CN101193915A

CN101193915A - 单克隆抗体及其用于检测宫颈疾病的方法

Info

Publication number: CN101193915A
Application number: CNA2006800205999A
Authority: CN
Inventors: T·J·菲舍; D·P·玛利诺斯克; A·J·泰勒
Original assignee: TriPath Imaging Inc
Current assignee: TriPath Imaging Inc
Priority date: 2005-04-27
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2026-04-26
Also published as: CN101193915B; ES2370414T3

Abstract

提供了用于在患者样本中诊断高度宫颈疾病的组合物和方法。该组合物包括单克隆抗体，及其变体和片段，其特异性结合MCM2。进一步提供了具有本发明的MCM2抗体的结合特性的单克隆抗体。这里也公开了能产生本申请的MCM2单克隆抗体的杂交瘤细胞系。发现该组合物可用于实施诊断高度宫颈疾病的方法，包括在来自患者的宫颈样本中检测MCM2的过量表达。进一步提供了用于实施本申请的方法的试剂盒。本申请还包括含有MCM2表位的氨基酸序列的多肽和将这些多肽用于生产抗体的方法。

Description

单克隆抗体及其用于检测宫颈疾病的方法

发明领域

本发明涉及能与MCM2结合的抗体和使用这些抗体的方法，尤其是用于宫颈疾病的诊断。

发明背景

宫颈癌是妇女中第二种最常见的肿瘤，占所有女性癌症的大约12％，而且导致每年大约250,000例死亡。Baldwin等(2003)NatureReviews Cancer 3：1-10。在许多发展中国家，群体筛选方案还没有，临床问题更加严重。在这些国家中，宫颈癌是妇女癌症死亡的第一位原因。

宫颈癌的大多数病例表现为鳞状细胞癌，虽然也看到腺癌。宫颈癌可通过群体筛选预防，因为它通过明确的非侵害性上皮内阶段进化，其可以从形态学上辨别。Williams等(1998)Proc.Natl.Acad.SciUSA 95：14932-14937。虽然不了解正常细胞如何变为转化的，但是通过宫颈上皮内瘤形成(CIN)，从正常的，复层上皮到侵害性癌的组织病理学变化的连续谱的概念已经众所公认多年。宫颈癌的前体是发育异常，而且本领域称之为CIN或鳞状上皮内病变(SIL)。鳞状上皮内异常可使用三级(CIN)或二级(Bethesda)系统进行分类。在Bethesda系统下，轻度鳞状上皮内病变(LSIL)，相当于CINI和HPV感染，通常表现生产性HPV感染，同时发展为侵害性疾病的风险相对较低。高度鳞状上皮内病变(HSIL)，相当于三级系统中的CINII和CINIII，显示高于LSIL的发展为宫颈癌的风险，虽然LSIL和HSIL都被认为是恶性肿瘤的可能性前体。在该系统下患者样本也可分类为ASCUS(未明确意义的非典型鳞状细胞)或AGUS(未明确意义的非典型腺细胞)。

通过人乳头状瘤病毒(HPV)的高风险类型，如类型16，18和31，已经建立了宫颈癌与感染的强烈关联。实际上，大量流行病学和分子生物学证据已经确定HPV感染为宫颈癌中的病因因素。而且，在85％或更多的高度子宫劲疾病病例中发现了HPV。不过，HPV感染是很常见的，可能发生在5-15％的年龄超过30岁的妇女中，但是仅有少数HPV阳性妇女将发展成高度子宫颈疾病或癌。HPV单独存在仅仅是感染的指示，而不是高度子宫颈疾病的指示，并且，因此，仅仅测试HPV感染导致许多假阳性。参见，例如，Wright等(2004)Obstet.Gynecol.103：304-309。

最新资料表明，HPV感染子宫颈的基础组织内的基底干细胞。干细胞分化成成熟的角质细胞，同时导致细胞迁移到复层宫颈上皮，与HPV病毒复制和细胞的再感染相关。在这种病毒复制过程期间，许多细胞改变发生，包括细胞循环下调，活性增殖，DNA复制，转录激活和基因组不稳定性(Crum(2000)Modern Pathology 13：243-251；Middleton等(2003)J Virol.77：10186-10201；Pett 等(2004)Cancer Res.64：1359-1368)。

大多数HPV感染本质上是瞬时的，同时病毒感染能在12个月的时期内自身消退。对于那些出现HPV的一种或多种致癌亚型的持续感染的个体，与没有HPV感染的患者相比，存在肿瘤形成发展的风险。考虑到HPV在宫颈肿瘤形成的发展过程中的重要性，HPV的临床检测已经成为鉴定患者处于宫颈的肿瘤形成发展风险中的重要诊断工具。基于HPV的筛选对于子宫颈疾病的临床效用在于它的阴性预测值。HPV阴性结果结合正常的Pap涂片的历史是没有疾病状况以及随后的1-3年期间较低的宫颈肿瘤形成发展风险的极好的指标。但是，阳性HPV结果不是子宫颈疾病的诊断；更确切地它是感染的指示。尽管大多数HPV感染是瞬时的并且将在12个月的时期内自发地清除，但是高风险的HPV病毒亚型的持续感染标志较高的宫颈肿瘤形成发展风险。为了增补HPV测试，鉴定与宫颈肿瘤形成相关的分子标记，期望能提高子宫颈疾病诊断的临床特异性。

