CN101326291A - 诊断和治疗心血管疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外或者体内诊断心血管疾病，尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其它血栓形成事件的方法，其中确定个体样品的编码人ARK2蛋白的核酸第950位的核苷酸，或者人ARK2蛋白第298位的氨基酸，本发明还涉及ARK2在开发和/或生产用于治疗心血管疾病的药物中的用途。

Description

诊断和治疗心血管疾病的方法
本发明涉及体外或者体内诊断心血管疾病(尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他的血栓形成事件)的方法，其中确定个体样品中人ARK2蛋白编码核酸第950位的核苷酸或者人ARK2蛋白第298位的氨基酸，本发明还涉及ARK2在开发和/或生产用于治疗心血管疾病的药物中的用途。
aurora激酶是在许多实体瘤中过表达的致癌性有丝分裂丝氨酸/苏氨酸激酶家族(Vankayalapati，H.等人，(2003)Molecular CancerTherapeutics，2，283-294)。起初，一种果蝇(Drosophila)的自发染色体分离缺陷突变体被鉴定和命名为aurora(Shindo，M.等人，(1998)，244，285-292)。人aurora1激酶也称为AUR1、ARK2、Alk2、AIM-1和STK12。本文使用术语ARK2。ARK2在有丝分裂中发挥作用，在有丝分裂过程中其尤其在中间体中积累(Shindo，M.等人，(1998)，同上)。也已证明ARK2缺陷细胞表现出胞质分裂缺陷(Descamps & Prigent(2001)，Sci.STKE，173，1)。ARK2的基因位于染色体17p13.1。
为了更好的理解ARK2在人类疾病的发生和进程中的可能涉及情况，使用良好表征的患者群进行基因型-表型相关性分析，该分析涉及以参考号NM_004217公开的ARK2参考序列中第950位的C→T变异。所述的变异导致在ARK2蛋白的相应第298位的苏氨酸向甲硫氨酸(Thr→Met)的氨基酸改变。已经已知ARK2基因的不同SNP遗传变体(单核苷酸多态性)，并且公开在网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi？locusld＝9212；http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/genesnpview？db＝&gene＝ENSG00000178999。
令人惊讶的发现，在编码人ARK2蛋白的核酸中第950位的从胞嘧啶向胸腺嘧啶核苷的变异，或者在ARK2蛋白第298位从苏氨酸向甲硫氨酸的相应的变异与心血管疾病的发生相关。
因此，本发明的一个主题涉及体外或者体内诊断心血管疾病，其中确定个体或者患者样品中编码人ARK2蛋白的核酸第950位的核苷酸或者人ARK2蛋白第289位的氨基酸。
在本发明的优选的实施方案中，心血管疾病是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件。
具体地，如果第950位的核苷酸在染色体DNA上被确定为胸腺嘧啶核苷，或者在mRNA上被确定为尿嘧啶，或者在第298位的氨基酸被确定为甲硫氨酸，则存在患高血压和/或狭窄的更高的风险。
根据本发明，术语“ARK2-C950C”指这样的一群个体，所述个体编码ARK2的基因的两个等位基因上，位于参考序列NM_004217第950位的核苷都是胞苷，该胞苷导致在相应的蛋白质第298位的氨基酸为苏氨酸。就此ARK2变体而言，这些个体是纯合的。因此，术语“ARK2-C950T”指这样的一群个体，所述个体在编码ARK2的基因的一个等位基因上具有胞苷(该胞苷导致在相应的蛋白质第298位的氨基酸是苏氨酸)，并且在编码ARK2的基因的另一个等位基因上具有胸腺嘧啶核苷(其导致在相应的蛋白质第298位的氨基酸是甲硫氨酸)。就此ARK2变体而言，这些个体是杂合的。根据本发明，术语“ARK2-T950T”指这样的一群个体，其中所述个体编码ARK2的基因的两个等位基因上，位于参考序列NM_004217第950位的核苷都是胸腺嘧啶核苷，该胸腺嘧啶核苷导致在相应的蛋白质第298位的氨基酸为甲硫氨酸。就此ARK2变体而言，这些个体是纯合的。
编码人ARK2蛋白的参考序列的核酸序列优选具有SEQ ID NO：1的核酸序列，并且人ARK2蛋白的氨基酸序列优选具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。然而，本发明还包括人ARK2的其他变体以及其非人的同系物，例如其他的哺乳动物ARK2同系物或者果蝇、秀丽隐杆线虫(Caenorhabdidis elegans)、小鼠或者大鼠的ARK2同系物，条件是在相应于所述的参考序列第950位的位置上存在胞苷向胸腺嘧啶核苷的核苷酸转变，和/或在相应于所述的参考序列第298位的位置上存在苏氨酸向甲硫氨酸的氨基酸转变，并且相应的蛋白质具有丝氨酸苏氨酸激酶活性。所述的酶活性可以通过本领域技术人员已知的激酶检测方法和/或本发明说明书中描述的方法进行检测。
一般地，在第950位的具体核苷酸可以通过核酸测序方法、核酸质谱分析、杂交方法和/或扩增方法进行确定。核酸测序方法的实例是焦磷酸测序(pyrosequencing)和/或使用放射性和/或荧光标记的核苷酸的测序。杂交方法的实例是Southern blot分析、Northern blot分析和/或基于DNA微阵列的杂交方法。扩增方法的实例是TaqMan分析，差异RNA展示分析和/或代表性差异分析(Shi M.M.(2002)Am J Pharmacogenomics.，2(3)，197-205；Kozian & Kirschbaum(1999)，Trends Biotechnol.，17(2)，73-8.)。
