CN101324583A - 氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法 - Google Patents

氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101324583A
CN101324583A CNA2007100233571A CN200710023357A CN101324583A CN 101324583 A CN101324583 A CN 101324583A CN A2007100233571 A CNA2007100233571 A CN A2007100233571A CN 200710023357 A CN200710023357 A CN 200710023357A CN 101324583 A CN101324583 A CN 101324583A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
reagent
oxidase
nad
coenzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007100233571A
Other languages
English (en)
Inventor
王尔中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Original Assignee
Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou ANJ Biotech Co Ltd filed Critical Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority to CNA2007100233571A priority Critical patent/CN101324583A/zh
Publication of CN101324583A publication Critical patent/CN101324583A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨基酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨基酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。

Description

氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种氨基酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨基酸浓度的方法，属于医学/食品/工业/农业/环境检验测定技术领域。
背景技术
氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测定项目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析仪)、分光光度计等方法，这些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、或仪器设备成本较高等缺点。
氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来说，多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。
大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎缩、肝功能衰竭、R e y e综合征、或某些因素造成蛋白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中氨基酸氮增加。
酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特异性高、方法简便、成本低的特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨基酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨基酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明氨基酸浓度测定方法原理如下：
氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+
过氧化氢
过氧化氢+辅酶NAD(P)H氧化酶还原型辅酶+氧
这种方法应用氨基酸氧化酶(amino acid oxidase；EC 1.4.3.2；EC1.4.3.3)偶联NAD(P)H氧化酶(NADPH oxidase；EC 1.6.3.1)酶促反应速率比色法/终点法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合NAD(P)H氧化酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算氨基酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨基酸诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液         100mmol/L
稳定剂         500mmol/L
辅酶           3mmol/L
氨基酸氧化酶   10000U/L
NAD(P)H氧化酶  12000U/L
本发明的氨基酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。
辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶。
辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨基酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液   100mmol/L
稳定剂                          500mmol/L
辅酶                            3mmol/L
氨基酸氧化酶                    10000U/L
NAD(P)H氧化酶                   12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。
实施例二
本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
辅酶                             3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
氨基酸氧化酶                     10000U/L
NAD(P)H氧化酶                    12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
辅酶                             3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
NAD(P)H氧化酶                    12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
氨基酸氧化酶                     10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定氨基酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。

Claims (6)

1.一种酶比色法及酶联法的氨基酸的浓度测定方法，其方法原理如下：
氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨离子+
                                   过氧化氢
过氧化氢+辅酶NAD(P)H氧化酶还原型辅酶+氧
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出氨基酸的浓度大小测定结果。
2.一种氨基酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液           20-500mmol/L
稳定剂           1-4000mmol/L
辅酶             1-6mmol/L
氨基酸氧化酶     1000-80000U/L
NAD(P)H氧化酶    1000-80000U/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成。辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶组成。辅酶、氨基酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
CNA2007100233571A 2007-06-13 2007-06-13 氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法 Pending CN101324583A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2007100233571A CN101324583A (zh) 2007-06-13 2007-06-13 氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2007100233571A CN101324583A (zh) 2007-06-13 2007-06-13 氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101324583A true CN101324583A (zh) 2008-12-17

Family

ID=40188206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007100233571A Pending CN101324583A (zh) 2007-06-13 2007-06-13 氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101324583A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101750327A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101324583A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法
CN101762486A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101750315A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101750349A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101762532A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸浓度测定方法
CN101762492A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸浓度测定方法
CN101324584A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸浓度测定方法
CN101750320A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101750358A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸浓度测定方法
CN101750333A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101324586A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸浓度测定方法
CN101762494A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101750289A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸浓度测定方法
CN101750319A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101324585A (zh) 氨基酸(氮)诊断/测定试剂盒及氨基酸(氮)浓度测定方法
CN101762502A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101750292A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101762533A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101750296A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101762485A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101750285A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101750291A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101750322A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN101762503A (zh) 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸浓度测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20081217

RJ01 Rejection of invention patent application after publication