CN101198617A - 合成的基因调控区 - Google Patents

合成的基因调控区 Download PDF

Info

Publication number
CN101198617A
CN101198617A CNA2006800210291A CN200680021029A CN101198617A CN 101198617 A CN101198617 A CN 101198617A CN A2006800210291 A CNA2006800210291 A CN A2006800210291A CN 200680021029 A CN200680021029 A CN 200680021029A CN 101198617 A CN101198617 A CN 101198617A
Authority
CN
China
Prior art keywords
control region
yeast
sequence
gene
binding site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800210291A
Other languages
English (en)
Inventor
M·库尔茨
J·布赖恩
M·K·布朗洛
L·舒尔茨
M·C·洛萨达
K·扬森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck and Co Inc
Original Assignee
Merck and Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck and Co Inc filed Critical Merck and Co Inc
Publication of CN101198617A publication Critical patent/CN101198617A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种合成的基因调控区，所述合成的基因调控区包括：包含酵母菌株的基因调控蛋白的结合位点的合成的基因调控序列，和位于所述合成的基因调控序列下游的来自丝状真菌菌株的启动子；其中，所述启动子能够被该酵母菌株的通用转录因子和RNA聚合酶识别；其中，所述合成的基因调控序列能够调节由所述酵母菌株中的丝状真菌启动子引发的转录。

