞(E)以各种E∶T比例一起培养4小时，双复孔的平均cpm用于计算特定的⁵¹Cr释放百分比。

免疫小鼠中的抗原特异性T细胞应答也可由zur Megede，J.等，在“序列修饰的1型人免疫缺陷病毒亚型B pol和gagpol DNA疫苗的表达和免疫原性”(Expression and immunogenicity of sequence-modified humanimmunodeficiency virus type 1 subtype B pol and gagpol DNA vaccines)，JVirol.77：6197-207，(2003)中所述的胞内细胞因子生产的流式细胞术测定(细胞因子流式细胞术或“CFC”)来检测。

细胞毒性T细胞(CTL)或CFC活性在回收自用本文所述HIV DNA构建物和多肽免疫的小鼠的脾细胞中检测。免疫动物的效应细胞一般表现出特异性裂解作为CTL应答指标的HIV肽脉冲SV-BALB(MHC匹配)靶细胞。肽脉冲的和来源于MHC不匹配小鼠品系(MC57)的靶细胞不裂解。CTL或CFC测定的结果用于显示本发明的多核苷酸/多肽免疫方法通过DNA免疫诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的效力。

实施例3

体内免疫原性研究

A.总的免疫方法

为评价使用本发明的组合物(含有多核苷酸组分和多肽组分)和方法产生的免疫应答，使用豚鼠、家兔、小鼠、恒河猴和/或狒狒进行研究。这些研究一般按下表(表3)所示构成并使用，例如以下组分：亚型B DNA--携带具有delV2的gp140的密码子优化编码序列的pCMVlink，该编码序列来源于SF162、亚型B；亚型C DNA--携带具有delV2的gp140的密码子优化编码序列的pCMVlink，该编码序列来源于TV1、亚型C；亚型B蛋白--来源于SF162、亚型B多肽、寡聚、密码子优化的具有delV2的gp140；和亚型C蛋白--来源于TV1、亚型C多肽的、寡聚、密码子优化的具有delV2的gp140。

表3

该免疫可使用单次或多次DNA免疫与单次或多次蛋白质免疫。上表中的免疫方法示范了以下方法：引发/加强方案(亚型B DNA/亚型B蛋白；亚型CDNA/亚型C蛋白)；混合的引发/加强，单次DNA引发和单次蛋白质加强(亚型B DNA/亚型C蛋白；亚型C DNA/亚型B蛋白)；混合的DNA引发单次蛋白质加强(亚型B和C DNA/亚型B蛋白；亚型B和C DNA/亚型C蛋白)；单次DNA引发混合的蛋白质加强(亚型B DNA/亚型B和C蛋白；亚型CDNA/亚型B和C蛋白)；与混合的DNA引发混合的蛋白质加强(亚型B和C DNA/亚型B和C蛋白)。免疫方案也可包括编码多肽的多核苷酸和来自同一亚型的两种毒株不同毒株的类似多肽。例如，多核苷酸可编码毒株MN的env，类似的多肽组分可含有SF162的env。如本文进一步讨论的，多肽和/或编码多肽的多核苷酸可截短修饰或改变以增强免疫原性。混合样品中的每种DNA和/或蛋白质(即，在本实施例中是B和C)的量可以与单次免疫递送相等的量加入(从而递送2×DNA和/或蛋白质总量)，或者可调整混合样品中的每种DNA和/或蛋白质的量从而在混合与单一样品中递送相同的DNA和/或蛋白质总量(1×)。

除了表3示范的多核苷酸组分和多肽组分组合的例子外，还提及了示范两种多核苷酸或两种多肽组分的其它组合。例如，使用HIV亚型B和亚型C免疫原组合继续以上实施例，本发明也包括单次DNA引发和单次DNA加强(亚型B DNA/亚型C DNA)；单次蛋白质引发和单次蛋白质加强(亚型B蛋白/亚型C蛋白)。

B.小鼠

可按照表3说明的免疫方案并使用基本上如实施例2所述的方法在小鼠中进行实验。

C.豚鼠

在豚鼠中进行的实验如下。各组(每组6只豚鼠)在0、4和12周用如表3所示含有表达盒的质粒DNA经胃肠外(例如，肌肉内或真皮内)或粘膜免疫，所述表达盒含有一种或多种HIV免疫原性多肽(例如，实施例2所述的gp140DNA)。然后，一亚组动物约于12-24周用如表3所示单剂量的HIV蛋白(例如，实施例2所述的gp140 DNA)加强(肌肉内、真皮内或粘膜)。然后动物可以8-16周的间隔用HIV蛋白加强多次。在第三次DNA免疫两周后和蛋白质加强两周后检测抗体滴度(几何平均滴度)。这些研究的结果用于证明本发明的组合物和方法产生免疫应答，特别是产生广泛和强有力抗各种HIV毒株的中和活性的有效性。

D.家兔

在家兔中进行的实验如下。用如表3所示含有表达盒的质粒DNA在多位点经肌肉内或真皮内(使用针注射，然后使用或不使用电穿孔，或使用Bioject无针注射)或粘膜免疫家兔，所述表达盒含有一种或多种HIV免疫原性多肽(例如，实施例2所述的gp140 DNA)。然后，一亚组动物用如表3所示单剂量的HIV蛋白(例如，实施例2所述的gp140 DNA)加强(肌肉内、真皮内或粘膜)。动物可用HIV蛋白加强多次。用于产生免疫应答的本发明组合物一般是高度免疫原性的并且基本上仅在家兔中免疫两次后产生抗原结合抗体的应答。这些研究的结果用于证明本发明的组合物和方法产生免疫应答，特别是产生广泛和强有力抗各种HIV毒株的中和活性的有效性。

E.恒河猴

在恒河猴中进行的实验如下。在约0、4、8和24周用如表3所示含有表达盒的质粒DNA经胃肠外或粘膜免疫恒河猴，所述表达盒含有一种或多种HIV免疫原性多肽(例如，实施例2所述的gp140 DNA)。可利用增强的DNA递送系统来增加在免疫方案的DNA引发期间的免疫应答，所述系统例如使用与PLG微粒形成复合物的DNA或DNA的盐水注射接着进行电穿孔。然后，一亚组动物用如表3所示单剂量的HIV蛋白(例如，实施例2所述的gp140 DNA)加强(肌肉内、真皮内或粘膜)。然后动物可在3-6个月的间隔用HIV蛋白加强多次。通常，在使用2或3次1mg剂量的多核苷酸组分后通过CTL测定或细胞因子流式细胞术检测到恒河猴具有可检测的HIV特异性T细胞应答。也可检测中和抗体。这些研究的结果用于证明本发明的组合物和方法产生免疫应答，特别是产生广泛和强有力抗各种HIV毒株的中和活性的有效性。

F.狒狒

用如表3所示含有表达盒的质粒DNA经胃肠外或粘膜免疫狒狒4次(在约0、4、8和24周)，所述表达盒含有一种或多种HIV免疫原性多肽(例如，实施例2所述的gp140 DNA)。DNA可在盐水中(有或没有电穿孔)或在PLG微粒上形成复合物来递送。然后，一亚组动物用如表3所示单剂量的HIV蛋白(例如，实施例2所述的gp140 DNA)加强(肌肉内、真皮内或粘膜)。动物通常可在3-6个月的间隔用HIV蛋白加强多次。