帕帕尼古劳染色的宫颈涂片(Pap涂片)的细胞学检查目前是选择用于检测宫颈癌的方法。Pap测试是一种主观判别法，已经保持基本上60年没有改变了。然而，考虑到它的性能，存在几个担忧。报道的单个Pap测试的灵敏度(测试呈阳性的疾病阳性的比例)较低，而且显示大范围的变化(30-87％)。对于确定潜在的高度疾病，单个Pap测试的特异性(测试呈阴性的疾病阴性的比例)在筛选群体中可能低到86％，而且在ASCUS PLUS群体中显著更低。参见，Baldwin等，上文。表征为LSIL或CINI的Pap涂片的显著百分数实际上是高度病变阳性的。此外，至多10％的Pap涂片被分类为ASCUS(未明确意义的非典型鳞状细胞)，即，不可能清楚地分类为正常、中度或严重病变，或肿瘤。然而，经验表明，至多10％的这种ASCUS群体具有高度病变，其因而被忽视。参见，例如，Manos等(1999)JAMA 281：1605-1610。因此，需要在高度宫颈疾病中选择性地过量表达的分子生物标记和用于检测这些生物标记的组合物来实施用于诊断高度宫颈疾病的可靠方法。

小染色体维持(MCM)蛋白在真核DNA复制中扮演必要角色。小染色体维持(MCM)蛋白在DNA复制的早期起作用，通过将预复制复合物加载到DNA上并在复制DNA链的从头合成期间起解旋酶的作用以帮助解开双螺旋DNA。每个MCM蛋白在它们的高度保守的中心功能域中都具有DNA依赖性ATP酶基序。MCM蛋白的水平通常以可变的方式增加，因为正常细胞从细胞周期的G0进展到G1/S期。在G0期，MCM2和MCM5蛋白比MCM7和MCM3蛋白的丰富度要低得多。MCM6与MCM2，MCM4和MCM7形成复合物，其结合组蛋白H3。此外，MCM4，MCM6和MCM7的亚复合物具有解旋酶活性，其由MCM6的ATP结合活性和MCM4的DNA结合活性介导。参见，例如，Freeman等(1999)Clin.Cancer Res.5：2121-2132；Lei等(2001)J.Cell Sci.114：1447-1454；Ishimi等(2003)Eur.J.Biochem.270：1089-1101，所有文献都以其全部内容引入这里作为参考。

早期出版物已经表明，MCM蛋白，尤其是，MCM-5，可用于检测宫颈疾病(Williams等(1998)Proc Natl Acad Sci U.S.A.95：14932-14937)，以及其它癌症(Freeman等(1999)Clin CancerRes.5：2121-2132)。出版的文献指出，MCM-5的抗体能检测宫颈赘生性细胞。MCM-5检测高度宫颈疾病的特异性尚未得到证实(Williams等(1998)Proc Natl Acad Sci U.S.A.95：14932-14937)。MCM-5表达的检测不仅限于高度宫颈疾病，还在确定的轻度发育异常和增殖细胞中被检测，该增殖细胞已经在感染高风险HPV之后重新进入细胞周期。除了MCM-5之外，来自MCM家族的其他成员，包括MCM-2与MCM-7，已经证明是用于在组织样本中检测宫颈肿瘤形成的可能有用的标记(Freeman等(1999)Clin Cancer Res.5：2121-2132；Brake等(2003)Cancer Res.63：8173-8180)。最近的结果已经表明，MCM-7看来是用于利用免疫化学形式检测高度宫颈疾病的特异性标记(Brake等(2003)Cancer Res.63：8173-8180；Malinowski等(2004)ActaCytol.43：696)。

因此，本领域需要能检测生物标记表达的抗体，该生物标记在高度宫颈疾病中选择性地过量表达。这种抗体可用于区分高度疾病与被认为不是临床疾病的不适，如早期HPV感染和轻微的发育异常的方法。

发明概述

提供了用于诊断高度宫颈疾病的组合物和方法。组合物包含能与本发明的核生物标记蛋白，特别是MCM蛋白，更特别是MCM2结合的单克隆抗体。这些单克隆抗体的抗原结合片段和变体，能产生这些抗体的杂交瘤细胞系，和含有本发明的单克隆抗体的试剂盒也包括在这里。

发现本发明的组合物可用于诊断高度宫颈疾病的方法。该方法包括检测至少一种核生物标记的过量表达，其中该核生物标记的过量表达是高度宫颈疾病的指示。具体地说，该方法包括利用本发明的抗体检测宫颈样本中MCM2的过量表达。

本发明的组合物进一步地包括分离的多肽，其包含能结合MCM2单克隆抗体的表位。发现这些多肽可用于生产MCM2抗体的方法。还提供了编码MCM2表位的氨基酸序列的分离的核酸分子。

发明详述

提供了用于诊断高度宫颈疾病的组合物和方法。组合物包括能与在高度宫颈疾病中选择性地过量表达的核生物标记蛋白，特别是MCM蛋白，更特别是MCM2结合的单克隆抗体。还公开了生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。进一步地提供了含有这里描述的单克隆抗体的试剂盒。发现本组合物可用于在患者中诊断高度宫颈疾病的方法。