Description

合成的基因调控区
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年6月14日提交的美国临时申请序号为60/690,321的优先权，此处通过引入的方式而引用。
发明背景
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或面包酵母广泛用作用于各种异源多肽表达的宿主。来自多种物种的许多不同蛋白质已经在酿酒酵母中被表达，有的至水平＞总细胞蛋白质的10％。表达通常通过质粒调节，该质粒包含编码异源多肽的DNA序列和酿酒酵母中调控基因表达的基因调控区，以及在酿酒酵母和大肠杆菌中筛选和扩增该质粒所需的其他序列。作为选择，也可以将所述编码序列和基因的调控区整合入酿酒酵母的染色体并实现高水平表达。
用于酿酒酵母中异源多肽的表达的基因调控区通常是天然存在于酿酒酵母中的那些基因调控区，例如，用于表达反向的GAL1和GAL10基因的基因调控区。相反，当异源基因调控区用于酿酒酵母细胞时，通常已经发现其是无活性的，或产生异常的转录起始。因而已提出使用酿酒酵母的基因调控区对于酿酒酵母细胞中异源基因的有效表达是必不可少的(Romanos等，YEAST 8：423-488(1992))。
此处引用的参考文献不被允许作为所要求的发明的现有技术。
发明概述
本发明涉及一种合成的基因调控区，所述合成的基因调控区包括：包含酵母菌株的基因调控蛋白的结合位点的合成的基因调控序列，和位于所述合成的基因调控序列下游的来自丝状真菌菌株的启动子。所述丝状真菌启动子能够被酵母菌株的通用转录因子和RNA聚合酶识别。所述合成的基因调控序列能够调节由所述酵母菌株中的丝状真菌启动子引发的转录。所述基因激活子的结合位点优选合成的结合位点。
根据本发明的一个实施方式，所述酵母菌株选自由酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)和Yarrowia lipolytica组成的组。根据本发明的一个优选实施方式，所述酵母菌株是酿酒酵母。根据本发明的一个替代性实施方式，所述酵母菌株是巴斯德毕赤氏酵母。
所述丝状真菌菌株可选自由玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和Penicillium purpurogenum组成的组。所述丝状真菌启动子可选自由玉米黑粉菌DPM1基因的启动子、构巢曲霉ArgB基因的启动子和Penicillium purpurogenum XynA基因的启动子组成的组。
根据本发明的一个实施方式，所述结合位点是用于酵母菌株的基因激活子。根据本发明的一个优选实施方式，所述结合位点是酿酒酵母的GAL4蛋白的结合位点。根据本发明的其他优选实施方式，所述结合位点包含选自由SEQID NO：10、11、12和15组成的组的序列，合成的GAL4结合位点。
所述基因调控序列还可包含酵母菌株的基因阻遏子的结合位点。根据本发明的一个实施方式，所述基因阻遏子的结合位点是酿酒酵母的MIG1蛋白的结合位点。根据本发明的一个优选实施方式，MIG1蛋白的结合位点包含选自由SEQ ID NO：18、19和20组成的组的序列。
根据本发明的一个优选实施方式，所述合成的基因调控区可包含选自由SEQ ID NO：21、22、23、24、25和26组成的组的序列。
本发明提供DNA表达载体，所述载体包含所述合成的基因调控区、在所述调控区的控制下编码蛋白质、多肽或肽的编码序列和酵母选择标记物。所述编码序列可编码真核生物、原核生物或病毒的氨基酸序列。如果所述酵母菌株是酿酒酵母，所述选择标记物可选自由LEU2、TRP1、URA3和HIS3组成的组。
所述DNA表达载体还可以包含位于编码序列下游的聚腺苷酸化信号序列。该DNA表达载体还可包含位于编码序列下游的转录终止子。该DNA表达载体还可包含酵母复制起点，例如基于酿酒酵母2μm DNA序列(2 micronDNA sequence)的复制起点。该DNA表达载体还可包含细菌复制起点。
本发明进一步提供包含所述DNA表达载体的酵母菌株。所述酵母菌株可选自由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)和Yarrowia lipolytica组成的组。
本发明的其他特征和优点将由此处提供的包括不同实施例的附加描述而变得清楚。所提供的实施例描述了用于实施本发明的不同要素和方法学。所述实施例并不限制所说明的发明。基于本公开，本领域的技术人员可鉴别并使用用于实施本发明的其他要素和方法学。
附图说明
图1：来自丝状真菌的启动子。可能的TATA框，标有下划线(波浪线)的转录起始位点。假定的MIG1结合位点以下划线(虚下划线)显示。
图1A：截断的XynA启动子序列(SEQ ID NO：1)。
图1B：DPM1启动子序列(SEQ ID NO：2)。
图1C：ArgB启动子序列(SEQ ID NO：3)。
图2：包含截断的XynA启动子和基因调控区的合成的基因调控区。假定的GAL4蛋白质结合位点以下划线显示。假定的MIG1蛋白结合位点以下划线(虚下划线)显示。
图2A-2F是所述合成的基因调控区的DNA序列。
图2A：EE2-XynA(SEQ JD NO：21)。
图2B：EE21-XynA(SEQ ID NO：22)。
图2C：EE22-XynA(SEQ ID NO：23)。
图2D：EE24-XynA(SEQ ID NO：24)。
图2E：EE25-XynA(SEQ ID NO：25)。
图2F：EE26-XynA(SEQ ID NO：26)。
图3：酿酒酵母中异源多肽的表达，分别由不同的合成的基因调控区和酵母天然存在的GAL1-GAL10基因调控区驱动。泳道2-5是来自半乳糖诱导的酵母细胞的样品。泳道6-9是来自在葡萄糖的存在下生长且未由半乳糖诱导的酵母细胞的样品。
具体实施方式
正如上述讨论的，广泛用于酵母中异源蛋白质表达的基因调控区一般是天然存在于酿酒酵母(例如，用于表达反向的GAL1和GAL10基因的基因调控区)中并且通常调控相应的酿酒酵母基因表达的那些基因调控区。相反，本发明提供一种不是天然存在的合成的基因调控区。如本文使用的，“基因调控区”是调控基因转录，即转录起始速率的DNA序列(Alberts等，Molecular Biology of theCell，3rd Edition，Garland Publishing；1994)。本发明的合成的基因调控区可用于调节酵母菌株中异源基因的表达。
1.酵母菌株
如本文使用的，术语“酵母”指任一种没有叶绿素和脉管组织，并且通过出芽或分裂生殖繁殖的单细胞真核生物，例如酵母属。酵母属由多种种属构成，包括酿酒酵母(cerevisiae)、卡尔斯伯酵母(carlsbergensis)、norbensis、糖化酵母(diastaticus)、oviformis、葡萄汁酵母(uvarum)、rouxii、montanus、克卢费氏酵母(kluyveri)和elongisporus。
根据本发明的一个优选实施方式，所述酵母菌株是酿酒酵母。如上所述，酿酒酵母通常用作用于各种异源多肽表达的宿主。用于重组体表达的酿酒酵母宿主细胞可被筛选或工程改造以促进重组体基因表达。因为菌株的遗传背景可极大影响用于异源蛋白质表达的菌株的性质，希望构造具有不同遗传背景的包含几个合乎需要的遗传标记的酵母菌株：防止分泌蛋白质的超糖基化的mnn9突变体，以及减少蛋白酶解的问题的prb1和/或pep4蛋白酶突变体(Joyce等，U.S.专利5,820,870)。对于包含GAL4结合位点的合成的基因调控区，可在宿主酿酒酵母株中实现GAL4转录因子的过表达，从而增强来自调控区的表达(Hopper等，U.S.专利5,068,185).
而且，几个酵母属，例如汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)和毕赤氏酵母属(Pichia)已经显示出包含对于利用甲醇作为用于生长的唯一碳源的相似的代谢途径。而且，其他种类的酵母属可利用多种碳源(包括半乳糖)生长。所述酵母菌株可来自酵母科和隐球酵母科家族，包括但不限于来自毕赤氏酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)和复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)的种属。
具体地说，所述酵母菌株也可选自由巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、Yarrowia lipolytica、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Schwanniomyces occidentalis组成的组。这些酵母菌株也用作异源基因表达的宿主生物体，类似于酿酒酵母。(例如，参见Buckholz和Gleeson，Bio/Technology 9：1067-1072(1991)；Gellisen和Hollenberg，Gene 190：87-97(1997)；Dominguez等，Int.Micobiol.1：131-142(1998)).
根据本发明的一个实施方式，所述酵母菌株是picliia pastoris。(例如，参见Werten等，Yeast 15：1087-1096(1999)；Cregg等，MoI..16，23-52(2000))
根据本发明的另一个实施方式，所述酵母菌株是多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。
根据本发明的一个实施方式，所述酵母菌株是Yarrowia lipolytics。(Muller等，Yeast 14：1267-1283(1998)；Madzak等，Journal of Biotechnology，109：63-81(2004)).
2.合成的调控区
本发明提供一种合成的基因调控区，其包括包含酵母菌株中基因调控蛋白结合位点的合成的基因调控序列，和位于该基因调控序列下游的来自丝状真菌菌株的启动子。该合成的基因调控区是特异的DNA序列。所述结合位点的序列优选不是酵母菌株中天然存在的基因调控区中的序列。
如本文使用的，术语“丝状真菌”指任一种多细胞真核生物，该多细胞真核生物没有叶绿素和脉管组织，并且形成常常产生特化子实体的分枝的丝状菌丝块。丝状真菌的实例包括玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)和Penicillium purpurogenum。