另外，在第298位的氨基酸序列可以通过检测特定蛋白质的量的方法确定和/或通过检测特定蛋白质的活性的方法确定。检测特定蛋白质的量的方法的实例是Western blot分析和/或ELISA。检测特定蛋白质的活性的实例是体外试验方法和/或使用人细胞、动物细胞、细菌细胞或者酵母菌细胞的体外全细胞试验方法，所有的方法对于本领域技术人员而言都是已知的和/或在本发明中被描述。
用于检测相应变体的样品的实例是细胞、组织或者体液，尤其是血液的细胞组分、内皮细胞或者平滑肌细胞。优选通过本领域技术人员已知的常规方法预处理样品，以分离和/或纯化样品中的核酸或者染色体DNA或者蛋白质用于进一步分析。
在一个任选的额外步骤中，个体罹患心血管疾病的风险可以如实施例中显示的进行确定。
在另一个任选的额外步骤中，选择合适的药物或者确定药物的剂量。
一般地，可以根据本发明将在ARK2基因中发现的遗传变异作为遗传标记，用于心血管疾病(也称为“冠心病”)(尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件)的个体的风险评估、遗传表征或分类和/或预防性治疗。
另外，根据本发明，该遗传变异可以作为遗传标记，用于适应性调整用于治疗个人或患者(在下文中也称为“个体”)的有效治疗剂的剂量或者一般性地增加其有效性，和/或用于鉴定具有增加的心血管疾病(尤其为高血压和/或狭窄)风险的正在或者被选择将要进行临床实验研究的个体。根据本发明，该遗传变异还可以被用于评估药物活性物质针对具体个体的耐受性、安全性和有效性，或者用于鉴定适宜于所述疾病的特定治疗的个体。
本发明还可以被用于针对待接受治疗或者建议的每个个体鉴定所述疾病的风险因素。
一般地，合适的个体是(i)没有显示出心血管疾病的症状的个体，(ii)已经被检测出有发展为心血管疾病的风险，但是还没有显示出疾病症状的个体，(iii)之前被诊断为罹患心血管疾病的个体。
根据本发明，一个优选的诊断心血管疾病的方法包括下述步骤：
(a)任选地，从待检查的个体或者患者获得样品，尤其是细胞、组织、体液、血液的细胞组分、内皮细胞或平滑肌细胞；
(b)从样品分离核酸探针，尤其是DNA探针；
(c)使用引物(尤其如在实施例中所述的引物)扩增包括ARK2基因第950位的特定区域；
(d)对扩增区域测序；
(e)分析测序的区域；
(f)评估心血管疾病的风险，特别是评估高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件的风险。
根据本发明，诊断心血管疾病的一个备选方法包括下述步骤：
(a)任选地，从待检查的个体或者患者获得样品，尤其是细胞、组织、体液、血液的细胞组分、内皮细胞或平滑肌细胞；
(b)从样品分离ARK2蛋白；
(c)确定ARK2蛋白第298位的氨基酸；
(d)评估心血管疾病的风险，尤其是评估高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件的风险。
本发明一般地还涉及确定个体罹患心血管疾病的风险的方法，其中该方法包括下述步骤：
(a)体外或体内确定个体的ARK2基因的基因型，
(b)转换从(a)中获得的数据，以便预后所述个体发展为心血管疾病的风险，
其中检出ARK2 Met298Met变异指示着增加的发展为心血管疾病的风险，所述心血管疾病尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件。
本发明的另一个实施方案一般地涉及针对罹患心血管疾病的个体选择药物活性化合物或者确定药物活性化合物剂量的方法，所述心血管疾病尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件，或者涉及用于确定心血管疾病治疗性处理的有效性的方法，所述心血管疾病尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件，
其中该方法包括下述步骤：
(a)体外测定个体的ARK2基因的基因型，
(b)针对所述的个体选择药物活性化合物或者确定药物活性化合物的剂量，或者确定治疗性处理的有效性，
其中，针对具有ARK2 Met298Met变异的个体，选择药物活性化合物和/或确定药物活性化合物的剂量和/或治疗性处理有效性。
本发明的另一个实施方案一般地涉及鉴定具有增加的患心血管疾病的风险的个体的方法，其中该方法包括下述步骤：
(a)体外或者体内确定个体的ARK2基因的基因型，
(b)为了鉴定所述个体，将(a)中获得的数据进行转换，
其中检出ARK2 Met298Met变异指示着发展为心血管疾病的增加的风险，所述的心血管疾病尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法，尤其是通过本文公开的任何方法实现对ARK2基因的基因型的确定。
另外，根据本发明，本文公开的ARK2和/或ARK2变体可以被用于生产用于治疗心血管疾病的药物。因此，本发明的另外的实施方案涉及含有如SEQ ID NO：3的氨基酸序列的ARK2蛋白或者在第298位存在氨基酸变异的ARK2变体和/或相应的编码ARK2蛋白或其变体的核酸序列在生产用于治疗心血管疾病的药物中的用途，所述的心血管疾病尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件。特别地，变体是如SEQ ID NO：7的ARK2蛋白的Met298Met变体，或者如SEQ ID NO：6的ARK2核酸的T950T变体。具体地，本领域技术人员已知的和/或本文公开的激酶试验可以被用于鉴定ARK2蛋白和/或ARK2变体(尤其是ARK2-Met298Met变体)的调制剂，例如激活剂或抑制剂。
因此，根据本发明，本文公开的ARK2和/或ARK2变体也可以被用做高通量筛选方法的一部分，以检测和评估用于治疗所述疾病的药物活性化合物。因而，本发明的另外的实施方案涉及筛选用于治疗心血管疾病的药物活性剂的方法，其中该方法包括下述步骤：
