CN101283277B - 用于测定分析物-酶复合物或者分析物-酶轭合物浓度、特别是电化学检测分析物用的方法和装置，以及附属测量装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种跟踪氧化还原活性物质浓度变化的方法，其中将适当的还原过程或氧化过程电势施加于测量装置的工作电极上。本发明的特征在于，工作电极的电势是脉冲调制的，而且交替产生测量相与驰豫相，测量相和驰豫相的脉冲宽度以适当方式确定。用电化学方法强制浓度梯度迅速弛豫，以使测量可在简单的转换器阵列上进行。实施该方法所用装置的特征是，除了相宜的恒电势器之外，该装置还包括转换器阵列(100、200)。所述转换器阵列(100、200)可由平面金属基体(1)构成，在该基体上置有至少一种柔性绝缘体(2)，金属表面与绝缘体表面坚固连结。所述转换器阵列(200)也可包括硅基CMOS结构。

Description

用于测定分析物-酶复合物或者分析物-酶轭合物浓度、特别是电化学检测分析物用的方法和装置,以及附属测量装置

本发明涉及一种测定分析物-酶复合物或者分析物-酶轭合物浓度用的方法和装置，特别是电化学检测分析物用的方法和装置。在这样一种方法中，底物经酶水解裂解而转化成报道分子，报道分子的浓度或浓度变化在静止电解液中用基于报道分子在同一贵金属电极上的氧化和还原的电流测量的测量方法来测定。此外，本发明还涉及一种用电化学转换器阵列来实施所述测量方法的附设测量装置。

采用所谓的生物传感器来测定血、水、空气或者食品中抗体、抗原或DNA。生物传感器基于分析物与俘获分子的特异结合，例如抗体与抗原的特异结合，或者DNA序列与互补的DNA俘获序列的特异结合。这种结合事件常用光学方法进行检测。在此情况下，将荧光染料引入分析物，例如在进行DNA分析时经PCR引入，并随后在带有不同俘获序列的位置上读出。然而，这样的光学装置价格昂贵，而且操作复杂。必需的仪器易损坏，而且不适用于实地试验。

在此场合下，适宜的其他途径是电化学生物传感器。此时，检测通过转化一种电化学物质来进行。电化学检测是普遍的，例如在葡萄糖传感器中。氧化还原酶即葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化，同时将存在的氧还原。然后，将所产生的过氧化氢又电化学氧化，并如此地用电流测定法来测定葡萄糖浓度。在对这些葡萄糖传感器的改进中，传递质替代了氧。在葡萄糖被氧化还原酶氧化的过程中，传递质如1，1-二甲基二茂铁同时被还原。在此情况下，对于以测电流法测定葡萄糖浓度而言，酶所还原的传递质的电化学氧化能以低得多的电势来进行，因此测量变得更精确，而且不易受干扰。由于这个原因，研制出了许多脉冲电流测量法，这些脉冲电流测量法不测定氧化还原传递质的总量，而是仅仅测定先前被酶所还原的量。

然而，对结合事件进行电化学检测时，必须尽可能灵敏地测定氧化还原活性物质的绝对量。分析物在传感器位置上存在的实际标记物是酶本身。例如就DNA分析而言，在PCR时，生物素标记物附于分析物上。在生物传感器上，不同DNA俘获序列结合在不同的传感器位置上。分析物仅在匹配的序列上杂交，而未结合的分析物被洗掉。为了检测这种结合情况，于是将链霉抗生物素-酶如碱性磷酸酶结合在生物素-标志分子上。如果添加酶底物如磷酸对氨基苯酯，则只在分析物已结合于其上的各传感器位置上，因磷酸盐水解而释出对氨基酚。磷酸对氨基苯酯用作碱性磷酸酶的底物，在CLIN.CHEM.36/11，第1941-1944页(1990)中作了介绍，文中记叙了一种基于珠子(Bead)的免疫测定。是否分析物已在珠子固定的抗体上结合，在此情况下也通过碱性磷酸酶来揭示。将珠子同磷酸对氨基苯酯一起保温，然后在流动-注射-分析系统中对上清液进行磷酸对氨基苯酯检查。在此情况下，该溶液流过电化学传感器，传感器的工作电极恒定极化在约+0.1V(对Ag/AgCl-参比电极)。在流动电解液或者试样体积中进行测量具有的优点是，在电极前面不发生值得一提的对氨基酚贫化。这是流动不断补充之故。然而，这样一种装置是与微型装置不兼容的。电化学传感器每次只能读出一种样品，而且所需体积也大。