2.1.启动子
真核细胞中的转录需要RNA聚合酶和通用转录因子在启动子处装配。如本文使用的，“启动子”是RNA聚合酶和通用转录因子装配处的DNA序列。启动子可包含TATA框和转录起始点。TATA框是被通用转录因子TFIID识别的T-A和A-T碱基对的短序列。哺乳动物细胞中，转录起始点通常位于TATA框(如上)下游的25碱基对。酵母中，TATA框到转录起点的距离通常约为100碱基对。
所述合成的基因调控区的启动子是来自丝状真菌菌株的启动子，可被酵母菌株的通用转录因子和RNA聚合酶识别，例如酿酒酵母(Romanos等，YEAST8：423-488，(1992))。
丝状真菌启动子的实例包括XynA基因、DPM1基因和ArgB基因的启动子(图1)(Zimmerman等，Yeast 12：765-771(1996)，Upshall等，MoI.Gen.Genet.204：349-354(1986)，Chavez等，Biol.Res.34：217-226(2001))。
2.2.基因调控序列
基因调控序列包含至少一个基因调控蛋白的结合位点，其在DNA上的存在影响转录起始的速率。基因调控蛋白质包括刺激基因表达的基因激活子和抑制基因表达的基因阻遏子。转录起始的速率可通过基因调控蛋白在相应基因调控序列的结合增大或见效。如本文使用的，“结合位点”指基因调控区中基因调控蛋白特异结合的DNA序列。
基因调控蛋白的结合位点最初由天然存在的基因调控区鉴别。根据已鉴别的给定基因调控蛋白的结合位点，可推断出假定的结合位点序列的共有序列。根据本发明的一个优选实施方式，该结合位点是合成的结合位点。如本文使用的，“合成的结合位点”是指不是从天然存在的基因调控区鉴别，而是考虑基因调控蛋白假定的共有序列而构建的结合位点。
真核类基因调控序列可能与启动子邻接、位于启动子的远端上游以至启动子的下游。(Alberts等，Molecular Biology of the Cell，3rd Edition，Garland Publishing；1994)。例如，酿酒酵母的基因调控序列通常位于启动子上游的几百个碱基对处。酿酒酵母的基因调控序列可通过结合转录因子刺激和/或抑制在它控制下的基因表达。基因调控序列的实例包括来自GAP(TDH)、PGK、TPI、PH05、ADH2，和CUP1基因的序列(Romanos等，YEAST 5：423-488，(1992))。
基因调控序列也决定一个基因调控区是组成型，即，驱动连续的基因表达，还是诱导型，即驱动响应信号的基因表达。例如，GAP(TDH)、PGK和TPI基因的基因调控区是组成型基因调控区域(Romanos等，YEAST 5：423-488(1992))。
基因调控序列优选是诱导型序列，其响应于一个或多个信号调节转录。在多种重组酵母表达系统中，例如酿酒酵母，许多不同异源多肽的表达往往证明对寄主细胞是有害的。因此，对这样的异源多肽的表达可能存在选择压力，因而使得在这种重组体培养的放大中，只有那些不表达异源多肽或少量表达异源多肽的细胞发生积累，所述少量表达使得所述培养成为该多肽的不经济的来源。这种重组体培养放大试验的最佳方案是在该培养发展到大量和高细胞密度期间维持最低的异源基因表达或不表达异源基因，然后仅仅在产品分离前的培养生长终期诱导异源基因的最大表达。因此，用于重组体基因表达的合成的基因调控区优选可诱导的基因调控区。
酿酒酵母GAL1-GAL10基因的基因调控序列是可诱导的基因调控序列。GAL1-GAL10的基因调控序列对半乳糖和葡萄糖响应。它涉及酿酒酵母中半乳糖代谢的调节，通过对负责利用半乳糖作为碳源的酶的受控表达，例如GAL1(半乳糖激酶)和GAL10(尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖酶-4-差向异构酶)(Lohr等，FASEBJ 9：777-787(1995))。在缺少半乳糖时，几乎检测不到这些酶的表达。如果细胞最初生长在含有葡萄糖的培养基中，并且向培养物中添加半乳糖，刚一耗尽培养基中的葡萄糖这些酶就相应的被诱导至少1000倍。这些诱导已显示mRNA转录水平的发生。
实验已详细说明基因调控区对半乳糖的诱导是必要和足够的，因此对驱动酿酒酵母中异源基因的表达有用。GAL1和GAL10基因是反向转录的。GAL1-GAL10基因调控区是位于这两个基因间约606bp的序列，包括GAL1和GAL10启动子和对半乳糖及葡萄糖响应的可诱导的基因调控序列。606bp序列用于pGAL110，约12.0kbp的酵母表达质粒(Hofmann等，Virology 209：506-518(1995))，以驱动酿酒酵母中下游的异源基因的表达。
GAL1-GAL10基因调控序列包含GAL4蛋白结合位点，对半乳糖响应的酵母基因激活子。GAL4蛋白结合位点的实例列于表1中。
表1-1
SEQ ID NO：  GAL4结合位点   参考文献
4   CGGATTAGAAGCCGCCG   West，et al.，Mol.Cell Biol.4：2467-2478(1984)
5   CGGGTGACAGCCCTCCG   ibid.
6   AGGAAGACTCTCCTCCG   ibid.
7   CGCGCCGCACTGCTCCG   ibid.
8   CGGAGGACTGTCCTCCG   Bram，et al.，EMBO J.5：603-608(1986)
9   CGGAGCACTCTCCTCCG   Melcher，et al.，Gene 247：53-61(2000)
列于表1-2的SEQ ID NO：4-9序列是在酿酒酵母中天然存在的基因调控区中识别的GAL4结合位点。
表1-2
SEQ ID NO：  GAL4结合位点
10   CGGATGACACTCCTCCG   假定的新序列
11   CGGGCCACTGTCGTCCG   ibid.
12   GGTCGAGGCCATCCCCG   ibid.
13   CGGACGACTGTGGTCCG   Bram，et al.，EMBO J.5：603-608(1986)
14   CGGGCGACACTCCTCCG   Bram，et al.，EMBO J.5：603-608(1986)
15   AGGTCGAGGCCATCCCG   ibid.
列于表1-2的SEQ ID NO：10-12和SEQ ID NO：15序列是合成的GAL4结合位点，其未在酿酒酵母中天然存在的基因调控区中被识别。SEQ ID NO：13和14序列是在酿酒酵母中天然存在的基因调控区中识别的GAL4结合位点。
GAL1-GAL10基因调控序列也包含MIG1蛋白结合位点，其是对葡萄糖响应的酵母基因阻遏子。MIG1蛋白结合位点的实例列于表2中。
表2-1
SEQ ID NO：   MIG1结合位点   参考文献
16   TATTTCTGGGGTA   Nehlin，et al.EMBO J.10：3373-3377(1991)
17   GGTTTGTGGGGCC   ibid.
SEQ ID NO：16-17序列是酿酒酵母中天然存在的基因调控区中识别的MIG1结合位点。
表2-2
SEQ ID NO：  MIG1结合位点
18   GCATACCGGGGCC   假定的新序列
19   ATTATGTGGGGTA   ibid.
20   AAAATCTGGGGAA   ibid.
SEQ ID NO：18-20序列是合成的MIG1结合位点，其未在酿酒酵母中天然存在的基因调控区中被识别。
合成的基因调控区经过构建以包括丝状真菌启动子和酵母转录因子的结合位点，例如GAL4和MIG1。根据优选实施方式，所述合成基因调控区在存在葡萄糖时被抑制，并在存在半乳糖且缺少葡萄糖时被激活。
图2显示合成基因调控区的一些实例，包括EE2-XynA(图2A，SEQ ID NO：21)、EE21-XynA(图2B，SEQ ID NO：22)、EE22-XynA(图2C，SEQ ID NO：23)、EE24-XynA(图2D，SEQ ID NO：24)、EE25-XynA(图2E，SEQ TD NO：25)和EE26-XynA(图2F，SEQ JD NO：26)。
3.表达载体
本发明提供一种DNA表达载体，其包含合成的基因调控区、在所述调控区的控制下编码多肽的DNA序列和酵母选择标记物。
3.1载体的构成要素
所述载体可以是整合型载体，其可整合入酵母染色体，或是附加型载体。为了在酿酒酵母细胞中被维持，附加型载体需要包括将被复制的复制起点。复制起点的实例包括酵母自主复制序列(ARS)，和从酿酒酵母天然的2μ环获得的序列。ARS载体可通过酵母着丝粒序列(CEN)稳定。通常，ARS/CEN载体的拷贝数约为每个细胞1或2，而基于2μ载体的拷贝数约为每个细胞10或40。(Romanos等，YEAST 8：423-488(1992))
所述表达载体可包含酵母选择标记物，即编码用于酵母中表型选择的多肽的基因。所述选择标记物可以是营养缺陷的选择标记物，包括LEU2、TRP1、URA3和HIS3，其用于相应的突变株，即分别对亮氨酸、色氨酸、尿嘧啶和组氨酸营养缺陷的突变株。所述选择标记物可以是显性的选择标记物，例如CUP1，其赋予酵母铜-抗性。同前。
为了分子扩增表达载体可能需要在细菌细胞中复制。因此，所述表达载体可包含细菌复制起点。所述表达载体也可包含细菌选择标记物，即编码用于细菌中表型选择的多肽的基因。所述细菌选择标记物可以是抗生素抗性标记物。所述细菌选择标记物的实例包括分别赋予氨苄青霉素、卡那霉素、四环素和氯霉素抗性的基因。
为了有效形成mRNA的3′端(end)，所述表达载体可包含位于异源基因下游的转录终止子。终止子可从TRP1、ADH1、GAP、MFα1和CYC1获得。同上。
3.2.酿酒酵母中表达的异源编码序列
编码蛋白质、多肽或肽的编码序列可处于表达载体DNA中的调控区的控制下。该编码序列可编码真核生物、原核生物或病毒的氨基酸序列。
由于遗传密码的简并性，许多不同的编码核酸序列可用于编码特定的氨基酸序列。因为几乎所有的氨基酸是通过不同的核苷酸三联体或“密码子”的组合编码，所以出现遗传密码的简并性。氨基酸通过如下密码子编码：
A＝Ala＝丙氨酸：密码子GCA、GCC、GCG、GCU
C＝Cys＝半胱氨酸：密码子UGC、UGU
D＝Asp＝天冬氨酸：密码子GAC、GAU
E＝Glu＝谷氨酸：密码子GAA、GAG
F＝Phe＝苯丙氨酸：密码子UUC、UUU
G＝Gly＝甘氨酸：密码子GGA、GGC、GGG、GGU
H＝His＝组氨酸：密码子CAC、CAU
I＝Ile＝异亮氨酸：密码子AUA、AUC、AUU
K＝Lys＝赖氨酸：密码子AAA、AAG