(a)提供含有如SEQ ID NO：3的氨基酸序列的ARK2蛋白或者在第298位存在氨基酸变异的ARK2变体，和/或编码ARK2蛋白或其变体的相应的核酸，
(b)提供受试化合物，
(c)测量或检测该受试化合物对ARK2蛋白或者ARK2变体或者相应的核酸的影响，
(d)分离适于治疗心血管疾病的化合物，所述的心血管疾病尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件。
特别地，变体是如SEQ ID NO：7的ARK2蛋白的Met298Met变体，或者如SEQ ID NO：6的ARK2核酸的T950T变体。一般地，在例如试验系统中提供ARK2蛋白、ARK2变体或者编码ARK2蛋白或变体的核酸，使其直接或者间接地与受试化合物接触，受试化合物尤其为生化的或者化学的受试化合物，例如化学化合物文库形式的受试化合物。然后，测量或者检测受试化合物对ARK2蛋白或者编码ARK2蛋白的核酸的影响。之后，可以分析和/或分离合适的调制剂，例如激活剂或抑制剂。关于对化学化合物文库的筛选，优选使用本领域技术人员已知的或者是可以商售获得的高通量试验。
一般地，受试化合物对ARK2蛋白或者ARK2变体或者编码ARK2蛋白或变体的核酸的影响可以是化合物对蛋白质或者核酸或者对包括该蛋白质或者核酸的细胞产生的任何物理、化学或者表型影响，由此鉴定调节蛋白质或者核酸的化合物。在本发明中，优选测量或者检测受试化合物对如本文公开的ARK2蛋白或者ARK2变体的激酶活性的影响。
激酶试验的一般概念是待分析的激酶(这里是ARK2丝氨酸/苏氨酸激酶)与合适的含有丝氨酸或者苏氨酸残基的底物或者肽接触，其中所述残基在合适的缓冲液中在优选存在ATP的情况下，可以被激酶磷酸化。优选的底物是染料标记的底物，例如荧光染料标记的肽，例如荧光素标记的肽。丝氨酸/苏氨酸激酶试验可以商售获得，例如Applied Biosystems，Inc.，California，USA的HitHunterTM丝氨酸/苏氨酸激酶试验或者PierceBiotechnology，Inc.，Illinois，USA的IQTM丝氨酸/苏氨酸激酶试验。其他的激酶试验在下文中进一步详细描述。
根据本发明，术语“化学化合物文库”指多个化学化合物，其从任意的多种来源(包括化学合成分子和天然产物)汇集在一起而产生，或者其通过组合化学技术产生。
一般地，在多相的或者均相的试验中测量或者检测受试化合物对ARK2、ARK2变体或者编码ARK2蛋白或者变体的核酸的影响。本文中，多相试验是指包括一个或者多个洗涤步骤的试验，而在均相的试验中这种洗涤步骤是不必要的。仅仅混合试剂和化合物然后测量。
合适的功能试验可以基于ARK2的基因表达或者其丝氨酸/苏氨酸激酶活性。一般地，商售可获得的激酶试验系统可以定量地检测掺入底物中的磷酸的量。
多相试验例如是ELISA，DELFIA、SPA和flashplate试验。
基于ELISA(酶联免疫吸附试验)的试验由多家公司提供。该试验使用可以被激酶(例如ARK2)磷酸化的随机的肽。含有激酶的样品通常被稀释到含有例如ATP和必需的阳离子的反应缓冲液中，然后被加入到板的孔中。反应可以通过简单地移去混合物而终止。此后，洗涤板。所述反应可以例如通过添加生物素酰化的底物到激酶而起始。反应之后，加入特异的抗体。样品通常被转移到预封闭的蛋白质G板，并且在洗涤之后加入例如链霉抗生物素-HRP。之后，去除未结合的链霉抗生物素-HRP(辣根过氧化物酶)。通过添加过氧化物酶底物而起始过氧化物酶颜色反应，并且在合适的光密度计上测量光密度。
基于DELFIA(解离增强的镧系荧光免疫试验)的试验是固相试验。抗体经常使用铕或者其他的镧系元素标记，并且在洗去未结合的铕标记的抗体之后检测铕的荧光。
SPA(闪烁亲近试验)和flashplate试验通常使用生物素/抗生物素相互作用而捕获放射性标记的底物。通常反应混合物包括激酶、生物素酰化的肽底物和γ-[P33]ATP。反应之后，生物素酰化的肽被链霉抗生物素捕获。在SPA检测中，链霉抗生物素被结合在含有闪烁体的珠子上，而在flashplate检测中，链霉抗生物素被结合在含有闪烁体的微量培养板的孔的内部。一旦被固定，放射性标记的底物充分地接近闪烁体以刺激光发射。
备选的均相试验例如是TR-FRET、FP、ALPHA和基因试验。
基于TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)的试验通常使用铕与APC(修饰的别藻蓝蛋白)或具有重叠光谱的其他染料(例如Cy3/Cy5或Cy5/Cy7)之间的荧光共振能量转移(Schobel，U.等人，(1999)Bioconjugate Chem.10，1107-1114)。例如以337nm的光激发铕之后，分子发射620nm荧光。但是，如果此荧光团充分接近APC，铕将转移其激发能给APC，其在665nm发荧光。激酶底物通常是生物素标记的底物。激酶反应之后，铕标记的-(P)-特异性抗体与链霉抗生物素-APC被加入。磷酸化的肽使得铕标记的抗体与链霉抗生物素-APC密切接触。APC密切亲近铕荧光团将引起有利于APC发荧光的铕荧光淬灭(FRET)。
基于荧光偏振(FP)的试验是使用偏振光以激发溶液中的荧光底物肽的方法。这些荧光肽在溶液中是自由的并发生翻转的，引起发射光去偏振化。然而，当底物肽结合至较大的分子，例如(P)-Tyr时，其翻转速度被极大地降低，发射光保持高度的偏振性。对于激酶试验，通常存在两个选择：
(a)荧光磷酸肽示踪剂结合至(P)-特异性抗体。磷酸化产物将与荧光磷酸肽竞争和抗体结合，导致偏振性从强向弱的改变。
(b)磷酸化的底物肽结合至磷酸特异性抗体，导致偏振性从弱向强的改变。
基于ALPHA(放大发光亲近均相)的试验是依赖单线态氧在通过磷酸化的肽而接近的供体和受体珠之间的转移的试验。一旦在680nm激发，在供体珠中的光敏剂将周围的氧转变为单线态氧，其扩散最多200nm的距离。在受体珠中的化学发光基团将能量转移给珠内的荧光受体，其然后在大约600nm发射光。