本发明的组合物包括与MCM2，或与其变体或片段特异性结合的单克隆抗体。特别地，提供了被命名为27C5.6与26H6.19的MCM2抗体。产生MCM2单克隆抗体27C5.6与26H6.19的杂交瘤细胞系于2005年4月14日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的专利保藏处，Manassas，Virginia，20110-2209，指定的专利保藏号分别为PTA-6668与PTA-6667。这些保藏物将按照关于用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约的条件保持。这些保藏物仅仅是为了本领域技术人员方便而提供的，而不是根据35U.S.C.§112需要该保藏物的一种许可。

这里也公开了具有单克隆抗体27C5.6与26H6.19的结合特性的抗体。这些抗体包括，但不限于，在竞争性结合测定中与这些抗体竞争的抗体，以及与能结合单克隆抗体27C5.6或26H6.19的表位结合的抗体。还提供了单克隆抗体27C5.6和26H6.19的变体和片段，其保留与MCM2特异性结合的能力。组合物进一步地包括产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，和含有这里公开的至少一种单克隆抗体的试剂盒。

“抗体”和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同的结构特性的糖蛋白。虽然抗体显示与抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体以及缺乏抗原特异性的其它抗体样分子。后面类型的多肽，例如，通过淋巴系统低水平产生并通过骨髓瘤以增加的水平产生。

术语“抗体”广泛地包含天然存在形式的抗体和重组抗体如单链抗体，嵌合和人源化抗体，和多特异性抗体以及所有上述抗体的片段和衍生物，该片段和衍生物具有至少一个抗原结合部位。抗体衍生物可含有与抗体缀合的蛋白质或化学部分。术语“抗体”以其广义使用，而且覆盖了完全装配的抗体，能结合抗原的抗体片段(例如，Fab′，F′(ab)₂，Fv，单链抗体，二价抗体)以及含有上述的重组肽。如这里使用的，“MCM2抗体”指与MCM2(SEQ ID NO：1)，或与其变体或片段特异性结合的任何抗体，而且包括单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，及其保留亲本抗体的抗原结合功能的片段。

本发明的MCM2抗体最佳地是单克隆抗体。如这里使用的术语“单克隆抗体”指从基本上均质化抗体的群体获得的抗体，即，含有该群体的各个抗体是相同的，除了可能以较少量存在的可能的天然存在的突变。

“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是大约150,000道尔顿的杂四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，但是二硫键的数目在不同的免疫球蛋白同种型的重链中是有差异的。每条重链和轻链还具有规则间隔开的链内二硫键。每条重链的一端具有可变区(VH)，其后面是许多恒定区。每条轻链的一端(V5)具有可变区，而它的另一端具有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列成行，而轻链可变区与重链的可变区排列成行。特定的氨基酸残基被认为形成轻链与重链可变区之间的界面。

术语“可变的”指抗体之间可变区的某些部分序列大量不同的事实，并用于每个特定抗体与它的特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在全部的抗体可变区中不是均匀分布的。其集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变区的多个高度保守的部分称为构架(FR)区。天然重链和轻链的可变区每个包含四个FR区，主要采取p-片状结构，通过三个CDR连接，其形成环连接，而且有时15个形成p-片状结构的一部分。每条链中的CDR紧密邻近地结合到一起：通过FR区，并与来自另一条链的CDR连接到一起，有助于抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，Vol.I，pages 647-669(1991))。

恒定区不直接参与抗体与抗原结合，但是显示各种效应功能，如抗体对于抗体依赖性细胞毒性的参与。

术语“高变区”，当这里使用时，指抗体的氨基酸残基，其：负责抗原结合。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.PublicHealth Service，National Institute of Health，i 25 Bethesda，MD.[1991])和/或那些来自“高变环”的残基(即，轻链可变区中的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，和重链可变区中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，J.MoI.Biol.，196：901-917[1987])。“构架”或“FR”残基是除了如这里认为的高变区残基以外的那些可变区残基。

“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2，和Fv片段；二价抗体；线性抗体(Zapata等(1995)Protein Eng.8(10)：1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其中每个都具有单一的抗原结合部位，以及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它很容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab′)₂片段，其具有两个抗原结合部位并且仍然能够交联抗原。

“Fv”是最小的抗体片段，其包含完整的抗原识别和结合部位。在双链Fv种类中，该区由紧密的，非共价结合的一条重链和一条轻链的二聚体组成。在单链Fv种类中，重链和轻链可变区可通过灵活的肽接头共价连接，以便轻链和重链可以类似于双链Fv中的“二聚”结构结合。每个可变区的三个CDR就是以这种结构相互作用以限定V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合部位。六个CDR共同地为抗体提供抗原结合特异性。然而，即使单个可变区(或Fv的一半，其只含有抗原特异性的三个CDR)也具有识别和结合抗原的能力，但是其亲和力低于完全的结合部位。

Fab片段也含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(C_H1)。Fab片段因在重链C_H1结构域的羧基末端增加了几个残基，包括来自抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸而不同于Fab′片段。Fab′这里命名为Fab′-SH，其中恒定区的半胱氨酸残基带有一个游离的巯基。F(ab′)₂抗体片段最初作为Fab′片段对产生，Fab′片段对之间具有铰链半胱氨酸。

MCM2抗体的片段包括在本发明中，只要它们保留所需的全长抗体的亲和力。因此，例如，MCM2抗体的片段将保留结合MCM2抗原的能力。这种片段的特征在于性质与对应的全长抗体类似，即，该片段将特异性地结合MCM2。这种片段这里称为“抗原结合”片段。

