CN101365468A - 器官保存和/或灌注 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于移植的器官特别是心脏的保存、灌注、和/或再灌注的方法。所述溶液包含蛋白激酶Cε(PKCε)的肽抑制剂。还公开了使用本发明的溶液的方法，包括保存移植用器官的方法、保护缺血性器官免于损害的方法、减少缺血后器官机能障碍的方法、维持缺血性器官中一氧化氮释放和/或抑制超氧化物释放的方法、和在从循环系统分离时保护器官免于损害的方法。

Description

器官保存和/或灌注
发明领域
本发明涉及移植用器官特别是心脏的保存、灌注、和/或再灌注的溶液。该溶液包含蛋白激酶C ε(PKC ε)的肽抑制剂。
发明背景
成功的器官移植经常受到缺血/再灌注损伤的限制。分离的人类心脏被剥夺氧气超过四小时逐渐地失去活力并且经常不能在接受者宿主中存活。其它器官例如肾脏、肝脏、胰脏、和肺也在移植之前从它们的宿主取出时经历组织和细胞损害。这种损害是由于缺氧的状况和缺少正常递送生理学浓度的氧气和养分并且除去由器官的细胞产生的毒性化合物的循环。在从它们的宿主切除之后立即进行器官的移植时，成功率较高。
最近的发展已经增加了器官移植和器官手术例如冠状动脉旁路手术成功的比例。第一个原因在于器官保存和器官灌流溶液。第二个原因在于用于为器官递送器官灌流溶液的方法和装置的改善。
短期的心肌保存目前在心脏停搏之后通过冷藏来提供。然而，各种方法存在有使用的溶液组成、保存温度和给药方案方面的区别。已经开发了用于停搏和保存心脏的不同溶液，用于在心脏手术中保护心肌。这些溶液的实例包括Krebs-Henseleit溶液、UW溶液、St.ThomasII溶液、Collins溶液和Stanford溶液。(参见例如，美国专利4,798,824和4,938,961；Southard和Belzer，Ann.Rev.Med.46：235-247(1995)；和Donnelly和Djuric，Am.J.Hosp.Pharm.48：2444-2460(1991))。尽管如此，由于移植的器官在取出的时间与在接受者中恢复血流的时间之间状况的恶化，仍存在有器官排斥。
在例如移植过程中，恢复血流是处理经历长时间缺血的器官的主要任务。然而，血流的再灌注诱导内皮和肌细胞损伤，引起器官机能障碍(Buerke等人，Am J Physiol 266：H128-136，1994；Lucchesi和Mullane，Ann Rev Pharmacol Toxicol 26：2011-2024，1986；和Lucchesi等人，J Mol Cell Cardiol 21：1241-1251，1989)。与再灌注损伤有关的顺序事件是由内皮机能障碍引发的，内皮机能障碍的特征在于在再灌注后的前2.5-5分钟内基底内皮细胞释放一氧化氮(NO)的减少(Tsao和Lefer，Am J Phyiol 259：H1660-1666，1990)。内皮来源的NO的减少与内皮和多形核(PMN)白细胞的细胞膜上粘着分子向上调节有关(Ma等人，Circ Res 72：403-412，1993；和Weyrich等人，J Leuko Biol 57：45-55，1995)。这一事件促进PMN/内皮的相互作用，其在再灌注后10到20分钟发生，并且随后在再灌注30分钟后观察到PMN渗透到心肌中(Lefer和Hayward，在The Role ofNitric Oxide in Ischemia-Reperfusion：Contemporary Cardiology中，Loscalzo等人，(Eds.)，Humana Press，Totowa，NJ，pp.357-380，2000；Lefer和Lefer，Cardiovasc Res 32：743-751，1996；Tsao等人，Circulation 82：1402-1412，1990；和Weyrich等人，J LeukoBiol 57：45-55，1995)。