基于EFC(酶片段互补)的试验或者等价的试验可以被尤其用于高通量筛选化合物。EFC试验是以工程化的β-半乳糖苷酶(由两个片段--酶受体(EA)和酶供体(ED)组成)为基础的。当将片段分开时，没有β-半乳糖苷酶活性，但是当这些片段在一起的时候，它们缔合(互补)以形成活性酶。EFC试验使用ED-分析物缀合物，其中该分析物可以被特异性结合蛋白质，例如抗体或者受体识别。在缺少特异性结合蛋白质时，ED-分析物缀合物能够与EA互补以形成活性的β-半乳糖苷酶，产生阳性发光信号。如果ED-分析物缀合物被特异性结合蛋白质结合，则与EA的互补被阻止，并且因此没有信号。如果(在样品中)提供游离的分析物，其将与ED-分析物缀合物竞争和特异性结合蛋白质的结合。游离的分析物将造成ED-分析物缀合物被释放以用于与EA互补，产生依赖于样品中存在的游离分析物的量的信号。
基因试验的另一个实例是功能试验，其中激酶的活性被转化为功能性的细胞反应，例如生长、生长抑制、分化或凋亡。对于这种类型的筛选，酵母是特别合适的模型系统。例如在ARK2酵母功能试验中，当在含有葡萄糖的培养基上培养时，例如ARK2酵母细胞象正常的酵母细胞一样生长。然而，当暴露于半乳糖时，诱导了ARK2在细胞内的表达，引起酵母细胞死亡。在这种情况下，抑制ARK2活性的化合物将防止细胞死亡。
另一个试验是基于固相结合的多肽(例如ARK2)和受试化合物造成的干扰作用。因此，受试化合物含有可检测的标记，例如上文已经解释的，可以将化合物放射性标记、荧光标记或者发光标记。另外，可以将化合物与允许间接检测的蛋白质偶联，所述间接检测例如通过使用过氧化物酶试验(其使用显色底物)的酶催化方式进行，或者通过结合可检测抗体的方式进行。另一个可行的方法是通过质谱(SELDI)研究固相结合的蛋白质复合物。对于例如本文公开的ARK2或者ARK2变体，例如可以通过该多肽内的内源性色氨酸残基的荧光改变，检测因与受试底物的相互作用而引起的构象改变。
固相结合的多肽也可以是阵列的一部分。使用固相化学和光不稳定保护基团制备这样的阵列的方法在例如US 5,744,305中公开。也可以使这些阵列与受试化合物或者化合物文库接触，并检测相互作用，例如结合或者构象改变。阵列的合适格式是目前用于初级和次级筛选的96-、384-或1,536格式。
本发明的另一个实施方案，使用全细胞实施该方法。通常生长在多孔板的底部的细胞被固定和透化处理，封闭和与例如抗目的底物的一级(P)-特异抗体孵育。然后，使用例如铕标记的或者HRP缀合的二抗联合特异的化学发光或者显色底物(例如如上文描述的)以产生信号。结合使用显微镜，不仅可以在单个细胞水平上定量(P)-特异抗体的量，还可以检测底物的磷酸化诱导的移位或者细胞的形态学改变。
本发明的方法方便地在自动化的系统中实现，该系统例如包括自动化的种板(plating)和自动化的液体转移系统，例如使用微流控技术(microfluidics)，即通道化结构。
在本发明的另一个实施方案中，该方法以高通量筛选系统的形式实现。在这样的系统中，筛选方法被方便地自动化和小型化，其尤其可以使用由机器人控制的小型化的孔和微流控技术。
鉴于上述的主题，本发明还涉及用于制备治疗心血管疾病的药物的方法，心血管疾病尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件，其中该方法包括下述步骤：
(a)实施如上文解释的筛选方法，
(b)以一种或者多种药学上可接受的载体或者辅助物质配制分离的化合物。
根据上述方法的步骤(b)，取决于施用方式，通常以一种或者多种药学上可接受的添加剂或者辅助物质配制所被检测到的受试化合物。所述添加剂或辅助物质为例如生理缓冲溶液(例如氯化钠溶液)、脱矿质水、稳定剂、ε-氨基己酸或胃蛋白酶抑制剂A或者螯合剂(例如EDTA)、凝胶形成剂，例如白凡士林、低黏性石蜡和/或黄蜡等等。
其它的合适的添加剂是，例如去污剂(例如Triton X-100或者脱氧胆酸钠)、还有多元醇类(例如聚乙二醇或者甘油)、糖(例如蔗糖或者葡萄糖)、兼性离子化合物(例如氨基酸，例如甘氨酸或者尤其是牛磺酸或者甜菜碱)和/或蛋白质(例如牛或人的血清白蛋白)。优选去污剂、多元醇和/或兼性离子化合物。
优选的生理缓冲溶液具有大约6.0-8.0的pH，特别是大约6.8-7.8的pH，尤其大约7.4的pH，和/或大约200-400毫渗透压摩尔/升的摩尔渗透压浓度，优选大约290-310毫渗透压摩尔/升的摩尔渗透压浓度。通常使用合适的有机或者无机缓冲液调整药物的pH，例如优选使用磷酸盐缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟乙基)哌嗪]-乙磺酸)或者MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙磺酸)。相应缓冲液的选择通常取决于所期望的缓冲液的体积摩尔浓度。例如磷酸盐缓冲液适合于注射和输注溶液。
药物可以使用常规的方式给药，例如通过口服剂型(例如片剂或者胶囊)、通过粘膜(例如鼻腔或者口腔)，以皮下植入的栓剂形式、通过含有本发明的药物的注射液、输注液或者凝胶。另外，治疗可以通过经皮治疗系统(TTS)而实现，其使得控制药物释放时间成为可能。TTS可以例如从EP 0 944 398 A1、EP 0 916 336 A1、EP 0 889 723 A1或者EP 0 852 493 A1已知。
如果仅仅是相对少量的溶液或者悬浮液向身体给药，例如大约1至大约20ml，则通常使用注射溶液。
如果施用较大量的溶液或者悬浮液，例如一升或者多于一升，则通常使用输注溶液。由于不同于输注溶液，在注射溶液的情况下仅仅给药几毫升，注射剂与血液或者组织液在pH和渗透压上的小的差异不会被注意到，或者仅仅会在疼痛感觉方面被轻微地注意到。因此，在使用之前稀释本发明的制剂通常是不必要的。然而在施用相对大量时，应在临给药之前，将本发明的制剂稀释到至少获得近似的等渗溶液的程度。等渗溶液的实例是0.9％浓度的氯化钠溶液。在输注的情况下，可以例如使用无菌水实现稀释，而给药可以通过例如所谓的通路(bypass)实现。