合适的抗体的抗原结合片段包含全长抗体的部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括，但不限于，Fab，F(ab′)₂，和Fv片段以及单链抗体分子。“Fab”是指免疫球蛋白的一价抗原结合片段，其由轻链和部分重链组成。F(ab′)₂是指免疫球蛋白的二价抗原结合片段，其包含两条轻链和两条重链的一部分。“单链Fv”或“sFv”抗体片段是指包含抗体的V_H与V_L结构域的片段，其中这些结构域存在于单一的多肽链中。参见，例如，美国专利4,946,778，5,260,203，5,455,030和5,856,456，引入这里作为参考。通常，Fv多肽进一步地在V_H与V_L结构域之间含有多肽接头，其使sFv能形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述参见Pluckthun(1994)The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies，Vol.113，ed.Rosenburg and Moore(Springer-Verlag，New York)，pp.269-315。

抗体或抗体片段可以从抗体噬菌体文库分离，该抗体噬菌体文库利用以下文献中描述的技术产生，例如，McCafferty等(1990)Nature 348：552-554(1990)和美国专利5,514,548。Clackson等(1991)Nature 352：624-628和Marks等(1991)J.MoI.Biol.222：581-597描述了使用噬菌体文库分别分离鼠和人抗体。后来的出版物描述了通过链改组(Marks等(1992)Bio/Technology 10：779-783)，以及组合感染和作为构建非常大的噬菌体文库的策略的体内重组(Waterhouse等(1993)Nucleic.Acids Res.21：2265-2266)来生产高亲和力(nM范围)人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统的单克隆抗体杂交瘤技术的可行的替代。

已经开发了各种技术用于生产抗体片段。传统地，这些片段是经过完整抗体的蛋白酶消化产生的(参见，例如，Morimoto等(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等(1985)Science 229：81)。不过，这些片段现在可以直接通过重组宿主细胞生产。例如，抗体片段可以分离自上面讨论的抗体噬菌体文库。可选择地，可以直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并进行化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter等(1992)Bio/Technology 10：163-167)。根据另一种方法，F(ab′)₂片段可以直接分离自重组宿主细胞培养物。用于生产抗体片段的其他技术对于熟练的专业人员是显而易见的。

优选本发明的抗体本质上是单克隆的。如上所述，“单克隆抗体”是指获自基本上均质化抗体的群体的抗体，即，含有该群体的各个抗体是相同的，除了可能以较少量存在的可能的天然存在的突变。该术语不限于关于抗体的种类或来源。该术语包括完整的免疫球蛋白以及片段如Fab，F(ab′)₂，Fv，以及其它保留抗体的抗原结合功能的片段。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点，即，MCM2蛋白内的特定表位，如这里下面所限定的。而且，与一般包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表明抗体的特性是获自基本上均质化抗体的群体，而不应被看作是需要通过任何特定的方法生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以通过Kohler等(1975)Nature 256：495首次描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等(1991)Nature 352：624-628；Marks等(199I)J.MoI.Biol.222：581-597；和美国专利5,514,548中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。

单克隆抗体可以使用Kohler等(1975)Nature 256：495-496的方法或其修改的方法制备。一般而言，用含有抗原的溶液免疫小鼠。可以通过在盐水中，优选在佐剂如弗氏完全佐剂中混合或乳化含有抗原的溶液，并肠胃外注射该混合物或乳液来进行免疫。本领域已知的任何免疫方法都可用于获得本发明的单克隆抗体。免疫动物以后，取出脾(并任选地，几个大的淋巴结)并分离成单个细胞。可通过将细胞悬液加入到涂有目标抗原的平板或孔中来筛选脾细胞。表达抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞(即抗体产生细胞)结合到平板上，而且不被漂洗掉。得到的B细胞，或所有分离的脾细胞，然后被诱导与骨髓瘤细胞融合以形成单克隆抗体产生交瘤，并培养于选择培养基中。得到的细胞通过连续稀释置于平板上并测定特异性结合目标抗原(而不结合无关抗原)的抗体的产生。选择的单克隆抗体(mAb)分泌杂交瘤然后进行体外(例如，在组织培养瓶或中空纤维反应器中)，或体内(作为小鼠的腹水)培养。单克隆抗体也可以使用多位点重复免疫技术(RIMMS)来生产。参见，例如，Kilpatrick等(1997)Hybridoma16(4)：381-389；Wring等(1999)J.Pharm.Biomed.Anal.19(5)：695-707；和Bynum等(1999)Hybridoma 18(5)：407-411，所有文献都以其全部内容引入这里作为参考。

作为使用杂交瘤的替代，可以在细胞系如CHO细胞系中生产抗体，如美国专利5,545,403；5,545,405；和5,998,144中所公开的；其引入这里作为参考。简要地，细胞系分别用能表达轻链与重链的载体转染。通过转染位于独立载体上的两种蛋白，可以生产嵌合抗体。另一个优点是抗体的正确的糖基化作用。还可以通过用生物标记蛋白筛选重组的组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)来鉴定和分离单克隆抗体，从而分离结合生物标记蛋白的免疫球蛋白文库成员。用于生成和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可以购买的(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAP9噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。另外，特别适用于生成和筛选抗体展示文库的方法和试剂的例子可发现于，例如，美国专利5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；和WO90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等(1989)Science246：1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J.12：725-734。