如果打算使用带有不同俘获体(capturers)——无论DNA-俘获序列还是抗体——的传感器阵列，则必须在静止的电解液中进行电化学检测，因而各传感器只检测直接在传感器上所固定俘获体的信号。对氨基酚浓度上升表明酶的存在。工作电极电势恒定的简单电化学传感器对此不适用。由于酶产物的转化不断进行，酶产物被消耗。因此，测量本身引起的浓度减小会与酶活性所致的浓度升高叠加。

为了回避这个问题，US 6682648B 1中建议使用交叉指形电极阵列(interdigital elektrode arrays)。每个传感器由两个交叉电极组成。用一种双恒电势仪使两个电极中的一者正极化，而使另一者负极化。对氨基酚首先在电极上氧化，并因此被耗尽。如果它现在能向第二电极扩散，则在那里又被还原，并可再次供测量之用。

后一种氧化还原循环体系的前提则是，两电极的间距离要非常小，然而这使得电极间对氨基酚和氧化产物醌亚胺通过扩散进行的输送很快进行充分，关于这请参阅出版物K.Aoki，J.Electroanal.Chem，270(1989)，第35页。在上述的US 6682648 B1中，建议为此建议使用结构尺寸小于1μm的交叉电极。由此产生的结果是，制造具有这种交叉电极的生物传感器列阵既复杂又昂贵。

DE 4335241A1、DE 31731A1、DE 19717809U 1和DE 19917052A1中提供了关于测量的其他信息，特别在液体中测量也或生物化学测量。具有可行电极布置的氧化还原循环电化学测量方法，在WO 01/67587A1中已予详细记叙。

根据最接近的现有技术，本发明所要解决的技术问题是，提供一种方法或装置，用此方法或装置有可能在直径≥30μm，优选≥50μm的平面电极列阵上，以μM量级测定氧化还原活性物质的浓度。在此情况下，该装置不应当是对流的，也即电极和溶液均不搅拌或者运动，而且测量频率＞1Hz。还有一个目的是提供相关的测量仪器。

在本说明书起始部分所提及的那类方法的情况下，按本发明，该所要解决的技术问题用权利要求1中的措施来解决。附设装置在权利要求17中作了说明，具体的测量装置在权利要求23中作了说明。本发明方法、相关的装置和相关测量装置的改进，是各从属权利要求的主题。

本发明建议，应对工作电极的电势加脉冲，这在另外的情况下早已建议过。此外，在本发明中，况且只建立交替的测量相和驰豫相，测量相脉冲宽度选择得能使临近测量相终点的电容电流小于法拉第电流，并且驰豫相脉冲宽度选择得能使临近脉冲终点的浓度梯度驰豫，以便下一个测量相开始时，氧化还原活性酶产物的浓度变化——测量本身引起的酶产物消耗所致——最大程度地减弱。因此，在测量相终点测得的电流产生一个显著的测量信号，该信号不能预料是‘先验的’。

按照本发明，浓度以及特别是酶产物浓度变化的快速测量，在分子生物学检测系统中，借助酶产生的氧化还原活性物质在固定于芯片组(chipband)上诸空洞(caverns)中的各工作电极上，经施加周期脉冲而发生的电化学氧化还原反应来进行，其中在双电层重新分布衰减之后，所测得的电流产生测量信号。

本发明的基础是发现了，采用适合测定氧化还原活性物质浓度的测量方法，可方便地在直径数量级为数百μm至1cm的电极上进行测量。特别是，结构复杂的交叉电极不再必需。从现在开始，甚至可以使用价格便宜的转换器阵列，举例来说，例如以本申请人名义申请的未公开德国专利申请AZ.102004004654.9-52中详细记叙的那些。

在相关的测量装置中，测量部分的结构比氧化还原循环简化得不需要双恒电势仪。简单的恒电势仪与脉冲发生器结合就足够了。

在本发明中，像在已知的氧化还原循环中那样，不建立静止状态，而浓度梯度的快速驰豫则用电化学方法诱发。为此，对工作电极的电势加脉冲。产生了一层扩散层，其厚度在测量周期终点达到最大值，该值因测量相长度而异。驰豫相期间建立了足够的还原电势，供测量氧化电流之用。测量相期间氧化并仍存在于电极前面的各种物质，再次被还原，浓度梯度消除，并因此扩散层也消除。