从再灌注的组织释放的趋化物质和血浆因子使PMN活化，增加PMN释放细胞毒物质(即，超氧阴离子)，并且有助于缺血/再灌注后的器官机能障碍(Lucchesi等人，J Mol Cell Cardiol 21：1241-1251，1989；Ma等人，Circ Res 69：95-106，1991；Tsao等人，Circulation 82：1402-1412，1990；和Tsao等人，Am Heart J 123：1464-1471，1992)。超氧化物与NO结合，以产生过氧亚硝基阴离子，从而在心肌缺血/再灌注之后降低NO的生物利用率并且促进内皮机能障碍和PMN渗透(Clancey等人，J Clin Invest 90：1116-1121，1992；Hansen，Circulation 91：1872-85，1995；Lucchesi等人，J Mol Cell Cardiol21：1241-1251，1989；Rubanyi和Vanhoutte，Am J Physiol 250：H815-821，1986；Tsao等人，Am Heart J 123：1464-1471，1992；和Weiss，New Eng J Med 320：365-375，1989)。
因此，仍需要可以延长移植用器官保存时间并且保护器官免于缺血之后的再灌注损伤的改善质量的溶液，使得器官可以在恢复血流之后恢复其正常功能。
发明内容
本发明提供用于器官特别是心脏的保存、灌注、和/或再灌注的溶液，其包含蛋白激酶C ε(PKC ε)的肽抑制剂。该溶液在器官从循环系统分离或者经历血流减少(缺血)时保护器官组织和细胞免于损害。本发明人发现，PKC ε的肽抑制剂可以在经历缺血/再灌注的器官中发挥保护作用。
在一个实施方案中，溶液包含溶解于溶液，优选盐溶液中的约1-10μM，优选约1-5μM的PKC ε的肽抑制剂。
本发明的溶液可用作灌注溶液或保存溶液。作为灌注溶液，将其泵入器官的脉管系统以保护器官组织和细胞。作为保存溶液，其用作在其中浸没器官的浴液。优选地，将器官用本发明的溶液灌注并且浸没在本发明的溶液中。另外，本发明的溶液还在缺血之后恢复器官血流时用作再灌注溶液。
本发明还包括使用本发明溶液的方法。这些包括保存移植用器官的方法、保护缺血性器官免于损害的方法、在缺血之后减少器官机能障碍的方法、和在从循环系统分离时保护器官免于损害的方法。
附图简述
图1表示在伪I/R、I/R、/R+PMN和I/R+PMN+PKC ε肽抑制剂(5μM)灌注的大鼠心脏中LVDP(左心室形成压＝左心室收缩末期压(LVESP)-左心室舒张末期压(LVEDP))的时间过程。
图2表示伪I/R、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+PKC ε肽抑制剂(5μM)组的LVEDP时间过程。
图3表示得自分离的灌注的大鼠心脏在缺血前(I)(最初的)和在再灌注45分钟之后(最终的)以mmHg表示的最初的和最终的LVDP。将心脏在有或没有PMN的存在下灌注。PMN诱导显著的收缩机能障碍，其由PKC ε肽抑制剂减弱。所有的数值表示为平均±SEM。研究的心脏数在条形图的底部。
图4表示得自在分离的灌注的大鼠心脏在缺血前(最初的)和再灌注之后(最终的)以mmHg/s表示的最初的和最终的LVDP最大比率(+dP/dtmax)。将心脏在有或没有PMN的存在下灌注。PMN诱导显著的收缩机能障碍，其由PKC ε肽抑制剂减弱。所有的数值表示为平均±SEM。研究的心脏数在条形图的底部。