L＝Leu＝亮氨酸：密码子UUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU
M＝Met＝甲硫氨酸：密码子AUG
N＝Asn＝天冬酰胺：密码子AAC、AAU
P＝Pro＝脯氨酸：密码子CCA、CCC、CCG、CCU
Q＝Gln＝谷氨酰胺：密码子CAA、CAG
R＝Arg＝精氨酸：密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU
S＝Ser＝丝氨酸：密码子AGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU
T＝Thr＝苏氨酸：密码子ACA、ACC、ACG、ACU
V＝Val＝缬氨酸：密码子GUA、GUC、GUG、GUU
W＝Trp＝色氨酸：UGG
Y＝Tyr＝酪氨酸：密码子UAC、UAU
如果需要，异源多肽在特殊宿主中的表达可通过密码子的优化而增强。密码子优化包括使用更优选的密码子。不同宿主中密码子优化的技术在本领域中是公知的。
通过利用高使用水平的密码子替换低或中度使用水平密码子可以实行特殊宿主的密码子优化。可以改变存在于编码序列中的最佳密码子的百分比。在不同的实施方式中，最佳密码子的数目(包括最初存在的密码子和引入的密码子)是密码子总数的至少50％，至少75％，至少95％或100％。
密码子的优化可如下进行：
1.对于特殊的密码子，通过酵母基因比较野生型密码子的频率与使用的总的密码子的频率。
2.如果该密码子不是酵母通常使用的那些密码子之一，利用最佳密码子将其替换以用于酵母细胞中的高表达。
3.对不同的密码子重复步骤(1)和(2)，直到实现密码子优化的所需水平。
4.检查新的编码序列中产生的不需要序列，例如无用的限制性内切酶位点、剪接位点、启动子、不需要的回文结构或重复序列、转录终止子序列和高频率的GC碱基。利用替换的密码子除去不需要的序列。
选择性密码子的用法(codon usage)由Lathe J.Molec.Biol，183：1-12，1985定义。不同宿主中的密码子的用法在本领域中是公知的。例如，Sharp等，Yeast7：657-678，1991，描述了酿酒酵母中同义密码子的用法。
酵母表达可通过同时使用优化的序列和未对酵母表达优化的序列而实现。
用于重组体基因生产、引入细胞和重组体基因表达的技术是本领域中公知的。上述技术的实例提供于下列参考文献：例如Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley，1987-2002和Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
实施例
下面提供实例以进一步描述本发明的不同特征。实施例也描述了用于实施本发明的有用的方法学。这些实施例并不限制所说明的发明。
实施例1：载体构建
为了分析合成的调控区在酿酒酵母中驱动基因表达的能力，通过BamHI和XmaI消化从pGAL110中除去GAL1-GAL10基因调控区，以形成11.3kbp的质粒pFUNGI。将合成的基因调控区和异源基因插入pFUNGI。例如，将携带或不携带优化的编码异源蛋白质(HP)的基因EE22-XynA(图2C，SEQ ID NO：25)和EE25-XynA(图2E，SEQ ID NO：27)插入pFUNGI，以分别形成pF25MCS、pF25MCS-HP和pF22MCS-HP。异源基因也插入pGAL110以形成pGAL110-HP作为对照。
实施例2：酿酒酵母表达
通过利用原生质体转化流程所述载体用于将包含Leu2突变体的酿酒酵母菌株转化为亮氨酸原养型(Leu+)。(Hinnen等，Proc.Nail.Acad.Sci U S A，75：1929-33，1978)
在没有亮氨酸并且包含1.0M山梨糖醇的合成琼脂培养基中筛选转化体。所有的没有亮氨酸并且包含1.0M山梨糖醇的合成琼脂培养基由REMEL，Lenexa，KS(分别为cat#09459和92155)获得。通过在SD-亮氨酸平皿上连续生长获得纯系的Leu+分离菌。(KD MEDICAL，Columbia MD)
为了在试管中生产，0.3ml等分试样的种子培养物转移到5.0ml的5x亮氨酸minus培养基(包含1.6％葡萄糖、4％半乳糖)中，或者转移到YEHDG培养基中，在28-30℃培养72小时以达到最终OD60O为5-16.0/ml。YEHDG培养基在每公升中包含：L-Hy-大豆蛋白胨-Sheffield，10g；酵母抽提物，20g；L-葡萄糖，16g；D(+)半乳糖，40g。为了在烧瓶中生产，1.5ml等分试样的种子培养物转移到上述25ml培养基中并在220rpm的摇动条件下生长。
每个样本收获10OD600单位的细胞后，细胞沉淀在0.3ml裂解缓冲剂(0.1M磷酸钠缓冲剂，pH 7.2，0.5M NaCl，2mM PMSF)中利用玻璃珠破碎。利用离心分离回收溶胞产物。根据厂家说明书通过Pierce BCA测定确定蛋白质浓度。在1X Tris-甘氨酸十二烷基磺酸钠缓冲剂中在还原和变性条件对Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen，Carlsbd，CA)进行电泳后，通过免疫印迹分析法分析细胞裂解物(cell lysate)的异源基因表达。所述样品包含总的细胞蛋白质。将凝胶Western转移到0.45微米的硝酸纤维素滤膜上(Invitrogen)。为了估算蛋白质大小，预染的标准样品与溶胞产物同时运行。
实施例3：由合成的基因调控区驱动的异源基因表达
异源蛋白质在大肠杆菌和酿酒酵母中表达并比较表达产物。
在耗尽葡萄糖后通过半乳糖诱导，异源蛋白质在所有检验的转化的酿酒酵母菌株中表达。图3(泳道2、3和4)中显示出：利用抗异源蛋白质的单克隆抗体(1∶5,000)通过蛋白质印迹分析检测由酿酒酵母制造的主要的蛋白质(500ng蛋白质/泳道)，其分子量为～105-110kDa。该～105-110kDa的蛋白质略小于纯化的大肠杆菌重组体产生的His-标签异源蛋白质(泳道1)样品中检测到的最大的蛋白质带，如His-标签加入至对照物的分子量。只包含pF25MCS载体的对照转化体的提取物中没有发现可检测信号(泳道4)。
利用pGAL110-HP转化的菌株中的异源基因表达水平可与由pF25MCS-HP得到的表达水平相比，但是大于由pF22MCS-HP得到的表达水平。因此，在驱动酿酒酵母中异源基因的表达时，合成的基因调节区EE25-XynA与天然存在的GAL1-GAL10基因调节区一样强。
对于生长在葡萄糖中的细胞，蛋白质印迹没有观察到蛋白质条带，这表明在转化的酿酒酵母中没有表达异源基因或其表达水平极低(图3，泳道7、8和9)。因此，表达被合成的基因调控区EE22-XynA和EE25-XynA控制，并在葡萄糖的存在下被抑制。这与来自GAL1-GAL10基因的天然存在的调控区的抑制相似。
其他实施方式也在下列权利要求的范围之内。虽然已经显示并描述了几个实施方式，但在不脱离本发明的精神和范围时可以进行各种改进。
序列表
<110>Merck & Co.，Inc.
<120>合成的基因调控区
<130>21624Y
<150>60/690,321
<151>2006-05-14
<160>26
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>318
<212>DNA
<213>Penicillium purpurogenum
<400>1
ggatattcgt ttagttagcc cctctactat gacattactt ctcctgggat cctataagca 60
aatcaatcgg ggagatgata ctgtaatgaa gaggacccta ggtgactacg atcttgtata 120
agtatcaggg ttgatccctc caaatgatag ccactgatgc tagaacatat tcatagtccc 180
aactagggag gtttactatc ctttcttcaa catcgactct cataatcgat atacttgaaa 240
acccaacaca gaaagaagtt gtagctgaga gtattagcta tatgaacttt tgggttgtgt 300
tcactcaaaa gtgagttt                                               318
<210>2
<211>372
<212>DNA
<213>Ustilago maydis
<400>2
ttgacgacac aaccacggag cgggtgttac ttcttctcac tcacgattct aactgctgtg 60
ttggtgcctc gcccacaatg aagaagagtg agtgctaaga cgattctcga ttcacggttc 120
tcgattctcg ccgtcttggt ctttgggaag gctaagagct aagtgccaag agctaagagc 180
ggcagaacca gaaacccttc gatcagctgc cgagctggac caccgaccac catcggtctt 240
agctacaaca ctagtcgacg gctcgacctg gtggctggtg gtagccagaa tcgatgttgt 300
accgctccaa atcactcata cacgtctaga atctcatggc gaggtttagt gagtatgtgc 360
agatcttaga gt                                                     372
<210>3
<211>1404
<212>DNA
<213>Aspergillus nidulans
<400>3
aagctttatt tcgcggtttt ttggggtagt catctaatga aacagacccg ttcgaaataa 60
agcgccaaaa aaccccatca gtagattact ttgtctgggc gacgcagcag aggaagcccc 120
gcgatgactc tataccaccg tacgccgata ctgcgtcgtc tccttcgggg cgctactgag 180
atatggtggc atgcggctat tatcatcatc gcggcgatgg agaagtgggg ttgactccga 240