因此，代替像在氧化还原循环中那样建立恒定扩散层厚度，在本发明的“强制驰豫电流测定法(Forced Relaxation Amperometry)”中，扩散层暂时建立并再次消除。在这两种情况下，都借此建立了一个至少局限于其最大值之内的扩散层厚度。如果意欲观察还原情况，则须在测量相期间建立还原电势并在驰豫相内建立相应氧化电势。

本发明的其他细节和优点，可参照附图并相结合权利要求书，由下面各实施例的附图说明得知。

图1至图4图解示出了用于阐明本发明的方法，

图5以脉冲宽度特征曲线和相关浓度曲线和信号曲线示出强制驰豫电流测定法的图解，

图6示出相对浓度对极间距离依赖关系的图示，

图7示出电流对浓度关系的图解，

图8示出驰豫相期间梯度与电势依赖关系图解，

图9示出电流密度对时间的依赖关系图示，

图10示出相应图5的驰豫相图示，

图11示出相应图5的实验值和计算值比较图示，

图12示出浓度对极间距离的依赖关系图示，

图13示出附有相关转换器阵列的强制驰豫电流测定法测量装置，

图14/15示出图9所示测量装置从上面和从下面看时的第一转换器阵列，

图16示出第二硅基转换器阵列的平面图以及

图17示出典型测量过程和测量电流曲线。图1至图4中，首先记叙了所谓“强制驰豫电流测定法(FRA)”的操作法。假定氧化还原循环的操作法本身由现有技术已知。

图5中，描绘了参照图1至4所阐明FRA法的相关信号曲线。接着，参照图6至图12说明了新测量方法的准确度，最后在图13中描述了一个具体的测量装置。这简要说明了一个示例性的转换器阵列，其结构示于图14和15。图16示出另一种转换器阵列。图17最后描述了在用该装置作DNA传感器时的方法实施。

详细说来，图1至图4中的附图标记1为支承至少一个测量电极2的支座，该支座附设了电子流动的电流路径3，同时供给分析物4。此外，还存在酶5，其浓度是分析物4浓度的量度，这是该酶直接或间接与分析物4结合或者被分析物4置换之故。

为与支座1结合，图3和4中指出了俘获子6。附图标记7标出了底物，该底物被酶5水解裂解而转化，因而产生报道分子8，报道分子在底物7稳定的条件下，能进行可逆电化学反应。

由支座和电极2构成的装置是一个传感器。电极2在测量相A期间极化得能使报道分子8被氧化或者还原，并在驰豫相B期间极化得能使报道分子8的氧化态或还原态在同一电极2上又被还原或氧化。这借助图3和图4来阐明。因此，测量相A期间流动的电流，是酶5所反应底物7的浓度的量度。

当分析物含有标记元件时，以及当酶含有与分析物的标记元件特异结合的偶联元件时，是有利的。酶也可直接与分析物结合。在此情况下，使与分析物特异结合的俘获分子，以已知方法固定在电极上或者固定在电极附近。

引入能与俘获分子特异结合的辅助分子，就得到其他实施方式。如果这种辅助分子直接与酶结合或者经由偶联元件与酶结合，则分析物置换辅助分子可通过在电极前面酶量减少来揭示。因此，测量信号下降表明分析物与俘获分子特异结合。

在另一种实施方式中，使用了辅助分子，该辅助分子能与分析物特异结合，而且同样直接与酶结合或者经由偶联元件与酶结合。分析物与俘获分子结合，并且辅助分子又与分析物结合。上升的测量信号揭示了结合复合物即俘获子-分析物-辅助分子-酶。在此，特别的优点是，分析物不必含标记元件。

图5中示出测量过程中不同的相。何者为测量相，何者为驰豫相，这取决于是否想要测量氧化电流或者还原电流。氧化和还原的脉冲宽度不一定要相同，也即时间t_ox和t_red可以不一样。电势

和也不一定要与物质的氧化还原电势

对称。

图5的描绘示出了使用方波脉冲条件下可能得到的电势曲线。在此情况下，将电势

或

以及时间δtox或Δt_RED对任意单位的脉冲形式11绘制曲线。脉冲形式11不一定要与氧化和还原的脉冲宽度对称。用锯齿波电压曲线或者正弦曲线来实现强制驰豫电流测定法，是同样可能的。详细说来，图5中，测量相用A来表示，驰豫相用B来表示。除了电势曲线11之外，曲线12还代表电极前面酶产物的浓度，并且电流13又作为测量信号。因此，对过程关键的电流值分别存在于驰豫区间的终点，并且是驰豫的浓度变化的量度。