每次免疫后2-4周对动物放血并用分离的血浆进行HIV抗体ELISA。该ELISA基本上按下文G章节所述进行，除了使用的二抗共轭物一般是以1:500稀释的抗-人IgG，g-链特异性过氧化物酶共轭物(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MD 63178)。50μg/ml酵母提取物可加入血浆样品和抗体共轭物的稀释液以降低由于狒狒中预先存在的酵母抗体造成的非特异性背景。在用HIV-多肽加强后通常在狒狒中观察到淋巴增殖应答。这种增殖结果是诱导T辅助细胞功能的指标。这些研究的结果用于证明本发明的组合物和方法产生免疫应答，特别是产生广泛和强有力抗各种HIV毒株的中和活性的有效性。

G.体液免疫应答

在任何免疫动物模型(包括上述以及，例如黑猩猩)中，在免疫后的各种时间用抗-HIV抗体ELISA(酶联免疫吸附测定)检测免疫动物的血清样品中的体液免疫应答。血清的抗体滴度通过上述抗-HIV抗体ELISA测定。简言之，筛选免疫动物的血清中直接抗用于免疫动物的DNA编码的HIV多肽/蛋白质和/或用于免疫动物的多肽(例如，寡聚的gp140)的抗体。通常使用对应于免疫研究中使用的每种亚型的多肽进行独立ELISA测定。

ELISA微滴定板的孔用选择的HIV多肽/蛋白质涂布过夜，洗涤4次，然后用PBS-0.2％吐温(Sigma)封闭2小时。除去封闭液后，加入100μl稀释的小鼠血清。然后，以1/25稀释并用连续3倍稀释来测试血清。洗涤微滴定板4次并与继发性、过氧化物酶偶联的抗-小鼠IgG抗体孵育(Pierce，Rockford，IL)。洗涤ELISA板并向每孔加入100μl 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB；Pierce)。15分钟后检测每孔的光密度。所报道的滴度一般是得到最大光密度(O.D.)一半的血清稀释度的倒数。

也可评价细胞免疫应答。

血清中中和抗体的存在基本上如下测定：在来源于Nathaniel Landau博士(Salk Institute，San Diego，CA)的5.25.EGFP.Luc.M7(M7-luc)细胞中检测病毒中和作用。除了使用市售荧光素酶试剂盒(Promega)通过荧光素酶报道基因表达来定量病毒感染外，该测定的形式基本上与其它文献所述的MT-2试验相同(Montefiori等，(1988)J.Clin Microbiol.26：231-235)。所有血清样品在测定前于56℃，热灭活1小时。HIV-1分离物的病毒原种在PBMC中产生。

实施例4

用作引发的各种HIV多肽编码质粒和用作加强的各种HIV多肽的免疫原 性方案的评价

为评价用于DNA引发/加强的亚型C(TV1)和亚型B(SF162)pg140dV2DNA和蛋白质的组合作用，在家兔中进行以下实验。DNA是分别在两个质粒中递送的gp140mod.TV1.dV2和gp140mod.SF162.dV2(DNA的来源在下文进一步描述)。蛋白质是寡聚物o-gp140.dV2.TV1和o-gp140.dV2.SF162(蛋白质的来源在下文进一步描述)。DNA构建物以3种剂量按0、4、12周的时间表用于免疫。蛋白质于12、24和41周加强。每只家兔在两侧IM/四头肌处注射1.0ml DNA混合物，然后进行电穿孔(G.Widera，“在体内通过电穿孔增加DNA疫苗递送和免疫原性”(Increased DNA vaccine delivery andimmunogenicity by electroporation in vivo)，J.Immunology，164，4635-4640(2000))。MF59佐剂蛋白质按1ml/动物注射于两侧IM/Glut。

所有基因均经序列修饰以提高编码的Env糖蛋白以Rev-非依赖方式表达，然后将这些基因克隆入pCMV的质粒载体用于上述DNA疫苗和蛋白质生产。。这些序列如本文所述是密码子优化的。简言之，所有修饰的包膜基因克隆入Chiron pCMVlink质粒载体，优选克隆入EcoRI/XhoI位点。

为获得gp140多肽，每个gp140构建物(即，gp140mod.TV1.mut7.delV2和gp140.mut7.modSF162.delV2)用于以下方法。

按照生产商的使用说明，使用Mirus TransIT-LT1多胺转染试剂(MirusCoiporation，Madison WI)用编码gp140蛋白质(例如，pCMV载体骨架)的质粒DNA转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞并孵育96小时。96小时后，将培养基换为选择培养基(F12专用250μg/ml G418)，细胞以1∶5分裂并再孵育48小时。每5-7天更换培养基直至菌落开始形成，在此时检出菌落、接种于96孔板并通过gp120俘获ELISA进行筛选。阳性克隆展开于24孔板并如上述通过俘获ELISA进行多次Env蛋白质生产的筛选。当在24孔板上达到汇合时，阳性克隆于T25烧瓶(Corning，Coming，NY)中扩增。长至汇合后，这些克隆经数次筛选，阳性克隆在T75烧瓶中扩增。

阳性T75克隆冷冻于液氮，用不同浓度的0-5μM氨甲喋呤(MTX)扩增最高表达克隆并将其接种于10mm培养皿。筛选形成菌落的板并如上述再次扩增所有阳性克隆。扩增克隆并在每一步用gp120俘获ELISA扩增并筛选。阳性克隆在每种氨甲喋呤水平冷冻。为了将规模扩大至更大的生物反应器，产量最高的克隆生长于预融合生物反应器(3L，100L)来扩增并使之适应低血清悬浮培养条件。

表达Env多肽的稳定的转染CHO细胞系用于产生gp140蛋白。纯化蛋白质，简言之通过以前所述的三步方案进行(Srivastava等，“初级r5亚型B人免疫缺陷病毒的寡聚包膜糖蛋白的纯化和鉴定”(Purification andcharacterization of oligomeric envelope glycoprotein from a primary r5 subtypeB human immunodeficiency virus)，J Virol 76：2835-47(2002))。首先，浓缩的细胞上清液通过Galanthus Nivalis-琼脂糖柱(GNA；Vector Laboratories，Burlingame，CA)。gp140SF162ΔV2蛋白结合于该柱，而大多数污染蛋白质流过。用500mM甲基甘露糖吡喃糖苷(MMP)洗脱结合的蛋白质。然后俘获的蛋白质通过DEAE和CHAP柱。

这些方法适用于来源于其它HIV亚型的其它HIV基因和蛋白质。此外，虽然该分析在家兔中进行，类似的分析也可在其它类型，例如实施例3所述的动物中进行。免疫周数可变。下表(表4)列出了示范性的方法，用于比较使用电穿孔的编码包膜多肽的亚型B和亚型C多核苷酸(在pCMVlink载体中)与亚型B和C包膜多肽的各种组合(单用或作为混合亚型疫苗)在家兔中的免疫原性。根据本发明的指导，本领域的技术人员可明白这种方法也同样适用于编码免疫原性HIV多肽的任何其它多核苷酸和免疫原性HIV多肽。

表4

 

组	动物#	免疫#	佐剂	免疫原	总剂量	体积/位点	位点/动物	途径
									1	1-4	1、2、3、4	MF59C	o-gp140 dV 2SF162	50μg	500μl	2	IM/G1ut(针)
2	5-8	1、2、3、4	Iscomatrix	o-gp140 dV 2SF162	50μg	500μl	2	IM/G1ut(针)
									3	9-12	1、2、3	-	pCMV 140dV2 SF162DNA	1.0mg	0.50m1	2	IM/Quad(针)

 