图5表示在七组心脏功能实验(伪I/R、伪I/R+PKC ε肽抑制剂(5μM)、I/R、I/R+PKC ε肽抑制剂(5μM)、I/R+PMN、和I/R+PMN+PKCε肽抑制剂(1和5μM))中的冠脉血流量。
图6表示在七组心脏功能实验(伪I/R、伪I/R+PKC ε肽抑制剂(5μM)、I/R、I/R+PKC ε肽抑制剂(5μM)、I/R+PMN、和I/R+PMN+PKCε肽抑制剂(1和5μM))中的心率。
图7表示与PKC ε肽抑制剂处理段(1、5、和10μM)相比，在未经处理的(基础的)段中从大鼠主动脉内皮释放的NO。
优选实施方案的详细说明
本发明提供用于器官特别是心脏的保存、灌注、和/或再灌注的溶液。该溶液包含蛋白激酶C ε(PKC ε)的肽抑制剂。优选地，PKC ε的肽抑制剂以约1-10μM、更优选约1-5μM的量存在于溶液中。
在优选实施方案中，1-10μM、更优选约3-5μM的肽抑制剂具有EAVSLKPT的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。此外，在其它实施方案中，优选肽抑制剂被肉豆蔻酰化，以促进被良好地吸收到器官的细胞中。肉豆蔻酰化优选在肽抑制剂的N-末端。
在优选实施方案中，肽抑制剂溶解于盐溶液中，优选溶解于生理盐水(0.9％ NaCl)中。肽抑制剂还可以溶解于已知的保存溶液中，例如Krebs-Henseleit溶液、UW溶液、St.Thomas II溶液、Collins溶液、Stanford溶液等中。溶液还可以包含一种或多种浓度分别为约4-7mM、约0.2-0.3mM、约108-132mM、约13-16mM、约18-22mM、约2-4mM、约0.5-1mM、约27-33mM、约0.9-1.1mM、约2.7-3.3mM、约25-35mM、和约80-120mM的钠(Na+)、钾(K+)、钙、(Ca2+)、镁(Mg2+)谷氨酸盐、精氨酸、腺苷、甘露醇(manitol)、别嘌呤醇、谷胱甘肽、棉子糖、和乳糖酸。Na+可为NaOH的形式，K+可为KCl和/或KH2PO4的形式；最优选为约2-3.5mM KCl和约2-3.5mM KH2PO4的比例；Ca2+可为CaCl2的形式；和Mg2+可为MgCl2的形式。溶液还可以包含蛋白激酶Cβ11(PKC β 11)的肽抑制剂、蛋白激酶C ζ(PKC ζ)的肽抑制剂、和蛋白激酶C δ(PKC δ)的肽活化剂的一种或多种。溶液优选保持在约7.0-7.5，更优选为约7.2-7.4的生理学pH。
本发明的溶液可以在器官移植特别是心脏的移植的所有阶段过程中使用，包括但不限于1)用于从供体分离器官(心麻痹溶液)；2)用于保存器官(低温储存/转运)；和3)用于将器官再植入接受者(再灌注溶液)。
在灌注或再灌注过程中，特别是用于心脏时，优选器官以约1mL/分钟的速率灌注约5分钟。灌注的速率可以改变，但是不应该超过约25mL/分钟。最重要的是，灌注速率不应太高而使得对器官的脉管系统施加过度的压力。
本发明的溶液可以如下制备：1)将肽抑制剂和不同的组分溶解在蒸馏水中并且稀释；2)使用例如NaOH调节pH到约7.2-7.4；和3)通过例如用0.2μm过滤器过滤将溶液灭菌。然后保持灭菌的溶液隔离环境的污染物。
无需进一步说明，通过前述说明和以下示例性实施例，本领域技术人员可以生产和利用本发明的化合物并且实践要求保护的方法。给出以下实施例用于举例说明本发明。应该理解，本发明不限于这种实施例中描述的特定条件或细节。
实施例