为作进一步考虑起见，假设应该测量处于还原态的分子的浓度。在此情况下，相对物质的氧化还原电势而言，测量相期间电势为正。当电势正得出现扩散极限电流时，达到最大测量电流。于是，电流是不受氧化还原反应动力学限制，而是只受扩散限制。

被还原物质的浓度剃度随时间的扩展，可由解释向单独无穷大半空间中扩散情况的菲克定律相应解得出，即：

$c(t,x)=c_{\∞}\·\mathrm{erf}\left(\frac{x}{2\sqrt{\mathrm{Dt}}}\right),s\→\∞$

式中各参数为，

c：作为时间和地点函数的浓度

C_∞：溶液中的浓度(X→∞)

erf：误差函数

D：扩散系数

s：电极前电解质空间的广度

限制电极前电解质空间的边界，就可以进而增大测量信号。由酶产生的报道分子，仅只部分地向电极扩散。另一部分扩散到远离电极的电解质空间中去。如果这时电解质空间缩小得小于测量相期间的扩散长度，则在测量相期间还发生电解质空间被报道分子饱和，而且再产生的任何报道分子都提高了电极前的浓度。这被视为被还原报道分子和被氧化报道分子的总浓度。然而，由于电解质空间非常小时生物化学测定难以进行，所以这要求电解质空间高度可变。测量才开始时，电解质空间变小，并因此提高了传感器的灵敏度。

而且，缩小电解质空间，报道分子从某个传感器上方的电解质空间扩散到第二个传感器上方的电解质空间的数量也减少。由各相邻传感器引起的传感器信号不正确，因此而变小，而且传感器阵列的选择性也得以改进。

图6中示出扩散系数D＝3.6E-6cm²/s的物质的两条浓度曲线21和22。这相当于对氨基酚(pAP)的扩散系数，下面以对氨基酚为例来演示“强制驰豫电流测定法”的工作原理，其化学反应如下：

0.1秒后，扩散层厚度约25μm。0.25秒后，pAP贫化层的广度早已为40μm。该层越厚，扩散所致驰豫就持续得越长。

图7示出由特征曲线31至34所示不同脉冲组的、作为溶液中pAP浓度函数的电流密度。测量相总是持续0.25秒，驰豫相持续0.75秒。测量相开始0.24秒后，进行电流测量。测量相期间，氧化电势相对氧化还原电势为+200mV。驰豫相期间，电势受到变化。假定相对氧化还原电势而言，值在-300mV和0mV之间。具体来说是，

特征曲线31中  -300mV/200mV，

特征曲线32中  -200mV/200mV，

特征曲线33中  -100mV/200mV，

以及  特征曲线34中  0mV/200mV。

有了这些参数就得出电流密度j的不同斜度，此斜度关系到电流密度对pAP浓度的功能性依赖关系。

电流密度对pAP浓度的梯度，也即测量灵敏度，由于驰豫相期间电势变负而持续增大。根据图4对驰豫电势绘制梯度，特征曲线41清楚显示强制驰豫电流测定法的有利效果。

虽然，驰豫电势对

为0V时，梯度仅只462Acm/mol，但在对为-300mV时，此值提高到864Acm/mol。数值上的此种倍增，系因氧化还原循环效果改进之故，因为驰豫电势对

为-300mV时，电极前醌亚胺完全还原成对氨基酚(pAP)。反之，在驰豫电势对为0V时，按照Nemst公式，电极紧前建立浓度比

对氨基酚∶醌亚胺＝1∶1

因此，醌亚胺仅又部分还原。

灵敏度提高只是″强制驰豫电流测定法″的一个优点，但却是决定性的优点。电流信号的稳定性，甚至在测量开始的最初数秒内，则是另一个重要优点。

为确定灵敏度起见，使用延长测量时间后校准的电流密度。酶活性测量时，譬如测量一开始就搅拌溶液或者用泵使溶液循环。借此，由酶产生的pAP被冲洗掉，并建立恒定的基本电流。然后，停掉泵，并在最初数秒内测量上升的浓度。典型的斜度为2μA/cm²s的数量级。如果这时测量本身导致信号衰减，则将两种效应叠加，并测量不足的电流斜度，并藉此测量酶活性。由于物质消耗所致的这种电流衰减还与物质浓度有关，此效应不能用归一化来消除。

