CN101230395B - 检测前庭导水管扩大相关基因slc26a4的109g＞t突变的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测方法，通过检测来自待测个体的样本中是否存在SLC26A4基因突变，而诊断该待测个体中前庭导水管扩大疾病的发生和类型，其中所述的SLC26A4基因突变为位于SLC26A4基因外显子2的109G＞T杂合突变。本发明还涉及一种用于检测来自待测个体的样本是否存在SLC26A4基因突变的检测试剂盒，以及SLC26A4基因突变在诊断和/或治疗与前庭导水管扩大相关疾病中的应用。该基因突变和检测方法将有利于临床上开展耳聋患者的SLC26A4基因突变筛查工作，为耳聋患者的诊断和治疗提供服务。

Description

检测前庭导水管扩大相关基因SLC26A4的109G＞T突变的试剂盒

本申请是中国专利申请200510132214.5的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于检测SLC26A4突变基因的试剂盒。

背景技术

SLC26A4基因位于7q31，其最初是由Everett等定位，并且发现该基因突变可以导致一种常染色体隐性遗传性疾病：Pendred综合征，临床表现为甲状腺肿，及合并前庭导水管扩大或Mondini畸形(前庭导水管扩大合并耳蜗发育不全)的感音神经性耳聋。后来，Usami等对6例单纯前庭导水管扩大家系的SLC26A4基因的筛查结果表明，该基因的突变还可以导致单纯前庭导水管扩大，其遗传模式也是隐性遗传.由此可见，SLC26A4基因突变可以导致前庭导水管扩大——单纯性前庭导水管扩大或者是合并耳蜗畸形的前庭导水管扩大。前庭导水管扩大是内耳最常见的畸形，其在遗传性耳聋中占到1～8％。临床上主要表现为高频听力损失为主的感音神经性耳聋，听力损失程度多表现为重度或者是极重度聋。发病多在儿童时期，其发病前常有感冒、发烧、外伤等使颅内压增高的诱因。

与前庭导水管扩大相关的SLC26A4基因mRNA全长4930bp，含21个外显子，开放阅读框架2343bp，贯穿外显子2和外显子21。该基因编码的蛋白——Pendrin是一个分子量为86kD，含780个氨基酸的跨膜蛋白，属于离子转运子家族。Scott和Bidart等的研究发现，Pendrin主要表达于甲状腺滤泡细胞的顶膜及内淋巴管和内淋巴囊的主细胞，介导碘离子和氯离子的转运，在维持甲状腺组织和内淋巴的离子平衡上发挥作用。在甲状腺，当Pendrin功能障碍时，其不能把碘离子及时转运到滤泡胶质，使碘离子在滤泡细胞内积聚，从而不能有效有机化并与甲状腺球蛋白结合，从而导致Pendred综合征中甲状腺肿的发生。Qvortrup等认为，大鼠的内淋巴囊类似甲状腺滤泡，有平衡胶状物质填塞囊腔，内淋巴囊主细胞的功能类似于甲状腺滤泡细胞，可以合成、分泌、吸收、消化蛋白质。氯离子转运障碍使内淋巴液的成分改变，从而损伤感觉上皮细胞，导致感音神经性耳聋。并且由于渗透压改变和成分改变的毒性机制导致膜迷路结构改变。由于内淋巴管和内淋巴囊到4岁时才停止发育，因此它们的扩大可以导致周围骨性结构的改变，例如前庭导水管或耳蜗结构的改变。

对于前庭导水管扩大患者SLC26A4基因突变的筛查，国外已经广泛开展，报道的致病突变位点超过100个，包括错义突变、框移突变、无义突变及剪接位点突变，分布于各个外显子。SLC26A4基因具有明显的异质性，不同种族其突变形式不完全相同。该基因突变后其编码的蛋白不能准确定位到细胞膜上，而是存在于内质网或者是高尔基体内，影响离子转运。

前庭导水管扩大患者SLC26A4基因突变的发现，不仅会促进该病的发病机理等基础研究的发展，还将大大促进前庭导水管扩大的基因诊断和治疗的开展。通过产前诊断筛查及新生儿SLC26A4基因突变的普遍筛查，可以降低前庭导水管扩大患儿的出生率，并且实现症前诊断，从而指导携带致病基因的患儿的行为，预防疾病的发生，这将会大大减少耳聋患者的数量，减轻社会压力。未来的研究将致力于基因治疗方面，能够预见，基因治疗将会给包括耳聋在内的各种遗传性疾病的治疗带来质的飞跃。