		3、4	MF59C	o-gp140 d V2SF162	50μg	500μl	2	IM/G1ut(针)
									4	13-16	1、2、33、4	-Iscomatrix	pCMV 140dV2 SF162DNAo-gp140 dV2SF162	1.0mg50μg	0.5ml500μl	22	IM/Quad(针)IM/G1ut(针)
5	17-20	1、2、3、4	MF59C	o-gp140 dV2TV1	50μg	500μl	2	IM/G1ut(针)
									6	21-24	1、2、33、4	-MF59C	pCMV 140dV2 TV1DNAo-gp140 dV2SF162	1.0mg50μg	0.5ml500μl	22	IM/Quad(针)IM/G1ut(针)
7	25-28	1、2、33、4	-MF59C	pCMV 140dV2 SF162DNApCMV 140dV2 TV1DNAo-gp140 dV2SF162	2.0mg(每种1.0mg)50μg	0.5ml500μl	22	IM/Quad(针)IM/G1ut(针)
									8	29-32	1、2、33、4	-MF59C	pCMV 140dV2 SF162DNApCMV 140dV2 TV1DNAo-gp140 dV2TV1	2.0mg50μg	0.5ml500μl	22	IM/Quad(针)IM/G1ut(针)
9	33-36	1、2、33、4	-MF59C	pCMV 140dV2 SF162DNApCMV 140dV2 TV1DNAo-gp140 dV2SF162o-gp140 dV2TV1	2.0mg100μg	0.50m1500μl	22	IM/Quad(针)IM/G1ut(针)
									10	37-40	1、2、33、4	-MF59C	pCMV 140dV2 SF162DNApCMV 140dV2 TV1DNAo-gp140 dV2SF162o-gp140 dV2TV1	2.0mg50μg	0.5ml500μl	22	IM/Quad(针)IM/G1ut(针)
11	41-44	1、2、33、4	-MF59C	pCMV 140dV2 SF162DNApCMV 140dV2 TV1DNAo-gp140 dV2SF162	1.0mg50μg	0.50m1500μl	22	IM/Quad(针)IM/G1ut(针)

MF59C佐剂是在10mM柠檬酸、pH6中含有5％角鲨烯、0.5％吐温80、0.5％司盘85的微流化乳剂，以10ml等份试样保存于4℃。

Iscomatrix佐剂是用于蛋白质递送的基于quil皂草毒蛋白的佐剂(来源于，例如，CSL Limited，Victoria，Australia)。

表4所列的多核苷酸和多肽如表5所述制备。

表5

 

多核苷酸构建物/多肽	描述
		pCMV 140 dV2 SF162DNA	质粒(pCMVlink)含有亚型B毒株SF162的合成的、密码子优化的HIV-1 gp140包膜基因(参见gp140.modSF162.delV2，图6，也参见PCT国际公布号WO/00/39302)。gp140基因含有gp120和gp41胞外域。构建物也在可变区V2含有缺失(dV2)。该质粒构建物含有人CMV增强子/启动子和卡那霉素抗性基因。质粒通过碱性裂解方法和Qiagen纯化从DH5--□n大肠杆菌细菌制备。质粒保存于-80℃待用。
pCMV 140 dV2 TV1DNA	该质粒(pCMVlink)含有来源于HIV-1亚型C毒株TV1的合成的、密码子优化的HIV-1 gp140包膜基因(参见，gp140mod.TV1.delV2，图8，也PCT国际公布号WO/02/04493)。该包膜基因和质粒的结构如上所述。
		o-gp140 dV2 SF162蛋白	除了V2区域缺失外，亚型B寡聚物蛋白在切割位点含有5个氨基酸突变(参见，gp140.mut7.modSF162.delV2，图7，也参见PCT国际公布号WO/00/3930)。蛋白质表达于CHO细胞并从中纯化。o-gp140蛋白的表达和纯化描述于，例如PCT国际公布号WO/00/39302和Srivastava等，J Virol 76：2835-47(2002)。
o-gp140 dV2 TV1蛋白	除了V2区域缺失外，亚型C寡聚物蛋白在切割位点含有5个氨基酸突变(参见，gp140mod.TV1.mut7.delV2，图9，也参见PCT国际公布号WO/02/04493)。蛋白质表达于CHO细胞并从中纯化。o-gp140蛋白的表达和纯化描述于，例如PCT国际公布号WO/00/39302和Srivastava等，J Virol 76：2835-47(2002)。

按下表(表6)所述制备给予各组动物的免疫原。

 

组	制备
		1，5	免疫1-4：蛋白质免疫+MF59蛋白质剂量是50μg蛋白质/动物。起始蛋白质在柠檬酸缓冲液中稀释至0.100mg/ml。保存于-80℃待用。于室温融解；物质清澈无颗粒物。向融解的蛋白质中加入等体积的MF95C佐剂并通过翻转试管良好混合。用每侧(IM/Glut)0.5ml佐剂蛋白免疫每只家兔，每只动物的总体积为1ml。在

 

	加入佐剂后1小时内使用蛋白质。用针注射。
		2	免疫1-4；蛋白质免疫+Iscomatrix原液浓度为1mg/ml。在免疫前立即将250μl、1mg/ml的Iscomatrix用PBS稀释为2.5ml、0.1mg/ml(CFU U21)。向2.5ml、0.1mg/ml蛋白质中加入等体积的(2.5ml)0.1mg/ml Iscomatrix并良好混合。用每侧(IM/Glut)0.5ml佐剂蛋白免疫每只家兔，每只动物的总体积为1ml。
3-4，63，64	免疫1—3：盐水配制的亚型B/C质粒DNA免疫原以无菌0.9％盐水配制的1.0mg/ml总DNA提供。保存于-80℃待用。于室温融解DNA；物质清澈或略有混浊无颗粒物。用每侧(IM/四头肌)0.5ml DNA混合物免疫每只家兔，每只动物两侧的总体积为1.0ml。动物在免疫前以1×剂量IP(按动物体重计)的氯胺酮-甲苯噻嗪(80mg/ml-4mg/ml)镇静状态下剃毛。用针注射DNA。DNA注射后，使用直径1cm、针长1cm的6-针循环阵列进行电穿孔。电穿孔脉冲以20V/mm、50ms脉冲长、1次脉冲/秒给予。免疫3-4：蛋白质免疫蛋白质剂量是50μg每种SF162蛋白/动物。起始SF162蛋白在柠檬酸缓冲液中稀释至0.100mg/ml。保存于-80℃待用。于室温融解；物质清澈无颗粒物。向融解的蛋白质中加入等体积的MF95C佐剂并通过翻转试管良好混合。用每侧(IM/Glut)0.5ml佐剂蛋白免疫每只家兔，每只动物的总体积为1ml。在加入佐剂后1小时内使用蛋白质。用针注射。免疫3-4：蛋白质免疫原液浓度为1mg/ml。在免疫前立即将Iscomatrix用PBS稀释至0.1mg/ml(CFU U21)。向0.1mg/ml蛋白质中加入等体积的0.1mg/mlIscomatrix并良好混合。用每侧(IM/Glut)0.5ml佐剂蛋白免疫每只家兔，每只动物的总体积为1ml。
		7-8，10	免疫1—3：盐水配制的亚型B/C质粒DNA免疫原以无菌0.9％盐水配制的2.0mg/ml总DNA提供。保存于-80℃待用。于室温融解DNA；物质清澈或略有混浊无颗粒物。用每侧(IM/四头肌)0.5ml DNA混合物免疫每只家兔，每只动物两侧的总体积为1.0ml。动物在免疫前以1×剂量IP(按动物体重计)的氯胺酮-甲苯噻嗪(80mg/ml-4mg/ml)镇静状态下剃毛。用针注射DNA。DNA注射后，使用直径1cm、针长1cm的6-针循环阵列进行电穿孔。电穿孔脉冲以20V/mm、50ms脉冲长、1次脉冲/秒给予。免疫3-4：蛋白质免疫蛋白质剂量是50μg蛋白/动物。起始蛋白在柠檬酸缓冲液中稀释至0.100mg/ml。保存于-80℃待用。于室温融解；物质清澈无颗粒物。向融解的蛋白质中加入等体积的MF95C佐剂并通过翻转试管使之良好混合。用每侧(IM/Glut)0.5ml佐剂蛋白免疫每只家兔，每只动物的总体积为1ml。在加入佐剂后1小时内使用蛋白质。用针注射。
9	免疫1—3：盐水配制的亚型B质粒DNA免疫原以无菌0.9％盐水配制的1.0mg/ml总DNA提供。保存于-80℃待用。于室温融解DNA；物质清澈或略有混浊无颗粒物。用每侧(IM/四头肌)0.5ml DNA混合物免疫每只家兔，每只动物两侧的总体积为1.0ml。动物在免疫前以1×剂量IP(按动物体重计)的氯胺酮-甲苯噻嗪(80mg/ml-4mg/ml)镇静状态下剃毛。用针注射DNA。DNA注射后，使用直径1cm、针长1cm的6-针循环阵列进行电穿孔。电穿孔脉冲以20V/mm、50ms脉冲长、1次脉冲/秒给予。