在本发明的一些方面中，可以根据细胞学，而不是组织学样本的理想染色来选择抗体。也就是说，在特定的实施方案中，根据最终样本类型(例如，细胞学制品)和结合特异性来选择抗体。经过多步的筛选过程选择并纯化针对特异性目标生物标记，如MCM2的抗体。这种用于抗体选择的方法描述于2005年03月23日提交的，名称为“用于检测宫颈疾病的方法和组合物”待审美国申请系列号11/087,227中，以其全部内容引入这里作为参考。

还提供了具有本发明的单克隆抗体结合特性的抗体。“结合特性”或“结合特异性”当用于指抗体时，意味着该抗体能识别与比较抗体相同或相似的抗原的表位。这种抗体的例子包括，例如，在竞争性结合测定中与本发明的单克隆抗体竞争的抗体。本领域的技术人员使用标准方法可以确定一种抗体是否竞争性地干扰另一种抗体。

“表位”指抗原分子的一部分，抗体针对其产生并将与其结合。“MCM2表位”包含MCM2蛋白的一部分，MCM2单克隆抗体结合该MCM2蛋白。表位可以含有线性氨基酸残基(即，表位内的残基一个接一个地以线性形式连续排列)，非线性氨基酸残基(这里称作“非线性表位”；这些表位不连续排列)，或线性和非线性氨基酸残基。典型地表位是短氨基酸序列，例如长度为大约5个氨基酸。用于鉴定表位的系统技术是本领域已知的并描述于，例如，美国专利4,708,871以及下面陈述的实施例中。简要地，在一种方法中，可以合成一组来源于抗原的重叠寡肽并结合到固相针阵列中，每个针上结合单一寡肽。针阵列可包括96孔微量滴定板，其可以同时测定全部的96种寡肽，例如，用于结合生物标记特异性的单克隆抗体。可选择地，噬菌体展示肽文库试剂盒(New England BioLabs)目前可购买用于表位作图。使用这些方法，可以确定对连续氨基酸的每个可能亚组的结合亲和力，以便鉴定给定抗体结合的表位。当表位长度肽序列用于免疫从中获得抗体的动物时，也可以通过推断来鉴定表位。

本发明还包括分离的多肽，其含有用于结合MCM2单克隆抗体的表位。这些多肽相当于与单克隆抗体结合的抗原(即，MCM2)的一部分。发现这种多肽可用于生产选择性结合MCM2的抗体的方法中。多肽用于生产抗体的能力这里称作“抗原活性”。例如，SEQ ID NO：3，4，和14所示的氨基酸序列(分别相当于SEQ ID NO：1所示的MCM2氨基酸序列中的369到382，688到710，和683到692位残基)含有MCM2单克隆抗体，更具体地单克隆抗体27C5.6和26H6.19所识别的表位。详情参见实施例4。还提供了SEQ ID NO：3，4，和14所示的MCM2表位序列的变体和片段，其保留原始多肽的抗原活性。本发明进一步地包括分离的核酸分子，其编码包含MCM2表位的多肽，及其变体和片段。

包含MCM2表位的本发明的多肽可用于生产特异性结合MCM2的单克隆抗体的方法中，如这里上面所述。这种多肽还可以用于生产多克隆MCM2抗体。例如，可以通过用含有MCM2表位的多肽(即，免疫原)免疫适合的个体(例如，兔子，山羊，小鼠，或其他的哺乳动物)来制备多克隆抗体。被免疫个体中的抗体滴度可以通过标准技术随时间来监测，如使用固定的生物标记蛋白，利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)。在免疫以后适当的时间，例如，当抗体滴度最高时，可以从个体获得抗体产生细胞并用于通过标准技术，如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497最初描述的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)Immunol.Today 4：72))，EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，ed.Reisfeld and Sell(Alan R.Liss，Inc.，New York，NY)，pp.77-96)，或三体瘤技术制备单克隆抗体。用于生产杂交瘤的技术是公知的(通常参见Coligan等，eds.(1994)Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)；Galfre等(1977)Nature266：55052；Kenneth(1980)Monoclonal Antibodies：A NewDimension In Biological Analyses(Plenum Publishing Corp.，NY；和Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54：387-402)。

本发明还包括含有这里描述的MCM2表位的单克隆抗体或多肽的氨基酸序列变体。可以通过在编码目标抗体的克隆的DNA序列中进行突变来制备变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域公知的。参见，例如，Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques inMolecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等(1987)Methods Enzymol.154：367-382；Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，NewYork)；美国专利4,873,192；以及其中引用的参考文献；这里引入作为参考。关于适当的氨基酸置换的指导，该氨基酸置换不影响目标多肽的生物学活性，可发现于Dayhoff等(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)的模型中，其引入这里作为参考。保守性置换，如一个氨基酸与另一个具有类似特性的氨基酸交换，是优选的。保守性置换的例子包括，但不限于，Gly<＝>Ala，Val<＝>Ile<＝>Leu，Asp<＝>Glu，Lys<＝>Arg，Asn<＝>Gln，和Phe<＝>Trp<＝>Tyr。

在构建目标多肽的变体中，进行修饰以便变体继续具有所需的活性，即，类似的与生物标记的结合亲和力。显然，在编码变体多肽的DNA中进行的任何突变不应该使序列位于阅读框架之外，而且优选不会产生互补区域，其可以产生二级mRNA结构。参见欧洲专利申请公开号75,444。