将雄性的Sprague Dawley大鼠(275-325g，Ace Animals，Boyertown，PA)用腹膜内(i.p.)给予的60mg/kg的戊巴比妥钠麻醉。另外，i.p.给予肝素钠(1,000U)。迅速地摘除心脏，为升主动脉插套管，并且启动用保持在37℃的改进的Krebs缓冲液以80mmHg的恒定压力进行心脏的逆行性灌注。Krebs缓冲液具有以下组成(表示为mmol/l)：17葡萄糖，120 NaCl，25 NaHCO3，2.5 CaCl2，0.5 EDTA，5.9 KCl，和1.2 MgCl2。将灌注液用95％ O2和5％ CO2充气并且在7.3-7.4的pH平衡。邻近心脏流入套管的灌注线路中的两个侧臂允许将PMN、不含PKC ε肽抑制剂的血浆(对照心脏)或包含不同浓度PKC ε肽抑制剂(1或5μM)的血浆直接灌注到冠状动脉流入线路中。通过流量计(T106，Transonic System，Inc.，Ithaca，NY)监控冠脉血流量。LVDP和+dP/dtmax使用压力传感器(SPR-524，Millar Instruments，Inc.，Houston，TX)监控，将所述传感器置于左心室腔中。将心脏浸入水夹套的包含保持在37℃的160mL Krebs缓冲液的储库中。
使用与计算机结合的Powerlab Station采集系统(ADInstruments，Grand Junction，CO)记录冠脉血流量、LVDP和+dP/dtmax。
每5分钟测量LVDP、+dP/dtmax、和冠脉血流量，持续15分钟，以使心脏平衡和获得基线测量。LVDP定义为左心室收缩末期压减去左心室舒张末期压。在15分钟之后，将Krebs缓冲液的流量降低为零，维持20分钟，以诱导系统缺血。在再灌注时，以1mL/分钟的速率为心脏输注再悬浮于5mL Krebs缓冲液的200 X 106 PMN加上5mL血浆，持续5分钟。在一些实验中，以1或5μM的最终浓度向血浆加入PKCε肽抑制剂(Genemed Synthesis，Inc.，San Francisco，CA)。伪I/R心脏未经过缺血并且不用PMN灌注。使用以下组的分离的灌注大鼠心脏：
第1组：伪I/R心脏未经过缺血并且不用PMN灌注，但是在35分钟时为灌注液灌注5mL的血浆(1mL/分钟)开始灌注(intoperfusion)(在同一时间点，给予I/R心脏5mL血浆，15分钟基线记录加上20分钟缺血)。这些心脏代表用于确定分离的大鼠心脏是否可以在整个80分钟方案过程中保持LVDP和+dP/dtmax的对照组(n＝6)。
第2组：伪I/R+PKC ε肽抑制剂(5μM)心脏未经过缺血并且不用PMN灌注。在35分钟对这些心脏给予PKC ε肽抑制剂(5μM，从5mM的在H2O中的原液溶解于血浆中)开始灌注。这个组用于测定PKC ε肽抑制剂是否产生强心或心脏抑制作用(n＝6)。
第3组：I/R心脏经过20分钟的缺血并且在再灌注的前5分钟用5mL的血浆灌注(1mL/分钟)，但是不用PMN灌注。这些心脏代表对照组，用于确定缺血20分钟之后再灌注是否使心脏功能丧失，但是在45分钟再灌注时间之后LVDP和+dP/dtmax回到基线值(最初的)(n＝7)。
第4组：I/R+PKC ε肽抑制剂(5μM，溶解于血浆)心脏经过20分钟缺血并且不用PMN灌注。这些心脏在再灌注的前5分钟过程中用5mL的血浆+PKC ε肽抑制剂灌注。这个组用于测定PKCε肽抑制剂在没有PMN的I/R中是否引起心脏抑制作用(n＝6)。
第5组：I/R+PMN心脏经过20分钟的缺血并且在再灌注的前5分钟用5mL的血浆(1mL/分钟)和PMN(再悬浮于5mL Krebs缓冲液)灌注。这些心脏代表对照组，用于与最初的基线值相比，测定缺血20分钟之后在PMN(200 x 106)的存在下再灌注45分钟是否在整个45分钟再灌注时间中产生持续的心脏收缩机能障碍(n＝7)。