发明内容

本发明的一个目的在于提供诊断前庭导水管扩大的方法，其通过检测来自患者的待测样本中是否存在具有本发明所述突变形式的SLC26A4突变基因而判断患者前庭导水管扩大症的发生和类型，进而为临床诊断和治疗提供参考。

本发明的另一个目的在于提供用于检测来自待测个体的样本是否存在SLC26A4基因突变的试剂盒。

本发明的再一个目的在于提供SLC26A4突变基因在诊断和/或治疗前庭导水管扩大相关疾病中的应用。

根据本发明的一方面，本发明提供了一种与前庭导水管扩大疾病相关基因的检测方法。该检测方法通过检测来自待测个体的样本中是否存在SLC26A4基因突变，而诊断该待测个体中前庭导水管扩大疾病的发生和类型，其中所述的SLC26A4基因突变位于SLC26A4基因外显子2的109G＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子4的334C＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子5的589G＞A杂合突变、位于SLC26A4基因外显子4的387delC杂合突变、位于SLC26A4基因外显子6的611G＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子7的812A＞G杂合突变、位于SLC26A4基因外显子10的1175A＞G杂合突变、位于SLC26A4基因外显子13的1540C＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子16的1746delG杂合突变、位于SLC26A4基因外显子18的2054G＞T突变、位于SLC26A4基因外显子3的281C＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子14的1586T＞G突变或位于SLC26A4基因外显子3的227C＞T杂合突变。

所述检测方法可包括下述步骤：

1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA；

2)以该DNA为模板，以针对SLC26A4基因所述各突变位点设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；

3)将得到的PCR产物进行直接测序分析，将所得到的序列与SLC26A4正常基因的序列进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的所述突变位点；

4)根据以上结果判断待测个体是否为SLC26A4基因突变导致的前庭导水管扩大。

所述检测方法可进一步包括下述步骤：

5)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在下述氨基酸突变位点：E37X、P112S、G197R、X144、G204V、D271G、N392S、Q514X、X585、R685I、T94I、I529S或P76L。

以下，具体说明SLC26A4基因109G＞T杂合突变的检测方法：

通过对89例前庭导水管扩大的家系成员及80名正常听力的对照组成员的SLC26A4基因进行筛查，发现一名前庭导水管扩大的患儿具有SLC26A4基因新的突变位点(109G＞T，E37X)。80名正常人的筛查中未检测到该突变，说明这一突变位点与前庭导水管扩大密切相关。图1给出SLC26A4编码区氨基酸与核酸碱基的对照图，并用灰色示出突变位点所在位置，从37位开始氨基酸的编码终止。

在本发明中，可采用本领域的检测点突变的常规方法来检测SLC26A4基因的突变位点，例如PCR(聚合酶链反应)-测序法、采用标记的SLC26A4基因DNA探针杂交法、或用限制性片段长度多态性方法等，对于某些特定突变位点，还可采用限制性内切酶酶切反应。

在本发明的一个具体实施方式中，检测待测个体的样本中是否存在SLC26A4基因109G＞T杂合突变的方法，包括下述步骤：

1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA；

2)以该DNA为模板，以下列PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；

PDS2-F：5’-CAGGACGCGGACCAGACT-3’

PDS2-R：5’-CGAGACTGATGGAGCCACCCTC-3’

3)将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与SLC26A4正常基因的序列进行比较，确定是否存在SLC26A4基因的109G＞T突变位点；

4)根据以上结果判断该待测个体是否存在SLC26A4基因109G＞T突变。

进一步的，该方法可以选择性的包括如下步骤：

5)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在E37X氨基酸突变位点。

在本发明中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列，例如根据Coyle等文献描述的序列而设计，也可利用Primer Premier 5.0进行设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45-50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合。在本发明中，SLC26A4基因的标准序列可以参考例如Genbank GeneID：5172。

在上述针对SLC26A4基因各突变位点的检测方法中，所得到的PCR反应产物还可以用变性高效液相色谱(DHPLC)或杂交探针等方法来检测，所用的杂交探针可以是与正常的SLC26A4核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针，以筛查是否存在已被确定的突变。