用恒定浓度进行的各次试验，提供了信号随时间稳定性的信息。浓度为50μm pAP，测量相期间的电势为+200mV。测量相持续时间为250毫秒，其中电流测量在240毫秒后进行。第一次试验中，驰豫相期间的电势对

为0V，第二次试验中对

为-300mV。驰豫相持续时间在250毫秒和4.75秒之间变化。

图9中用图示法示出电流密度j的时间依赖性：在特征曲线51至54中得到不同驰豫相持续时间Δt_RED，具体来说介乎0.255和4.755之间。在测量的最初10秒中，电流显著下降。在驰豫相长度为0.25秒时，10秒内减少14μA/cm²。如果驰豫相持续时间提高到4.75秒，则10秒内信号减小到9μA/cm²。因此，驰豫相持续时间越短，信号随时间的这种减小就越大。但即使驰豫时间长时，比起应用中要测量的、数量级为2μA/cm²s的斜度来，10秒内减小0.9μA/cm²s还是相当大的。

如果这时驰豫相期间的电势降到-300mV，则信号稳定性显著得以改进。这特别由图6揭示，图6以相同松弛相参数ΔtRed的特征曲线61至64，示出了相应于图5的图示。

驰豫时间为0.25秒时，10秒内信号下降仍为8μA/cm²。驰豫时间为0.75秒时，这些值在10秒内仍为2μA/cm²，1.75时10秒内仍为1μA/cm²，而且历时4.75秒后10秒内仅为0.5μA/cm²。甚至驰豫时间为0.75秒时，也即测量频率为1Hz，而且驰豫电势为-300mV时，信号下降为-300mV，并因此误差也仅约期望测量值的1％。

这些试验显现了持续时间和驰豫相电势对测量信号的影响。模拟计算可另外实证强制驰豫电流测定法的效果。对此，一方面计算了氧化还原循环中的电流密度，另一方面测定了无氧化还原循环的电流密度以资比较。

为以氧化还原循环进行模拟，假定电解质空间厚度为100μm。氧化电势和还原电势都选择得能使反应在扩散极限电流范围内进行，那就是说，电流为最大电流。氧化电势时脉冲宽度为250毫秒，还原电势下脉冲宽度为750毫秒。进行无氧化还原循环计算时，这些参数都是相同的，除非驰豫相期间不规定电势，并且电流不能流过恒电势仪。因此，此时该装置电化学退耦。

以实验结果对相应脉冲宽度和电势

以及

进行了模拟数据比较。这些电势极值最接近于模拟设置值。模拟数据的y轴截距与实验结果一致。

图11示明试验和强制驰豫电流测定法模拟令人满意地一致，其中71为所测值，72为计算的特征曲线。4秒内2μA/cm²时，在这些条件下，电流密度下降很小。反之，不用“强制驰豫电流测定法”，在最初4秒内，电流密度下降已为12μA/cm2，这由特征曲线73阐明。驰豫相期间，在氧化还原电势情况下，恒电势测量方法的试验结果介于其间，这由特征曲线74示出。

信号稳定性改进了6倍，可直接归因于浓度分布。正如第5驰豫相终点所示那样，下一幅附图示明pAP的计算浓度分布与电极间距的函数关系。

在“强制驰豫电流测定法”中，驰豫相期间，先前形成的氧化产物又被还原。因此，在驰豫相终点，紧临电极的pAP浓度又升到原始值C_∞。再离电极远一点，浓度仅轻微降低。然而，不用“强制驰豫电流测定法”，则紧接下一个测量相之前的电极前浓度仅为38％。再离电极远一点，浓度也明显降低。

后者由图12以特征曲线81和82详细揭示，此外，特征曲线82所示用于无氧化还原循环测量的实施例，实际上适应于测量虽能被氧化但其氧化产物不能再还原的物质的浓度。对能还原但其还原产物不能再被氧化的物质来说，情况也类似。在生物化学传感器的情况下，该物质譬如可为萘酚，它正如pAP那样，也可在酶反应过程中被释出。