agacacttca atagtagtag cgccgctacc tcttcacccc aactgaggct tctgtgaagt 300
aaggagcgac gctgttgatt tgtagacgac gcttgatagg gagaagcatt ttcctcgctg 360
cgacaactaa acatctgctg cgaactatcc ctcttcgtaa attgtcgtga tgctcgccca 420
acagaggccg actcgcctca tccgtcataa taacagcact acgagcgggt tgtctccggc 480
tgagcggagt aggcagtatt cgaacgctgt gtaaagcgga gtggggggga aagtgtggat 540
tgtggagagt gcttgcgaca catttcgcct caccccccct ttcacaccta acacctctca 600
atgcgatagt gttgaggctg atcagacggc gaatcgggcc agatatgacc tacgctatca 660
caactccgac tagtctgccg cttagcccgg tctatactgg agtttagagg cctcatttga 720
ctataattta cataaattag ataaatagag tcaaatctcc ggagtaaact gatattaaat 780
gtatttaatc tatttatctc atgaacgcat gcaataattg cagcaaatat tgatgaagcg 840
agaggtagga tacttgcgta cgttattaac gtcgtttata actacttcgc tctccatcct 900
cgatgaagga ctgtgagcag ttcaaggtat cagcagagtc aagggcctga gctacttcct 960
gacactcgtc aagttccata gtcgtctcag ttcccggact tgcaatggcg gtgatccgtg 1020
atcagcgaac ggaaggggcg ctaactctgt acgttaccgc cactaggcac tagtcgcttg 1080
ccttccccgc gattgagaca ttctttacca atgatcggaa gctcctgctg gcggacttat 1140
gagtcattca aagaaatggt tactagcctt cgaggacgac cgcctgaata ctcagtaagt 1200
cgaatcattt ctcagttatt tgtggatgcc ctcgttctgt ccacaatttc gcttagtaaa 1260
gagtcaataa acacctacgg gagcaagaca ggtgttaaag tttccgcccc aagtctttta 1320
agttctttaa catctatatt cttgcacttc aaaggcgggg ttcagaaaat tcaagaaatt 1380
gtagatataa gaacgtgaag cagt                                        1404
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>4
cggattagaa gccgccg                 17
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>5
cgggtgacag ccctccg                 17
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>6
aggaagactc tcctccg                 17
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>7
cgcgccgcac tgctccg                 17
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>8
cggaggactg tcctccg                 17
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>9
cggagcactc tcctccg                 17
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的GAL4结合位点
<400>10
cggatgacac tcctccg                 17
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的GAL4结合位点
<400>11
cgggccactg tcgtccg                 17
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的GAL4结合位点
<400>12
ggtcgaggcc atccccg                 17
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>13
cggacgactg tggtccg                 17
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>14
cgggcggcac tcctccg                 17
<210>15
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的GAL4结合位点
<400>15
aggtcgaggc catcccg                 17
<210>16
<211>13
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>16
tatttctggg gta                     13
<210>17
<211>13
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>17
ggtttgtggg gcc                     13
<210>18
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的MIG1结合位点
<400>18
gcataccggg gcc                     13
<210>19
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的MIG1结合位点
<400>19
attatgtggg gta                     13
<210>20
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的MIG1结合位点
<400>20
attatgtggg gta                     13
<210>21
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的基因调控区
<400>21
aaaatctggg gaa                     13
<210>22
<211>872
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的基因调控区
<400>22
gagacagccc tcggagcact ctcctccgag cgtgagcctc aggtcgaggc cactgtcggg 60
agcctcgtga gaggaggctc gcactcggag tccagctccg gtgatcgcga tgcacttaca 120
tcaggtgcgc tcgtgcgtta ctaatgcgga ggacagcgct acgtgaatgt agtccacgcg 180
agcacgcaat gattacgcct cctgtgtcct ccgatctatt gacgtattta cgtatactag 240
gagaataaat cgctacagga ggctagataa ctgcataaat gcatatgatc ctcttattta 300
gcgamggata gctcgccccg gtatgcaatc attctacata cgttaaaatc gaactactat 360
cgagcggggc catacgttag taagatgtat gcaattttag cttgatcgaa tataggatcg 420
tttttcaatt tacggatatt ctggtggtat tattatgctt atatcctagc aaaaagttaa 480
atgcctataa gaccaccata ataatamgmg tatgtggggt gttaatttct agggatattc 540
gtttagttag cccctctact atacacccca caattaaaga tccctataag caaatcaatc 600
ggggagatga atgacattac ttctcctggg atggtgacta cgatcttgta taagtatcag 660
tactgtaatg aagaggaccc taccactgat gctagaacat attcatagtc ggttgatccc 720
tccaaatgat agctttcttc aacatcgact ctcataatcg ccaactaggg aggtttacta 780
tcgaaagaag ttgtagctga gagtattagc atatacttga aaacccaaca catcactcaa 840
atatatgaac ttttgggttg tgtagtgagt tt                               872
<210>23
<211>912
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的基因调控区
<400>23
gagagacagc cctcggagca ctctcctccg tccgtgaccg tcaggtcgag gccactgtcg 60