更优选的步骤在实施例中逐一地或者集中地说明，并且通过作为每个步骤的参考而并入此处。
下述的附图、表格、序列和实施例将用于解释本发明，而不限制本发明的范围。
附图说明
图1A显示具有NCBI号NM_004217的人ARK2基因的核酸序列。
图1B显示具有AC135178编号的ARK2的染色体核酸序列的部分。使用粗体和下划线标记出用于扩增相应于参考序列NM_004217第950位的具有遗传变异C→T的遗传部分的引物。
(ARK2-298R＝CCTGCAGGTGGACCTAAAGTTC；
ARK2-298F＝GCCTGAGCAGTTTGGAGATGAG)。
图2显示衍生自具有NCBI号NM_004217的核酸序列的人ARK2的氨基酸序列。ARK2蛋白第298位的氨基酸使用粗体和下划线标出。
图3显示人ARK2基因T950T变体的核酸序列。
图4显示人ARK2Met298Met变体的氨基酸序列。
序列描述
SEQ ID NO：1显示具有NCBI号NM_004217的人ARK2蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO：2显示具有AC135178编号的ARK2的染色体核酸序列的部分。
SEQ ID NO：3显示衍生自具有NCBI号NM_004217的核酸序列的人ARK2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4显示第一个引物序列ARK2-298R。
SEQ ID NO：5显示互补序列的第二个引物序列ARK2-298F。
SEQ ID NO：6显示人ARK2基因T950T变体的核酸序列。
SEQ ID NO：7显示人ARK2的Met298Met变体的氨基酸序列。
实施例
通过5′-核酸酶试验(TAQMAN TM )进行SNP检测
用于扩增的寡核苷酸(引物)：
下述引物用于检测在具有索引号NM_004217的ARK2序列中第950位的核苷酸从C向T的改变：
引物1：5′-GCCTGAGCAGTTTGGAGATGAG-3′(参考序列AC135178的核苷酸179605-179584；Fig.1B；SEQ ID NO：5)；
引物2：5′-CCTGCAGGTGGACCTAAAGTTC-3′(参考序列AC135178的核苷酸179532-179553的互补序列；Fig.1B；SEQ ID NO：4)。
用于扩增的PCR方法：
使用的试剂来自Applied Biosystems(Foster City，USA)。在Primus96plus热循环仪(MWG Biotech AG，Germany)上进行PCR反应，总体积为5μl，含2.5μl SuperHot-Master-Mix(Bioron GmbH，Germany)，0.125μl Assay-by-Design-Mix(Applied Biosystems，Austria)，0.375μl H2O和2μl DNA。使用15μl矿物油覆盖反应混合物。
PCR反应的扩增程序：
94℃，1min   x1循环
92℃，15sec  x45循环
60℃，1min   x1循环。
PCR产物的分析：
在VICTOR荧光板读数器(HVD Life Sciences，Austria)上检测荧光，针对FAM标记的探针(298Thr等位基因；ARK2-298M1(Thr)FAM-TCCCGTGGGCACG)，使用485nm/520nm的激发/发射过滤器，针对VIC标记的探针(298Met等位基因；ARK2-298V1(Met)VIC-CTCCCATGGGCACG)，使用530nm/572nm的激发/发射过滤器。数据以MS-Excel格式输出，并且使用散点图分析。
结果
人群的特征
表1显示所研究的人群的特征
  n   ％
 总数   2074
 性别   女性   603   29,07
  男性   1471   70,93
 年龄   61,8(+/-10,5)
 BMI(体重指数)   29,1(+/-4,4)
 血压   1214   58,7
 吸烟者   1372   66,41
  II型糖尿病   361   17,46
  心肌梗死   830   40,59
  中风   145   7,01
ARK2基因的变体的频率和分布
表2显示在研究的患者群中，ARK2基因在参考序列NM_004217的第950位的遗传变体的频率和分布。
表2
  频率   百分比
  ARK2-T950T(ARK2Met298Met) 21 1,46
  ARK2-C950T(ARK2 Thr298Met) 290 20,18
  ARK2-C950CARK2Thr298Thr) 1126 78,36
ARK2的Thr298Met变体的影响
表3显示ARK2的Thr298Met变体在研究的患者群中对高血压、冠心病(具有＞20％的狭窄)的发生、多于1次的心肌梗死和中风/TIA/PRIND(TIA＝短暂性局部缺血发作；PRIND＝长期的可逆性局部缺血性神经障碍)的发生率的影响。P值小于0.05被认为是统计学相关的。
表3
  ARK2-T950TMet298Met   ARK2-C950TThr298Met   ARK2-C950CThr298Thr   p值   调整的P值
  高血压   16(76.19％)   184(63.45％)   618(54.88％)   0.0063
  冠心病   17(85.00％)   238(82.93％)   859(77.81％)   0.0286
  ＞1次心肌梗死   3(14.29％)   28(9.66％)   66(5.86％)   0.0464
  中风/TIA/PRIND   6(28.57％)   17(5.86％)   83(7.37％)   0.0006
结果
相比较于在第950位具有不同的ARK2基因型的患者，具有ARK2-T950T的患者显示出统计学上更高的高血压和冠心病的发病率以及多于1次的心肌梗死和中风/TIA/PRIND的发病率。
结论
上述的编码ARK2的基因和/或ARK2蛋白的遗传变体之间的统计学显著相关性清楚地指明所述的遗传变体涉及心血管疾病的发生，所述心血管疾病尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或血栓形成事件。因此，所述的遗传变体是例如心血管疾病(尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或血栓形成事件)预后的生物学标记。基于本发现的另外的本发明实施方案在说明书中更详细的描述。
序列表
SEQ ID NO：1
   1 ggccgggaga gtagcagtgc cttggacccc agctctcctc cccctttctc tctaaggatg
  61 gcccagaagg agaactccta cccctggccc tacggccgac agacggctcc atctggcctg
 121 agcaccctgc cccagcgagt cctccggaaa gagcctgtca ccccatctgc acttgtcctc
 181 atgagccgct ccaatgtcca gcccacagct gcccctggcc agaaggtgat ggagaatagc
 241 agtgggacac ccgacatctt aacgcggcac ttcacaattg atgactttga gattgggcgt
 301 cctctgggca aaggcaagtt tggaaacgtg tacttggctc gggagaagaa aagccatttc
 361 atcgtggcgc tcaaggtcct cttcaagtcc cagatagaga aggagggcgt ggagcatcag
 421 ctgcgcagag agatcgaaat ccaggcccac ctgcaccatc ccaacatcct gcgtctctac
 481 aactattttt atgaccggag gaggatctac ttgattctag agtatgcccc ccgcggggag
 541 ctctacaagg agctgcagaa gagctgcaca tttgacgagc agcgaacagc cacgatcatg
 601 gaggagttgg cagatgctct aatgtactgc catgggaaga aggtgattca cagagacata
 661 aagccagaaa atctgctctt agggctcaag ggagagctga agattgctga cttcggctgg
 721 tctgtgcatg cgccctccct gaggaggaag acaatgtgtg gcaccctgga ctacctgccc
 781 ccagagatga ttgaggggcg catgcacaat gagaaggtgg atctgtggtg cattggagtg
 841 ctttgctatg agctgctggt ggggaaccca ccctttgaga gtgcatcaca caacgagacc
 901 tatcgccgca tcgtcaaggt ggacctaaag ttccccgctt ctgtgcccac gggagcccag
 961 gacctcatct ccaaactgct caggcataac ccctcggaac ggctgcccct ggcccaggtc
1021 tcagcccacc cttgggtccg ggccaactct cggagggtgc tgcctccctc tgcccttcaa
1081 tctgtcgcct gatggtccct gtcattcact cgggtgcgtg tgtttgtatg tctgtgtatg
1141 tataggggaa agaagggatc cctaactgtt cccttatctg ttttctacct cctcctttgt
1201 ttaataaagg ctgaagcttt ttgt
SEQ ID NO：2
179461 TCCAAACAGA ATGGGTAGTC AAGGAAGATG TAGCCAGGGT GAAACTAATG CAGCCCTTCC
179521 ATCTCTTCAC ACCTGCAGGT GGACCTAAAG TTCCCCGCTT CCGTGCCCAT GGGAGCCCAG
179581 GACCTCATCT CCAAACTGCT CAGGCATAAC CCCTCGGAAC GGCTGCCCCT GGCCCAGGTC
179641 TCAGCCCACC CTTGGGTCCG GGCCAACTCT CGGAGGGTGC TGCCTCCCTC TGCCCTTCAA
SEQ ID NO：3
MAQKENSYPWPYGRQTAPSGLSTLPQRVLRKEPVTPSALVLMSRSNVQPTAAPGQKV
MENSSGTPDILTRHFTIDDFEIGRPLGKGKFGNVYLAREKKSHFIVALKVLFKSQIE
KEGVEHQLRREIEIQAHLHHPNILRLYNYFYDRRRIYLILEYAPRGELYKELQKSCT
FDEQRTATIMEELADALMYCHGKKVIHRDIKPENLLLGLKGELKIADFGWSVHAPSL
RRKTMCGTLDYLPPEMIEGRMHNEKVDLWCIGVLCYELLVGNPPFESASHNETYRRI
VKVDLKFPASVPTGAQDLISKLLRHNPSERLPLAQVSAHPWVRANSRRVLPPSALQS
VA
SEQ ID NO：4
1 CCTGCAGGTGGACCTAAAGTTC
SEQ ID NO：5
1 GCCTGAGCAGTTTGGAGATGAG
SEQ ID NO：6
   1 ggccgggaga gtagcagtgc cttggacccc agctctcctc cccctttctc tctaaggatg
  61 gcccagaagg agaactccta cccctggccc tacggccgac agacggctcc atctggcctg
 121 agcaccctgc cccagcgagt cctccggaaa gagcctgtca ccccatctgc acttgtcctc
 181 atgagccgct ccaatgtcca gcccacagct gcccctggcc agaaggtgat ggagaatagc
 241 agtgggacac ccgacatctt aacgcggcac ttcacaattg atgactttga gattgggcgt
 301 cctctgggca aaggcaagtt tggaaacgtg tacttggctc gggagaagaa aagccatttc
 361 atcgtggcgc tcaaggtcct cttcaagtcc cagatagaga aggagggcgt ggagcatcag
 421 ctgcgcagag agatcgaaat ccaggcccac ctgcaccatc ccaacatcct gcgtctctac
 481 aactattttt atgaccggag gaggatctac ttgattctag agtatgcccc ccgcggggag
 541 ctctacaagg agctgcagaa gagctgcaca tttgacgagc agcgaacagc cacgatcatg
 601 gaggagttgg cagatgctct aatgtactgc catgggaaga aggtgattca cagagacata
 661 aagccagaaa atctgctctt agggctcaag ggagagctga agattgctga cttcggctgg
 721 tctgtgcatg cgccctccct gaggaggaag acaatgtgtg gcaccctgga ctacctgccc
 781 ccagagatga ttgaggggcg catgcacaat gagaaggtgg atctgtggtg cattggagtg
 841 ctttgctatg agctgctggt ggggaaccca ccctttgaga gtgcatcaca caacgagacc
 901 tatcgccgca tcgtcaaggt ggacctaaag ttccccgctt ctgtgcccat gggagcccag
 961 gacctcatct ccaaactgct caggcataac ccctcggaac ggctgcccct ggcccaggtc
1021 tcagcccacc cttgggtccg ggccaactct cggagggtgc tgcctccctc tgcccttcaa
1081 tctgtcgcct gatggtccct gtcattcact cgggtgcgtg tgtttgtatg tctgtgtatg
1141 tataggggaa agaagggatc cctaactgtt cccttatctg ttttctacct cctcctttgt
1201 ttaataaagg ctgaagcttt ttgt
SEQ ID NO：7
MAQKENSYPWPYGRQTAPSGLSTLPQRVLRKEPVTPSALVLMSRSNVQPTAAPGQKV
MENSSGTPDILTRHFTIDDFEIGRPLGKGKFGNVYLAREKKSHFIVALKVLFKSQIE
KEGVEHQLRREIEIQAHLHHPNILRLYNYFYDRRRIYLILEYAPRGELYKELQKSCT
FDEQRTATIMEELADALMYCHGKKVIHRDIKPENLLLGLKGELKIADFGWSVHAPSL
RRKTMCGTLDYLPPEMIEGRMHNEKVDLWCIGVLCYELLVGNPPFESASHNETYRRI
VKVDLKFPASVPMGAQDLISKLLRHNPSERLPLAQVSAHPWVRANSRRVLPPSALQS
VA

Claims (36)

1.体外诊断心血管疾病的方法，其中确定个体样品中编码人ARK2蛋白的核酸第950位的核苷酸或者人ARK2蛋白第298位的氨基酸。
2.如权利要求1的方法，其中心血管疾病是高血压、狭窄、血管阻塞和/或血栓形成事件。
3.如权利要求1或2的方法，其中第950位的核苷酸在染色体DNA中被确定为胸腺嘧啶核苷，或者在mRNA中被确定为尿嘧啶，或者第298位的氨基酸被确定为甲硫氨酸。
4.如权利要求1-3中任一项的方法，其中编码人ARK2蛋白的核酸具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列。
5.如权利要求1-3中任一项的方法，其中人ARK2蛋白具有SEQ IDNO：7的氨基酸序列。
6.如权利要求1-4中任一项的方法，其中在第950位的核苷酸由选自核酸测序方法、核酸的质谱分析、杂交方法和/或扩增方法的方法确定。
7.如权利要求6的方法，其中核酸测序方法选自焦磷酸测序和/或在放射性和/或荧光标记的核苷酸的协助下的测序。
8.如权利要求6的方法，其中杂交方法选自Southern blot分析、Northern blot分析和/或基于DNA微阵列的杂交方法。
9.如权利要求6的方法，其中扩增方法选自TaqMan分析，差异RNA展示分析和/或代表性差异分析。
10.如权利要求1-3和5中任一项的方法，其中第298位的氨基酸序列由检测特定蛋白质的量的方法和/或检测特定蛋白质的活性，优选丝氨酸/苏氨酸激酶活性的方法确定。
11.如权利要求10的方法，其中特定蛋白质的量由选自western blot分析和/或ELISA的方法检测。
12.如权利要求10的方法，其中特定蛋白质的活性由体外试验和/或使用人细胞、动物细胞、细菌细胞或者酵母细胞的体外全细胞试验检测。