优选地，参比多肽的变体的氨基酸序列与参比抗体分子，或与参比抗体分子的较短部分的氨基酸序列具有至少70％或75％序列同一性，优选至少80％或85％序列同一性，更优选至少90％，91％，92％，93％，94％或95％序列同一性。更优选地，这两种分子具有至少96％，97％，98％或99％序列同一性。为了本发明的目的，使用缺口打开罚分12和缺口延伸罚分2，62的BLOSOM矩阵的仿射缺口检索，利用Smith-Waterman同源性检索算法来确定序列同一性百分比。Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489中教导了Smith-Waterman同源性检索算法。变体可以，例如，与参比抗体有少至1到15个氨基酸残基，少至1到10个氨基酸残基，如6-10个，少至5个，少至4个，3个，2个，或甚至1个氨基酸残基不同。

就两个氨基酸序列的最佳序列比对而言，相对于参比氨基酸序列，变体氨基酸序列的毗连区段可以具有附加的氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。用来与参比氨基酸序列进行比较的毗连区段将包括至少20个毗连氨基酸残基，并且可以是30，40，50，或更多个氨基酸残基。可以对与保守残基置换或缺口相关的序列同一性进行校正(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。

本发明的MCM2单克隆抗体可以用如下所述的可检测物质进行标记，以便于在样品中进行生物标记蛋白检测。发现这种抗体可用于实施本发明的方法。本发明的抗体和抗体片段可与可检测物质偶联，以便于检测抗体结合。当用于这里时，单词“标记”指可检测的化合物或组合物，其直接或间接地与抗体缀合，以便产生“标记的”抗体。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或，在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。为了标记抗体的可检测物质的例子包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料和放射性材料。适合的酶的例子包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的例子包括7-羟基香豆素，荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，二氯三嗪基胺荧光素，5-二甲氨基萘磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶，萤光素，和水母蛋白；和适合的放射性材料的例子包括¹²⁵I，¹³¹I，³⁵S，或³H。

进一步地提供了含有本发明的至少一种MCM2单克隆抗体的试剂盒。“试剂盒”指任何制品(例如，包装或容器)，其包含至少一种试剂，即，抗体，用于特异性检测MCM2的表达。试剂盒可以作为单位推销，批发，或销售，用于进行本发明的方法。另外，试剂盒可以包括描述该试剂盒及其使用方法的包装说明书。

本发明的试剂盒通常包含至少一种针对MCM2的单克隆抗体，用于检测抗体结合的化学药品，染色剂，而且，任选地，一种便于鉴定阳性染色细胞的涂蓝剂(bluing agent)。检测抗原-抗体结合的任何化学药品都可用于本发明的试剂盒。在一些实施方案中，检测化学药品包括与第二抗体缀合的标记聚合物。例如，可以提供与酶缀合的第二抗体，该酶催化位于抗原-抗体结合部位的发色团的沉淀。使用它们检测抗体结合的这些酶和技术是本领域公知的。在一个实施方案中，试剂盒包含与HRP标记的聚合物缀合的第二抗体。进一步地提供了与缀合酶相容的发色团(例如，在HRP标记的第二抗体的情况下，DAB)和溶液，如过氧化氢，用于封闭非特异性染色。在其他的实施方案中，通过使用与单克隆抗体结合的小鼠探针试剂，接着添加与HRP缀合的右旋糖酐聚合物，该HRP与小鼠探针试剂结合，来检测与生物标记蛋白结合的抗体。这种检测试剂可从，例如，Biocare Medical购买。

本发明的试剂盒可以进一步地包含过氧化物酶封闭试剂(例如，过氧化氢)，蛋白质封闭试剂(例如，纯化的酪蛋白)，和复染剂(例如，苏木精)。试剂盒中可以进一步地提供涂蓝剂(例如，氨水或TBS，pH7.4，与Tween-20和叠氮化钠)，以便于检测阳性染色细胞。试剂盒也可以包含用于质量控制目的的阳性和阴性对照样品。

在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含两种MCM2单克隆抗体，更具体地单克隆抗体27C5.6和26H6.19。进一步地提供了含有两种MCM2单克隆抗体和针对拓扑异构酶IIα(Topo2A)的第三抗体的试剂盒。当试剂盒中存在多种抗体时，每种抗体可以作为单独的试剂提供或，做为选择，作为含有所有目标抗体的抗体混合物提供。而且，任何或所有的试剂盒试剂都可以装在容器内，该容器保护它们不受外界环境影响，如位于密封容器内。本发明的试剂盒可用于诊断高度宫颈疾病并且可以进一步地包括用于Pap染色的试剂(例如，EA50和橙黄G)。

发现本发明的组合物可用于在患者中诊断高度宫颈疾病的方法中，如2005年03月23日提交的，名称为“用于检测宫颈疾病的方法和组合物”的待审美国申请系列号11/087,227中公开的那些方法，以其全部内容引入这里作为参考。“诊断高度宫颈疾病”意欲包括，例如，诊断或检测宫颈疾病的存在，监视疾病的进展，和鉴定或检测表明高度宫颈疾病的细胞或样本。术语诊断，检测和鉴定高度宫颈疾病在这里可以互换使用。“高度宫颈疾病”指用阴道镜检法分类为恶变前病状，恶性病状，中度到严重发育异常，和宫颈癌的那些病症。基础高度宫颈疾病包括CINII，CINIII，HSIL，原位癌，腺癌和癌症(FIGO I-IV期)的组织学鉴定。