 

	免疫3-4：蛋白质免疫蛋白质剂量是50μg每种蛋白/动物，总共100μg。起始蛋白在柠檬酸缓冲液中稀释至0.200mg/ml。保存于-80℃待用。于室温融解；物质清澈无颗粒物。向融解的蛋白质中加入等体积的MF95C佐剂并通过翻转试管良好混合。用每侧(IM/Glut)0.5ml佐剂蛋白免疫每只家兔，每只动物的总体积为1ml。在加入佐剂后1小时内使用蛋白质。用针注射。
		11	免疫1—3：盐水配制的亚型B质粒DNA免疫原以无菌0.9％盐水配制的1.0mg/ml总DNA提供。保存于-80℃待用。于室温融解DNA；物质清澈或略有混浊无颗粒物。用每侧(IM/四头肌)0.5ml DNA混合物免疫每只家兔，每只动物两侧的总体积为1.0ml。动物在免疫前以1×剂量IP(按动物体重计)的氯胺酮-甲苯噻嗪(80mg/ml-4mg/ml)镇静状态下剃毛。用针注射DNA。DNA注射后，使用直径1cm、针长1cm的6-针循环阵列进行电穿孔。电穿孔脉冲以20V/mm、50ms脉冲长、1次脉冲/秒给予。
	免疫3-4：蛋白质免疫蛋白质剂量是50μg蛋白/动物。起始蛋白在柠檬酸缓冲液中稀释至0.100mg/ml。保存于-80℃待用。于室温融解；物质清澈无颗粒物。向融解的蛋白质中加入等体积的MF95C佐剂并通过翻转试管良好混合。用每侧(IM/Glut)0.5ml佐剂蛋白免疫每只家兔，每只动物的总体积为1ml。在加入佐剂后1小时内使用蛋白质。用针注射。

免疫时间表(表7)如下所示：

表7

 

免疫周数：组	10	24	312	424	541	656
							1	Gp140dV2 SF162+MF59C	Gp140dV2SF162+MF59C	Gp140dV2SF162+MF59C	Gp140dV2SF162+MF59C	Gp140dV2SF162+MF59C	Gp140dV2SF162+MF59C
2	Gp140dV2 SF162+Iscomatrix	Gp140dV2SF162+Iscomatrix	Gp140dV2SF162+Iscomatrix	Gp140dV2SF162+Iscomatrix	Gp140dV2SF162+Iscomatrix	Gp140dV2SF162+Iscomatrix
							3	pCMV 140dV2 SF162DNA	pCMV140 dV2SF162	pCMV 140dV2SF162	Gp140dV2SF162+	Gp140dV2SF162+	Gp140dV2SF162+

 

		DNA	DNAGp140dV2SF162+MF59C	MF59C	MF59C	MF59C
							4	pCMV 140dV2 SF162DNA	pCMV140 dV2SF162DNA	pCMV 140dV2SF162DNAGp140dV2SF162+Iscomatrix	Gp140dV2SF162+Iscomatrix	Gp140dV2SF162+Iscomatrix	Gp140dV2SF162+Iscomatrix
5	Gp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C
							6	PCMV140dV2TV1DNA	pCMV140dV2TV1DNA	pCMV 140dV2 TV1DNAGp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C
7	pCMV140dV2 SF162DNA+PCMV 140dV2 TV1DNA	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2	Gp140dV2SF162+MF59C	Gp140dV2SF162+MF59C	Gp140dV2SF162+MF59C

 

		TV1 DNA	TV1 DNAGp140dV2SF162+MF59C
							8	pCMV140dV2 SF162DNA+PCMV 140dV2 TV1DNA	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2TV1 DNA	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2TV1 DNAGp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C	Gp140dV2 TV1+MF59C
9	pCMV140dV2 SF 162DNA+PCMV 140dV2 TV1DNA	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2TV1 DNA	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2TV1 DNAGp140dV2SF162+MF59CGp140dV2 TV1	Gp140dV2SF162+MF59CGp140dV2 TV1+MF59C(100μg蛋白)	Gp140dV2SF162+MF59CGp140dV2 TV1+MF59C(100μg蛋白)	Gp140dV2SF162+MF59CGp140dV2 TV1+MF59C(100μg蛋白)

 

			+MF59C(100μg蛋白)
							10	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV 140dV2 TV1DNA	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2TV1 DNA	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2TV1 DNAGp140dV2SF162+MF59CGp140dV2TV1+MF59C(50μg蛋白)	Gp140dV2SF162+MF59CGp140dV2 TV1+MF59C(50μg蛋白)	Gp140dV2SF162+MF59CGp140dV2 TV1+MF59C(50μg蛋白)	Gp140dV2SF162+MF59CGp140dV2 TV1+MF59C(50μg蛋白)
11	pCMV140dV2 SF162DNA+PCMV 140dV2 TV1DNA	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2TV1 DNA	pCMV140dV2SF162DNA+PCMV140 dV2TV1DNA(1.0mg)	Gp140dV2SF162+MF59C	Gp140dV2SF162+MF59C	Gp140dV2SF162+MF59C

 

			Gp140dV2SF162+MF59C
								注意：除了11组使用每种0.5mgDNA以外，所有的DNA各是1.0mg	注意：除了10组使用每种25μg蛋白质以外，所有的蛋白质各是50μg			注意：除了11组使用每种0.5mgDNA以外，所有的DNA各是1.0mg	注意：除了10组使用每种25μg蛋白质以外，所有的蛋白质各是50μg

以下为所有组(A-F)的放血时间表(表8)

                         表8

放血： 0       1       2       3       4       5       6       7

周：   0       2       6       8       12      14      16      24

样品   用于血  用于血  用于血  用于血  用于血  用于血  用于血  用于血

       清的凝  清的凝  清的凝  清的凝  清的凝  清的凝  清的凝  清的凝

       结血液  结血液  结血液  结血液  结血液  结血液  结血液  结血液

放血： 8       9       10      11      12      13      14      15

周：   26      28      41      43      45      56      58      60

样品： 用于血  用于血  用于血  用于血  用于血  用于血  用于血  用于血

       清的凝  清的凝  清的凝  清的凝  清的凝  清的凝  清的凝  清的凝

       结血液  结血液  结血液  结血液  结血液  结血液  结血液  结血液

为评价用于DNA引发/加强的亚型C(TV1)和亚型B(SF162)gp140 dV2DNA和蛋白质产生抗HIV毒株SF162(B型)的中和抗体的组合作用，进行以下比较。

使用基本上如下所述进行的以下试验在收集自免疫家兔的血清中检测抗PBMC-培养的SF162和TV1 HIV1毒株的中和抗体应答。在来源于NathanielLandau博士(Salk Institute，San Diego，CA)的5.25.EGFP.Luc.M7(M7-luc)细胞中检测病毒中和作用。除了使用市售荧光素酶试剂盒(Promega)通过荧光素酶报道基因表达来定量病毒感染外，该试验的形式基本上与其它文献所述的MT-2试验相同(Montefiori等，J.Clin Microbiol.26：231-235，(1988))。所有血清样品在测定前于56℃，热灭活1小时。HIV-1分离物的病毒原种在PBMC中产生。中和抗体滴度报道为在测试孔中检测到相比于病毒对照孔的50％荧光素酶活性时血清稀释度的倒数。图4和5所示的值是每组动物的中和滴度的几何平均滴度加上标准偏差。

中和抗体存在的测定的结果见图4和图5。在图中，以下免疫组对应于表4中的组：B DNA+B蛋白质；C DNA+B蛋白质(组6)；B+C DNA+B蛋白质(组7)；B+C DNA+C蛋白质(组8)；B+C DNA和蛋白质(组9)；B+C DNA和蛋白质(1/2)(组10)和B+C DNA(1/2)+C蛋白质(组11)。

在图4中，每组3条柱中的第一竖直柱是预放血的家兔血清中抗HIV-1SF162的中和活性(图4，预放血)，第二竖直柱是来自第三次免疫后两周放血的血清(图4，第三次免疫后两周)，第三竖直柱是来自第四次免疫后两周放血的血清(图4，第四次免疫后两周)。

图4总结了上述7组之间抗HIV-1 SF162的中和滴度的数据。这些结果证实所有组均表现出抗HIV-1 SF162分离物的强中和活性。此外，与第三次免疫后相比，第四次免疫后中和活性显著增加。用B基因和B蛋白(BDNA+B蛋白)引发和加强显示高滴度，C基因和B蛋白(C DNA+B蛋白)也这样。就混合(B+C)DNA引发和单次蛋白质加强而言，B蛋白对混合基因引发(B+C DNA+B蛋白)产生高加强和对C蛋白(B+C DNA+C蛋白)产生加强。就混合的DNA引发和蛋白质加强而言，半剂量(50μg)的蛋白(B+CDNA和蛋白(1/2))诱导与全剂量(100μg)的蛋白(B+C DNA和蛋白)一样的高中和活性。用亚型C蛋白加强混合的DNA引发和单次蛋白质，半剂量(1mg)的DNA(B+C DNA+C蛋白)也得到与全剂量的2mg DNA(B+C DNA(1/2)和C蛋白)一样的中和活性。

在图5中，预放血家兔血清中抗HIV-1TV1的中和活性的预放血值比每组柱低一个对数(图5，预放血)，每组的灰色竖直柱是第四次免疫两周后放血的血清(图5，第四次免疫后两周)。

图5总结了显示上述7个组之间抗HIV-1 TV1(南非亚型C)的中和滴度的数据。这些结果证实所有组均显示出抗HIV-1亚型C TV1分离物的中和活性(如预期一样，由于未使用亚型C DNA或蛋白，B DNA+B蛋白显示出最低的中和活性)。就失配的单次DNA引发和单次蛋白质加强(C DNA+B蛋白)而言，用C基因引发和B蛋白加强与用B基因和B蛋白(B DNA+B蛋白)一样显示出高滴度。就混合的(B+C)DNA引发和单次蛋白质加强而言，使用B(B+C DNA+B蛋白)与C(B+C DNA+C蛋白)得到相似的加强效应。就混合的DNA引发和蛋白质加强而言，全剂量的100μg蛋白(B+C DNA和蛋白)与半剂量的50μg蛋白(B+C DNA和蛋白(1/2))一样诱导高中和活性。半剂量(1mg)的DNA(B+C DNA(1/2)+C蛋白)也得到与全剂量的2mgDNA(B+C DNA+C蛋白)一样的中和活性。

比较图4和图5中的数据支持了在对象中产生免疫应答的本发明组合方法。这种比较显示结合来源于不同亚型的DNA可引发针对不同亚型的多种毒株的广泛应答。这可能表示靶向共同保守的表位。此外，当免疫力是用不同亚型DNA的多种毒株引发时，用单一亚型蛋白足以加强广泛的中和应答。DNA引发保持了天然包膜结构。除B细胞应答外，这能诱导T细胞应答。最后，这些结果证实使用较低剂量蛋白质混合物也可提供强的免疫应答。

这些研究的结果证实本发明组合物和方法产生免疫应答，特别是产生广泛且强有力的抗各种HIV毒株的中和活性的的有效性。

实施例5

E1-E3缺失、复制缺损型Ad-HIV重组体对E3缺失、复制型Ad-HIV重组 体的免疫原性研究

以下实验在黑猩猩中进行。该实验选择具有最低Ad5-和Ad7-交叉反应性抗体的黑猩猩。Ad5和Ad7微滴定中和测定基本上按照Buge等，J.Virol.71：8531-8541(1997)和Lubeck等，Nature Med.3：651-8(1997)所述进行。根据表9所示时间表免疫黑猩猩。如表所示，每组包括2或3只动物。图24也提供了在第49周的第二次加强后其它时间表和结果。

表9

 

组	黑猩猩ID号	周0(IN)	周12(IN)	周37(IM)
					1	271363163	delAd5-E3-HIV gp160107pfu(复制型)	Ad7delE3-HIVgp160 107pfu(复制型)	MF59配制的SF162o-gp140 V2
2	182D386	Ad5delE3-HIV gp160108pfu(复制型)	Ad7delE3-HIVgp160 108pfu(复制型)	MF59配制的SF162o-gp140 V2
					3	360376	Ad5delE1/E3-HIVgp160108pfu(复制缺损型)	Ad7delE1/E3-HIVgp160 108pfu(复制缺损型)	MF59配制的SF162o-gp140 V2
4	373A003A136	Ad5delE1/E3-HIVgp160 109pfu(复制缺损型)	Ad7delE1/E3-HIVgp160 109pfu(复制缺损型)	MF59配制的SF162o-gp140 V2

(IN＝鼻内；IM＝肌肉内)

delAd5-E3、Ad7delE3、Ad5delE1/E3和Ad7delE1/E3载体已见描述(NanX.等，“Ad7粘粒系统的开发与Ad7deltaEldeltaE3HIV(MN)env/rev重组病毒的产生”(Development of an Ad7 cosmid system and generation of anAd7deltaEldeltaE3HIV(MN)env/rev recombinant virus)，Gene Ther.Feb，10(4)：326-36(2003))。

腺病毒载体(Ad重组体)含有来源于HIV-1亚型B原型毒株MN的插入物，其中该插入物编码gp160包膜蛋白(参见，例如GenBank登录M17449；Gurgo，C.等，“两种新的美国HIV-1分离物的包膜序列”(Envelope sequences of twonew United States HIV-1isolates)，Virology 164(2)：531-6(1988)；Lori，F.等，“两种1型缺损人免疫缺陷病毒(HIV-1)分子克隆的相互互补对HIV-1细胞趋向性和毒力的影响”(Effect of reciprocal complementation of twodefective human immunodeficiency virus type 1(HIV-1)molecular clones onHIV-1 cell tropism and virulence)，J.Virol.66(9)：5553-60(1992)；Lukashov，V.V.等，“通过外周血单核细胞培养、B-细胞系增殖和T-细胞系适应增加从HIV-1毒株LAI和MN(NM)的原始基因组RNA种群中选择基因型和表型”(Increasing genotypic and phenotypic selection from the original genomicRNA populations of HIV-1 strains LAI and MN(NM)by peripheral bloodmononuclear cell culture，B-cell-line propagation and T-cell-line adaptation)，AIDS 9(12)：1307-11(1995))。HIV-1MN是最早可用的HIV-1分离物之一，并且是常用的参考和疫苗毒株。

MN分离物取自1984年美国，新泽西，Newark地区的6岁男性儿童AIDS患者。其母亲是于1982年死于肺炎的IV毒品使用者。其父亲也呈HIV血清阳性。其它来自该患者1984年的血液样品和于死前不久所采的1987年样品(GenBank登录U72495)的序列也可用。也参见GenBank登录L48364-L48379。该分离物的MN序列克隆于λ噬菌体。Pol、nef和vpu的编码序列被过早地截短；pol显示在3783有框内终止密码子；nef和vpu分别在9357位和6412位被过早地截短。另一个可用的MN分离物的完整基因组是GenBank登录号AF075719，并且虽然不是pol或vpu，它也具有缺损基因。该分离物的一组V3序列可用(GenBank登录号L48364-L48379；Lukashov，V.等，AIDS 9：1307-1311(1995))。分离物MN可获得自NIH AIDS试剂计划，为X4。

含有HIV-1 MN gp160蛋白编码序列的Ad-重组载体(见表9)以PBS稀释并滴入鼻孔，500μl/鼻孔，总共1ml。在接种前3天开始给予抗生素，共11天。

用于蛋白质加强的多肽组分含有SF162 o-gp140 V2蛋白。该蛋白来自与用于多核苷酸组分中的gp160编码序列相同的HIV-1亚型，这些序列来源于HIV-1MN。使用在CHO细胞中表达、含有gp140.mut7.mod.SF162.delV2序列的CMV3载体，然后基本上按照，例如PCT国际公布号WO/00/39302所述分离寡聚蛋白质来制备SF162 o-gp140V2蛋白。

蛋白质加强一般为100μg的SF162 o-gp140V2/黑猩猩。SF162 o-gp140V2蛋白以用柠檬酸缓冲液配制为0.200mg/ml提供、保存于-80℃待用并于室温融解。该物质清澈无颗粒物。加入等体积的MF59C佐剂。混合物保存于4℃并在使用前翻转试管几次使之良好混合。

每只动物以1ml总体积/动物免疫(每只动物使用1或2个IM位点)。蛋白在加入佐剂1小时内使用。

收集血液、分泌样品和粪便样品。一般就血液样品而言，采血10ml来获得血清，采血30ml来获得肝素化血液。

对收集的样品进行以下所列的测定。

A.通过ELISA对免疫的黑猩猩血清进行HIV包膜抗体的结合测定

结合测定中使用标准的HIV Env ELISA方法来检测按上述免疫的黑猩猩血清中的HIV包膜抗体。这些方法基本上如Buge等，J.Virol.71：8531-8541(1997)和Lubeck等，Nature Med.3：651-8(1997)所述。图23显示了HIVIIIB和HIVSF162 Env蛋白的结合抗体滴度的数据(图23(A))以及HIVIIIB的血清抗体滴度的动力学(图23(B))。也评价了SF162包膜蛋白的结合抗体滴度的其它数据并示于图20。

图24A-D分别证实了使用不同的亚型B毒株组分的本发明所述的引发加强方案(用HIV-MN的env/rev和SF162的gp Δ 140V2的腺引发)诱导了交叉亚型结合抗体，该抗体识别来自所示亚型A、B、C和E的gp120。

B.抗TCLA和原始HIV分离物的中和抗体测定

在MT-2试验中检测抗TCLA毒株的病毒中和作用(Montefiori等，J.ClinMicrobiol.26：231-235(1988))。在获得自Nathaniel Landau博士(SalkInstitute，San Diego，CA)的M7-luc细胞中测定抗原始HIV-1毒株的病毒中和作用。除了使用市售荧光素酶试剂盒(Promega)通过荧光素酶报道基因表达来定量病毒感染外，该试验的形式基本上与其它文献所述的MT-2试验相同(Montefiori等，J.Clin Microbiol.26：231-235(1988))。所有血清样品在测定前于56℃，热灭活1小时。HIV-1分离物的病毒原种在PBMC中产生。

表10显示了在黑猩猩中进行这些研究的一些中和抗体数据。

表10

 

组/动物	载体/剂量	放血日	HIV-1 MN1	HIV-1 SF1622
					1-14×0271(SW)	delE3，107	0	<20	<20
1-1		105	<20	<20
					1-1		273	48	40
1-24×0363(SW)	delE3，107	0	<20	<20
					1-2		105	25	92
1-2		273	1,296	5,877
					2-14×0386(SW)	delE3，108	0	<20	<20
2-1		105	<20	20
					2-1		273	228	133
2-2182D(NI)	delE3，108	0	<20	<20
					2-2		105	47	97
2-2		273	5,801	3,437
					3-14×0376(SW)	delE1，E3，108	0	<20	<20
3-1		105	<20	<20
					3-1		273	<20	<20
4-14×0373(SW)	delE1，E3，109	0	<20	<20
					4-1		105	34	<20
4-1		273	72	119
					4-287A003(NI)	delE1，E3，109	0	<20	<20
4-2		105	<20	<20
					4-2		273	<20	<20
4-3A136(NI)	delE1，E3，109	0	<20	<20
					4-3		105	<20	<20
4-3		273	<20	21

1-通过上述MT-2试验测定。中和抗体滴度报道为在测试孔中检测到相比于病毒对照孔的50％细胞杀死时血清稀释度的倒数。

2-通过上述M7luc试验测定。中和抗体滴度报道为在测试孔中检测到相比于病毒对照孔的50％荧光素酶活性时血清稀释度的倒数。

表10的结果支持了本文所述组合方法诱导强有力和广泛HIV-中和活性的用途。例如，在放血日273，从组1-3的所有动物获得的血清含有中和抗体，该中和抗体抗用于多核苷酸免疫的包膜蛋白编码序列(HIV-1 MN)所来源于的亚型B毒株和用于多肽免疫的包膜蛋白编码序列(HIV-1 SF162)所来源于的亚型B毒株。

总体上，复制型重组腺载体(delE3)比不能复制的腺构建物(del E1，E3)更强地引发B细胞应答并且具有由ELISA测定到的较高Env-特异性结合抗体滴度与较高抗MN和SF162病毒毒株的血清中和抗体应答。图25A和B也证明了复制型腺载体产生的更有效的中和抗体。这些结果证实复制型腺病毒载体在引发抗亚型B疫苗毒株HIV1 MN和HIV1 SF162的中和抗体应答方面更有效。

下表11证实组合Ad-HIV env/rev gp140 Δ V2方案引发能中和原始分离物的广泛反应性的抗体。所测试的亚型B毒株是Bal、JR-FL、Bx08、6101、692、1168、1196和ADA。

表11.中和的原始亚型B分离物的数目

 

黑猩猩#(复制型病毒)	复制型Ad-HIV剂量	第一次gp140免疫后	第二次gp140免疫后
				271	107	2/8	2/8
363	107	7/8	3/8
				A163	107	0/8	8/8
386	108	0/8	1/8
				182D	108	2/8	4/8
(非复制型病毒)	非复制型剂量
				376	108	0/8	1/8
360	108	3/8	2/8
				373	109	4/8	6/8
A003	109	0/8	0/8
				136	109	0/8	0/8

下表12证实用env/rev的活腺病毒引发和用gp140ΔV2多肽组分加强的组合方案以较低剂量的多核苷酸引发组合物提供更大的应答。所示结果用于亚型B原始分离物Bal、JR-FL、Bx08、6101、692、1168、1196和ADA。

RLU表示在M7-荧光素酶试验(Montifeiori)中的相对光单位。该试验使RLU100％降低与100％中和相关，而RLU0％降低表示0％中和。

参考图26，组合腺病毒env/rev和B型(或“进化支B”)gp140 ΔV2的组合方案的作用也产生中和抗体(即，能在体外阻断进化支C毒株(HIVTV1)细胞的感染)。图26A和B分别显示了证实复制型和复制缺损型腺病毒在进化支B免疫方案后对进化支C HIVTV1诱导中和抗体的结果。在此实施例中，用Ad5-HIVMNenv/rev于第0周和用Ad7-HIVMNenv/rev于第13周鼻内免疫黑猩猩。用以MF-59佐剂配制的寡聚HIVSF162 gp140)V2于第37和49周肌肉内加强黑猩猩。显示了所示免疫后引发的抗HIVTV-1的峰值中和抗体滴度。

这些数据证实可用一给定亚型的第一HIV毒株的包膜蛋白免疫对象，用同一亚型的第二HIV毒株的包膜蛋白加强并产生抗两种HIV毒株的中和抗体。结合实施例4和5所示的数据证明这种HIV毒株可在同一亚型内或来自不同亚型。

C.ADCC活性的产生

如上所述，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)也对免疫的宿主提供保护。可使用本领域熟知的各种标准免疫测定来检测这种应答。(参见，例如Montefiori等，(1988)J.Clin Microbiol.26：231-235；Dreyer等，(1999)AIDS Res HumRetroviruses(1999)15(17)：1563-1571)。

分析了用不同的亚型B毒株组分(具有HIV-MN的env/rev和SF162的gp Δ 140V2多肽组分的腺病毒)按本实施例所述方案免疫黑猩猩的血清的ADCC活性。按照上述用于中和试验的方法免疫黑猩猩并检测抗HIV-包膜包被的靶细胞的ADCC活性。

图27证实本实施例的方案产生抗用来源于进化支B HIVIIIB毒株的HIV包膜蛋白包被的细胞的ADCC活性。此外，与复制缺损型Ad-重组体相比，15-51周在用复制型Ad-重组体引发的黑猩猩中观察到ADCC杀死％显著增加(P＝0.022)。

参考表13，本发明的方案产生抗进化支A、B、C或E的gp120包被的细胞的ADCC活性(即，交叉进化支ADCC活性)。

表13

交叉进化支ADCC

ADCC运行031404，效应物是人PBL，靶是用进化支A、B、C或E的gp120包被的CEM-NKr

D.细胞免疫应答

1.T-细胞淋巴细胞增殖

图21和28显示了使用本实施例的方案接种后用于引发的复制型和非复制型腺病毒的淋巴细胞增殖性应答。

检测了抗HIV-IIIB gp120的增殖性T-细胞应答。这些试验基本上如Buge等，J.Virol.71：8531-8541(1997)所述进行。数据示于图21和28。这些结果证实作为引发免疫，复制型腺病毒载体比非复制型腺病毒载体产生更高的T细胞增殖性应答。

2.IFN-γ产生

进行了HIV env重叠肽的ELISPOT。试验方法基本上如Zhao等，J.Virol.77：8354-8365(2003)所述。用于此试验的肽来源于HIV-1 MN Env。图29证实使用本实施例方案中所用的复制型和非复制型腺病毒引发后诱导了IFN-γ产生。

其它试验可用于评价免疫的黑猩猩的免疫应答，所述试验包括(但不限于)以下：

A.通过CR-释放进行CTL试验

该标准CTL试验基本上如Lubeck等，Nature Med.3：651-8(1997)和Buge等，J.Virol.71：8531-8541(1997)所述进行。

B.Ad5和Ad7微滴定中和试验。

这些试验基本上如Buge等，J.Virol 71：8531-8541(1997)所述进行。

C.通过PCR在鼻和粪便样品中进行Ad脱落试验

这些试验基本上如Buge等，J.Virol所述进行。

本实施例中的数据证实本发明的组合方法可用于产生抗相同亚型的多种病毒株的广泛中和抗体。此外，本实施例中的数据也证实本文所述的组合方法可用于产生抗同一分离物的多种丙毒毒株的HIV分离物以及抗其它进化支或亚型的抗体。组合免疫方案产生的抗体可结合并中和同一毒株和其它进化支的HIV的多种分离物，所述方案利用含有编码一亚型的一种毒株的多肽的核酸的组分和含有同一亚型的不同毒株的类似多肽的第二组分。产生的抗体也包括显示抗同一毒株和其它进化支的HIV的多种分离物的ADCC活性。

虽然详述了本发明的一些优选实施方案，应理解的是可作出明显的改变而不脱离本发明的构思和范围。提供以下实施例仅为说明性目的，决非想限制本发明的范围。

Claims (83)

1.一种在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，所述组合物含有，

多核苷酸组分和多肽组分，其中

所述多核苷酸组分基本上由一种编码来源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸构成，

所述多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的HIV免疫原性多肽，前提是该多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于第二HIV毒株，其中所述第一HIV毒株和所述第二HIV毒株不同。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二HIV毒株是与所述第一HIV毒株的亚型相同的HIV毒株。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二HIV毒株是与所述第一HIV毒株的亚型不同的HIV毒株。

4.一种在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，所述组合物含有，

多核苷酸组分和多肽组分，其中

所述多核苷酸组分含有两种或多种多核苷酸序列，这些序列含有两种或多种来源于不同HIV毒株的类似HIV免疫原性多肽的编码序列，

所述多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的HIV免疫原性多肽，前提是如果该多肽组分含有的多肽数目相同或大于该多核苷酸组分编码的类似HIV免疫原性多肽，则该多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于与该多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV毒株。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述至少两种HIV免疫原性多肽的编码序列来源于同一亚型的不同HIV毒株。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，来源于和多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV毒株的多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于多核苷酸组分提供的所述HIV免疫原性多肽相同亚型的不同HIV毒株。

7.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述至少两种HIV免疫原性多肽的编码序列来源于不同亚型的不同HIV毒株。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，来源于和多核苷酸组分提供的HIV免疫原性多肽不同的HIV毒株的多肽组合物的至少一种HIV免疫原性多肽来源于多核苷酸组分提供的所述HIV免疫原性多肽的不同亚型的不同HIV毒株。

9.一种在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，所述组合物含有，

多核苷酸组分和多肽组分，其中

所述多核苷酸组分基本上由一种编码来源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸构成，

所述多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的HIV免疫原性多肽，前提是该多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于第二HIV毒株，其中所述第一HIV毒株和所述第二HIV毒株不同；

前提是(i)该多核苷酸组分不编码来源于除第一亚型以外任何亚型的类似HIV免疫原性多肽，和(ii)该多肽组分不含有来源于除第一亚型以外任何亚型的类似HIV免疫原性多肽。

10.一种在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，所述组合物含有，

多核苷酸组分和多肽组分，其中

所述多核苷酸组分含有两种或多种多核苷酸序列，而所述序列含有来源于不同HIV毒株的两种或多种类似HIV免疫原性多肽的编码序列，

所述多肽组分含有一种或多种与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的HIV免疫原性多肽，前提是该多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于和该多核苷酸组分提供的类似HIV免疫原性多肽不同的HIV毒株。

11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述一种或多种类似HIV免疫原性多肽来源于不同的HIV亚型。

12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述多核苷酸组分或所述多肽组分含有至少一种是天然多核苷酸或多肽的多核苷酸。

13.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述多核苷酸组分含有至少一种合成的多核苷酸。

14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述合成的多核苷酸含有在哺乳动物细胞中表达而优化的密码子。

15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述合成的多核苷酸含有在人细胞中表达而优化的密码子。

16.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸组分和含有HIV免疫原性多肽的多肽组分是HIV包膜多肽。

17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸组分和所述含有HIV免疫原性多肽的多核苷酸组分的至少一种含有改变或突变。

18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，编码所述HIV免疫原性多肽的所述多核苷酸组分含有改变或突变。

19.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述多肽HIV免疫原性多肽组分含有改变或突变。

20.如权利要求18或19所述的组合物，其特征在于，所述组合物在切割位点或在糖基化位点含有突变。

21.如权利要求18或19所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有V1区域的缺失或突变。

22.如权利要求18或19所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有V2区域的缺失或突变。

23.如权利要求18或19所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有V3区域的缺失或突变。

24.如权利要求18或19所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有区域的缺失或修饰，所述区域选自V1区域、V2区域、V3区域和它们的组合。

25.如权利要求18或19所述的组合物，其特征在于，所述组合物暴露HIV env蛋白的中和表位。

26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，至少一种所述包膜多肽被修饰以暴露结合CCR5趋化因子共同受体的CD4结合区域或包膜结合区域。

27.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述至少一种编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸编码选自以下的免疫原性HIV多肽：Gag、Env、Pol、Prot、Int、RT、vif、vpr、vpu、tat、rev和nef。

28.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述第一HIV亚型选自亚型A、亚型B、亚型C、亚型D、亚型E、亚型F、亚型G、亚型H、亚型I、亚型J、亚型K、亚型N和亚型O。

29.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，至少一种所述免疫原性HIV多肽含有一种或多种改变或突变。

30.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述多核苷酸组分还含有编码其它抗原性多肽的序列，前提是该其它抗原性多肽不是来源于HIV-1毒株的免疫原性多肽。

31.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述多肽组分还含有具有其它抗原性肽的多肽，前提是该其它抗原性多肽不是来源于HIV-1毒株的免疫原性多肽。

32.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述多核苷酸组分还含有编码一种或多种与选择的宿主细胞相容的控制元件的序列，其中所述控制元件操作性连接于编码HIV免疫原性多肽的多核苷酸。

33.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述控制元件选自转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列、优化翻译起始的序列、内部核糖体进入位点和翻译终止序列。

34.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述转录启动子选自CMV、CMV+内含子A、SV40、RSV、HIV-Ltr、MMLV-ltr和金属硫蛋白。

35.一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括

提供如权利要求1-34和74-82中任一项所述的在哺乳动物中产生免疫应答的组合物；

在与所述多核苷酸在所述对象中表达相容的条件下，将一种或多种基因递送载体给予对象来产生编码的HIV免疫原性多肽，所述载体含有该组合物的所述多核苷酸组分的多核苷酸；和

将多肽组分给予所述对象。

36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因递送载体和所述多肽组分同时给予。

37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述所述一种或多种基因递送载体和所述多肽组分依次给予。

38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述多肽组分还含有佐剂。

39.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸组分还含有运载体。

40.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因递送载体是非病毒运载体。

41.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因递送载体使用颗粒运载体递送。

42.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因递送载体包被在金或钨颗粒上并且所述包被颗粒使用基因枪递送至所述对象。

43.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因递送载体使用PLG颗粒递送。

44.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因递送载体包囊在脂质体制剂中。

45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因递送载体是病毒载体。

46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒载体选自不同亚型、种类或血清型的病毒载体。

47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是逆转录病毒载体。

48.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体。

49.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是甲病毒载体。

50.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是腺病毒载体。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述腺病毒载体是活的复制型载体。

52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述腺病毒载体是非复制型载体。

53.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。

54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。

55.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括适应性免疫应答。

56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫应答还包括先天免疫应答。

57.如权利要求55或56所述的方法，其特征在于，所述方法包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性应答。

58.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括体液免疫应答。

59.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括细胞免疫应答。

60.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因递送载体按以下方式给予：肌肉内、粘膜内、鼻内、皮下、真皮内、经皮、阴道内、直肠内、口服或静脉内。

61.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫应答导致在对象中产生抗来源于第一HIV亚型的多种毒株的中和抗体。

62.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫应答导致在对象中产生抗来源于多种HIV亚型的多种毒株的中和抗体。

63.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括在所述对象体内产生中和多种HIV分离物的广泛中和抗体。

64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，表征了所述广泛中和抗体显示使用CCR5共同受体中和HIV毒株的活性。

65.如权利要求63所述的方法，其特征在于，表征了所述广泛中和抗体显示抗来自相同HIV亚型的两种或多种HIV毒株的中和活性。

66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述中和抗体显示抗两种或多种选自以下HIV分离物的HIV毒株的中和活性：Ba、JR-FL、Bx08、6101、692、1168、1196和ADA。

67.如权利要求63所述的方法，其特征在于，表征了所述广泛中和抗体显示抗来自两种或多种不同HIV亚型的两种或多种HIV毒株的中和活性。

68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述中和抗体显示抗两种或多种选自以下HIV亚型的中和活性：A、B、C、D、E、F、G和O。

69.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括在所述对象中产生介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体。

70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，表征了所述抗体显示抗来自两种或多种不同HIV亚型的两种或多种HIV毒株的ADCC活性。

71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述抗体显示抗两种或多种选自以下HIV亚型的ADCC活性：A、B、C、D、E、F、G和O。

72.如权利要求69所述的方法，其特征在于，表征了所述广泛中和抗体显示抗来自同一HIV亚型的两种或多种HIV毒株的中和活性。

73.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述中和抗体显示抗两种或多种选自以下HIV分离物的HIV毒株的中和活性：Ba、JR-FL、Bx08、6101、692、1168、1196和ADA。

74.如权利要求1-34中任一项所述在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，其特征在于，所述多肽组分可以表达所述多肽组分的多核苷酸的形式给予。

75.如权利要求74所述的组合物，其特征在于，所述多肽组分用病毒载体给予。

76.如权利要求75所述的组合物，其特征在于，所述病毒载体选自腺病毒、甲病毒和痘病毒。

77.如权利要求74所述在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，其特征在于，一种或多种所述多核苷酸作为DNA制剂给予对象。

78.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，所述DNA制剂含有DNA和PLG。

79.如权利要求1-34中任一项所述的组合物，其特征在于，所述多肽组分以在病毒样颗粒上表达的蛋白质形式给予。

80.一种在哺乳动物中产生免疫应答的组合物，所述组合物含有，

多核苷酸组分和多肽组分，其中

所述多核苷酸组分含有编码来源于第一HIV毒株的HIV免疫原性多肽的多核苷酸；

所述多肽组分含有与所述多核苷酸组分编码的多肽类似的HIV免疫原性多肽，前提是该多肽组分的至少一种HIV免疫原性多肽来源于第二HIV毒株，其中所述第一HIV毒株和所述第二HIV毒株不同。

81.如权利要求80所述的组合物，其特征在于，所述第二HIV毒株是与所述第一HIV毒株的亚型相同的HIV毒株。

82.如权利要求81所述的组合物，其特征在于，所述第二HIV毒株是与所述第一HIV毒株的亚型不同的HIV毒株。

83.如权利要求35-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽组分由病毒载体递送。

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