13.如权利要求1-12中任一项的方法，其中样品选自细胞、组织和/或体液。
14.如权利要求1-13中任一项的方法，其中在一个另外的步骤中确定个体罹患心血管疾病的风险。
15.如权利要求1-13中任一项的方法，其中在一个另外的步骤中选择合适的药物或者确定药物的剂量。
16.如权利要求1-15中任一项的方法，包括下述步骤：
(a)任选地，从待检查的个体获得样品；
(b)从样品分离核酸探针，尤其是DNA探针；
(c)在引物协助下扩增包括ARK2基因第950位的特定区域；
(d)对扩增的区域进行测序；
(e)分析测序的区域
(f)评估心血管疾病，尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的风险。
17.如权利要求16的方法，其中引物选自SEQ ID NO：4和/或SEQ IDNO：5。
18.如权利要求1-4、6-9或13-15中任一项的方法，包括下述步骤：
(a)任选地，从待检查的个体或者患者获得样品，特别是细胞、组织、体液、血液的细胞组分、内皮细胞或者平滑肌细胞；
(b)从样品分离ARK2蛋白；
(c)确定ARK2蛋白第298位的氨基酸；
(d)评估心血管疾病，尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的风险。
19.确定个体罹患心血管疾病的风险的方法，其中该方法包括下述步骤：
(a)体外确定个体的ARK2基因的基因型，
(b)转换(a)中获得的数据，以对所述个体发展为心血管疾病的风险进行预后，
其中ARK2 Met298Met变异的检出指示着发展为心血管疾病，尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的风险增加。
20.用于针对罹患心血管疾病，尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的个体选择药物活性化合物或者确定药物活性化合物剂量，或者用于确定心血管疾病，尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的治疗性处理的有效性的方法，其中该方法包括下述步骤：
(a)体外确定个体ARK2基因的基因型，
(b)针对所述的个体选择药物活性化合物或者确定药物活性化合物的剂量，或者确定治疗性处理的有效性，
其中针对具有ARK2 Met298Met变异的个体选择药物活性化合物和/或确定药物活性化合物的剂量和/或确定治疗性处理的有效性。
21.用于鉴定具有增加的罹患心血管疾病的风险的个体的方法，其中该方法包括下述步骤：
(a)体外确定个体的ARK2基因的基因型，
(b)转换(a)中获得的数据，以便鉴定该个体，
其中ARK2 Met298Met变异的检出指示着发展为心血管疾病，尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的风险增加。
22.含有如SEQ ID NO：3的氨基酸序列的ARK2蛋白质或者在氨基酸第298位具有变异的ARK2变体和/或编码所述ARK2蛋白或者其变体的相应核酸序列在生产用于治疗心血管疾病，尤其是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其它血栓形成事件的药物中的用途。
23.如权利要求22的用途，其中该变体是如SEQ ID NO：7的ARK2蛋白的Met298Met变体，或者如SEQ ID NO：6的ARK2核酸的T950T变体。
24.筛选用于治疗心血管疾病的药物活性剂的方法，其中该方法包括下述步骤：
(a)提供含有如SEQ ID NO：7的氨基酸序列的ARK2蛋白、在氨基酸第298位具有变异的ARK2变体和/或编码所述ARK2蛋白或其变体的相应核酸，
(b)提供受试化合物，
(c)测量或检测该受试化合物对ARK2蛋白或者ARK2变体或者对相应的核酸的影响，
(d)分离适于治疗心血管疾病，特别是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其它血栓形成事件的化合物。
25.如权利要求24的方法，其中该变体是如SEQ ID NO：7的ARK2蛋白的Met298Met变体，或者是如SEQ ID NO：6的ARK2核酸的T950T变体。
26.如权利要求24或25的方法，其中该受试化合物以化学化合物文库的形式提供。
27.如权利要求24-26中任一项的方法，其中在多相或者均相试验中测量或者检测该受试化合物对ARK2蛋白或者ARK2变体或者相应的核酸的影响。
28.如权利要求27的方法，其中多相试验是ELISA(酶联免疫吸附试验)、DELFIA(解离增强镧系荧光免疫试验)、SPA(闪烁亲近试验)或flashplate试验。
29.如权利要求27的方法，其中均相试验是TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)试验、FP(荧光偏振)试验、ALPHA(放大发光亲近均相试验)、EFC(酶片段互补)试验或者基因分析试验。
30.如权利要求24-29中任一项的方法，其中该方法在阵列上实施。
31.如权利要求24-30的方法，其中该方法使用全细胞实施。
32.如权利要求24-31中任一项的方法，其中该方法在自动化系统中实施。
33.如权利要求24-32中任一项的方法，其中该方法使用微流控技术实施。
34.如权利要求24-33中任一项的方法，其中该方法是高通量筛选方法。
35.用于生产治疗心血管疾病，特别是高血压、狭窄、血管阻塞和/或其它血栓形成事件的药物的方法，其中该方法包括下述步骤：
(a)实施如权利要求24-34中任一项的方法，
(b)用一种或者多种药学上可接受的载体或者辅助物质配制分离的化合物。
36.如权利要求1-35中任一项的方法或者如说明书，包括实施例中描述的任何主题。
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