本发明的方法包括检测至少一种核生物标记的过量表达，该核生物标记在高度宫颈疾病中选择性过量表达。“核生物标记”指主要在细胞的核中表达的任何蛋白的基因。核生物标记可以在细胞的其他部分中以较低的程度表达。“在高度宫颈疾病中选择性过量表达”指目标核生物标记在高度宫颈疾病中过量表达，但是不在分类为LSIL，CINI，不存在任何发育异常的HPV-感染样本的病症中，不成熟的化生性细胞中，及其他认为不是临床疾病的不适中过量表达。因此，本发明的核生物标记的检测允许将表明基础高度宫颈疾病的样本与表明良性增生，早期HPV感染，或轻微的发育异常的样本区分开。特定的目标核生物标记包括MCM蛋白，特别是MCM2和Topo2A。

在本发明的一个特定的方面中，该方法包括从患者中获得宫颈样本，使样本与至少一种本发明的MCM2单克隆抗体接触，并检测抗体与MCM2的结合。在其他的实施方案中，使样本与至少两种特异性结合MCM2的单克隆抗体，特别是单克隆抗体27C5.6与26H6.19接触。在另外的实施方案中，使样本与这两种MCM2单克隆抗体以及特异性结合Topo2A的第三抗体接触。检测抗体结合的技术是本领域公知的。与目标生物标记结合的抗体可以利用化学试剂检测，该化学试剂能产生可检测信号，该可检测信号相当于抗体结合的水平，并因此，相当于生物标记蛋白表达的水平。用于检测抗体-抗原结合的任何方法都可用于实施本发明的方法。

如这里使用的，“宫颈样本”指从其中生物标记的表达可以被检测的宫颈中取样的任何细胞，组织或体液样本。这种身体样本的例子包括但不限于妇科的液体，活组织检查和涂片。可以通过各种技术包括，例如，通过刮取或拭取某区域，或通过用针吸取体液来从患者中获得宫颈样本。收集宫颈样本的方法是本领域公知的。在特定的实施方案中，宫颈样本包括宫颈细胞，特别是在基于液体的制品中。

在一个实施方案中，根据基于液体的细胞学样品制备指南如，例如，SurePath

(TriPath Imaging，Inc.)或ThinPrep

制品(CYTYC，Inc.)来收集宫颈样本。宫颈样本可以被转移到载玻片上用于在放大下观察。固定和染色溶液可用于位于载玻片上的细胞，其用于保存样品并用于便于检验。在一个实施方案中，收集宫颈样本并进行处理以提供单层样本，如美国专利5,346,831中所述，其引入这里作为参考。

本领域技术人员应当理解，本发明方法中的任何或所有的步骤都可以手动或自动化的方式由个人执行。因此，宫颈样本制备，抗体，和抗体结合检测的步骤可以自动化进行。本发明的方法也可以与常规的Pap染色技术相结合以允许更准确地诊断高度宫颈疾病。

下面的实施例作为例示，而不是作为限制提供：

实施例

实施例1：生产针对MCM2的小鼠单克隆抗体

产生MCM2特异性的小鼠单克隆抗体。抗原(免疫原性多肽)是全长的重组六组氨酸标记的MCM2蛋白。使用杆状病毒表达系统在Tni细胞中表达该抗原。具体地说，将六组氨酸标记的MCM2的编码序列克隆到pFastBacl质粒(Invitrogen)中，用于在Tni细胞中表达。使用杆状病毒表达系统生产重组蛋白的方法是本领域公知的。标记的MCM2蛋白使用装有Ni+2离子的螯合琼脂(来自Qiagen的Ni-NTA)进行纯化并用作免疫原。免疫原性MCM2多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：11中。

小鼠免疫和杂交瘤融合基本上如Kohler等(1975)Nature256：495-496中所述的进行。小鼠用溶于溶液中的免疫原性标记的MCM2蛋白进行免疫。从免疫的小鼠分离抗体产生细胞并与骨髓瘤细胞融合以形成单克隆抗体产生杂交瘤。将杂交瘤培养于选择培养基中。得到的细胞通过连续稀释置于平板上并分析特异性结合MCM2(而不结合无关抗原)的抗体的产生。为了证实目标单克隆抗体只与MCM2蛋白反应，而不与六组氨酸标记反应，筛选抗MCM2-FLAG-标记蛋白的选择的杂交瘤。MCM2-FLAG蛋白的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：12和13所示。选择的单克隆抗体(mAb)分泌杂交瘤然后进行培养。

使用重组蛋白质A涂层的树脂(STREAMLINE

，Amersham，Inc.)，从“耗尽的”杂交瘤细胞(即，细胞生长直到生活力下降到0-15％之间)的培养基上清液中纯化抗体。抗体使用低pH洗脱，之后立即中和pH。合并在280nm处具有显著吸光率的级分。得到的合并物用PBS进行渗析。对纯化的抗体进行进一步的表征。MCM2单克隆抗体26H6.19和27C5.6都被确定是IgG₁同种型。这些抗体的表位作图的详情描述如下。