ggagcctcgt gagaggaggc aggcactggc agtccagctc cggtgatccc gatgcactta 120
catcaggtcc gctcgtgcct tactaatccg gaggacaggg ctacgtgaat gtagtccagg 180
cgagcacgga atgattaggc ctcctgtgtc ctccgatcta ttgacgtatt tacgtatact 240
aggagaataa atcgctacag gaggctagat aactgcataa atgcatatga tcctcttatt 300
tagcgamgga tagctcatca ttctatgcaa tcattcccca gattttgcta tcgaactact 360
atcgagtagt aagatacgtt agtaaggggt ctaaaacgat agcttgatcg aatataggat 420
cgtttaacaa tttacggttt ttctggtggt attagcaagc ttatatccta gcaaattgtt 480
aaatgccaaa aagaccacca taatcgttmg aatctgggga attaattgtc cacgagcagg 540
attttttgtc aggatattcg ttagacccct taattaacag gtgctcgtcc taaaaaacag 600
tcctataagc mgtttagtta gcccctctac tatgacatta cttctcctgg gatggtgact 660
acaaatcaat cggggagatg atactgtaat gaagaggacc ctaccactga tggatcttgt 720
ataagtatca gggttgatcc ctccaaatga tagctttctt cactagaaca tattcatagt 780
cccaactagg gaggtttact atcgaaagaa gtacatcgac tctcataatc gatatacttg 840
aaaacccaac acatcactca aatgtagctg agagtattag ctatatgaac ttttgggttg 900
tgtagtgagt tt                                                     912
<210>24
<211>872
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的基因调控区
<400>24
gagacagccc tcggatgaca ctcctccgag cgtgagcctc aggtagaggc cactgtcggg 60
agcctactgt gaggaggctc gcactcggag tccatctccg gtgatcgcga tgcacttaca 120
tcaggtgcgc tcgtgcgtta ctaatgcggg ccacagcgct acgtgaatgt agtccacgcg 180
agcacgcaat gattacgccc ggtgtgtcgt ccgatctatt gacgtattta cgtatactag 240
gagaataaat ccgtacagca ggctagataa ctgcataaat gcatatgatc ctcttattta 300
ggcamggata gctcgccccg gtatgcaatc attctacata cgttaaaatc gaactactat 360
cgagcggggc catacgttag taagatgtat gcaattttag cttgatcgaa tataggatcg 420
tttttcaatt tacggatatt ctggtggtat tattatgctt atatcctagc aaaaagttaa 480
atgcctataa gaccaccata ataatamgmg tatgtggggt gttaatttct agggatattc 540
gtttagttag cccctctact atacacccca caattaaaga tccctataag caaatcaatc 600
ggggagatga atgacattac ttctcctggg atggtgacta cgatcttgta taagtatcag 660
tactgtaatg aagaggaccc taccactgat gctagaacat attcatagtc ggttgatccc 720
tccaaatgat agctttcttc aacatcgact ctcataatcg ccaactaggg aggtttacta 780
tcgaaagaag ttgtagctga gagtattagc atatacttga aaacccaaca catcactcaa 840
atatatgaac ttttgggttg tgtagtgagt tt                               872
<210>25
<211>908
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的基因调控区
<400>25
gagacagccc tcggatgaca ctcctccgag cgtgagcctc aggtcgaggc cactgtcggg 60
agcctactgt gaggaggctc gcactcggag tccagctccg gtgatcgcga tgcacttaca 120
tcaggtgcgc tcgtgcgtta ctaatgcggg ccacagcgct acgtgaatgt agtccacgcg 180
agcacgcaat gattacgccc ggtgtgtcgt ccgatctatt gacgtattta cgtatactag 240
gagaataaat cactacagca ggctagataa ctgcataaat gcatatgatc ctcttattta 300
gtgamggata gctcatcatt ctatgcaatc attccccaga ttttgctcaa atgaacctat 360
cgagtagtaa gatacgttag taaggggtct aaaacgagtt tacttgcgat caaattaacg 420
tttaacaatt tacggttttt ctggtggtat tagcaagcta gtttaattgc aaattgttaa 480
atgccaaaaa gaccaccata atcgttmgaa tctggggaat taattgtcac gagcaggatt 540
ttttgtcagg atattcgttt agacccctta attaacagtg ctcgtcctaa aaaacagtcc 600
tataagcamg ttagttagcc cctctactat gacattactt ctcctgggat ggtgactacg 660
aatcaatcgg ggagatgata ctgtaatgaa gaggacccta ccactgatgc atcttgtata 720
agtatcaggg ttgatccctc caaatgatag ctttcttcaa tagaacatat tcatagtccc 780
aactagggag gtttactatc gaaagaagtt catcgactct cataatcgat atacttgaaa 840
acccaacaca tcactcaaag tagctgagag tattagctat atgaactttt gggttgtgta 900
gtgagttt                                                          908
<210>26
<211>870
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的基因调控区
<400>26
gagacagccc tcggatgaca ctcctccgag cgtgagcctc aggtcgaggc cactgtcggg 60
agcctactgt gaggaggctc gcactcggag tccagctccg gtgatcgcga tgcacttaca 120
tcaggtgcct cgtgcgttac taatgcgggc cacagcgcta cgtgaatgta gtccacggag 180
cacgcaatga ttacgcccgg tgtgtcgtcc gatctattga cgtatttacg tatactagga 240
gaataaatcg ctacagcagg ctagataact gcataaatgc atatgatcct cttatttagc 300
gamggatagc tcatcattct atgcaatcat tccccagatt ttgctcaaat gaacctatcg 360
agtagtaaga tacgttagta aggggtctaa aacgagttta cttgcgatga aattaacgtt 420
taacaattta cggtttttct ggtggtatta gtaagctact ttaattgcaa attgttaaat 480
gccaaaaaga ccaccataat cattmgmgaa tctggggaat taatttctag ggatattcgt 540
ttagttagcc cctctacttt agacccctta attaaagatc cctataagca aatcaatcgg 600
ggagatgaat gacattactt ctcctgggat ggtgactacg atcttgtata agtatcagta 660
ctgtaatgaa gaggacccta ccactgatgc tagaacatat tcatagtcgg ttgatccctc 720
caaatgatag ctttcttcaa catcgactct cataatcgcc aactagggag gtttactatc 780
gaaagaagtt gtagctgaga gtattagcat atacttgaaa acccaacaca tcactcaaat 840
atatgaactt ttgggttgtg tagtgagttt                                  870