从图13中可以详细看出这种测量装置，除借助于转换器阵列100之外，该转换器阵列还会参照图14和15详加说明，所述测量装置基本上由适宜的恒电势仪105结合脉冲发生器106来实现，该脉冲发生器任选提供方波脉冲、锯齿波脉冲或者正弦波脉冲。借助于两个运算放大器107或者107′(其中一者连‘接地’电势)和固定式测量电阻器108，将恒电势仪105设计成可提供适宜的电势。此外在此情况下，脉冲宽度、重复频率和电势的高度可予规定。特别是，测量相和松弛相的脉冲宽度可以单独调节，而且宽度可不同。电势大小也可不同。

给转换器阵列100分配各电极，电极按用途分配成一个参比电极RE(＝reference electrode)、一个反电极CE(＝counter electrode)和至少一个测量电极WE(＝working electrode)。这些电极以三电极排列形式与恒电势仪105相连。恒电势仪105的信号接通信号处理单元(图9中未详细示出)，该信号处理单元用来评价上述测量方法实施情况和准确度。通常，得到用来进行评价的图13中以Iout表示的信号波形。

图14/16中示出作为测量装置部件的转换器阵列100，该转换器阵列是平面型的而且具柔韧性，特别是制造起来成本低廉。在此情况下，重要的是，从现在起可用简化的转换器阵列100来进行强制驰豫电流测定法测量。图14和15显现了转换器阵列100的顶面和底面——由金属基体101和绝缘层102构成。在顶面上绘出了称作凹窝、例如圆形的凹穴103_i。凹窝103_i借助于绝缘体102的结构化来形成。在凹穴103_i底部上，露出金属基体的顶面，并且只要涂有分析物就形成一个测量点。

后侧面的图示藉线条显示出结构化，并因此将金属基体101分隔成彼此绝缘的各部分。每个金属岛相应于前侧面上的一个凹穴103_i。各个点(dots)指出了针卡(needle card)对金属表面的简化电接触。在此情况下，重要的是，多个金属岛(优选三个)同分析物一起来确定一个传感器，并且用包括测量电极WE、反电极GE和参比电极RE的相关电极使之宜于进行电化学测量。

但在另一种构造形式中，也可以使用按CMOS-工艺规程制造的转换器阵列，参照图16说明如下，

图16中，在传感器或者支座1的感测表面上设置许多供进行生物化学分析用的微空腔200。m×n个单元按行按列排成转换器阵列200。在此情况下，重要的是，生物化学反应或测量可在各凹窝中同时进行，而不会在添加物质时发生反应从第一个凹窝到第二个凹窝串扰。

图16中，在具有感测表面或各感测元件的支座1上，安设分立的电触点。诸触点构成电测量回路的输入端。例如有两个电源电压输入端Vdd、Vss，一个接地电势输入端GND，一个时钟信号输入端，一个控制电压输入端Vin和一个复位信号输入端。另外，还在芯片1上借助标准硅技术集成多路转换器210、″Gray counter&decoder″215和放大器220。在输出端获得测量信号，在阵列安排具有许多凹窝作为m×n个单独传感器的情况下，得到多路转换信号，该多路转换信号例如用10kHz频率读出。

单路‘out’上输出的多路转换信号由各个别电压值的图案组成，由该图案可借助数据分析仪中的多路信号分离器获得单个传感器信号。

这样，图16中，在可资选择的测量装置中使用按薄膜工艺规程在刚性基体上制造的转换器阵列，以代替图13至15所示的自支承的柔性转换器阵列。在此情况下，提供了尺寸大于扩散长度的平面电极。就上述实施例而言，典型的扩散长度为25μm，因而平面电极的尺寸≥30μm，优选≥50μm。

刚性基体特别是硅，其优选设有绝缘层。

用这种转换器也可进行本发明的氧化还原循环，这与用于信号处理的CMOS操作法相一致。

有了图13所示的装置和任选自图14/15或图16所示转换器阵列100或者200，举例来说，可制造用于DNA分析的生物化学传感器，举例来说，使用藉图14/15所描述的转换器阵列100，其由金属层和该金属层结合、附有凹窝3_i的绝缘层构成。凹窝3_i直径为0.8mm，深度为90μm，两个邻接测量点之间的距离为1mm。电极表面覆有2.3μm厚的金层。

在如此描述的装置中，转换器阵列上方电解质空间的高度在测定期间可变化。转换器阵列上方的电解质空间可由柔性材料限定边界，在此情况下，柔性材料可被从上面施加的力在列阵延伸的方向上压紧。因此，电解质空间缩小得使列阵上各传感器之间的转运蛋白分子输送受阻。

总的说来，就上述应用场合而言，因而传感器至少安设三个，但优选4个。然后，将各电极中的一个电极覆以银/氯化银(Ag/AgCl)层作为参比电极，另一电极用作反电极CE，并且另外两个电极用作测量电极WE。

在各测量电极的一者上，将长度为25的合成寡核苷酸序列借助端巯基固定在金表面上作为正样品。第二测量电极保持空白作为负样品。然后，将载带1mg/ml牛血清白蛋白溶液的两个表面保温15分钟，并接着在100μm的深流动通道中置入该传感器阵列。首先，将10μl的10μM生物素化的目标序列在约5分钟内用泵越过电极循环。然后，经洗涤步骤后，将后一种被链霉抗生物素标记过的碱性磷酸酶加于其上。洗涤用100mM三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液进行，该缓冲液预先用盐酸和130mM的NaCl滴定到pH 8。再次洗涤后，将2mM在缓冲液中的酶底物磷酸对氨基苯酯(pAPP)的溶液用泵越过该传感器阵列进行循环。在酶即碱性磷酸酶存在下，将酶底物pAPP转化成对氨基酚(pAP)。

为进行测量起见，将参比电极RE、反电极CE和两个测量电极WE中的一者分别按三电极系统接到恒电势仪上。测量借助“强制驰豫电流测定法”进行。测量相期间，由酶产生的对氨基酚被氧化成醌亚胺。氧化电势

对

为+200mV。驰豫相中，所形成的醌亚胺再还原成对氨基酚，也就是说在时。测量相的脉冲宽度为250毫秒，驰豫相为750毫秒。测量相开始240毫秒后，进行电流测量。

测量开始时，接通正样品，也即附有俘获序列的电极。含有酶底物的溶液(用泵输送)先流过负样品，然后流过正样品。由酶形成的pAP经流态运动从电极冲洗掉，因此在泵开动时电流恒定且很小。如果这时将泵停掉，pAP浓度因酶活性之故而随时间升高。测量中，这由电流信号以20nA/s的速度剧烈升高显示出来。如果再开启泵，则信号又降到原始值。这个过程可任意多次重复。

图17显示有正样品和负样品的、所描述传感器安设中泵″开动″/″停止″时电流随时间的分布，特征曲线121显示泵电流的变化。试验得到随各个峰值的特定变化，其中参数一方面是泵的活动(″停止″/″开动″)，另一方面是测量电极转换。所关注的测量区域分别用虚线配衬。t＝400秒时，切换到负样品。在此情况下，停住泵时，电流先下降，然后短时间保持恒定，并再慢慢升高。此升高系pAP从正样品向负样品扩散所致。泵″开动″时，峰值电流叠加于此，这是因为电解液先从正样品向负样品流动，并因此向邻接电极运输高的pAP浓度。总的说来，正样品和负样品的鉴别都很好。

Claims (36)

1.电化学检测分析物的方法，该方法具有下列措施：

-该方法中使用一种酶，所述酶的浓度是分析物浓度的量度，在所述方法中该酶直接或者间接与分析物结合或者被分析物置换；

-该方法中使用一种底物，它被酶通过水解裂解而转化从而产生报道分子，该报道分子在底物是稳定的条件下可进行电化学可逆反应；

-该方法中使用至少有一个不小于30μm的平面电极的传感器，其中使电极在测量相(A)的持续时间内极化得使报道分子被氧化或者被还原，而且其中所述电极在驰豫相(B)的持续时间内极化得使同一电极上的氧化态或还原态报道分子重新被还原或氧化，

-测量相(A)期间流动的电流，被记录为被酶所转化的底物浓度的量度。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，使用带有标记元件的分析物。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，使用带有偶联元件的酶，所述偶联元件与分析物的标记元件特异性结合。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶是与分析物结合的。

5.权利要求3所述的方法，其特征在于，在电极上或在电极附近固定有俘获分子，其中所述俘获分子与分析物特异性结合。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于使用辅助分子，该辅助分子含有与俘获分子特异结合的标记元件。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶含有偶联元件，该偶联元件与辅助分子的标记元件特异结合。

8.权利要求1所述的方法，其特征在于，使用辅助分子，该辅助分子直接和酶偶联，并与俘获分子特异结合。

9.权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述辅助分子被所述分析物从其与俘获分子的特异结合中置换出来。

10.权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述分析物与俘获分子和辅助分子特异结合。

11.前述权利要求1至8中任何一项所述的方法，其特征在于，测量相

(A)临近终点时电容电流比法拉第电流小。

12.权利要求11所述的方法，其特征在于，临近驰豫相(B)终点，测量相(A)期间被氧化的报道分子最大程度地被再还原。

13.权利要求11所述的方法，其特征在于，临近驰豫相(B)终点，测量相(A)期间被还原的报道分子最大程度地被再氧化。

14.权利要求13所述的方法，其特征在于，将电势选择得使得报道分子的还原反应和氧化反应在扩散极限电流范围内进行。

15.权利要求13所述的方法，其特征在于，测量相(A)的重复率至少为0.5Hz。

16.前述权利要求1至8中任何一项所述的方法，其特征在于，在驰豫相(B)期间，报道分子完全还原或完全氧化。

17.按照权利要求1所述方法对分析物进行电化学检测用的系统，具有

-酶(5)，其浓度是分析物(4)浓度的量度，

-底物(7)，其被酶(5)通过水解裂解而转化，

-报道分子(8、8′)，其在底物(7)是稳定的条件下，能进行可逆电化学反应，以及

-至少设有一个电极(2)的传感器(1)，其在测量相(A)持续时间内极化得能使报道分子(8、8′)氧化或还原，并且在驰豫相(B)的持续时间内极化得能使在同一电极(2)上的氧化或还原形式的报道分子又被还原或氧化，因此在测量相(A)期间流动的电流是被酶(5)反应的底物浓度的量度。

18.权利要求17所述的系统，其特征在于，提供辅助分子。

19.权利要求17所述的系统，其特征在于，所述分析物(4)含有标记元件。

20.权利要求17所述的系统，其特征在于，酶(5)含有偶联元件，该偶联元件与分析物(5)的标记元件特异结合。

21.权利要求17所述的系统，其特征在于，所述酶(5)与分析物(4)结合。

22.权利要求17所述的系统，其特征在于，俘获分子(4)结合在电极上或者结合在电极附近，该俘获分子与分析物(4)特异结合。

23.一种用于在权利要求17至22中任何一项所述系统中实施权利要求1至16中任一项所述方法的测量装置，其特征在于，一种用来产生时间上可预定的可变电势的部件(105)；以及适用于测量的转换器阵列(100，200)。

24.权利要求23所述的测量装置，其特征在于，所述转换器阵列(100)由至少一种柔性平面金属基体构成，在该金属基体上设有至少一个柔性绝缘体，金属表面和绝缘体表面牢固结合，其中金属基体的结构型式是：存在互相电绝缘的金属部位(101_i)，而且其中位于金属基体上的绝缘体的结构型式是：在绝缘体中，限定了具有敞露金属表面(101_i)的凹窝(103_i)，其中金属部位(110_i)在远离或者逆对传感器表面(111_i)的那侧(112_i)可接触到。

25.权利要求23所述的测量装置，其特征在于，所述转换器阵列(100)是芯片组。

26.权利要求23所述的装置，其特征在于，所述转换器阵列(200)包括平面电极，其最小尺寸大于通常的扩散长度。

27.权利要求23所述的测量装置，其特征在于，所述平面电极的尺寸为至少30μm。

28.权利要求23所述的测量装置，其特征在于，所述平面电极按薄膜工艺规程在非传导性的刚性基体形成。

29.权利要求28所述的测量装置，其特征在于，所述刚性基体是硅。

30.权利要求28所述的测量装置，其特征在于，基体上有绝缘体。

31.权利要求23所述的测量装置，其特征在于，所述转换器阵列(200)按CMOS工艺规程组装而成。

32.权利要求23所述的测量装置，其中在转换器阵列上形成电解质室，其特征在于，测量过程中，所述电解质室的高度是可变的。

33.权利要求32所述的测量装置，其特征在于，所述电解质空间在转换器阵列上被柔性材料限定边界，所述柔性材料可在从上向下作用的力下沿列阵延伸的方向运动。

34.权利要求33所述的测量装置，其特征在于，所述电解质空间可缩小到能阻止报道分子在列阵中各传感器之间运往。

35.权利要求23所述的测量装置，其特征在于，所述平面电极的尺寸为50μm。

36.权利要求32所述的测量装置，其特征在于，所述电解质空间在转换器阵列上被可在从上向下作用的力下沿列阵延伸的方向挤压的柔性材料限定边界。

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