根据本发明的另一方面，本发明提供了用于检测来自待测个体的样本是否存在SLC26A4基因突变的试剂盒，试剂盒中可以包含以下几种试剂的一种或几种的组合：

从待测样品中提取DNA的试剂；

用于扩增样本DNA中SLC26A4基因下述突变位点的PCR引物及相应的PCR反应试剂：

位于SLC26A4基因外显子2的109G＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子4的334C＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子5的589G＞A杂合突变、位于SLC26A4基因外显子4的387delC杂合突变、位于SLC26A4基因外显子6的611G＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子7的812A＞G杂合突变、位于SLC26A4基因外显子10的1175A＞G杂合突变、位于SLC26A4基因外显子13的1540C＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子16的1746delG杂合突变、位于SLC26A4基因外显子18的2054G＞T突变、位于SLC26A4基因外显子3的281C＞T杂合突变、位于SLC26A4基因外显子14的1586T＞G突变或位于SLC26A4基因外显子3的227C＞T杂合突变。对PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切反应的试剂；和/或

对PCR扩增产物进行测序的试剂。

例如，本发明的一个实施方案中提供一个检测SLC26A4基因所述突变的试剂盒，容器内装有用以检测SLC26A4基因所述突变的成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中SLC26A4基因所述突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、酶切反应和/或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述的一对PDS-F和PDS-R引物，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。

所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤：

(1)提取待测血样的DNA，利用上述的一对PDS-F和PDS-R引物，进行PCR扩增反应；

(2)酶切反应进行突变检测；和/或

(3)PCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genbank中的标准序列比较确定突变位点的存在；

(4)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在所述氨基酸突变位点。

该试剂盒可简便快捷地检测SLC26A4基因的所述突变位点，从而应用于前庭导水管扩大病例的突变检测及其诊断治疗。

根据本发明的再一方面，本发明提供了SLC26A4突变基因在诊断和/或治疗前庭导水管扩大中的应用，通过检测来自患者的待测样本中是否存在SLC26A4基因的所述突变而判断该患者的耳聋发生原因及类型，进而为临床诊断和治疗提供参考；此外，在进一步的临床治疗方面，在检测结果为发生了SLC26A4基因的所述突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可以进行基因治疗。

本发明首次提供了在中国人群中存在SLC26A4基因的所述十三种突变，并且说明该突变基因与前庭导水管扩大相关。同时，本发明提出了通过检测患者中是否存在SLC26A4基因突变而判断耳聋发生的原因和类型的检测方法，这将有利于在临床上开展耳聋患者的SLC26A4突变筛查工作，为耳聋患者提供诊断和治疗服务。

下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的说明，详细描述但不限制本发明。

附图简要说明

图1～5为关于SLC26A4基因109G＞T杂合突变的附图：

图1为SLC26A4编码区氨基酸与核酸碱基的对照：突变位于第109个碱基，对应于第37位的氨基酸变为翻译终止信号(灰色标记的是突变的碱基和氨基酸)，其后的氨基酸序列用下划线标记，此段氨基酸序列缺失；

图2为Pendrin的结构示意图，星号示出第37位氨基酸所在位置，发生E37X突变后，其后氨基酸序列缺失；

图3为本发明SLC26A4基因109G＞T杂合突变检测方法中PCR反应过程示意图，示出了反应温度和时间；

图4为本发明SLC26A4基因109G＞T杂合突变检测方法中，对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中示出了定量Marker的片段位置；

图5为本发明方法SLC26A4基因外显子2的部分测序结果，上方为正常对照序列，下方为突变序列，箭头所指为突变位点(109G＞T，E37X)。

发明的具体实施方式

本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

本发明研究过程：通过聋病门诊收集前庭导水管扩大患者，在患者及其家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式。然后，应用酚氯仿抽提方法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均准确对应于登记的患者临床资料。然后，根据Coyle等的文献所描述设计引物，部分利用PrimerPremier 5.0进行设计，包含SLC26A4基因编码区及其侧翼序列，进行PCR扩增。对PCR产物进行直接测序：测序引物与PCR扩增引物相同，应用ABI公司3730DNA测序仪进行正反向测序。将得到的序列与Genbank中的标准序列比较，确定SLC26A4突变位点。针对SLC26A4基因的某些突变位点，对PCR产物还可选择性的进行酶切反应：应用特定的限制性内切酶可将正常人PCR产物切成两个片段，而出现突变后，酶切位点消失，不能切开。按正常阅读框进行翻译以确定SLC26A4基因的突变位点。

          SLC26A4基因109G＞T杂合突变的检测

以前庭导水管扩大的病人作为研究对象，通过对89例该病家系成员及80例正常对照的SLC26A4基因的编码区各外显子的筛查，发现一名前庭导水管扩大患者在外显子2上具有SLC26A4基因新的突变(109G＞T，E37X)。该患者为一复合杂合子，符合常染色体隐性遗传的模式，其SLC26A4的等位基因存在另一个突变。这一突变位点在80名对照组中均没被发现，说明这一突变位点与前庭导水管扩大共分离。

【实施例1】SLC26A4基因109G＞T杂合突变的检测方法

一、待测对象血样DNA的制备

1、研究对象：聋病门诊收集的前庭导水管扩大的患者89例，正常对照80例。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5-10ml。

2、基因组DNA提取：采用酚氯仿抽提法。

第一天

1)抗凝血用PBS作1倍稀释。

2)在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃-28℃)，上面铺一层1倍体积已稀释的血液，室温1000×g，离心20分钟。

3)吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入5mlEp管中，5000×g，离心10分钟，然后用PBS洗一次。5000×g，离心10分钟。

4)将细胞悬于2mlTE缓冲液中，加10％的SDS至终浓度0.5％(100μl)，蛋白激酶k 100-200μg/ml(10mg/ml)，50℃水浴3-5小时。

5)用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，5000×g，离心10分钟。

6)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚：氯仿混合物，混匀，5000×g，离心10分钟。

7)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿：异戊醇混合物，混匀，5000×g，离心10分钟。

8)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。

9)加入2.5倍体积的无水乙醇。

10)-20℃沉淀DNA过夜。

第二天

11)高速离心，10000×g，10分钟，4℃。

12)弃上清，加入75％乙醇2ml，高速离心10000×g，5分钟。

13)弃上清，吹干。

14)用TE缓冲液溶解(200μl TE/5ml全血，400μl TE/10ml全血)。

15)分装。1％琼脂糖电泳和分光光度计定量。

二、SLC26A4基因外显子4的PCR扩增

1、引物序列

上游引物：

PDS2-F：5’-CAGGACGCGGACCAGACT-3’(nt864-nt881)

下游引物：

PDS2-R：5’-CGAGACTGATGGAGCCACCCTC-3’(nt1350-nt1371)

注：SLC26A4基因序列检索号：Gene ID：5172

2、PCR反应体系的建立

SLC26A4基因的PCR反应体系的组成见表1。

            表1  SLC26A4基因的PCR反应体系

名称	原液浓度	加样量(μl)	体系终浓度
				缓冲液	10×	2.5	1×
dNTP	2.5mM	2.0	0.2mM
				引物	10μM	0.6	0.24μM
Taq酶	5units/μl	0.3	0.06units/μl
				模板(步骤一中提取的DNA)	100ng/μl	1	4ng/μl
总反应体系	ddH2O补齐至25μl

其中缓冲液、dNTP、Taq酶从宝生物公司购得。引物由上海生工公司合成。反应条件：PCR反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图3所示。

三、PCR产物的纯化

1、向装有PCR产物的96孔板中加入50μl无菌水，混匀。

2、将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。

3、纯化板中再次加入50μl的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。

4、将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20μl的去离子水，静止15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。

5、保存在-20℃冰箱中。

四、电泳定量

1、样品准备

PCR产物(2μl)+上样缓冲液(6μl)共8μl×96

取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6μl，在从装有PCR产物的腔板中，每孔用排枪移出PCR产物(2μl)，转移到点样板上、混匀、离心(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。

2、流程

1)配胶(1.0％琼脂糖)：称取3.0g琼脂糖，悬浮于300ml 0.5×TBE中(500ml锥形瓶)。

2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。

3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10μl，10mg/ml)，摇匀。

4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。

5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×TBE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。