Claims (28)

1.一种合成的基因调控区，所述合成的基因调控区包括：包含酵母菌株的基因调控蛋白的结合位点的合成的基因调控序列，和位于所述合成的基因调控序列下游的来自丝状真菌菌株的启动子；其中，所述启动子能够被该酵母菌株的通用转录因子和RNA聚合酶识别；其中，所述合成的基因调控序列能够调节由所述酵母菌株中的丝状真菌启动子引发的转录。
2.权利要求1的调控区，其中，所述结合位点是合成的结合位点。
3.权利要求1的调控区，其中，所述酵母菌株是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
4.权利要求1的调控区，其中，所述酵母菌株是巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)。
5.权利要求1的调控区，其中，所述酵母菌株是多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。
6.权利要求1的调控区，其中，所述酵母菌株是Yarrowia lipolytica。
7.权利要求1的调控区，其中，所述丝状真菌菌株选自由玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和Penicillium purpurogenum组成的组。
8.权利要求7的调控区，其中，所述启动子选自由Penicillium purpurogenum的XynA基因的启动子、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的DPM1基因的启动子和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的ArgB基因的启动子组成的组。
9.权利要求1的调控区，其中，所述基因调控蛋白的结合位点是该酵母菌株的基因激活子的结合位点。
10.权利要求9的调控区，其中，所述结合位点是酿酒酵母的GAL4蛋白的结合位点。
11.权利要求10的调控区，其中，所述结合位点包含选自由SEQ ID NO：10、11、12和15组成的组的DNA序列。
12.权利要求1的调控区，其中，所述基因调控蛋白的结合位点是所述酵母菌株基因阻遏物的结合位点。
13.权利要求9的调控区，其中所述基因调控序列还包含基因阻遏物的结合位点。
14.权利要求10的调控区，其中，所述基因调控序列还包含酿酒酵母的MIG1蛋白的结合位点。
15.权利要求14的调控区，其中，所述MIG1蛋白的结合位点包含选自由SEQ ID NO：18、19和20组成的组的序列。
16.权利要求1的调控区，其中，所述合成的基因调控区包含选自由SEQ IDNO：21、22、23、24、25和26组成的组的序列。
17.一种DNA表达载体，所述载体包含：合成的基因调控区，所述合成的基因调控区包括：包含酵母菌株的基因调控蛋白的结合位点的合成的基因调控序列，和位于所述合成的基因调控序列下游的来自丝状真菌菌株的启动子；其中，所述启动子能够被该酵母菌株的通用转录因子和RNA聚合酶识别；其中，所述合成的基因调控序列能够调节由所述酵母菌株中的丝状真菌启动子引发的转录；编码序列，所述编码序列在所述调控区的控制下编码蛋白质、多肽或肽，以及酵母选择标记物。
18.权利要求17的DNA表达载体，所述载体还包含位于所述编码序列下游的聚腺苷酸化信号序列。
19.权利要求17的DNA表达载体，所述载体还包含位于所述编码序列下游的转录终止子。
20.权利要求17的DNA表达载体，其中，所述酵母选择标记物是酿酒酵母选择标记物。
21.权利要求20的DNA表达载体，其中，所述酿酒酵母选择标记物选自由LEU2、TRP1、URA3和HIS3组成的组。
22.权利要求20的DNA表达载体，所述载体还包含酿酒酵母的复制起点。
23.权利要求22的DNA表达载体，其中，所述酿酒酵母的复制起点基于酿酒酵母2μm DNA序列。
24.权利要求17的DNA表达载体，所述载体还包含细菌复制起点。
25.一种酵母菌株，所述酵母菌株包含DNA表达载体，所述载体包含：合成的基因调控区，所述合成的基因调控区包括：包含酵母菌株的基因调控蛋白的结合位点的合成的基因调控序列，和位于所述合成的基因调控序列下游的来自丝状真菌菌株的启动子；其中，所述启动子能够被该酵母菌株的通用转录因子和RNA聚合酶识别；其中，所述合成的基因调控序列能够调节由所述酵母菌株中的丝状真菌启动子引发的转录；编码序列，所述编码序列在所述调控区的控制下编码蛋白质、多肽或肽，以及酵母选择标记物。
26.权利要求25的酵母菌株，其中，所述酵母菌株选自由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和Yarrowia lipolytica组成的组。
27.权利要求25的酵母菌株，其中，所述酵母菌株是酿酒酵母。
28.一种用于制造重组蛋白、多肽或肽的方法，所述方法包括表达权利要求25所述的酵母菌株的编码序列。
CNA2006800210291A 2005-06-14 2006-06-09 合成的基因调控区 Pending CN101198617A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69032105P 2005-06-14 2005-06-14
US60/690,321 2005-06-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101198617A true CN101198617A (zh) 2008-06-11