第6组：I/R+PMN+PKC ε肽抑制剂(1μM)心脏经过20分钟缺血并且在再灌注的前5分钟过程中用1μM PKC ε肽抑制剂(溶解于血浆)和PMN(200 x 106)灌注。这些心脏代表了用于测定PKC ε抑制在减少PMN诱导的心脏收缩机能障碍方面的作用的组(n＝6)。
第7组：I/R+PMN+PKC ε肽抑制剂(5μM)心脏经过20分钟缺血并且在再灌注的前5分钟过程中用5μM PKC ε肽抑制剂(溶解于血浆)和PMN(200 x 106)灌注。这些心脏代表用于测定更高浓度的PKC ε肽抑制剂在减少PMN诱导的心脏收缩机能障碍方面的PKC ε作用的组(n＝6)。
图1表示伪I/R、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+PKC ε肽抑制剂(5μM)组的心脏收缩功能(LVDP)的时间过程，并且举例说明在80分钟灌注时间过程中LVDP的变化。伪I/R组的心脏在整个灌注时间的过程中保持100±2％的LVDP最初基线值。I/R组的心脏在再灌注的最初阶段过程中经历LVDP的抑制，但是在再灌注结束时，其恢复到最初基线值的92±3％。然而，I/R+PMN组的心脏表现出严重的心脏收缩机能障碍，在再灌注结束时只恢复到最初基线值的55±5％。相反，I/R+PMN+PKCε肽抑制剂(5μM)的心脏在再灌注后15分钟发生LVDP的显著恢复(最初基线值的88±9％)并且在45分钟再灌注时间过程中持续改善并且恢复到最初基线值的99±6％。
在LVDP时间过程中观察到的PKCε抑制剂处理的心脏和对照I/R+PMN心脏之间的显著区别可以主要归因于舒张末期压(LVEDP)。图2是伪I/R、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+PKC ε肽抑制剂(5μM)组的LVEDP时间过程。最初的LVEDP没有显著区别(5-8mmHg)。然而，早在再灌注后15分钟在对照I/R+PMN和I/R+PMN+PKC ε抑制剂处理的心脏之间观察到显著区别，并且这个区别在45分钟再灌注过程中得到保持。与I/R+PMN+PKC ε抑制剂处理的心脏的最终LVEDP为16±2mmHg相比，对照I/R+PMN心脏具有42±7mmHg的最终LVEDP，并且这个区别是显著的(p<0.01)。
为了确定PKC ε肽抑制剂是否对心脏的收缩功能产生任何直接的变力性效应，将伪I/R心脏用PKC ε肽抑制剂(5μM)灌注。这个组用作研究的对照组之一。这些心脏在80分钟再灌注时间结束时没有表现出LVDP(图3)或+dP/dtmax(图4)的任何显著变化，由此表明这个剂量的PKC ε肽抑制剂对心脏收缩功能没有直接作用。
图3和4分别表示得自分离的灌注心脏的LVDP和+dP/dtmax的最初和最终值。研究的所有组的最初基线值之间没有显著区别。对于伪I/R、I/R、伪I/R+PKC ε肽抑制剂和I/R+PKC ε肽抑制剂(5μM)组的LVDP和dP/dtmax最初和最终值之间没有显著区别。然而，在I/R+PMN组的LVDP和+dP/dtmax的最初和最终值之间有显著区别。观察到在再灌注之后45分钟LVDP有55±5％和+dP/dtmax有47±4％的从最初基线值的显著降低(p<0.01)。5μM剂量是最具心脏保护性的，因为在I/R+PMN+PKC ε肽抑制剂(5μM)的心脏中在再灌注后45分钟，LVDP和+dP/dtmax分别恢复到最初基线值的99±6％和87±5％。这些数值与再灌注后45分钟的I/R+PMN显著不同(p<0.01)。PKC ε肽抑制剂的1μM剂量没有心脏保护性，因为I/R+PMN+PKC ε肽抑制剂(1μM)组的心脏的LVDP和+dP/dtmax分别只恢复到66±9％和59±9％。1μM剂量组的LVDP和+dP/dtmax的最终值与I/R+PMN组没有显著不同。