6)加样：用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。

7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。

8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，进行定量。定量marker为DL 2000，如图4所示，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，DL2000的总浓度是300ng/5μl。电泳时取5ul DL2000，因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取3μl(PCR产物)+5μl(上样缓冲液)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的含量。

五、SLC26A4基因PCR扩增产物的直接测序

1、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求

DNA纯度：OD260/OD280＝1.6～2.0。

DNA浓度：PCR产物10ng/μL。

DNA用量：

PCR产物

100-200bp     1-3ng

200-500bp     3-10ng

500-1000bp    5-20ng

1000-2000bp   10-40ng

＞2000bp      40-100ng

2、测序反应

(1)测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

(2)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

(3)目前的反应体系为5μl，各种试剂加入量见表2。

    表2  SLC26A4基因PCR扩增产物的测序反应体系

模板	纯化的PCR产物(实施例2中制备)	200-500bp	3-10ng
				500-1000bp	5-20ng
		1000-2000bp	40-100ng
				BigDye v3.1*			0.25μl
5×缓冲液(Tris-HCl pH9.0，MgCl2)			0.875μl(Kit)
				引物			3.2pmol
用无菌水补至5μl

*BigDye 3.1为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的荧光染料。

(4)样品放于PCR仪上，所做反应的过程见表3。

表3  SLC26A4基因PCR扩增产物的测序反应过程

步骤	作用
		1	96℃，2min.
2	重复以下过程30个循环：●96℃，10sec；●50℃，5sec；●60℃，4min.
		3	保持在4℃，直到纯化

(5)反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。

3、测序反应物的纯化和测序

(1)向每孔中加入20μl 80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；

(2)在每孔中加入30μl 70％乙醇，4,000rpm离心10min，倒甩；

(3)重复第2步的操作；

(4)重复第2步的操作；

(5)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

(6)加入5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

(7)上机器前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。

测序图如图5所示。

【实施例2】突变位点进化研究

突变分析：应用DNAStar5.0(Lasergene Inc.)软件包中的SeqmanTM软件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对，找出突变序列，发现了突变位点(109G＞T，E37X)。

进化研究：109G＞T突变位于Pendrin的氨基末端，其使氨基酸编码终止于37位，其后的734个氨基酸丢失。该突变必定影响Pendrin的结构和功能。

检测前庭导水管扩大相关的SLC26A4基因突变的试剂盒及其应用

【实施例3】

检测SLC26A4基因突变的试剂盒可以根据需要制备成检测各单一突变位点的单独的试剂盒，也可以制备成检测多个或所有SLC26A4基因突变位点的试剂盒，下面以检测本发明的11个突变位点的试剂盒为例进行说明：

1、试剂盒含有：

(1)扩增用引物

前述为检测SLC26A4基因的13个突变位点设计的11对引物，或者其他可使用的针对该13个突变基因设计的引物；

注：SLC26A4基因序列检索号：Gene ID：5172

其他可选地包含在试剂盒中的试剂包括下述试剂：

(2)PCR扩增用Taq酶 5U/μl

(3)10×缓冲液(含15ml MgCl₂)

(4)dNTP          2.5mM

(5)Sca I限制性内切酶；EcoRV限制性内切酶；

(6)10×L Buffer

(7)Big-Dye mix

2、使用方法

主要包括如下步骤：

1)PCR扩增

采集待测个体的样本(血液、体液、组织等)，提取DNA，用上述针对各突变基因的引物分别进行PCR扩增；

2)PCR产物纯化

将含有PCR产物的MultiScreen-PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随后将MultiScreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后转移至另一洁净的96孔板中；

3)测序反应及验证

将上述扩增的针对各突变位点的PCR产物以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于ABI PRISM 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与Genbank中的标准序列比较可以发现突变位点；

4)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在相应的氨基酸突变位点。

具体方法参见前面实施例中的详细描述。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

Claims (1)

1.一种用于检测是否存在SLC26A4基因外显子2的109G＞T杂合突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增样本DNA中SLC26A4基因第109位碱基的PCR引物；以及下述一种或几种试剂的组合：

从待测样品中提取DNA的试剂；

相应的PCR反应试剂；

对PCR扩增产物进行测序的试剂；

其中所述的PCR引物为：

PDS2-F：5’-CAGGACGCGGACCAGACT-3’

PDS2-R：5’-CGAGACTGATGGAGCCACCCTC-3’。

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