Family

ID=37570761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800210291A Pending CN101198617A (zh) 2005-06-14 2006-06-09 合成的基因调控区

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8026082B2 (zh)
EP (1) EP1893628B1 (zh)
JP (1) JP2008543308A (zh)
CN (1) CN101198617A (zh)
AT (1) ATE482265T1 (zh)
AU (1) AU2006259650A1 (zh)
CA (1) CA2611877A1 (zh)
DE (1) DE602006017072D1 (zh)
ES (1) ES2350706T3 (zh)
WO (1) WO2006138167A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701754A (zh) * 2015-11-13 2017-05-24 中国农业科学院作物科学研究所 一种玉米rna聚合酶iii识别的启动子及其应用
CN113462686A (zh) * 2020-03-30 2021-10-01 中国科学院深圳先进技术研究院 制备具有梯度活性的半乳糖诱导合成启动子的方法、及其制备的启动子、应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012064619A1 (en) * 2010-11-10 2012-05-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Pichia pastoris loci encoding enzymes in the proline biosynthetic pathway

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5068185A (en) 1986-07-10 1991-11-26 Merck & Co., Inc. Trains of yeast for the expression of heterologous genes
GB8620926D0 (en) 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
CA2069147A1 (en) * 1991-05-22 1992-11-23 Kazuaki Kitano Dna and its use
US5407822A (en) * 1991-10-02 1995-04-18 Sanofi Artificial promoter for the expression of proteins in yeast
WO1996026413A1 (en) 1995-02-24 1996-08-29 Mäntsälän Saha Ky Optical method for determining of three-dimensional form of an object
US5820870A (en) 1995-03-22 1998-10-13 Merck & Co., Inc. Recombinant human papillomavirus type 18 vaccine
DE602004018838D1 (de) * 2004-04-01 2009-02-12 Council Scient Ind Res Neue temperatur-regulierte promotoren und expressionsvektoren aus s.pombe

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701754A (zh) * 2015-11-13 2017-05-24 中国农业科学院作物科学研究所 一种玉米rna聚合酶iii识别的启动子及其应用
CN106701754B (zh) * 2015-11-13 2019-06-11 中国农业科学院作物科学研究所 一种玉米rna聚合酶iii识别的启动子及其应用
CN113462686A (zh) * 2020-03-30 2021-10-01 中国科学院深圳先进技术研究院 制备具有梯度活性的半乳糖诱导合成启动子的方法、及其制备的启动子、应用

Also Published As

Publication number Publication date
ES2350706T3 (es) 2011-01-26
AU2006259650A1 (en) 2006-12-28
ATE482265T1 (de) 2010-10-15
CA2611877A1 (en) 2006-12-28
US20100041097A1 (en) 2010-02-18
EP1893628B1 (en) 2010-09-22
WO2006138167A1 (en) 2006-12-28
JP2008543308A (ja) 2008-12-04
US8026082B2 (en) 2011-09-27
DE602006017072D1 (de) 2010-11-04
EP1893628A1 (en) 2008-03-05
EP1893628A4 (en) 2008-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6833812B2 (ja) プロモーター変異体
Schultz et al. Regulated overproduction of the GAL4 gene product greatly increases expression from galactose-inducible promoters on multi-copy expression vectors in yeast
Fleer Engineering yeast for high level expression
EP1732940B1 (en) METHOD FOR CONSTRUCTION AND USE OF &lt;i&gt;KLUYVEROMYCES LACTIS&lt;/i&gt; PROMOTER VARIANTS IN &lt;i&gt;K.LACTIS&lt;/i&gt; THAT SUBSTANTIALLY LACK &lt;i&gt;E. COLI&lt;/i&gt; TRANSCRIPTIONAL CAPABILITY
CN102459609B (zh) 包含表达增强子的真核宿主细胞
US5834237A (en) Combined use of two expression cassettes for the production of a protein of interest
CN101198617A (zh) 合成的基因调控区
Houard et al. Engineering of non-conventional yeasts for efficient synthesis of macromolecules: the methylotrophic genera
US6235499B1 (en) Method for transforming schizosaccharomyces pombe
US5068185A (en) Trains of yeast for the expression of heterologous genes
CN113015782A (zh) 用于酵母的前导序列
JP5973563B2 (ja) 相同組み換えによる酵母形質転換体の形質転換用および選択用のカセットならびに方法
EP2591121B1 (en) Production cell line
CN113056554A (zh) 重组酵母细胞
CN113316641A (zh) 串联蛋白表达
JPH11503318A (ja) 酵母中で興味あるタンパク質を発現するための新規なプロモーター
EP3027752B1 (en) Signal sequence for protein expression in pichia pastoris
DE69616276T2 (de) Verfahren zur produktion von proteinen
EP4194560A1 (en) Improved production of secreted proteins in fungal cells
KR101328481B1 (ko) 염색체 통합용 효모 발현 벡터 및 이의 용도
JP2001509392A (ja) 組換え酵母細胞による分泌タンパク質の産生増加
US10351864B2 (en) Cloning vector
KR20220098155A (ko) 비바이러스성 전사 활성화 도메인들 및 그와 관련된 방법들 및 이용들
Neill CONSTRUCTION OF A NOVEL VECTOR FOR THE EXPRESSION OF FOREIGN GENES IN YEAST (ALPHA-GLIADIN, CYC1)
Tarutina et al. Formation of ARS-independent miniplasmids upon transformation of yeast Pichia methanolica with DNA molecules containing “transforming” and “nontransforming” genes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20080611

C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned