CN101397564A - 通过操作信使rna前体加工而提供的针对环境毒性的保护 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过操作信使RNA前体加工而提供的针对环境毒性的保护。进一步地，本发明描述了前信使RNA加工作为由例如锂和钠毒性引起的环境压力的新靶的鉴定。由不同生物体过度表达参与前mRNA加工的不同类型的蛋白质(或蛋白质片段)可保护酵母免于盐压力的损害，这说明，不依赖其机制，对这种过程的任何刺激都可能抵消无机盐的毒性作用。已经通过在转基因拟南芥植株中过度表达这些类型的蛋白质而观察到耐受性NaCl和LiCl的相似表型，证明了这种保护作用在真核细胞和生物体中的普遍性。

Description

通过操作信使RNA前体加工而提供的针对环境毒性的保护

本申请是一件分案申请，其原申请的申请日为2001年4月19日，申请号为01809382.5，发明创造名称为“通过操作信使RNA前体加工而提供的针对环境毒性的保护”。

发明领域

本发明涉及参与信使RNA前体加工的核酸和蛋白质用于在真核细胞和生物体中增强针对环境压力(诸如无机盐毒性)的耐受性的用途。

发明背景

对锂和钠毒性敏感的细胞靶的本质为我们呈现了关于真核细胞中离子稳态生理学的重要图谱。这些靶的表征对于理解临床问题诸如锂对偶极紊乱治疗的影响(Schou，1997，Arch.Gen.Psychiatry，54：9)或与高血压有关的高钠水平(Lifton，1996，Science，272：676)是至关重要的。完全不同但也与离子稳态有关的另一个问题是耕地在大量灌溉后的渐进盐化，为了在干旱地区发展足够的农业，这使得培育耐盐农作物成为迫切需要(Serrano，1996，Int.Rev.Cytol.，165：1；Yeo，1998，J.Exp.Bot.，49：915；Holmberg和Bülow，1998，Trends Plant Sci.，3：61)。

除了离子运输(Haro等人，1991，FEBS Lett.，291：189；Gaxiola等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：1480；Apse等人，1999，Science，285：1256)和渗压剂合成(Tarczynski等人，1998，Plant J.，16：155)，操作对高离子浓度和水压力最敏感的细胞系统提供了改进农作物盐耐受性的候选途径(Serrano，1996，Int.Rev.Cytol.，165：1；Tezara等人，1999，Nature，401：914)。

遗传和生化分析已经将酵母基因HAL2的产物鉴定为盐毒性的重要生理靶(

等人，1993，EMBO J.，12：3105；Dicht1等人，1997，EMBO J.，16：7184)。HAL2编码3’，5’-二磷酸核苷酸酶，它对锂和钠的抑制非常敏感(Murgu 

等人，1995，Science，267：232)。Hal2p的盐抑制导致有毒化合物3’-磷酸腺苷5’-磷酸(pAp)的胞内积累(Murgu 

等人，1996，J.Biol.Chem.，271：29029)，继而抑制硫酸基团的还原和转移反应，并抑制有些外切核糖核酸酶(Dichtl等人，1997，EMBO J.，16：7184；Gil-Mascarell等人，1999，PlantJ.，17：373)。植物(Gil-Mascarell等人，1999，Plant J.，17：373)和哺乳动物(López-Coronado等人，1999，J.Biol.Chem.，274：16043)中存在与HAL2同源的基因，尽管后者中所编码的酶受到锂但非钠的抑制。

Hal2p的野生型蛋白质和耐受锂与钠的突变形式的过度表达所赋予的盐耐受性较为适中(Albert等人，2000，J.Mol.Biol.，295：927)。这说明还存在盐毒性的其它靶，而且一旦克服了HAL2瓶颈，它们将成为限制性因素，但是尚不知道这些重要的盐敏感过程。

下面的两项专利申请涉及渗透压，但描述的保护机制与本发明描述的普遍机制不同：ES2110918A(1998-02-16)涉及通过操作碳水化合物代谢而生成耐受性渗透压的植物；ES2134155A1(1998-10-07)涉及通过在淡土植物中使用编码具有过氧化物酶活性的蛋白质的基因而赋予对渗透、水、和盐压力的耐受性的方法。

发明概述

本发明隐含的技术问题是提供可用于为遭受由盐、干旱、或寒冷和冻结压力引起的压力条件(像渗透压)的细胞和生物体增强压力耐受性的方法。

本发明通过操作信使RNA加工而在细胞和生物体中提供了针对渗透压的保护，从而解决了这个技术问题。本发明提供了能够赋予异源宿主细胞或宿主生物体以针对压力条件的耐受性的一套分离基因。这些基因都参与mRNA前体的加工(诸如合成、剪接、5’和3’末端修饰、运动、运输至细胞质、代谢、等)，而且它们在分开转化对盐敏感的酵母突变体后都显示抗盐表型。由此，每种基因都能担当压力耐受性的有效增强剂，而无需其它因素的辅助。

这套基因包括SR样蛋白质、(核)RNA结合因子、核糖核蛋白复合物成分、转录因子和核移动蛋白，它们使得本领域熟练技术人员能够在遗传学上改变目的生物体，使之耐受性压力处境，诸如渗透压处境，更具体的说是无机盐或Na⁺或Li⁺毒性。公开的每种基因都使得本领域熟练技术人员能够通过将至少一种上述基因导入细胞来更改细胞命运和/或植物发育和/或生化和/或生理。对于例如农作物的栽培，它们中的许多对压力条件像盐、干旱、或寒冷敏感，本发明公开的基因提供了解决产量降低和经济利益降低问题的可能性。

本发明提供了通过操作信使RNA前体加工来解决由环境压力引起的细胞毒性的方法，而且本发明的实施方案包括方法、核酸、多肽、载体、宿主细胞、和转基因生物体像转基因植物。

发明详述

土壤盐度是对植物农业而言最重要的非生物或环境压力之一。除了普遍改进农作物盐耐受性的实践目的，盐耐受性研究还是基础植物生物学的一个重要部分。同样，关于其它两项主要的非生物压力即干旱和寒冷的研究与盐压力工作有密切联系。例如，受到盐压力调控的许多基因也响应干旱或寒冷压力(Zhu J.K.，1997，Molecularaspects of osmotic stress in plants即植物中渗透压的分子方面，CRC Crit.Rev.Plant Sci.，16：253-277)。因而，本领域熟练技术人员能够推定的，当分离基因在转染宿主生物体后赋予其以盐耐受性时，它还能够赋予针对寒冷和/或干旱压力的耐受性。盐、干旱、和寒冷被认为是渗透压的三种最重要形式。

为了在真核细胞中鉴定环境毒性的新靶，发明人表征了在酵母细胞中表达时赋予对无机盐的耐受性增加的基因。因此，搜索了能够通过在酵母细胞中过度表达而赋予盐压力耐受性的拟南芥(Arabi dopsis thaliana)(Minet等人，1992，Plant J.，2：417)和甜菜(Beta vulgaris)cDNA文库，其中通过向培养基中添加甲硫氨酸来避免pAp的积累及其毒性作用(Gl ser等人，1993，EMBOJ.，12：3105；Dichtl等人，1997，EMBO J.，16：7184；Murgu 

等人，1995，Science，267：232；Murgu 

等人，1996，J.Biol.Chem.，271：29029)。这种策略的结果就是产生了本发明。这是用于鉴定参与植物应答盐压力的基因和蛋白质的功能性方法。为此目的，如实施例1和实施例3所述构建了cDNA表达库，并将感受态酵母菌株(见实施例2)用于筛选在过度表达时提高酵母盐耐受性的cDNA。这些酵母菌株的生长通常在与削弱大多数农作物生长的NaCl或LiCl浓度相似的高浓度(150mM)下受到抑制。在用cDNA文库转化酵母细胞后，合并菌落，并对它们选择存在150mM NaCl时的生长能力。实施例4进一步描述了这种筛选流程。

增强盐耐受性的拟南芥基因的分离

筛选了大约7.5 x 10⁵个转化体的拟南芥cDNA文库，并分离得到能够在酵母中赋予针对高盐浓度的耐受性的3个独立克隆(图1)。令人惊讶的是，这3种cDNA编码的蛋白质都参与信使RNA前体的加工。将这3种蛋白质称为Ct-SRL1、RCY1、和U1A。

这些蛋白质中的两种属于所谓的“SR样”或“富含交替精氨酸的”因子家族，其特征是包含具有高含量的Arg残基与Ser、Asp、和/或Glu交替的结构域(RS结构域)(图2)。该家族的成员参与组成性和/或旁路剪接，并且参与信使RNA的加工和代谢过程中不同步骤(转录、5’和3’末端修饰、和前mRNA剪接、将成熟RNA运输至细胞质、等)的偶联。具有SEQ ID NO.3所列氨基酸序列的Ct-SRL1蛋白质是由本文鉴定为SEQ ID NO.1的cDNA编码的，它还发现于来自P1克隆MNJ8(Genbank编号AB017069)的拟南芥5号染色体的基因组区域。同样，SEQ ID NO.3的蛋白质序列也呈现于公开的数据库，编号BAB09109，但是尚未指出该序列有任何功能。Ct-SRL1的cDNA不是全长的，它编码推测的SR样蛋白质(包含RS结构域)的羧基末端。它在酵母中的表达赋予针对锂和钠的耐受性(图1)。

第二个克隆编码的推定的蛋白质具有与K型和T型细胞周期蛋白有关的N端细胞周期蛋白结构域和富含精氨酸的C端结构域(图2A)。将这种SR样蛋白质命名为RCY1，作为富含精氨酸的细胞周期蛋白1的变更。它在酵母中的表达赋予针对锂和钠的耐受性(图1)。为了测定这种SR样蛋白质中RS结构域在酵母中增强盐耐受性的作用，分开克隆RCY1的细胞周期蛋白结构域和RS结构域，并转化到酵母细胞中。在图2A中通过标有下划线的甲硫氨酸残基标记了两个结构域的分割，并将包含RS结构域的C端部分称为SEQ ID NO.21(图5)。单独的RS结构域的表达即赋予与全长蛋白质表达相同的表型(图3)。这些结果证明，在“SR样”因子的情况中，是RS结构域本身而非特定蛋白质的表达赋予针对盐压力的耐受性。本文将RCY1蛋白质的氨基酸组成呈现于SEQ ID NO.4。本文将RCY1的cDNA鉴定为SEQ ID NO.2，该序列还发现于来自克隆T9J22的拟南芥2号染色体序列的基因组区域。该基因组拟南芥克隆的核苷酸序列对应于RCY1基因的部分核苷酸序列，将它注解为推定的细胞周期蛋白(编号AAC14513.1)。来自公开数据库的这一蛋白质预测缺乏RCY1蛋白质的前55个氨基酸。因此，将对应于氨基末端区域的RCY1蛋白质片段呈现于SEQ ID NO.22。

第三个拟南芥克隆编码拟南芥的U1A蛋白质，它是U1-snRNP的成分，后者是在前信使RNA内含子加工最初步骤之一中识别5’-剪接位点的核糖核蛋白复合物。拟南芥的U1A蛋白质先前被(S impson等人，1995，EMBO J.，14：4540-4550)描述为剪接体U1-snRNP的特异成分。U1A在酵母中的表达赋予较弱的LiCl耐受性，且不赋予NaCl耐受性(图1)。具有SEQ ID NO.6所列氨基酸组成的U1A蛋白质是由本文鉴定为SEQ ID NO.5的cDNA编码的。可以在公开的数据库中找到该蛋白质序列和核酸序列，编号分别是CAA90283.1和Z49991，而且具有充分的注解。上文所述序列呈现于图5。

在存在和缺乏甲硫氨酸时且在不同的遗传背景中观察上文所述表型。

酵母中通过表达拟南芥克隆而得到的盐耐受的性改进并非由于离子运输的刺激，因为它与胞内锂浓度的变化无关。这是如实施例5中所述测定的。同样，该表型在液泡运输缺陷的酵母菌株中得到维持。

上述结果说明，可能是对另一细胞过程的作用引起了所观察到的压力耐受性。本发明人相信，信使RNA前体的加工可能是真核细胞中离子毒性的作用靶。这一观点先前从未被描述过。

与本文一致的是，发明人已经确认了前mRNA内含子加工在酵母中受到例如LiCl的存在的抑制。前mRNA体内剪接的两项独立测试支持本发明。首先，发明人测量了酵母细胞中由质粒合成的β-半乳糖苷酶的比活，该质粒包含由内含子人为中断的大肠杆菌(Escherichiacoli)LacZ基因(实施例6)。在向培养基中添加LiCl时，他们检测到这种酶的积累相对于由不含内含子的对照构建物生成的酶有降低。拟南芥SRL1RS结构域在这些酵母细胞中的同时表达部分阻断所观察到的抑制(未显示数据)。这些结果已经得到了第二种测定法的确认，其中发明人如实施例7中所述通过RT-PCR技术直接测定了存在锂时对剪接的抑制。证明了存在LiCl时内源酵母信使RNA前体例如对应于SAR1基因的前mRNA的积累。因为普遍的剪接抑制将首先影响通常以较低效率得到加工的那些内含子的消除，所以发明人为这些实验选择了包含这种内含子的SAR1前mRNA(Kao和Siliciano，1996，Mol.Cell.Biol.，16：960-967)。此外，通过将酵母细胞在盐压力条件下保温，发明人观察到SAR1前mRNA的积累，和它是如何通过Ct-SRL1的同时共表达而得到部分逆转的。发明人通过这种方法证明了存在盐时前mRNA的加工抑制由上述拟南芥克隆之一(如Ct-SRL1)的表达而得到部分逆转。

本发明的普遍意义由过度表达Ct-SRL1 cDNA的转基因拟南芥植株的表型而得到确认。与该机制普遍特征一致的是，相同Ct-SRL1 cDNA在CaMV35S启动子控制下在拟南芥转基因植株中的表达以与酵母中相似的方式增加它们对NaCl和LiCl的耐受性。例如，通过在含有对野生型对照种子有毒的LiCl浓度的琼脂平板中使转基因种子发芽，可以观察到这种现象(图4)。3个独立的转基因系能够生长，显示了本发明方法的效率。

根据这些结果和根据分离拟南芥克隆的真正本质，可以推断，不管具体机制如何，对信使RNA前体加工的任何刺激都能够抵消盐的毒性作用，而且针对盐压力的这种保护作用在所有真核细胞和生物体中是普遍的。

本发明的普遍特征(即针对盐压力的保护作用不依赖物种)通过同样赋予盐耐受性且同样涉及信使RNA前体加工的甜菜基因和真核基因的分离而得到了确认。

增强盐耐受性的甜菜基因的分离

本发明的另一方面是筛选经NaCl诱导的甜菜叶片的cDNA文库并随后分离得到赋予酵母细胞以压力耐受性的七种甜菜基因的流程。下面是用于鉴定参与植物应答盐压力的的甜菜基因和蛋白质的功能性方法。为此目的，如实施例1和实施例3中所述由甜菜叶片构建经NaCl诱导的cDNA表达文库，并将对Na⁺敏感的酵母突变株JM26(见实施例2)用于筛选在过度表达后增加酵母盐耐受性的甜菜cDNA。这种酵母突变体的生长通常在与削弱大多数农作物物种生长的NaCl浓度相似的浓度(150mM)下受到抑制。在用cDNA文库转化酵母细胞后，合并菌落，并对它们选择存在150mM NaCl时的生长能力。实施例4进一步描述了这种筛选流程。进一步表征在高盐浓度存活的六个阳性克隆，它们包含具有SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、或SEQ ID NO.17所示序列的基因。由这些基因编码的相应蛋白质序列分别具有SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、或SEQ ID NO.18所列氨基酸组成。所有这些序列都呈现于图5。令人惊讶的是，六个选定酵母克隆的每一个都受到所编码蛋白质参与mRNA加工的基因的转化：一种蛋白质是推定的精氨酸-天冬氨酸RNA结合蛋白；两种是推定的RNA结合蛋白；两种是推定的转录因子；一种显示与核运动蛋白有相似性。因此，正如关于本发明拟南芥基因所述且如上所述，这些蛋白质(及其编码基因)适合作为通过操作前mRNA加工而发挥作用的压力耐受性增强剂。

因此，本发明涉及SEQ ID NO.7所列新的分离甜菜核酸，它编码推定的精氨酸-天冬氨酸RNA结合蛋白，且能够在酵母细胞中增强盐耐受性。自第51位核苷酸起始、至第1079位核苷酸终止的开放读码框编码SEQ ID NO.8所列氨基酸序列。该多肽与拟南芥推定的精氨酸-天冬氨酸RNA结合蛋白(瑞士PROT编号AAB68037)具有76％同一性和86％相似性。氨基酸比较是使用程序GAP进行的(符号比较表：blosum62.cmp，CompCheck：6430，BLOSUM62氨基酸替代矩阵，参考文献：Henikoff S.和Heni koff J.G.，1992，Ami no acidsubstitution matrices from protein blocks即来自蛋白质模块的氨基酸替代矩阵，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919)。该程序还用于比较下列红甜菜多肽的氨基酸序列。

本发明还涉及SEQ ID NO.9所列新的分离红甜菜核酸，它编码推定的RNA结合蛋白，且能够在酵母细胞中增强盐耐受性。自第14位核苷酸起始、至第625位核苷酸终止的开放读码框编码SEQ ID NO.10所列氨基酸序列。该多肽与拟南芥推定的RNA结合蛋白(瑞士PROT编号AAG52616.1)具有68％同一性和78％相似性。

本发明还涉及SEQ ID NO.1l(也称为克隆或序列编号11)所列新的分离红甜菜核酸，它编码推定的转录因子，且能够在酵母细胞中增强盐耐受性。自第51位核苷酸起始、至第1119位核苷酸终止的开放读码框编码SEQ ID NO.12所列氨基酸序列。该多肽与菠菜(Spinac iaoleracea)核RNA结合蛋白(瑞士PROT编号AAF14145.1)具有81％同一性和86％相似性。

SEQ ID NO.11的第1-475位核苷酸发表于EST数据库，编号BF011019，描述为甜菜发芽cDNA文库的DNA片段，而且与推定的转录因子相似。

本发明还涉及SEQ ID NO.13所列新的分离红甜菜核酸，它编码推定的转录因子，且能够在酵母细胞中增强盐耐受性。自第51位核苷酸起始、至第1121位核苷酸终止的开放读码框编码SEQ ID NO.14所列氨基酸序列。该多肽与菠菜核RNA结合蛋白(瑞士PROT编号AAF14144.1)具有81％同一性和87％相似性。

本发明还涉及SEQ ID NO.15所列新的分离红甜菜核酸，它编码推定的RNA结合蛋白，且能够在酵母细胞中增强盐耐受性。自第2位核苷酸起始、至第970位核苷酸终止的开放读码框编码SEQ ID NO.16所列氨基酸序列。该多肽与稻(Oryza sativa)推定的RNA结合蛋白(瑞士PROT编号AAG59664.1)具有68％同一性和74％相似性。

本发明还涉及SEQ ID NO.17所列新的分离红甜菜核酸，它编码未知类型的蛋白质，且能够在酵母细胞中增强盐耐受性。自第35位核苷酸起始、至第922位核苷酸终止的开放读码框编码SEQ ID NO.18所列氨基酸序列。该多肽与与核运动蛋白相似的拟南芥蛋白质(瑞士PROT编号BAA97317.1)具有61％同一性和69％相似性。

因此，本发明的一个优选实施方案涉及用于对生物体诱导压力耐受性的方法，包括表达参与信使RNA前体加工的一种或多种甜菜基因。

上文所述的筛选和选择流程同样可用于由植物以外的其它生物体选择基因。作为范例，选择了在酵母细胞中增强盐耐受性的家鼠(Mus musculus)序列。如SEQ ID NO.19所列的该序列编码U2snRNP辅助因子蛋白质的推定的小亚基，且能够在酵母细胞中增强盐耐受性。自第37位核苷酸起始、至第969位核苷酸终止的开放读码框编码SEQ ID NO.20所列氨基酸序列。该多肽与拟南芥U2snRNP辅助因子小亚基(瑞士PROT编号BAB10638.1)具有78％同一性和84％相似性。该序列呈现于图5。

该结果例示了哺乳动物基因也可用于本发明的方法。本发明的方法因而可普通应用于通过操作信使RNA前体而赋予宿主细胞或生物体以压力耐受性。

如上所述选择的有些酵母克隆的令人惊讶的强烈表型及在分离位置中和在异源背景中这些基因担当压力耐受性增强剂的事实使得这些基因成为非常有吸引力的工具，可用于在任何目的生物体中诱导压力耐受性而无需辅助化合物。这些基因在如本文所述分离和转染的酵母细胞中增强渗透压(特别是无机盐压力，诸如Na⁺和Li⁺)耐受性的能力清楚证明了它们将它们自身的渗透压耐受性赋予任何异源宿主生物体的潜力。或者，本发明的每一种压力耐受性基因都可彼此联合，以改变细胞命运或植物形态、植物发育、植物生化、或植物生理。

依照第一个实施方案，本发明涉及在细胞和生物体中增强压力耐受性的方法，包括操作信使RNA前体的加工过程。

依照一个优选实施方案，所述压力可以是环境压力，诸如但不限于渗透压、盐压力、干旱压力、寒冷压力、或冻结压力。

依照一个优选实施方案，本发明的方法涉及增强细胞和生物体的盐耐受性。

本发明的另一个实施方案涉及保护细胞和生物体免于盐毒性的损害的方法，包括操作信使RNA(mRNA)前体的加工过程。

依照一个实施方案，操作信使RNA前体加工过程的一种方式是对参与或干预信使RNA前体加工过程或mRNA前体加工途径之一的至少一种分子进行遗传或生化操作。

术语“细胞”指任何原核或真核细胞。术语“生物体”指任何原核或真核起源的单细胞或多细胞生物体。

本发明清楚描述的几种基因和蛋白质属于可用于增强压力耐受性的不同基因和蛋白质类型。本发明的这些基因和蛋白质已经显示了对mRNA加工过程有一定影响。

因此，依照还有一个优选实施方案，本发明涉及任何上述方法，其中包括对具有Arg-Ser、Arg-Glu、和Arg-Asp二肽高含量结构域(RS结构域)的蛋白质、RNA结合蛋白、U1-snRNP或U2-snRNP复合物成分、转录因子、或核运动蛋白进行遗传或生化操作。

本发明还涉及包含SEQ ID NO.1所示核酸序列即编码SEQ IDNO.3所列氨基酸序列的分离核酸、或包含如SEQ ID NO.2所示即编码SEQ ID NO.4所列氨基酸序列的核酸、或编码包含SEQ ID NO.22所示氨基酸序列的多肽的核酸用于至少一种上述方法的用途。SEQ IDNO.1和2与编码SR样蛋白质的基因共享实质性同源性。

本发明还涉及用于任何上述方法的包含SEQ ID NO.5所示核酸序列即编码SEQ ID NO.6所列氨基酸序列的分离核酸。SEQ ID NO.5与编码I1-s nRNP或U2-snRP复合物的成分的基因共享实质性同源性。

本发明还涉及用于任何上述方法的包含SEQ ID NO.7、9、11、13、15、17、或19任一项所示核酸序列即编码SEQ ID NO.8、10、12、14、16、18、或20任一项所列氨基酸序列的分离核酸。SEQ IDNO.7、9、13、和15与编码RNA结合蛋白的基因共享实质性同源性。SEQ ID NO.19与编码I1-snRNP或U2-snRP复合物的成分的基因共享实质性同源性。SEQ ID NO.11和17与编码转录因子的基因共享实质性同源性。

本发明还涉及选自下组且编码蛋白质或其免疫学活性和/或功能性片段的分离核酸：

(a)包含SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一项所示DNA序列或其互补序列的核酸；

(b)包含对应于(a)中SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一项的RNA序列或其互补序列的核酸；

(c)与(a)或(b)中定义的核苷酸序列特异杂交的核酸；

(d)所编码的多肽或蛋白质具有与SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21所示多肽至少50％、优选至少60％、70％、或80％、更优选至少85％或90％、最优选95％同一的氨基酸序列的核酸；

(e)所编码的多肽或蛋白质具有SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22所示氨基酸序列的核酸；

(f)由于SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一项所示或(a)-(e)中定义的核酸的核苷酸序列遗传密码而具有简并性的核酸；

(g)由于生物体之间编码SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一项所示多肽或蛋白质或(a)-(e)中定义的核苷酸序列的密码子使用率差异而具有分歧的核酸；

(h)由于编码SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一项所示多肽或蛋白质或(a)-(e)中定义的等位基因的差异而具有分歧的核酸；

(i)编码由SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一项所示或(a)-(e)中定义的DNA序列编码的多肽或蛋白质的免疫学活性和/或功能性片段的核酸；

(j)编码SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21中定义的蛋白质或多肽或(a)-(i)中定义的核酸，且特征为所述序列是DNA、cDNA、基因组DNA、或合成DNA。

应当理解，本发明还涉及用于任何上述方法的(a)-(j)中定义的任何核酸。

本发明还涉及特异扩增本发明核酸之一(优选(a)-(j)中定义的那些核酸)或与之特异杂交的长度为至少15个核苷酸的核酸分子。

本发明还涉及包含本发明核酸的载体，其中所述载体优选表达载体，其中核酸可操作连接能够在原核和/或真核宿主细胞中表达所述序列的一种或多种控制序列。因此，本发明还涉及包含本发明核酸或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以选自细菌、昆虫、真菌、酵母、植物、或动物细胞。

依照还有一个实施方案，本发明涉及编码包含上文所述“RS结构域”的蛋白质的天然或合成核酸用于本文所述任何方法的用途。

本发明还涉及编码在真核细胞中参与信使RNA前体加工过程的蛋白质的天然或合成核酸在本发明任何方法中的用途。

本发明还涉及与本文所述至少一种序列具有至少50％同一性的核酸在用于增强压力耐受性的方法中的用途，所述方法包括操作mRNA前体加工的过程或途径。优选的是，所述核酸源自真核细胞或生物体。

本发明还包括对应于至少一种本发明核酸的反义分子及其在本发明任何方法中的用途。

依照还有一个实施方案，本发明涉及可以由至少一种本发明核酸编码的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫学活性和/或功能性片段，所述多肽可以是天然的、合成的、富集的、分离的、不含细胞的、和/或重组的。这些多肽的每一种都可用于本发明的任何方法。

优选多肽是那些包含SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22任一项所示氨基酸序列的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫学活性和/或功能性片段。

本发明还涉及生成本发明多肽的方法，包括在允许表达多肽的条件下培养上文所述宿主细胞并由培养物回收生成的多肽。

本发明还涉及用于生成转基因植物、植物细胞、或植物组织的方法，包括将可表达形式或本发明载体中的本发明核酸导入所述植物、植物细胞、或植物组织。

本发明还涉及用于生成改变的植物、植物细胞、或植物组织的方法，包括将本发明多肽直接导入所述植物的细胞、组织、或器官。

本发明还涉及用于实现本发明多肽的表达的方法，包括将可操作连接一种或多种控制序列的本发明核酸或本发明载体稳定导入植物细胞的基因组。

本发明还涉及用于生成转基因植物的方法，还包括由所述植物细胞再生植株。

本发明还涉及可以通过上述方法之一获得的转基因植物细胞，其中所述核酸稳定整合到所述植物细胞的基因组中。

依照本发明，由于表达权利要求13的至少一种核酸或权利要求25或26的至少一种多肽或权利要求23的反义分子，可以生成耐受盐压力的转基因植物。所述转基因植物也是本发明的一部分，由于表达至少一种本发明核酸或反义分子或至少一种本发明多肽而显示表型变化的转基因植物也属于本发明一部分。

本发明还涉及本发明植物的任何可收获部分，优选选自下组：种子、叶、果实、茎干培养物、根状茎、根、块茎、和鳞茎。由本发明任何植物或植物部分衍生的后代同样是本发明的一部分。

依照另一个实施方案，本发明涉及用于在植物中增强压力耐受性的方法，包括在所述植物的细胞、组织、或部分中表达本发明的至少一种核酸或至少一种多肽或反义分子。

依照另一个实施方案，本发明涉及用于在植物中改变压力耐受性的方法，包括在所述植物的细胞、组织、或部分中表达本发明的至少一种核酸或至少一种多肽或反义分子。

应当清楚，上述方法中的压力耐受性可以指由环境引起的任何压力，诸如但不限于渗透压、盐压力、干旱压力、冻结压力、或寒冷压力。

另外，本发明的任何方法、核酸、反义分子、或多肽都可用于提高产量、刺激植物生长(可以是该植物的任何部分，诸如根、叶、种子)(的方法)。

本发明还涉及可以通过任何上述方法获得的植物，用于在高盐浓度的土壤上栽培，优选盐含量超过1mM盐离子的土壤。

由于表达本发明的任何核酸和/或蛋白质而更加耐受盐压力的新的酵母菌株或其它单细胞真核生物同样构成本发明的一部分。

本发明还涉及体外细胞培养系统，它包括耐受盐的、因表达至少一种核酸、载体、多肽、或权利要求23的反义分子而获得的上文定义的动物、植物、或宿主细胞。

本发明还涉及由本文所述方法衍生的对人的至少一种治疗性应用。

本发明还涉及特异识别本发明多肽或其特定表位的抗体。

本发明还涉及诊断组合物，它包含本发明的至少一种核酸、载体、反义分子、多肽、或抗体。

定义和实施方案的详述

专业定义

“对某一过程的操作”在本文中指干预或调控该过程，优选增强、催化、改变、或变更该过程。这种干预可能对该过程的每一个步骤或每一种成分或每一种产物或每一种结果产生影响。这种干预还可能对该过程的效率、速率、或产量产生影响。

“对某一过程的遗传操作”在本文中指通过对该过程所涉及的遗传序列(如核苷酸序列、RNA、DNA)的任何类型干预来操作某一过程。除了细胞的天然遗传活性诸如不同核酸的复制、转录、翻译、和加工，术语“对某一过程的遗传操作”还包括分子生物学技术和遗传工程技术。本领域熟练技术人员知道这些人工遗传技术，例如克隆、转化、重组、表达、过度表达、沉默、等。作为“对某一过程的遗传操作”的范例，可以干预编码参与信使RNA前体加工过程的蛋白质的遗传序列。或者，可以干预直接参与信使RNA前体加工过程的RNA分子(诸如小核RNA)。

在所述遗传序列编码蛋白质且该编码序列的表达、构造、结构、或定位遭到改变的情况中，使用术语“对某一蛋白质的遗传操作”。更具体的说，可以改变所述编码序列的组成或表达，或者可以在进行该过程的宿主细胞中导入或删除所述编码序列。更具体的说，所述蛋白质可以是参与前mRNA加工的任何成分，诸如但不限于U1-snRNP或U2-snRNP复合物成分、转录因子、RNA结合蛋白、或核运动蛋白。

“对某一过程的生化操作”在本文中指通过使用干预所述过程的生化方法来操作所述过程。生化方法指使用对生物学过程有影响的任何物质(化学药品、肽、和分子)。例如，可以在进行该过程的细胞中导入肽、蛋白质、或生化或化学物质以干预该过程。更具体的说，可以在细胞中直接导入由本发明基因衍生的蛋白质或肽以增强信使RNA前体的加工过程。

在所述生化方法涉及使用蛋白质或肽的情况中或者在所述生化方法导致蛋白质修饰的情况中，使用术语“对某一蛋白质的生化加工”。

“细胞”在本文中理解为它的广义，包括每一种存活细胞，诸如原核和真核细胞。

“信使RNA前体”在本文中指尚未成为成熟信使RNA(由其翻译成多肽)的任何RNA分子，因为它的组成、结构、或定位还有待改变。

“信使RNA前体的加工”在本文中指改变信使RNA前体的组成、结构、或定位的任何过程。这种加工在真核细胞中的范例是转录过程中信使RNA前体的合成、前体5’和/或3’端的修饰像聚腺苷酸化、前体中内含子的剪接像组成性或旁路剪接、前体的代谢或前体转移至核膜、和成熟RNA运输至细胞质等。前体DNA的这种加工或代谢的不同步骤的偶联也是本说明书中所用术语“信使RNA前体的加工”的一部分。前体RNA的转录后加工包括核内分解切割、核外分解消化、和共价修饰的复杂途径。各个加工步骤的一般次序在真核细胞中是相当保守的，但是根本的机制在很大程度上还不知道。前mRNA加工是重要的细胞活性，而且已经在酵母细胞酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中进行了研究(Venema和Tollervey，1995，Yeast，11(16)：1629-1650)。加工步骤包括多种蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质-RNA和RNA-RNA相互作用。不同转录因子、RNA结合蛋白、其它核蛋白诸如核运动蛋白、和核RNA在前mRNA加工中的精确作用在很大程度上仍然还不知道。因此，干预信使RNA前体加工过程的蛋白质可能是许多不同类型的蛋白质。前mRNA的核运输所涉及的几种因子可用于本发明的方法，因为它们参与前mRNA的加工。前mRNA主要是由位于染色质结构域与染色质间区域之间介面的基因转录得到的。部分或完全加工并与核蛋白复合后，转录本离开它们的合成位点，并经由染色质间区运动至核孔，在那里，它们被输出机器捕获并输出至细胞质。能够运输的mRNA复合了正确的核蛋白补体(回顾见Plitz和Pderson，2000，J.Struct.Biol.，129(2-3)：252-257)。U1-snRNP和U2-snRNP的作用主要在于前mRNA的剪接。U1小核核糖核蛋白颗粒或复合物U1-snRNP 70K(U1-70K)基因的产物(一种U1-snRNP特异蛋白质)，涉及动物及植物中前mRNA的基本及旁路剪接(Golovkin和Reddy，1996，Plant Cel l，8：1421-1435)。在其它报告中描述了U1-70K蛋白质的不同相互作用蛋白质，诸如SC35样蛋白质和富含丝氨酸/精氨酸的蛋白质(Golovkin和Reddy，1999，J.Biol.Chem.，245(51)：36428-36438)。已经描述了U2小核核糖核蛋白辅助因子诸如U2A(Domon等人，1998，J.Biol.Chem.，273(51)：34603-34610)。本发明的范围涵盖参与信使RNA前体剪接的任何蛋白质。已经描述了小核RNA在植物的前mRNA加工中的作用(Brown和Shaw，Pl ant Ce ll，1998，10：649-657)。因此，还可以通过干预RNA分子来建立对前mRNA加工过程的操作。Jarrous等人，1999，J.Cell Biol.，146(3)：559-572显示在细胞核中可找到Rpp29和Rpp38(人RNA酶P的蛋白质亚基)，而且它们位于卷曲体中，卷曲体是参与前体mRNA加工所需要的其它几种小核核糖核蛋白的生物发生的细胞器。这些类型的蛋白质是参与前mRNA加工的核糖核蛋白核糖核酸酶复合物的一部分，因而也可用于本发明的方法。本领域尚未精确确定核运动蛋白的作用。仍有许多参与信使RNA前体加工的分子有待阐明。

Blencowe等人，1999，77(4)：277-291：The processingof messenger RNA precursors(pre-mRNA) to mRNA requires alarge number of proteins that contains domains rich inalternating arginine and serine residues(RS domains)(信使RNA前体(前mRNA)变成mRNA的加工需要包含富含交替精氨酸和丝氨酸残基的结构域(RS结构域)的大量蛋白质)描述了本文所用的“SR样蛋白质”。它们包括剪接因子SR家族的成员和在结构上和在功能上与SR家族截然不同的蛋白质，下文共同称为SR相关蛋白质。两组RS结构域蛋白质都在组成性和受控前mRNA剪接中发挥功能。最近，鉴定了几种SR相关蛋白质与mRNA3’端形成有关且参与输出。Blencowe等人，1999，77(4)：277-291进一步回顾了包含RS结构域的蛋白质可能在前mRNA合成和加工的不同步骤的协调中发挥基础作用的证据。通用定义

术语“蛋白质”、“肽”、“寡肽”、或“多肽”在用于本文时指任何长度的聚合形式的氨基酸。所述术语还包括已知的氨基酸修饰，诸如形成二硫键、半胱氨酸化、氧化、谷胱甘肽化、甲基化、乙酰化、法尼基化、生物素化、硬脂酰化、甲酰化、添加硫辛酸、磷酸化、硫酸化、遍在蛋白化、豆蔻酰化、棕榈酰化、香叶基香叶基化、环化(如形成焦谷氨酸)、氧化、脱酰胺作用、脱水、糖基化(如戊糖、己糖胺、N-乙酰己糖胺、脱氧己糖、己糖、唾液酸、等)、酰化、和放射性标记(如¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、¹⁴C、³²P、³³P、³H)及非天然存在的氨基酸残基、L-氨基酸残基和D-氨基酸残基。

本发明蛋白质的“同系物”指那些相对于所述蛋白质而言包含氨基酸替代、删除、和/或添加的肽、寡肽、多肽、蛋白质、和酶，即相对于所述蛋白质而言，它们是未曾改变它的一项或多项功能特性、特别是未曾降低所生成活性的同系物。例如，所述蛋白质的同系物将包括所述蛋白质的生物活性氨基酸序列变体。为了生成这种同系物，可以用具有相似特性(例如疏水性、亲水性、疏水矩、抗原性、形成或打断α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向、等等)的其它氨基酸替代所述蛋白质中存在的氨基酸。

本发明蛋白质的替代性变体指那些其中消除了所述蛋白质氨基酸序列中的至少一个残基并在该位置插入了不同残基的变体。氨基酸替代通常指单个残基，但是根据对多肽的功能性约束可以成簇；插入通常是1-10个氨基酸残基的数量级，删除的范围是大约1-20个残基。优选的是，氨基酸替代将包括保守氨基酸替代，诸如上文所述。

本发明蛋白质的插入性变体指那些其中在所述蛋白质的预定位点导入了一个或多个氨基酸残基的变体。插入可以包括一个或多个氨基酸的氨基末端和/或羧基末端融合及序列内插入。一般而言，氨基酸序列内插入将小于氨基或羧基末端融合，数量级是大约1-10个残基。氨基或羧基末端融合蛋白质或肽的范例包括用于酵母双杂交系统的转录激活剂的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、His6标签、谷胱甘肽S-转移酶、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位(EETARFQPGYRS)、c-myc表位(EQKLISEEDL)、FLAG表位(DYKDDDK)、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位(YPYDVPDYA)、蛋白C表位(EDQVDPRLIDGK)、和VSV表位(YTDIEMNRLGK)。

本发明蛋白质的删除性变体的特征是由所述蛋白质的氨基酸序列消除了一个或多个氨基酸。

使用本领域众所周知的肽合成技术(诸如固相肽合成法等)或重组DNA操作，可以容易的生成本发明蛋白质的氨基酸变体。用于生成蛋白质变体(表示为替代性、插入性、或删除性变体)的DNA序列操作在本领域是众所周知的。例如，用于在具有已知序列的DNA中预定位点生成替代性突变的技术对于本领域熟练技术人员而言是众所周知的，诸如M13诱变、T7-Gen体外诱变试剂盒(USB，Cl eveland，OH)、QuickChange Site Directed mutagenesis kit即快速改变定点诱变试剂盒(Stratagene，San Diego，CA)、由PCR介导的定点诱变、或其它定点诱变方案。用于生成蛋白质变体(表示为替代性、插入性、或删除性变体)的DNA序列操作的另一种候选方案包括靶向体内基因修饰，这可以如先前所述(Palmgren，1997；Yoon等人，1996)通过嵌合RNA/DNA寡核苷酸来实现。

本发明蛋白质的“衍生物”指那些包含所述多肽的至少大约五个连续氨基酸残基但保留所述蛋白质的生物学活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质、和酶。相对于所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列而言，“衍生物”还可以额外包含天然存在的、不同糖基化的、酰化的、或非天然存在的氨基酸残基。或者/另外，相对于所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列而言，衍生物还可以包含一个或多个非氨基酸替代基，例如共价或非共价结合在氨基酸序列上的报告分子或其它配体，诸如结合在氨基酸序列上以便于其检测的报告分子。

“免疫学活性”指受到抗体的识别即与之结合的分子或其特定片段诸如表位或半抗原。

本发明的内容还包括任何本发明多肽的同系物、衍生物、和/或免疫学活性片段。

“抗体”包括单克隆、多克隆、合成、或重链抗体，以及抗体片段诸如Fab、Fv、或scFv片段。可以通过先前所述(Liddle和Cryer，1991)技术来制备单克隆抗体，包括融合小鼠骨髓瘤细胞与衍生自免疫动物的脾细胞。术语“抗体”还包括它们的衍生物，诸如标记抗体。抗体标记包括碱性磷酸酶、PKH2、PKH26、PKH67、荧光素(FITC)、Hoechst 33258、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明(TRITC)、Quantum Red、德克萨斯红、Cy3、生物素、琼脂糖、过氧化物酶、金球、和放射性标记(如¹²⁵I、¹³⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P、³³P、³H)。依赖针对蛋白质的抗体的分子生物学工具包括蛋白质凝胶印迹分析、能够鉴定基因的表达文库筛选、蛋白质定量法包括ELISA和RIA、蛋白质的免疫亲和纯化、蛋白质的免疫沉淀(Magyar等人，1997)、和免疫定位。抗体(尤其是肽抗体)的其它用途包括研究蛋白水解加工(Loffler等人，1994；Woulfe等人，1994)、测定蛋白质活性位点(Lerner，1982)、研究前体和翻译后加工(Baron和Baltimore，1982；Lerner等人，1981；Semler等人，1982)、鉴定蛋白质参与蛋白质-蛋白质相互作用的结构域(Murakami等人，1992)、和研究基因表达中的外显子使用(Tamura等人，1991)。

本发明的范围还包括识别上文定义的本发明蛋白质或其同系物、衍生物、或片段的抗体。

术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“DNA序列”、或“核酸分子”在用于本文时指任何长度的聚合形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或二者组合)。所述术语还包括双链和单链DNA和RNA。所述术语还包括已知的核苷酸修饰，诸如甲基化、环化和“加帽”、和用类似物诸如次黄苷替代一个或多个天然存在的核苷酸。所述术语还涵盖肽核酸(PNA)，这是一种DNA类似物，其中主链是由N-(2-氨乙基)-甘氨酸单位而非糖构成的假肽。PNA模拟DNA的性质，且结合互补核酸链。PNA的中性主链导致比通常更强的结合和更强的特异性。另外，已经将PNA的独特的化学、物理、和生物学特性用于生成有力的生物分子工具、反义和反基因试剂、分子探针、和生物传感器。

“重组DNA分子”或“嵌合基因”指通过连接来自不同来源的DNA片段而生成的杂种DNA。“异源核酸序列”指与启动子序列并非天然相关的序列。尽管该核苷酸序列对于启动子序列而言是异源的，然而它对于植物宿主而言可能是同源的、天然的、异源的、或外源的。“有义链”指双链DNA分子中与其mRNA转录本同源的那条链。“反义链”包含与“有义链”序列互补的倒置序列。

“编码序列”或“开放读码框”或“ORF”定义为在置于适当调控序列的控制下时即当所述编码序列或ORF以可表达形式存在时能够转录成mRNA和/或翻译成多肽的核苷酸序列。所述编码序列或ORF以5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子为界。编码序列或ORF可以包括但不限于RNA、mRNA、cDNA、重组核苷酸序列、合成制造的核苷酸序列、或基因组DNA。所述编码序列或ORF可以用干预性核酸序列中断。基本上编码相同蛋白质但由不同来源分离的基因和编码序列可以由充分不同的核酸序列构成。相反，充分不同的核酸序列可以设计用于实现本质上相同蛋白质的表达。所述核酸序列是例如指定基因存在的不同等位基因或遗传密码的简并性或密码子使用率的差异的结果。因而，氨基酸诸如甲硫氨酸和色氨酸是一种密码子编码，而其它氨基酸诸如精氨酸、亮氨酸、和丝氨酸每一种都能够由多达六种不同密码子翻译而成。下文为根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)(细菌)、拟南芥、紫苜蓿(Medicago sativa)(两种双子叶植物)、和稻(单子叶植物)例示了优选密码子使用率的差异。这些范例摘录自http://www.kazusa.or.jp/codon。作为一个范例，密码子GGC(甘氨酸)是根癌农杆菌中最频繁使用的密码子(36.2‰)，是稻中第二个最频繁使用的密码子，但是在拟南芥和紫苜蓿的使用率则低得多(分别是9‰和8.4‰)。在编码甘氨酸的四种可能密码子中(见表2)，所述GGC密码子在根癌农杆菌和稻中是最优选使用的。然而，在拟南芥中是GGA(和GGU)密码子，在紫苜蓿中是GGU(和GGA)密码子。等位基因变体还定义为包含单核苷酸多态性(SNP)及小插入/删除多态性(INDEL；INDEL的大小通常小于100bp)。SNP和INDEL在大多数生物体的天然发生多态性菌株中形成最大一套序列变体。它们有助于基因作图和基因及基因功能的发现。它们还有助于鉴定参与决定性过程诸如生长速率、植株大小和植株产量、植株活力、疾病抵抗力、压力耐受性、等的遗传基因座(如植物基因)。现在有许多技术可用于鉴定SNP和/或INDEL，包括(1)PCR及随后的变性高效液相层析(DHPLC；如Cho等人，1999)；(2)恒定变性剂毛细管电泳(CDCE)联合高保真PCR(如Li-Sucholeiki等人，1999)；(3)变性梯度凝胶电泳(如Fischer和Lerman，1983)；(4)矩阵辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS；如Ross等人，2000)；(5)实时荧光监控PCR测定法(如Tapp等人，2000)；(6)Acrydite^TM凝胶技术(如Kenney等人，1998)；(7)循环双脱氧指纹(CddF；如Langemeier等人，1994)；(8)单链构象多态性(SSCP)分析(如Vidal-Puig和Moller，1994)；和(9)小型测序引物延伸反应(如Syvanen，1999)。上文(1)的变体“基因组中靶向诱导局部损伤”(TILLING；McCallum等人，2000a；McCallum等人，2000b)技术也可用于在例如经化学诱变后显示有趣表型的植株个体中快速鉴定改变后的基因。

“杂交”指充分同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全发生于溶液中，即两种互补核酸都处于溶液中。依赖这种过程的分子生物学工具包括聚合酶链式反应(PCR以及以此为基础的所有方法)、扣除杂交、随机引物延伸、核酸酶S1作图、引物延伸、逆转录、cDNA合成、RNA差异显示、和DNA序列测定。杂交过程还可以发生于互补核酸之一固定在基质诸如磁珠、Sepharose即琼脂糖珠、或任何其它树脂上的情况。依赖这种过程的分子生物学工具包括poly(A+)mRNA的分离。杂交过程还可以发生于互补核酸之一固定在固相支持物诸如硝酸纤维素或尼龙膜上或者通过例如光刻法固定在例如硅质玻璃支持物上的情况(后者称为核酸阵列或微阵或者称为核酸芯片)。依赖这种过程的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、菌落杂交、噬斑杂交、原位杂交、和微阵杂交。为了能够进行杂交，通常通过热或化学方法使核酸分子变性，从而使双链熔解成两条单链和/或由单链核酸消除发夹或其它二级结构。杂交严谨度受到诸如温度、盐浓度、和杂交缓冲液组成等条件的影响。高严谨度的杂交条件包括高温和/或低盐浓度(盐包括NaCl和Na₃-柠檬酸)和/或在杂交缓冲液中包含甲酰胺和/或降低杂交缓冲液中诸如SDS(去污剂)等化合物的浓度和/或由杂交缓冲液中排除诸如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子拥挤)等化合物。例如Sambrook等人，1989描述了常规杂交条件，但是熟练技术人员将领会可以根据已知或预期同源性和/或核酸序列的长度设计许多不同的杂交条件。特异杂交指严谨条件下的杂交。足够低的严谨杂交条件对于分离上文定义的DNA序列的异源核酸是特别优选的。产生所述异源性的要素包括上文讨论的等位性、遗传密码简并性、和优选密码子使用率的差异。

因此，本发明的范围还涉及编码上文定义的本发明多肽及其同系物、衍生物、和/或免疫学片段的本发明DNA序列在任何杂交方法中的用途。本发明还涉及与所述本发明DNA序列发生杂交的DNA序列。

“特异扩增”在本文中指选择性且只扩增具有特定碱基对组成的核酸序列的扩增方法(如聚合酶链式反应)。

本发明定义的DNA序列可以由间插序列中断。“间插序列”指中断包含所述本发明DNA序列的编码序列或中断包含所述本发明DNA序列的DNA序列可表达形式的任何核酸序列。消除间插序列能够恢复所述编码序列或所述可表达形式。间插序列的范例包括内含子、可转移DNA序列诸如转座子、和DNA标签诸如T-DNA。“可转移DNA序列”指可以因重组事件而转移的任何DNA序列。

为了实现蛋白质在细胞、组织、或器官(优选植物起源)中的表达，可以将蛋白质直接导入所述细胞，诸如通过显微注射或弹果手段，或者可以可表达形式将编码所述蛋白质的分离核酸分子导入所述细胞、组织、或器官。

优选的是，本发明的DNA序列包含编码上文定义的本发明蛋白质或其同系物或衍生物或其免疫学活性片段的编码序列或开放读码框(ORF)。本发明的优选蛋白质包含SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、和21所示氨基酸序列。

“载体”或“载体序列”指可以通过转化导入生物体且可以在所述生物体中稳定维持的DNA序列。在例如大肠杆菌、根癌农杆菌、酿酒酵母、或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的培养物中维持载体是可能的。可以在细菌和/或病毒中维持和扩增其它载体诸如噬菌粒和粘粒载体。载体序列通常包含由限制酶识别的一套独特位点即多克隆位点(MCS)，其中可以插入一种或多种非载体序列。

“非载体序列”因此指整合到载体所含MCS的一个或多个位点中的DNA序列。

“表达载体”是一小群载体，其由于包含能够使插入的非载体序列成为可表达形式的适当调控序列，因而能够表达由所述非载体序列编码的蛋白质。本领域知道表达载体能够在生物体包括细菌(如大肠杆菌)、真菌(如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、昆虫细胞(如杆状病毒表达载体)、动物细胞(如COS或CHO细胞)、和植物细胞(如基于马铃薯病毒X的表达载体，参阅例如Vance等人，1998，WO9844097)中表达蛋白质。有关典型的植物表达载体也可参阅本说明书。

本发明清楚包括包含非载体DNA序列的任何载体或表达载体，所述非载体DNA序列包含依照本发明的核苷酸序列或编码上文定义的本发明的蛋白质或其同系物、衍生物、和/或免疫学活性片段。

作为在生物学系统中由表达载体介导的蛋白质生成的候选方案，可以应用蛋白质化学合成。可以液相或固相合成肽。然而，固相肽合成法(Merrifield，1963)是最常用的方法，它涉及连续添加氨基酸而形成线性肽链。

“可表达形式”或“在表达控制序列的控制之下”指分离核酸分子处于适合于转录成mRNA和/或翻译成蛋白质的形式，其或是组成性的或是在受到胞内或胞外信号(诸如环境刺激或压力(促分裂原、缺氧、低氧、温度、盐、光、脱水、等)或化学化合物诸如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或诸如抗生素(四环素、氨苄青霉素、利福平、卡那霉素)、激素(如赤霉素、生长素、细胞分裂素、糖皮质激素、油菜素类固醇、乙烯、脱落酸、等)、激素类似物(碘乙酸(IAA)、2，4-D、等)、金属(锌、铜、铁、等)、或地塞米松、等)的诱导之后发生转录和/或翻译。正如本领域技术人员将知道的，功能性蛋白质的表达可能还需要一种或多种翻译后修饰，诸如糖基化、磷酸化、去磷酸化、或一种或多种蛋白质-蛋白质相互作用、等。术语“可表达形式”的范围包括所有这些过程。

优选的是，通过在所述细胞、组织、或器官中导入并表达编码所述蛋白质的分离核酸分子(诸如cDNA分子、基因组基因、合成寡核苷酸分子、mRNA分子、或开放读码框)来实现所述蛋白质在特定细胞、组织、或器官(优选植物起源)中的表达，其中所述核酸分子可操作连接合适的调控序列，包括启动子(优选植物可表达启动子)和终止子序列。

“调控序列”指实现其所连接编码序列的表达所必需的控制DNA序列。这种控制序列的本质随宿主生物体而不同。在原核生物中，控制序列通常包含启动子、核糖体结合位点、和终止子。在真核生物中，控制细胞通常包含启动子、终止子、和增强子或沉默子。本发明的范围还包括本发明中定义的与任何调控序列融合的核苷酸序列。术语“控制序列”意欲在最低限度上包含表达所必需的所有成分，而且还可以包含额外的有利成分和决定何时、如何、和何处表达特定基因的成分。

“启动子”在本文中采用它的广义，包括由经典真核基因组基因衍生的转录调控序列，它包含精确转录起始所需要的TATA盒，连同或不含CCAAT盒序列和应答发育和/或外部刺激或以组织特异方式改变基因表达的额外调控元件(即上游激活序列、增强子、和沉默子)。

术语“启动子”还包括经典原核基因的转录调控序列，在这种情况中，它可以包含-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。

术语“启动子”还用于描述在细胞、组织、或器官中赋予、激活、或增强核酸分子表达的合成或融合分子或衍生物。

启动子可以包含一种或多种特定调控元件的额外拷贝，以进一步增强它可操作连接的核酸分子的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。可以将这种调控元件邻接异源启动子序列，以应答例如铜、糖皮质激素、地塞米松、四环素、赤霉素、cAMP、脱落酸、生长素、损伤、乙烯、茉莉酮酸酯、或唾液酸而驱动核酸分子的表达，或者将核酸分子的表达赋予特定细胞、组织、或器官诸如分生组织、叶、根、胚、花、种子、或果实。在本发明的内容中，启动子优选植物可表达启动子序列。然而，本发明也不排除在非植物细胞(诸如细菌、酵母细胞、昆虫细胞、和动物细胞)中也发挥功能或只在非植物细胞中发挥功能的启动子。“植物可表达的”指启动子序列(包括添加或包含的任何额外调控元件)至少能够在植物细胞、组织、或器官(优选单子叶或双子叶植物细胞、组织、或器官)中诱导、赋予、激活、或增强表达。

术语“植物可操作的”或“在植物中可操作的”在本文中用于启动子序列时应当理解为与植物可表达启动子序列等同。

在本文中，“受控启动子”或“可调控启动子序列”指任选在特定条件下，能够在植物的特定细胞、组织、或器官或一组细胞、组织、或器官中赋予结构基因的表达，然而并不是在所有条件下在整个植株中通常都赋予表达的启动子。因此，可调控启动子序列可以是在一套特定条件下(诸如在通过化学化合物或其它引发剂诱导基因表达后)在植株内特定部位或者在整个植株中赋予其可操作连接的基因以表达的启动子序列。优选的是，用于进行本发明的可调控启动子在植株内特定部位赋予表达(或是组成性的或是在诱导后)，但不是在任何环境中在整个植株中都赋予表达。这种启动子的范围包括细胞特异启动子序列、组织特异启动子序列、器官特异启动子序列、细胞周期特异基因启动子序列、可诱导启动子序列、和经修饰后在特定植物部分中在任一时间赋予表达的组成性启动子序列，诸如通过可转座遗传因子(Ac、Ds、Spm、En、或其它转座子)内所述组成性启动子的整合。本领域熟练技术人员将知道，“可诱导启动子”指其转录活性应答发育、化学、环境、或物理刺激而得到提高或诱导的启动子。本发明的范围包括与压力可诱导启动子融合的、权利要求书中定义的核苷酸序列。相似的，熟练技术人员将理解，“组成性启动子”指在生物体(优选植物)的大多数但不必所有部分中、在大多数但不必所有生长和发育阶段有转录活性的启动子。相反，术语“遍在启动子”指在生物体(优选植物)的大多数但不必所有部分中有转录活性的启动子。

本领域熟练技术人员将能够容易的由可公开获得或可容易获得的来源选择适当的启动子序列用于调控上文所述本发明蛋白质的适当表达，而无需过度的实验。

将核酸分子置于启动子序列的调控控制之下或可操作连接启动子序列指将放置所述核酸分子使得表达受到启动子序列的控制。启动子通常但不必位于其所调控核酸分子的上游或位于5’端、且距离转录起始位点2kb以内。在构建异源启动子/结构基因组合时，通常优选启动子与基因转录位点的距离与启动子同它在天然环境下控制的基因(即衍生该启动子的基因)的距离大致相同。

“表达”指在细胞自身或无细胞系统中生成蛋白质或核苷酸序列。它包括由编码所述产物的DNA转录成RNA产物、转录后修饰、和/或翻译成蛋白质产物或多肽，以及可能的翻译后修饰。

“可操作连接”指并列，其中所述成分的相互关系使它们能够以预定方式发挥功能。与编码序列“可操作连接”的控制序列的连接方式能够在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。在控制序列是启动子的情况中，熟练技术人员清楚优选使用双链核酸。

术语“终止子”指位于转录单位末端、发出转录终止信号的DNA序列。终止子是包含有助于向初级转录本3’端添加聚腺苷酸序列的聚腺苷酸化信号的3’非翻译DNA序列。本领域知道且描述了在衍生自病毒、酵母、霉菌、细菌、昆虫、鸟、哺乳动物、和植物衍生的细胞中有活性的终止子。可以由细菌、真菌、病毒、动物、和/或植物分离这些终止子。

特别适用于本发明基因构建物的终止子的范例包括根癌农杆菌胭脂碱合酶(NOS)基因终止子、根癌农杆菌章鱼碱合酶(OCS)基因终止子序列、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因终止子序列、稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子序列(t3’Bt2)、玉蜀黍玉米醇溶蛋白基因终止子序列、rbcs-1A基因终止子、和rbcs-3A基因终止子序列、等。

本领域熟练技术人员将知道可能适用于进行本发明的合适启动子序列和终止子序列。可以容易的使用这些序列而无需任何过多实验。

改变基因表达可以是下调表达。本发明的内容关注参与信使RNA前体加工过程的一些蛋白质的表达下调。当所述蛋白质是信使RNA加工的负调控剂时，这能够导致例如对信使RNA加工和压力耐受性的有益影响。“表达下调”在用于本文时指降低基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的水平。可以通过例如以相对于启动子序列的有义取向(若导致共遏制)或反义取向添加编码序列或其部分，而且可通过例如插入诱变(如T-DNA插入或转座子插入)或通过基因沉默策略(Angell和Baulcombe，1988，WO9836083；Lowe等人，1989，WO9853083；Lederer等人，1999，WO9915682；或Wang等人，1999，WO9953050)来实现表达下降。以沉默基因表达为目标的遗传构建物可以相对于启动子序列的有义和/或反义取向包含所述基因(或其一个或多个部分)的核苷酸序列。用于下调基因表达的另一种方法包括使用核酶(Atikins等人，1999，WO9400012；Lenee等人，1995，WO9503404；Lutziger等人，2000，WO0000619；Prinsen等人，1997，WO9713865；和Scott等人，1997，WO9738116)。

可以通过将细胞、组织、器官、或生物体施用或暴露于所述基因产物或其同系物、类似物、衍生物、和/或免疫学活性片段来实现调控(包括降低)活性基因产物或基因产物活性的水平。免疫调控是能够下调活性基因产物和/或基因产物活性水平的技术的另一个范例，包括在其中所述基因产物和/或基因产物活性水平有待调控的细胞、组织、器官、或生物体中施用、暴露、或表达针对所述基因产物的抗体。这些抗体包括“plantibodies”、单链抗体、IgG抗体、和重链camel antibodies及其片段。本发明的范围还包括识别本发明蛋白质且可用于所述免疫调控的抗体。

还可以通过将细胞、组织、器官、或生物体施用或暴露于所述基因产物或其活性的抑制剂或激活剂来实现调控(包括降低)活性基因产物或基因产物活性的水平。这种抑制剂或激活剂包括依照本发明鉴定的蛋白质(包括例如蛋白酶和激酶)和化学化合物。

“细胞命运和/或植物发育和/或植物形态和/或生化和/或生理”指植物的一项或多项发育和/或形态和/或生化和/或生理特征因属于本文所述发明的一个或多个步骤的执行而受到改变。

“细胞命运”指在植物发育或其细胞过程中，特别是在细胞周期过程中或作为细胞周期过程的后果而生成的特定细胞的细胞类型或细胞特征。

“植物发育”或术语“植物发育特征”或相似术语在用于本文时应当理解为指植物中参与确定植物细胞(特别是祖细胞将发育而成的特定组织或器官类型)的发育命运的任何细胞过程。与植物发育有关的细胞过程对于本领域熟练技术人员而言是知道的。这些过程包括例如形态发生、光形态发生、苗发育、根发育、营养发育、生殖发育、茎干延长、开花，及参与确定细胞命运的调控机制，特别是参与细胞周期的过程或调控过程。

“植物形态”或术语“植物形态特征”或相似术语在用于本文时将由本领域熟练技术人员理解为指植物的外观，包括任何一项或多项结构特征或其组合。这种结构特征包括植物的任何细胞、组织、或器官、或成组细胞、组织、或器官(包括根、茎干、叶、苗、叶柄、毛状体、花、花瓣、柱头、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、种子、胚、胚乳、种皮、糊粉、纤维、果实、形成层、木材、心材、薄壁组织、通气组织、筛分子、韧皮和维管组织、等)的形状、大小、数目、位置、颜色、质地、排列、和图案。

“植物生化”或术语“植物生化特征”或相似术语在用于本文时将由本领域熟练技术人员理解为指植物的代谢和催化过程，包括初级和次级代谢及其产物，包括由植物生成的任何小分子、大分子、或化学化合物，诸如但不限于淀粉、糖、蛋白质、肽、酶、激素、生长因子、核酸分子、纤维素、半纤维素、胼胝质、凝集素、纤维、色素(诸如花青素)、维生素、矿质、微量营养物、或大量营养物。

“植物生理学”或术语“植物生理学特征”或相似术语在用于本文时将理解为指植物的功能性过程，包括发育过程(诸如生长、扩大、和分化)、性发育、有性生殖、结子、种子发育、灌浆、无性生殖、细胞分裂、休眠、发芽、光适应、光合作用、叶片扩大、纤维生成、次级生长、或木材生成、等；植物对外部应用因子(诸如金属、化学药品、激素、生长因子、环境、和环境压力因素(如缺氧、低氧、高温、低温、脱水、光、白昼长度、水淹、盐、重金属、等))的应答，包括植物对所述外部应用因子的适应性应答。术语“环境压力”在本领域已经以不同方式进行了定义，而且与术语“渗透压”大大交叠。例如Holmberg和Bülow，1998，Trends Plant Sci.，3：61-66定义了导致非生物压力的不同环境压力因素。术语渗透压在用于本文时指由盐度、干旱、热、寒冷、和冻结等条件诱导的压力处境。术语“环境压力”在用于本发明时指由非存活或非生物环境压力生成的、作用于细胞、组织、种子、器官、或完整植株的代谢、生长、或生存力的任何不利影响。更具体的说，它还涵盖诸如水压力(水淹、水浸、干旱、脱水)、缺氧(低水平的氧、CO₂、等)、氧压力、渗透压、盐压力、温度压力(热、冷、冻结、霜冻)、营养物贫乏、污染物压力(重金属、有毒化学药品)、臭氧、高光(high light)、病原体(包括病毒、细菌、真菌、昆虫、和线虫)等环境因素及其组合。

术语“缺氧压力”指足以生成上文定义的压力的任何氧水平下降，包括低氧和缺氧。

术语“水淹压力”指与将植物、植物部分、组织、或分离细胞长时间或短时间的淹没在液体培养基中(诸如季风、多雨季节、山洪暴发、或过度灌溉等期间)有关或由其诱导的任何压力。

“寒冷压力”和“热压力”分别指由低于或高于特定植物物种的最佳生长温度范围的温度诱导的压力。本领域熟练技术人员能够容易的测定或知道这种最佳生长温度范围。

“脱水压力”指与细胞、组织、器官、或完整植株失水、膨胀度降低、或水含量降低有关或由其诱导的任何压力。

“干旱压力”指由细胞、组织、器官、或生物体缺水或水供应降低诱导或与其有关的任何压力。

“氧化压力”指升高反应性氧种类的胞内水平的任何压力。

术语“由盐度诱导的压力”、“盐压力”、或“盐离子毒性”或无机盐毒性或相似术语指与盐浓度升高有关或由其诱导且导致细胞胞内或胞外环境的渗透势微扰的任何压力。在诱导所述盐压力的无机盐中知道的最清楚的范例就是Na⁺和Li⁺。

依照本发明的方法将多核苷酸和/或调控序列导入所述植物后获得的转基因植物获得了针对相应野生型植株易感的环境压力的抗性、耐受性、或增强的耐受性或抗性。

术语“耐受性”和“抗性”覆盖自迟滞至完全抑制由上文定义的环境压力条件引起的细胞代谢改变、细胞生长降低、和/或细胞死亡的保护范围。优选的是，依照本发明的方法获得的转基因植物耐受性或抵抗环境压力条件，即所述植物能够在相应野生型植株显示生长、代谢、生存力、生产力降低、和/或雄性或雌性不育的环境条件下充分的正常生长。在用于本文时，“压力耐受性”指在压力下生长和生成生物量的能力、在压力后再次起始生长和生成生物量的能力、和在压力下存活的能力。术语“压力耐受性”还覆盖植物在压力下完成与在非压力条件下相似的发育程序的能力，如与在非压力条件下相似，在压力下由休眠转向发芽和由营养转向生殖阶段。用于测定植物生长或压力应答的方法学包括但不限于高度测量、叶片面积、植物水关系、开花能力、生成后代的能力、和产量，或本领域熟练技术人员知道的任何其它方法学。

“生长”指植物或其部分生长并增加生物量的能力，而“产量”指植物或其部分(特别是那些有商业价值的部分)的可收获生物量。“在压力和非压力条件下的生长和/或产量”指田间生长的植物几乎总是将经历一些形式的压力(尽管轻微)的事实。因此，优选不区分非压力与轻微压力条件。由于预计本发明对生长和产量的某些有利影响在严重和轻微压力条件下均会发生，因此将它们描述成在压力和非压力条件下增加生长和/或产量。

用于将重组DNA导入植物组织或细胞的手段包括但不限于使用CaCl₂的转化及其变化形式，特别是先前所述方法(Hanahan，1983)、直接将DNA摄取到原生质体中(Krens等人，1982；Paszkowski等人，1984)、由PEG介导的摄取到原生质体中(Armstrong等人，1990)、微粒轰击、电穿孔(Fromm等人，1985)、DNA显微注射(Crossway等人，1986；Fromm等人，1985)、组织外植体或细胞的微粒轰击(Christou等人，1988)、用核酸真空渗透组织、或(在植物的情况中)由T-DNA介导的由农杆菌转移至植物组织(An等人，1985；Herrera-Estrella等人，1983a；Herrera-Estrella等人，1983b)。用于转化单子叶植物的方法在本领域是众所周知的，包括由农杆菌介导的转化(Cheng等人，1997，WO9748814；Hansen，1998，WO9854961；Hiei等人，1994，WO9400977；Hiei等人，1998，WO9817813；Rikiishi等人，1999，WO9904618；Saito等人，1995，WO9506722)、微粒轰击(Adams等人，1999，US5969213；Bowen等人，1998，US5736369；Chang等人，1994，WO9413822；Lundquist等人，1999，US5874265/US5990390；Vasil和Vasil，1995，US5405765；Walker等人，1999，US5955362)、DNA摄取(Eyal等人，1993，WO9318168)、农杆菌细胞的显微注射(von Holt，1994，DE4309203)、和超声处理(Finer等人，1997，US5693512)。

依照本领域众所周知的流程，可以由经转化或转染的细胞再生完整植株。可以用本发明的基因构建物转化能够随后通过器官发生或胚胎发生而克隆繁殖的植物组织，并由此再生完整植株。选择的特定组织将随可用于或最适用于待转化的特定物种的克隆繁殖系统而变化。例示性组织靶包括叶片、花粉、胚、子叶下、胚轴、雌配子体、愈伤组织、已有分生组织(如顶端分生组织、腋芽和根部分生组织)以及诱导的分生组织(如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。

优选的是，通过本领域公认的任何手段，诸如微粒轰击、显微注射、由农杆菌介导的转化(包括“浸花”转化法；Bechtold和Pelletier，1998；Trieu等人，2000)、原生质体融合、或电穿孔等，用负责生成蛋白质的遗传序列转染或转化依照本发明方法生成的植物。最优选的是，所述植物是通过由农杆菌介导的转化生成的。

“二元转化载体”指包含下列各项的T-DNA转化载体：包含在待转化的真核细胞中有活性的至少一种目的基因和/或至少一种选择标记的T-DNA区；和包含在大肠杆菌和农杆菌中有活性的至少一种复制起点和用于在大肠杆菌和农杆菌中进行选择的标记基因的载体主链区。或者，二元转化载体在农杆菌中的复制依赖分开的辅助质粒的存在。二元载体pGreen和辅助质粒pSoup构成诸如Hellens等人，2000中所述或因特网站点http://www.pgreen.ac.uk上可获得的系统的范例。

二元转化载体的T-DNA边界可以衍生自章鱼碱型或胭脂碱型Ti质粒或二者兼之。二元载体的T-DNA只有在联合辅助质粒时才转移到真核细胞中。本领域还知道用于有效植物共转化的多种二元载体农杆菌菌株(Bidney和Scelonge，2000，WO0018939)。

“宿主”或“宿主细胞”或“宿主生物体”在本文中指能够作为本发明序列的受体的任何原核或真核细胞或生物体。术语“宿主”在用于本文时包括可以进行遗传工程改造的原核或真核生物体。这种宿主的范例参阅Maniatis等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual即分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1982。“植物细胞”包括衍生自任何植物且在培养过程以单细胞、细胞组、或愈伤组织存在的任何细胞。植物细胞还可以是培养中或天然生长中的发育中或成熟植物的任何细胞。

“植物”包括属于绿色植物(Viridiplantae)超家族的任何植物物种。本发明可应用于任何植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括选自下组的饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木、或灌木：Acacis spp.(金合欢)、Acerspp.(槭)、Actinidia spp.(猕猴桃)、Aesculus spp.(七叶树)、Agathisaustralis(新西兰贝壳杉)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、Andropogonspp.(须芒草)、Arachis spp.(落花生)、Areca catechu(槟榔)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、Baikiaeaplurijuga、Betulaspp.(桦木)、Brassica spp.(芸苔)、Bruguieragymnorrhiza(木榄)、Burkeaafricana、Buteafrondosa(紫铆)、Cadaba farinose、Calliandra spp.(牛缨花)、Camellia sinensis(茶)、Canna indica(美人蕉)、Capsicum spp.(辣椒)、Cassia spp.(决明)、Centrosemapubescens(距瓣豆)、Chaenomeles spp.(木瓜)、Cinnamomumcassia(肉桂)、Coffea arabica(小果咖啡)、Colophospermummopane、Coronilliavaria、Cotoneasterserotina、Crataegusspp.(山楂)、Cucumis spp.(甜瓜)、Cupressus spp.(柏木)、Cyathea dealbata、Cydonia oblonga(榅桲)、Cryptomeria japonica(日本柳杉)、Cymbopogon spp.(香茅)、Cyntheadealbata、Cydoniaoblonga、Dalbergiamonetaria、Davallia divaricata、Desmodium spp.(山蚂蟥)、Dicksoniasquarosa、Diheteropogon amplectens、Diocleaspp.、Dolichosspp.(扁豆)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis(稗)、Ehrartia spp.(厚壳树)、Eleusine coracana(子)、Eragrestis_spp.(画眉草)、Erythrina spp.(刺桐)、Eucalyptus spp.(桉)、Euclea schimperi、Eulalia villosa(金茅)、Fagopyrum spp.(荞麦)、Feijoa sellowiana(南美稔)、Fragaria spp.(草莓)、Flemingia spp.(千斤拔)、Freycinetia banksii(藤露兜树)、Geranium thunbergii(老鹳草)、Ginkgo biloba(银杏)、Glycine javanica、Gliricidiaspp.(墨西哥丁香)、Gossypium hirsutum(陆地棉)、Grevilleaspp.(银桦)、Guibourtia coleosperma、Hedysarum spp.(岩黄蓍)、Hemarthria altissima(牛鞭草)、Heteropogon contortus(黄茅)、Hordeum vulgare(大麦)、Hyparrhenia rufa、Hypericum erectum(小连翘)、Hyperthelia dissolute、Indigoincarnata(庭藤)、Iri sspp.(鸢尾)、Leptarrhenapyrolifolia、Lespedezas pp.(胡枝子)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala(银合欢)、Loudetia simplex、Lotonusbainesii、Lotus spp.(百脉根)、Macrotyloma axillare、Malusspp.(苹果)、Manihot esculenta(木薯)、Medicago sativa(紫苜蓿)、Metasequoia glyptostroboides(水杉)、Musasapientum(大蕉)、Nicotianum spp.(烟草)、Onobrychis spp.(驴豆)、Ornithopus spp.、Oryza spp.(稻)、Peltophorumafricanum、Pennisetum spp.(狼尾草)、Persea gratissima(鳄梨)、Petuniaspp.(碧冬茄)、Phaseolus spp.(菜豆)、Phoenix canariensis、Phormium cookianum、Photinia spp.(石楠)、Picea glauca(白云杉)、Pinus spp.(松)、Pisumsativum(豌豆)、Podocarpus totara(新西兰罗汉松)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、Populus spp.(杨)、Prosopis cineraria(牧豆树)、Pseudotsuga menziesii(花旗松)、Pterolobium stellatum、Pyrus communis(西洋梨)、Quercus spp.(栎)、Rhaphiolepsis umbellate(厚叶石斑木)、Rhopalostyl issapida、Rhus natalens is、Ribesgrossularia、Ribes spp.(茶藨子)、Robinia pseudoacacia(洋槐)、Rosa spp.(蔷薇)、Rubus spp.(悬钩子)、Salix spp.(柳)、Schyzachyrium sanguineum、Sciadopitys verticillata(金松)、Sequoia sempervirens(北美红杉)、Sequoiadendrongiganteum(巨杉)、Sorghum bicolor、Spinacia spp.(菠菜)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、Tadehagi spp.(葫芦茶)、Taxodiumdistichum(落羽松)、Themeda triandra(黄背草)、Trifoliumspp.(车轴草)、Triticum spp.(小麦)、Tsuga heterophylla(异叶铁杉)、Vacciniums pp.(乌饭树)、Vicia spp.(蚕豆)、Vitis vinifera(葡萄)、Watsonia pyramidata、Zantedeschia aethiopica(马蹄莲)、Zea mays(玉蜀黍)、苋菜、朝鲜蓟、芦笋、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、canola、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、亚麻、散叶甘蓝、小扁豆、油籽、油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、和茶等，或上文具体提及的任何植物的种子，或任何上述物种的组织、细胞、或器官培养物。本发明可应用于任何植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括选自下组的饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木、或灌木：Acacis spp.(金合欢)、Acer spp.(槭)、Actinidia spp.(猕猴桃)、Aesculusspp.(七叶树)、Agathis australis(新西兰贝壳杉)、Albiziaamara、Alsophi latricolor、Andropogon spp.(须芒草)、Arachis spp.(落花生)、Areca catechu(槟榔)、Asteliafragrans、Astragaluscicer、Baikiaea plurijuga、Betula spp.(桦木)、Brassica spp.(芸苔)、Brugui era gymnorrhiza(木榄)、Burkea africana、Butea frondosa(紫铆)、Cadabafarinose、Calliandra spp.(牛缨花)、Camellia sinensis(茶)、Canna indica(美人蕉)、Capsicum spp.(辣椒)、Cassia spp.(决明)、Centrosema pubescens(距瓣豆)、Chaenomeles spp.(木瓜)、Cinnamomum cassia(肉桂)、Coffeaarabica(小果咖啡)、Colophospermum mopane、Coronilliavaria、Cotoneaster serotina、Crataegus spp.(山楂)、Cucumis spp.(甜瓜)、Cupressus spp.(柏木)、Cyatheadealbata、Cydonia oblonga(榅桲)、Cryptomeria japonica(日本柳杉)、Cymbopogon spp.(香茅)、Cynthea dealbata、Cydoniaoblonga、Dalbergia monetaria、Davalliadivaricata、Desmodium spp.(山蚂蟥)、Dicksonia squarosa、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp.、Dolichos spp.(扁豆)、Dorycniumrectum、Echinochloa pyramidalis(稗)、Ehrartiaspp.(厚壳树)、Eleusine coracana(子)、Eragrestisspp.(画眉草)、Erythrina spp.(刺桐)、Eucalyptu sspp.(桉)、Eucleas chimperi、Eulalia villosa(金茅)、Fagopyrum spp.(荞麦)、Feijoa sellowiana(南美稔)、Fragariaspp.(草莓)、Flemi ngia spp.(千斤拔)、Freycinetia banksii(藤露兜树)、Geranium thunbergii(老鹳草)、Ginkgo biloba(银杏)、Glycine javanica、Gliricidiaspp.(墨西哥丁香)、Gossypium hirsutum(陆地棉)、Grevilleaspp.(银桦)、Guibourtia coleosperma、Hedysarum spp.(岩黄蓍)、Hemarthria altissima(牛鞭草)、Heteropogon contortus(黄茅)、Hordeum vulgare(大麦)、Hyparrhenia rufa、Hypericum erectum(小连翘)、Hyperthelia dissolute、Indigoincarnata(庭藤)、Iris spp.(鸢尾)、Leptarrhenapyrolifolia、Lespedeza spp.(胡枝子)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala(银合欢)、Loudetia simplex、Lotonusbainesii、Lotus spp.(百脉根)、Macrotyloma axillare、Malusspp.(苹果)、Manihot esculenta(木薯)、Medicago sativa(紫苜蓿)、Metasequoia glyptostroboides(水杉)、Musasapientum(大蕉)、Nicotianum spp.(烟草)、Onobrychis spp.(驴豆)、Ornithopus spp.、Oryza spp.(稻)、Peltophorumafricanum、Pennisetum spp.(狼尾草)、Persea gratissima(鳄梨)、Petunia spp.(碧冬茄)、Phaseolus spp.(菜豆)、Phoenix canariensis、Phormium cookianum、Photinia spp.(石楠)、Picea glauca(白云杉)、Pinus spp.(松)、Pisumsativum(豌豆)、Podocarpus totara(新西兰罗汉松)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、Populus spp.(杨)、Prosopis cineraria(牧豆树)、Pseudotsuga menziesii(花旗松)、Pterolobium stellatum、Pyrus communis(西洋梨)、Quercus spp.(栎)、Rhaphiolepsis umbellate(厚叶石斑木)、Rhopalostylis sapida、Rhus natalensis、Ribesgrossularia、Ribess pp.(茶藨子)、Robinia pseudoacacia(洋槐)、Rosa spp.(蔷薇)、Rubus spp.(悬钩子)、Salixspp.(柳)、Schyzachyrium sanguineum、Sciadopitysverticillata(金松)、Sequoia sempervirens(北美红杉)、Sequoiadendron giganteum(巨杉)、Sorghum bicolor、Spinacia spp.(菠菜)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、Styl osanthos humilis、Tadehagi spp.(葫芦茶)、Taxodium distichum(落羽松)、Themeda triandra(黄背草)、Trifolium spp.(车轴草)、Triticum spp.(小麦)、Tsuga heterophylla(异叶铁杉)、Vaccinium spp.(乌饭树)、Vicia spp.(蚕豆)、Vitis vinifera(葡萄)、Watsoniapyramidata、Zantedeschia aethiopica(马蹄莲)、Zea mays(玉蜀黍)、苋菜、朝鲜蓟、芦笋、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、canola、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、亚麻、散叶甘蓝、小扁豆、油籽、油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、和茶等，或上文具体提及的任何植物的种子，或任何上述物种的组织、细胞、或器官培养物。

“谷类”包括具有可食用谷粒的作物，例如属于禾本科、为了获得其营养谷粒而栽培的植物，诸如燕麦、大麦、黑麦、小麦、稻、和玉米等。

本发明的范围还包括双杂交系统的应用，其中将本发明的任何序列用于研究与其它因素诸如蛋白质的相互作用。“酵母双杂交实验”指以如下观察结果为基础的实验：许多真核转录因子包含两种结构域，即DNA结合结构域(DB)和激活结构域(AB)，当它们在物理上分开时(即破坏共价连接)，它们不实行靶基因的表达。对于能够相互作用的两种蛋白质而言，将一种所述蛋白质融合DB，将另一种所述蛋白质融合AD，则它们能够重新联合转录因子的DB和AD结构域，从而导致靶基因的表达。酵母双杂交实验中的靶基因通常是报告基因，诸如β-半乳糖苷酶基因。因而可以通过测量报告基因产物的活性来量化酵母双杂交实验中蛋白质配偶体之间的相互作用(Bartel和Fields，1997)。或者，可以使用哺乳动物双杂交系统，包括例如编码报告基因的嵌合绿色荧光蛋白(Shioda等人，2000)。还有一种候选方案是使用例如HIS作为报告基因的细菌双杂交系统(Joung等人，2000)。本领域熟练技术人员还将认识到，在双杂交系统的适合形式及其它技术(如凝胶阻滞、免疫沉淀、竞争抑制)中，有可能研究蛋白质-寡核苷酸相互作用，因而使用本发明任何序列的这些技术也属于本发明的范围之内。

术语“序列片段”或“部分序列”指所指原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)的长度可以广泛变化；最小长度是足以提供具有所指原始序列的至少一种可比功能和/或活性的序列，而最大长度并不重要。在有些应用中，最大长度通常并不显著大于提供原始序列期望活性和/或功能所需要的长度。通常，截短氨基酸或核苷酸序列的长度范围将是大约5-大约60个氨基酸。然而，更通常的是，序列的最大长度将是大约50个氨基酸，优选大约60个氨基酸。通常期望选择至少大约10、12、或15个氨基酸或核苷酸的序列，最大值可达大约20或25个氨基酸或核苷酸。

本发明还包括用于高通量化合物筛选的方法。本领域熟练技术人员能够容易的设计使用一种或几种本发明元件的这种方法。

仍然有待获得或鉴定的化合物可以是能够结合参与前体信使RNA加工过程因而可用于本发明方法的任何核酸、肽、或蛋白质的化合物。例如样品(如来自植物、动物、或微生物的细胞提取物)中可能包含所述化合物或其组合。此外，所述化合物在本领域可能是已知的但迄今不知道能够遏制或激活参与前体信使RNA加工的蛋白质。

本发明的范围还包括向植物细胞中导入一种或多种重组核酸分子，诸如在所述植物细胞中以有效量表达后所编码蛋白质能提高或诱导依照本发明的或权利要求书中定义的内源多核苷酸表达或者诱导权利要求的多肽的活性的DNA分子。

通过参考下文非限制性图和实施例进一步描述了本发明。

图的简述

图1

表达拟南芥cDNA分离克隆U1A、Ct-SRL1、或RCY1的酵母菌株的耐盐表型，通过“悬滴测试(drop test)”测定；其中在不含盐或含指定LiCl或NaCl浓度的平板上测试不同菌株和包含空表达载体的对照菌株的饱和培养物的系列稀释物。

图2

由克隆RYC1(A：SEQ ID NO.4)和Ct-SRL1(B：SEQ ID NO.3)的核苷酸序列衍生的氨基酸序列。定义RS结构域的二肽Arg-Ser、Arg-Glu、和Arg-Asp以粗体字母书写。(A)中标有下划线的M指示在酵母中表达RCY1的RS结构域(SEQ ID NO.21)时用作起始子的甲硫氨酸残基。

图3

表达RCY1的氨基末端(细胞周期蛋白)结构域、羧基末端RS结构域、或全长蛋白质的酵母菌株的耐盐表型。如图1的实验进行悬滴测试。

图4

转基因拟南芥植株的耐盐表型。将来自经CaMV 35S启动子控制下的Ct-RSL1 cDNA转化的3个独立转基因系(L1、L3、和L5，作为获得的12个系的范例)的T2种子在不含(A)或含有(B)20mM LiCl的琼脂平板上发芽。将来自野生型植株(Wt)的种子用作对照。所有转基因系都显示相似表型。

图5

本发明的基因和蛋白质的序列。

实施例

实施例1：植物材料

将红甜菜(甜菜变种DITA，本文也称为“甜菜”)种子播种在装有沙子和蛭石混合物(1:1w/w)的陶罐中。在温室条件(20℃ 8小时和25℃ 16小时，补充光照以刺激最少12小时的光周期)下栽培植物。用含2.4g/L Ca(NO₃)₂·4H₂O、1g/L KNO₃、1g/L MgSO₄·7H₂O、0.3g/L KH₂PO₄、5.6mg/L Fe-quelate(Kelantren，Bayer)、1.1mg/L ZnSO₄·7H₂O、3.3mg/L MnO₄·H₂O、0.3mg/L CuSO₄·5H₂O、3.8mg/L H₃BO₃、0.18mg/L(NH₄)₆Mo₇·4H₂O的营养液进行定期灌溉。为了构建cDNA文库，在收获前用200mM NaCl灌溉3周龄的植株达24小时。

实施例2：酵母菌株和培养条件

用拟南芥cDNA文库转化酿酒酵母感受态细胞W303-1A(MATaura3，leu2，his3，trp1，ade2，ena 1-4::HIS3)。

将由J.M.Mulet(Universidad Polit écnica de Valencia，Instituto de Biologia MolecularyCellular de Plantas)提供的酿酒酵母菌株JM26(MAta leu 2-3，112 ura 3-1 trp 1-1，ade2-1 his 3-11，15 can 1-100，ena 1-4::HIS3，nha1::TRP1)用于筛选红甜菜cDNA文库。菌株JM26是W303.1A(Wallis等人，1989，Cell，58：409-419)的衍生物，它具有基因ENA1-4和NHA1的无效突变，二者分别编码在酵母中负责排出大部分钠的Na⁺泵APT酶和Na⁺/H⁺反向转运蛋白(Garciadeblas等人，1993，Mol.Gen.Genet.，236：363-368；Ba uelos等人，1998，Microb iology，144：2749-2758)。

在基本合成葡萄糖培养基(SD)或丰富培养基(YPD)中培养酵母细胞。SD培养基含有2％葡萄糖、0.7％不含氨基酸的酵母氮碱、和50mM琥珀酸，用Tris调至pH5，依照指示添加需要的氨基酸[100μg/ml亮氨酸、30μg/ml腺嘌呤、100μg/ml甲硫氨酸]。YPD培养基含有1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、和2％葡萄糖。依照图和实施例所示向培养基中添加NaCl和LiCl。固体培养基含有2％细菌学级琼脂。

实施例3：cDNA文库的构建

Minet等人，1992，Plant J.，2(3)：417-422描述了在载体pFL61中构建拟南芥cDNA文库。

为了构建经过盐压力诱导的甜菜cDNA文库，使用实施例1中描述的植物材料。使用由经盐处理的甜菜植株的叶片制备的poly(A)⁺RNA合成定向cDNA(cDNA合成试剂盒，Stratagene)。将cDNA连接到噬菌体λPG15载体中，并进行包装(Gigapack II gold包装提取物，Stratagene)。该噬菌体插入了可切除的表达质粒pYPGE15(以URA3作为选择标记)，后者可直接用于大肠杆菌和酵母互补(Brunelli和Pall，1993，Yeast，9：1309-1318)。通过cre-lox重组酶系统(Brunelli和Pall，1993，Yeast，9：1309-1318)由λPG15回收质粒cDNA文库。

实施例4：赋予酵母以盐耐受性的cDNA克隆的筛选和分离

为了筛选在酵母中增加盐耐受性的拟南芥cDNA，通过LiCl法(Gietz等人，1992，Nucleic Acids Res.，20：1425)将在pFL61中构建的cDNA文库用于转化酵母菌株W303-1A。在基本培养基添加25mM和50mM LiCl、或如图所示、且含有400μM甲硫氨酸的平板中对转化体筛选盐耐受性。对抗性克隆进行由氟乳清酸诱导的质粒丧失(Boeke等人，1984，Mol.Gen.Genet.，197：354-346)，从而只选择那些显示依赖质粒的LiCl耐受性的克隆。结果在野生型菌株和液泡运输缺陷的双重突变体ena1-4::HIS3 tfp1::LEU2中得到了确认。

为了筛选在酵母中增加盐耐受性的甜菜cDNA，将在pYPGE15中构建的cDNA文库用于转化酵母突变株JM26。合并在含有亮氨酸和腺嘌呤的SD平板上通过尿嘧啶原养型选择的转化体，并以2 x 10⁵细胞/板(12 x 12cm)的密度再次涂布在筛选培养基(含有亮氨酸、腺嘌呤、和甲硫氨酸且添加0.15M NaCl的SD)上。向选择培养基中添加甲硫氨酸以避免选择早已在拟南芥中发现的HAL2样同系物(Quintero等人，1996，Plant Cell，8：59-537；Gel-Mascarell等人，1999，Plant J.，17(4)：373-383)。或者，为了选择Li⁺抗性酵母细胞，将转化体再次涂布在筛选培养基(含有亮氨酸和腺嘌呤且添加20mM LiCl的SD)上。在相同的NaCl或LiCl培养基上再次筛选推定的阳性克隆。

实施例5：胞内锂含量的测定

将表达本发明cDNA克隆的酵母细胞或用空载体转化的对照菌株培养至指数期，然后向培养基中添加LiCl至终浓度30mM。在不同时间采集10ml样品，并如先前所述(Murgùia等人，1996，J.Biol.Chem.，271：29029-29033)测定胞内锂含量。

实施例6：β-半乳糖苷酶测定

用酵母表达载体中的Ct-SRL1 cDNA转化包含半乳糖诱导性启动子控制下的大肠杆菌LacZ基因(被或未被内含子中断)(Legrain和Rosbash，1989，Cell，75：573-583)的酵母细胞，或者用空质粒进行转化作为对照。将培养物在含有或不含35mM LiCl的葡萄糖基本培养基中培养至指数期，然后换成半乳糖培养基并维持在相同盐条件，以诱导β-半乳糖苷酶表达。在诱导后0(背景值)和4小时采集样品，并如先前所述(Serrano等人，1973，Eur.J.Biochem.，34：479-482)在渗透后细胞中测量β-半乳糖苷酶活性。

实施例7：RT-PCR测定

将过度表达Ct-SRL1cDNA或用空载体转化的酵母细胞培养至指数期，然后向培养基中添加LiCl至终浓度150mM，并在不同时间纯化总RNA。用不含RNA酶的DNA酶1消化等量的总RNA，并使用M-MuLV RT酶(Roche Molecular Biochemicals)和与3’剪接位点下游277个核苷酸的第二个SAR1外显子发生杂交的引物preSAR1rp(5’-CATCAAATCTTTCAGGG-3’，SEQ ID NO.23)进行逆转录。随后使用Netzyme(Molecular Netline Bioproducts)DNA聚合酶和与SAR1内含子3’端发生杂交的引物preSAR1fp(5’-CTTTATTTTACTGTACAG-3’，SEQ ID NO.24)进行15个循环的PCR扩增。第5个循环后加入[α-³²P]dCTP(740kBq，110TBq/mmol，Amersham)，并在6％PA-尿素凝胶中分离产物，进行放射自显影。使用FUJI(Fujifilm BAS-1500)磷光成像仪测定扩增条带的相对强度。将缺乏逆转录酶的样品用作对照。

实施例8：植物转化

将本发明的克隆(例如拟南芥Ct-SRL1 cDNA)亚克隆到pBI121(Clontech)中取代GUS基因，并通过电穿孔将生成的二元载体导入根癌农杆菌菌株C58C1中。如http://www.arabidopsis.org/protocols_Mundy2.html#trans.inf所述通过体内渗透获得转基因植株(像拟南芥植株)。

或者，可以用本发明的基因转化其它双子叶或单子叶植物。因此，将它们克隆到合适的植物转化载体(诸如二元载体)中，处于植物可操作性调控序列(诸如植物可操作启动子和植物可操作终止子)的控制之下。可以使用本领域熟练技术人员众所周知的标准技术(诸如由农杆菌介导的基因转移)将包含本发明基因的这些载体转化到植物(诸如农作物植物)中。表达本发明基因的转基因植株预计显示对环境压力的耐受性增加，诸如对无机盐毒性的耐受性增加。可以通过例如转基因植株在含盐培养基中发芽的能力而观察到这种增加的耐受性。

实施例9：用本发明的基因转化稻

在酵母中参与盐耐受性的甜菜或拟南芥基因在单子叶植物(诸如稻)中的表达能够赋予该单子叶植物以压力耐受性。

为了将本发明基因的压力耐受性活性转移至单子叶植物，通过本领域熟练技术人员众所周知且下一段概述的标准技术用可操作连接启动子的每一种上述基因(SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、和19)转化稻。在范围为1天-1或多周的几个时间周期后，如下所述对幼苗检查转化基因的表达。这里通过在器官发生培养基中栽培幼苗，并通过PCR或反向PCR检查DNA或RNA的存在而进行的。在确认了基因表达后，如下所述对经转化稻植株检查对压力环境(包括盐、干旱、和寒冷)的耐受性的增强(参阅WO97/13843)。这是通过在含有数量渐增的NaCl或LiCl的培养基中栽培经转化稻植株而进行的。同样，通过分别在亚最佳栽培温度和亚最佳湿度水平下栽培经转化植株来测试对寒冷或干旱的抵抗力的增加(参阅WO97/13843)。

由拟南芥介导的稻转化

将本发明的基因可操作连接启动子，并克隆到载体中。通过电穿孔用这些载体转化根癌农杆菌菌株LBA4404或C58，随后在含有适当抗生素的固体琼脂培养基上选择经转化细菌细胞。

为了证明本发明基因在稻中的表达，将稻日本栽培种Nipponbare或Taipei的309枚成熟的、干燥的种子脱壳，灭菌，并在含有2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的培养基上发芽。在黑暗中保温4周后，切下由盾片衍生的胚性愈伤组织，并在相同培养基中增殖。然后将选择的胚性愈伤组织与农杆菌共培养。将共培养后的愈伤组织在含有2，4-D的培养基上在黑暗中在存在合适浓度的适当选择剂时培养4-5周。在此期间，形成了快速生长的抗性愈伤组织岛。将此材料转移至含有浓度降低的2，4-D的培养基并在光照下保温后，成胚潜力得到释放，并在随后的4-5周内形成苗。由愈伤组织切下苗，并在含有生长素的培养基中保温1周，然后可以由此转移至土壤。在湿度高、白昼短的人工气候室中栽培变硬的苗。可以在移植后3-5个月收获种子。该方法以超过50％的比率产生单基因座转化体(Chan等人，1993，PlantMol.Biol.，22：491-506；Hidi等人，1994，Plant J.，6：271-282)。

参考文献

An G.，Watson B.D.，Stachel S.，Gordon M.P.，& Nester E.W.(1985)New cloning vehicles for transformation ofhigher plants(用于转化高等植物的新克隆载体).EMBO J.4，277-284.

Armstrong C.L.，Petersen W.P.，Buchholz W.G.，Bowen B.A.，&Sulc S.L.(1990)Factors affecting PEG-mediated stabletransformation of maize protoplasts(影响由PEG介导的玉米原生质体稳定转化的因素).Plant Cell Reports 9，335-339.Baron M.H.& Baltimore D.(1982)Antibodies against thechemical lysynthesized genome-linked protein ofpoliovirus react with native virus-specific proteins(针对化学合成的脊髓灰质炎病毒基因组连接蛋白的抗体与天然病毒特异蛋白发生反应).Cell 28，395-404.

Bartel P.L. & Fields S.(1997)The Yeast Tow-HybridSystem(酵母双杂交系统).Oxford University Press.Bechtold N.& Pelletier G.(1998)In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thalianaplants by vaccum infiltration(通过真空渗透在植物中进行的由农杆菌介导的成熟拟南芥植株的转化).Methods Mol.Biol.82，259-266.

Cho R.J.，Mindrinos M.，Richards D.R.，Sapolsky R.J.，Anderson M.，Drenkard E.，Dewdney J.，Reuber T.L.，Stammers M.，Federspiel N.，Theologis A.，Yang W.H.，Hubbell E.，Au M.，Chung E.Y.，Lashkari D.，Lemieux e.，Dean C.，Lipshutz R.J.，Ausubel F.M.，Davis R.W.，&Oefner P.J.(1999)Genome-wide mapping with biallelicmarkers in Arabidopsis thaliana(使用biallelic标记在拟南芥中进行基因组范围的作图).Nat.Genet.23，203-207.Christou P.，McCabeD.E.，& Swain W.F.(1988)Stabletransformation ofsoybean callus by DNA-coated goldparticles(使用由DNA包被的金微粒进行的大豆愈伤组织的稳定转化).Plant Physiol.87，671-674.

Crossway A，Oakes J.V.，Irvine J.M.，Ward B.，Knauf V.C.，&Shewmaker C.K.(1986)Int egration of foreign DNAfollowing microinjection oftobaccome sophyllprotoplasts(外源DNA在显微注射到烟草叶肉原生质体中后的整合).Mol.Gen.Genet.202，179-185.

Dodds J.H.(1985)Plant genetic engineering(植物遗传工程).

Cambridge Univers ity Press.

Fromm M.，Taylor L.P.，& Walbot V.(1985)Expression ofgenes transferred into monocot and dicot plant cells byelectroporation(通过电穿孔转移到单子叶和双子叶植物细胞中的基因的表达).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A82，5824-5828.

Hanahan D.(1983)Studies on transformation of Escherichiacoli with plasmids(关于用质粒转化大肠杆菌的研究).J.Mol.Biol.166，557-580.

Hellens R.P.，Edwards E.A.，Leyland N.R.，Bean S.，&Mullineaux P.M.(2000)pGreen：a versatile and flexiblebinary Ti vector for Agrobacterium-mediated planttransformation(pGreen：用于由农杆菌介导的植物转化的通用且稳定的二元Ti载体).Plant Mol.Biol.42，819-832.Herrera-Estrella L.，De Block M.，Messens E.H.J.P.，VanMontagu M.，& Schell J.(1983a)Chimeric genes asdominant selectable markers in plant cells(在植物细胞中作为显性选择标记的嵌合基因).EMBO J.2，987-995.

Herrera-Estrella L.，Depicker A.，Van Montagu M.，& SchellJ.(1983b)Expression of chimaeric genes transferredinto plant cells using a Ti-plasmid-deri vedvector(使用由Ti质粒衍生的载体转移到植物细胞中的嵌合基因的表达).Nature 303，209-213.

Joung J.K.，Ramm E.I.，& Pabo C.O.(2000)A bacterial two-hybrid selectin system for studying protein-DNA andprotein-protein interactions(用于研究蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用的细菌双杂交选择系统).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A97，7382-7387.

Krens F.A.，Molendijk L.，Wullems G.J.，& Schilperoort R.A.(1982)In vitro transformation of plant protoplastswith Ti-pl asmid DNA(使用Ti质粒DNA在体外转化植物原生质体).Nature 296，72-74.

Langemeier J.L.，Cook R.F.，Issel C.J.，& Montelaro R.C.(1994)Application of cycle dideoxy fingerprinting toscreening heterogeneous populations of the equineinfectious anemia virus(循环双脱氧指纹用于筛选马传染性贫血病毒的异源群体的应用).Biotechniques 17，484-6，488，490.

Lerner R.A.(1982)Tapping the immunological repertoire toproduce antibodies of predetermined specificity(利用免疫库来生成具有预定特异性的抗体).Nature 299，593-596.

Lerner R.A.，Green N.，Alexander H.，LiuF.T.，SutcliffeJ.G.，& Shinnick T.M.(1981)Chemically synthesizedpeptides predicted from the nucleotide sequence of thehepatitis B virus genome elicit antibodies reactivewith the native envelope protein of Dane particles(由乙肝病毒基因组的核苷酸序列预测的化学合成肽引发能够与丹氏粒天然包膜蛋白发生反应的抗体).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78，3403-3407.

Li-Sucholeiki X.C.，Khrapko K.，Andre P.C.，Marcelino L.A.，KargerB.L.，& Thilly W.G.(1999)Applications ofconstant denaturant capillary electrophoresis/high-fidelity polymerase chain reaction to human geneticanalysis(恒定变性剂毛细电泳/高保真聚合酶链式反应用于人类遗传分析的应用).Electrophoresis 20，1224-1232.

Liddle J.E.& CryerA.(1991)A Pract ical Guide toMonoclonal Antibodies(单克隆抗体实践指南).Wiley NewYork.

Loffler J.，LanguiD.，Probst A.，& Huber G.(1984)Accumulation of 50kDa N-terminal fragment of beta-APP695 in Alzheimer’s disease hippocampus andneocortex(β-APP695的50kDaN端片段在阿尔茨海默氏病海马和新皮层中积累).Neurochem.Int.24，281-288.

Magyar Z.，Meszaros T.，Miskolczi P.，Deak M.，Feher A.，Brown S.，Kondorosi E.，Athanasiadis A.，Pongor S.，Bilgin M.，Bako L.，Koncz C.，& Dudits D.，(1997)Cellcycle phase specificity of putative cyclin-dependentkinase variants in synchronized alfalfa cel ls(推定的细胞周期蛋白依赖性激酶变体在同步化苜蓿细胞中的细胞周期阶段特异性).Plant Cell 9，223-235.

McCallum C.M.，Comai L.，Greene E.A.，& Henikoff S.(2000b)Targeted screening for induced mutations(用于诱导突变的靶向筛选).Nat.Biotechnol.18，455-457.

McCallum C.M.，Comai L.，Greene E.A.，& Henikoff S.(2000a)Targeting induced locallesions in genomes(TILLING)for plant functional genomics(用于植物功能基因组学的基因组中靶向诱导局部损伤).Plant Physiol.123，439-442.Merrifield R.B.(1963)Solid phase peptide synthesis.I.

The synthesis of a tetrapeptide(固相肽合成。I.四肽合成).

J.Amer.Chem.Soc.85，2149-2154.

Murakami T.，Simonds W.F.，& Spiegel A.M.(1992)Site-specific antibodies directed against G protein beta andgamma subunits：effects on alphaand betagamma subunitinteraction(针对G蛋白β和γ亚基的位点特异抗体：对α与βγ亚基相互作用的影响).Biochemistry 31，2905-2911.

PalmgrenG.(1997)Transgenic plants：environmental lysafefactories of the future(转基因植物：未来对环境安全的工厂).Trends Genet.13，348.

Paszkowski J.，Shillito R.D.，Saul M.，Mandak V.，& HohnT.H.B.P.I.(1984)Direct gene transfer to plant(直接将基因转移至植物).EMBO J.3，2727-2722.

Ross P.，Hall L.，& Haff L.A.(2000)Quantitative approachto single-nucleotide polymorphism analysis using MALDI-TOF mass spectrometry[In Process Citation](使用MALDI-TOF质谱的单核苷酸多态性分析的定量方法).Biotechniques29，620-629.

Sambrook J.，Fritsch E.F.，& Maniatis T.(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册).

Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Semler B.L.，Anderson C.W.，Hanecak R.，Dorner L.F.，&Wimmer E.(1982)A membrane-associated precursor topoliovirus UPg identified by immunoprecipitation withantibodies directed against a synthetic heptapeptide(通过使用针对合成七肽的抗体的免疫沉淀鉴定的脊髓灰质炎病毒Upg的膜相关前体).Cell 28，405-412.

Shioda T.，Andriole S.，Yahata T.，& Isselbacher K.J.(2000)A green fluorescent protein-reporter mammalian two-hybrid system with extrachromosomal maintenance of aprey expression plasmid：Application to interactionscreening(在染色体外维持捕获物表达质粒的绿色荧光蛋白-报告基因哺乳动物双杂交系统：用于筛选相互作用).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A97，5220-5224.

Tamura R.N.，Cooper H.M.，Collo G.，& Quaranta V.(1991)Cell type-specific integrin variants with malternativealpha chain cytoplasmic domains(具有替换α链细胞质结构域的细胞类型特异整合蛋白变体).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A88，10183-10187.

Trieu A.T.，Burleigh S.H.，Kardailsky I.V.，Maldonado-Mendoza I.E.，Versaw W.K.，Blaylock L.A.，Shin H.，Chiou T.J.，Katagi H.，Dewbre G.R.，Weigel D.，&Harrison M.J.(2000)Technical Advance：Transformationof Medicago trunctula viainfiltration of seedlings orflowering plants with Agrobacterium(技术进步：通过用农杆菌渗透幼苗或正开花植株来转化Medicago trunctula).Plant J.22，531-541.

Vidal-Puig A.& Moller D.E.(1994)Comparative sensitivityof alternative single-strand conformation polymorphism(SSCP)methods(替换单链构象多态性(SSCP)方法的相对敏感性).Biotechniques 17，490-2，494，496.

Woulfe J.，Lafortune L.，de Nadai F.，Kitabgi P.，& BeaudetA.(1994)Post-translational processing of theneurotensin/neuromedin N precursor in the centralnervous system of the rat—II.Immunohistochemicallocalization of maturation products(大鼠中枢神经系统中神经降压肽/神经调节肽N前体的翻译后加工。II.成熟产物的免疫组织学定位).Neuroscience 60，167-181.

Yoon K.，Cole-Strauss A.，& Kmiec E.B.(1986)Targeted genecorrection of episomal DNA in mammalian cells mediatedby a chimeric RNA.DNA oligonucleotide(哺乳动物细胞中由嵌合RNA.DNA寡核苷酸介导的游离DNA的靶向基因修正).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A93，2071-2076.

序列表

<110>Universidad Politecnica de Valencia

<120>通过操作信使RNA前体加工而提供的针对真核细胞和生物体中的盐离子毒性的保护

<130>CROP-016-PCT

<140>

<141>

<150>P200001102

<151>2000-04-19

<160>24

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>840

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

<210>2

<211>1433

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

<210>3

<211>221

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

<210>4

<211>416

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>4

<210>5

<211>920

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>5

<210>6

<211>250

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>6

<210>7

<211>1492

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>7

<210>8

<211>342

<212>PRT

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>8

<210>9

<211>650

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>9

<210>10

<211>203

<212>PRT

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>10

<210>11

<211>1464

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>11

<210>12

<211>356

<212>PRT

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>12

<210>13

<211>1310

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>13

<210>14

<211>356

<212>PRT

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>14

<210>15

<211>1155

<212>DNA

<213>甜菜(Betavu lgaris)

<400>15

<210>16

<211>322

<212>PRT

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>16

<210>17

<211>1200

<212>DNA

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>17

<210>18

<211>295

<212>PRT

<213>甜菜(Beta vulgaris)

<400>18

<210>19

<211>1050

<212>DNA

<213>家鼠(Mus musculus)

<400>19

<210>20

<211>310

<212>PRT

<213>家鼠(Mus musculus)

<400>20

<210>21

<211>117

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>21

<210>22

<211>55

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>22

<210>23

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：探针或引物

<400>23

<210>24

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：探针或引物

<400>24

Claims (53)

1.增强细胞和生物体中的压力耐受性的方法，包括操作信使RNA前体的加工过程。

2.增强细胞和生物体中的盐毒性的方法，包括操作信使RNA前体的加工过程。

3.依照权利要求1或2任一项的方法，其中所述操作包括对参与或干预信使RNA前体加工过程的分子进行的遗传或生化操作。

4.依照权利要求1或3的方法，其中所述压力耐受性包括对渗透、干旱、寒冷、或冻结压力的耐受性。

5.依照权利要求1-4任一项的方法，包括对具有Arg-Ser、Arg-Glu、和Arg-Asp二肽高含量的结构域(RS结构域)的蛋白质进行的遗传或生化操作。

6.依照权利要求1-4任一项的方法，包括对属于RNA结合蛋白的蛋白质进行的遗传或生化操作。

7.依照权利要求1-4任一项的方法，包括对U1-snRNP或U2-snRNP复合物的成分进行的遗传或生化操作。

8.依照权利要求1-4任一项的方法，包括对转录因子进行的遗传或生化操作。

9.依照权利要求1-4任一项的方法，包括对核运动蛋白进行的遗传或生化操作。

10.包含SEQ ID NO.1所示核酸序列即编码SEQ ID NO.3所列氨基酸序列的分离核酸、或包含如SEQ ID NO.2所示即编码SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.21所列氨基酸序列或包含SEQ ID NO.22的氨基酸序列的核酸用于依照权利要求1-5的任何方法的用途。

11.包含SEQ ID NO.5所示核酸序列即编码SEQ ID NO：6所列氨基酸序列的分离核酸用于权利要求1-4或7的任何方法的用途。

12.包含SEQ ID NO.7、9、11、13、15、17、或19任一核酸序列即编码SEQ ID NO.8、10、12、14、16、18、或20任一所列氨基酸序列的分离核酸用于权利要求1-4的任何方法的用途。

13.选自下组且编码蛋白质或其免疫学活性和/或功能性片段的分离核酸：

a)包含SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一所示DNA序列或其互补序列的核酸；

b)包含对应于(a)中SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一项的RNA序列或其互补序列的核酸；

c)与(a)或(b)中定义的核苷酸序列特异杂交的核酸；

d)所编码的蛋白质具有与SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一项所示多肽至少95％同一的氨基酸序列的核酸；

e)所编码的蛋白质包含SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22任一项所示氨基酸序列的核酸；

f)由于遗传密码简并性而是SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一项所示或(a)-(e)中定义的核酸的简并性的核酸；

g)由于生物体之间密码子使用率的差异而与编码SEQ IDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一项所示蛋白质或(a)-(e)中定义的核苷酸序列具有分歧的核酸；

h)由于编码SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一项所示蛋白质或(a)-(e)中定义的等位基因的差异而具有分歧的核酸；

i)编码由SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一项所示或(a)-(e)中定义的DNA序列编码的蛋白质的免疫学活性和/或功能性片段的核酸；

j)编码SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21中定义的蛋白质或(a)-(i)中定义的核酸，其特征为所述序列是DNA、cDNA、基因组DNA、或合成DNA。

14.与权利要求13的核酸特异杂交的长度为至少15个核苷酸的核酸分子。

15.特异扩增权利要求13的核酸的长度为至少15个核苷酸的核酸分子。

16.包含依照权利要求13的核酸的载体。

17.依照权利要求16的载体，它是表达载体，其中所述核酸可操作连接能够在原核和/或真核宿主细胞中表达所述序列的一种或多种控制序列。

18.包含依照权利要求13的核酸或权利要求16或17的载体的宿主细胞。

19.依照权利要求18的宿主细胞，其选自细菌、昆虫、真菌、酵母、植物、或动物细胞。

20.编码包含权利要求5中定义的“RS结构域”的蛋白质的天然或合成核酸用于权利要求1-4的任何方法的用途。

21.编码在真核细胞中参与信使RNA前体加工过程的蛋白质的天然或合成核酸在权利要求1-9的任何方法中的用途。

22.与权利要求10-13任一项中鉴定的至少一种序列具有至少50％同一性的核酸在权利要求1的方法中的用途，其中所述核酸源自真核细胞。

23.对应于权利要求12中定义的至少一种核酸的反义分子。

24.权利要求23的反义分子在权利要求1-4的任何方法中的用途。

25.可以由权利要求13定义的至少一种核酸编码的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫学活性和/或功能性片段。

26.包含SEQ ID NO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22任一项所示氨基酸序列的权利要求25的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫学活性和/或功能性片段。

27.生成依照权利要求25或26的多肽的方法，包括在允许表达多肽的条件下培养权利要求18或19的宿主细胞并由培养物回收生成的多肽。

28.用于生成转基因植物、植物细胞、或植物组织的方法，包括将可表达形式的依照权利要求13的核酸分子或依照权利要求16或17的载体导入所述植物、植物细胞、或植物组织。

29.用于生成改变后的植物、植物细胞、或植物组织的方法，包括将权利要求25或26的多肽直接导入所述植物的细胞、组织、或器官。

30.用于实现权利要求25或26的多肽的表达的方法，包括将可操作连接一种或多种控制序列的权利要求13的核酸或依照权利要求16或17的载体稳定导入植物细胞的基因组。

31.权利要求28或30的方法，还包括由所述植物细胞再生植株。

32.可以通过权利要求31的方法获得的转基因植物细胞，其中所述核酸稳定整合到所述植物细胞的基因组中。

33.因表达权利要求13的至少一种核酸或权利要求25或26的至少一种多肽或权利要求23的反义分子而耐受盐压力的转基因植物。

34.因表达权利要求13的至少一种核酸或权利要求25或26的至少一种多肽或权利要求23的反义分子而显示表型变化的转基因植物。

35.权利要求33和34的植物的可收获部分。

36.权利要求35的植物的可收获部分，其选自下组：种子、叶、果实、茎干培养物、根状茎、根、块茎、和鳞茎。

37.由权利要求33-36任一项任何植物或植物部分衍生的后代。

38.用于在植物中增强压力耐受性的方法，包括在所述植物的细胞、组织、或部分中表达权利要求13的至少一种核酸或权利要求25或26的至少一种多肽或权利要求23的反义分子。

39.用于在植物中改变压力耐受性的方法，包括在所述植物的细胞、组织、或部分中表达权利要求13的至少一种核酸或权利要求25或26的至少一种多肽或权利要求23的反义分子。

40.权利要求38或39的方法，其中所述压力是渗透压。

41.权利要求38或39的方法，其中所述压力是盐压力。

42.权利要求38或39的方法，其中所述压力是干旱压力。

43.权利要求38或39的方法，其中所述压力是冻结压力。

44.权利要求38或39的方法，其中所述压力是寒冷压力。

45.权利要求1-9、27-31、或38-44任一项的方法用于提高产量。

46.权利要求13的核酸、权利要求16或17的载体、权利要求25或26的多肽用于提高产量的用途。

47.权利要求13的核酸、权利要求16或17的载体、权利要求25或26的多肽用于刺激植物生长的用途，可以是在该植物的任何部分，诸如根、叶、种子中。

48.可以通过权利要求1-9、28-31、或38-42的任何方法获得的植物或者权利要求33或34的植物用于在盐含量超过1mM盐离子的土壤上栽培的用途。

49.因表达权利要求13的任何核酸和/或权利要求25或26的蛋白质而更加耐受盐压力的新的酵母菌株或其它单细胞真核生物。

50.体外细胞培养系统，它包括因表达权利要求13的至少一种核酸、权利要求16或17的载体、权利要求25或26的多肽、或者权利要求23的反义分子而获得的权利要求18或19中定义的耐受盐的动物、植物、或宿主细胞。

51.由权利要求1中描述的方法衍生的对人的治疗性应用。

52.特异识别权利要求25或26的多肽或其特定表位的抗体。

53.诊断组合物，它包含权利要求13-15的至少一种核酸、权利要求16或17的载体、权利要求25或26的多肽、或权利要求52的抗体。

Images