图5举例说明在心脏功能实验中七个组的冠脉血流量。最初的冠脉血流量没有显著区别(16-21ml/分钟)。对照I/R+PMN组只恢复到最初基线值的34±8％，而I/R+PMN ε抑制剂处理的心脏恢复到最初基线值的62±3％，这个区别是显著的(p<0.01)。
图6举例说明在心脏功能实验中七个组的心率。最初的心率没有显著区别(295-265心跳/分钟)。对照I/R+PMN组只恢复到最初基线值的72±7％，而I/R+PMN+PKC ε抑制剂处理的心脏恢复到最初基线值的85±4％，这个区别是显著的(p<0.05)。
图7举例说明从大鼠主动脉内皮未经处理(基础)段释放的NO，与PKC ε肽抑制剂(1-10μM)处理的段相比。将乙酰胆碱(Ach)(10μM)用作阳性对照。PKC ε肽抑制剂处理段有剂量-反应作用，其显著地抑制基础的NO释放，从2.12±0.39皮摩尔/mg组织到0.66±0.28(5μM；p<0.05)和0.26±0.42(10μM)皮摩尔/mg组织。尽管内皮来源的NO增加通常与I/R之后的心脏保护有关，但是推测在早期再灌注过程中底物(L-精氨酸)或辅因子(BH4)不容易得到时，内皮NO释放(eNOS)的酶可以使其生产特征改变为产生超氧化物释放。
尽管本文已经明确地描述了本发明的某些目前优选的实施方案，但是本发明所述技术领域的技术人员显而易见，可对本文中表示和描述的各种实施方案进行改变和修饰而不脱离本发明的精神实质和范围。因此，意在本发明只受到随后的权利要求和适用的法律性规则所要求的程度的限制。

Claims (24)

1.用于器官保存的灌注、保存、和/或再灌注的溶液，其包括蛋白激酶Cε(PKCε)的至少一种肽抑制剂。
2.权利要求1的溶液，其中所述至少一种肽抑制剂被溶解于盐溶液中。
3.权利要求1的溶液，其进一步包括氯化钾。
4.权利要求1的溶液，其中所述PKC ε的至少一种肽抑制剂具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
5.权利要求1的溶液，其中所述PKC ε的至少一种肽抑制剂的浓度为约1-10μM。
6.权利要求1的溶液，其中所述器官是心脏。
7.权利要求1的溶液，其中所述器官是哺乳动物器官。
8.权利要求7的溶液，其中所述哺乳动物是人。
9.权利要求1的溶液，其中所述器官被保存用于移植。
10.保存移植用器官、保护缺血性器官、减少缺血后器官机能障碍、或在从循环系统分离之后保护器官免受损害的方法，所述方法包括用权利要求1的溶液灌注器官的步骤。
11.权利要求10的方法，其中至少一种肽抑制剂被溶解于盐溶液中。
12.权利要求10的方法，另外包括氯化钾。
13.权利要求10的方法，其中所述至少一种肽抑制剂具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列。
14.权利要求10的方法，其中所述PKC ε的至少一种肽抑制剂的浓度为约1-10μM。
15.权利要求10的方法，其中所述器官是心脏。
16.权利要求10的方法，其中所述器官是哺乳动物器官。
17.权利要求16的方法，其中所述哺乳动物是人。
18.权利要求10的方法，其中所述器官被保存用于移植。
19.权利要求10的方法，其中肽抑制剂/活化剂被肉豆蔻酰化。
20.权利要求10的方法，另外包括将器官浸没在权利要求1的溶液中的步骤。
21.权利要求10的方法，其中灌注步骤以小于约20mL/分钟的速率进行。
22.权利要求10的方法，其中灌注步骤以约1mL/分钟的速率进行。
23.权利要求10的方法，其中所述灌注步骤是逆行性灌注。
24.权利要求10的方法，其中所述灌注步骤持续约5分钟。
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