实施例2：从杂交瘤细胞中分离单克隆抗体

下列方法用于从杂交瘤细胞中分离单克隆抗体：

培养基制备

-添加100ml Hyclone胎牛血清(FBS)到无菌的1,000ml贮液瓶中。

-添加10ml MEM非必需氨基酸溶液。

-添加10ml青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺溶液。

-适量到大约1000ml，带有ExCell 610-HSF培养基。

-将无菌盖置于瓶上并塞得紧紧的。轻轻地涡旋进行混合。

-连接1000ml无菌乙酸盐真空过滤单元(0.2μm)与真空泵系统。

-轻轻地倒出大约一半培养基溶液到无菌乙酸盐过滤单元中并开启真空泵。

-一旦第一个一半培养基已经过滤，就将剩余的培养基倒入到过滤单元中并继续过滤。

-所有的培养基已经过滤以后，将真空软管从真空过滤单元上拆开并关掉真空泵。从过滤瓶中移出过滤单元的接收器部分。将新的无菌瓶盖置于瓶上。

-储存于2℃到10℃。避光保存。

初始的杂交瘤细胞培养

-在预热的37℃水浴中解冻储备杂交瘤冷冻培养物的小瓶。

-用70％乙醇喷雾冷冰小瓶的外部。

-将解冻的小瓶移到生物学安全工作橱中。

-从冷冰的小瓶中移出细胞并将细胞转移到15ml离心管中。

-逐滴添加7ml细胞培养基到含有解冻细胞的15ml离心管中。

-以200g重力离心含有解冻细胞和培养基的15ml离心管5分钟。

-细胞处于离心机中的同时，添加45ml细胞培养基到无菌T-225烧瓶中。

-离心以后，目测检查试管中细胞沉淀的存在。

-从离心管中除去培养基，当心不要取出细胞沉淀。注意：如果细胞沉淀被弄乱，则重复离心步骤。

-添加5ml细胞培养基到含有沉淀细胞的15ml离心管中。吸移以重悬细胞沉淀到培养基中。

-将重悬细胞和培养基的全部内含物转移到含有45ml培养基的T-225烧瓶中。

-盖上T-225烧瓶。

-在显微镜下观察完整细胞的存在。将T-225烧瓶立即置于CO₂培养箱中并允许细胞孵育过夜。

杂交瘤细胞系的扩展

-继续监测细胞培养物的生活力，浓度，和污染的存在。

-监测并调节来自初始的T-225烧瓶的细胞悬液，直到浓度为大约600,000细胞/ml到800,000细胞/ml和总共200到250ml培养基。

-取出细胞并添加额外的满足最低的细胞密度要求所需的培养基。将细胞悬液分装并转移到新的无菌T-225烧瓶中。将2xT-225烧瓶置于CO₂培养箱中。

-监测来自2xT-225烧瓶的细胞，直到浓度为大约600,000细胞/ml到800,000细胞/ml和每个烧瓶总共200到250ml培养基。

-取出细胞并添加额外的满足最低的细胞密度要求所需的培养基。将细胞悬液分装并转移到2个另外的新的无菌T-225烧瓶中，总共4xT-225烧瓶。将所有的烧瓶放回到CO₂培养箱中。

-监测细胞，并调节4xT-225烧瓶中的体积，直到细胞浓度为大约600,000细胞/ml到800,000细胞/ml，其中每个T-225烧瓶的总体积大约250ml(或合计大约1000ml)。

-继续监测来自4xT-225烧瓶的细胞，直到细胞已经生长至耗尽，其最终的生活力为0％-15％。细胞培养物上清液现在准备用于澄清处理。

上清液的澄清

-开启台式离心机。将500ml试管适配器置于转子桶中，关闭盖子并将温度设定为4℃(+/-)4℃。

-使用无菌技术，将来自全部4个目前已经耗尽的T-225烧瓶的培养基倒入到2×500ml锥形离心管中。

-确定2×500ml试管被平衡。根据需要将上清液从一个试管转移到另一个试管以平衡它们。

-于2℃到10℃，以1350g(+/-40g)离心已经耗尽的上清液15分钟。

-离心完成以后，将上清液无菌地滗析到无菌的1000ml贮液瓶中并用无菌盖塞紧。

-将1ml无菌地转移到微管中。于2℃到10℃储存装有样本的微管(避光保存)。

-澄清的上清液样本准备用于使用Easy-Titer

测定法进行IgG评估。

缓冲液制备

结合缓冲液：

-添加大约600ml DI H₂O到干净的烧杯中。

-添加77.28ml硼酸溶液(4％W/V)。在室温下用干净的搅棒搅拌。

-称取233.76g氯化钠并放入溶液中，同时继续搅拌。

-用DI H₂O使溶液达到大约950ml并继续搅拌。

-当氯化钠已经溶解且溶液澄清时，用氢氧化钠调节pH到9.0±0.2。

-将溶液移到干净的1000ml量筒中并用DI H₂O定容到1000ml。

-将完成的缓冲液转移到适当的贮液瓶中。该缓冲液在使用之前可以储存长达7天。

-重复该全过程以制备另外的0.2升到1.0升结合缓冲液。

洗脱缓冲液

-称取1.725g磷酸二氢钠并放入到带有干净的搅棒的干净的250ml烧杯中。

-称取3.676g柠檬酸钠并放入同样的干净的250ml烧杯中。

-添加大约175ml DI H₂O并在室温下搅拌直到溶解。

-称取4.38g氯化钠并放入溶液中，同时继续搅拌。

-用DI H₂O使溶液达到大约225ml并继续搅拌。

-当氯化钠已经溶解且溶液澄清时，用盐酸调节pH到3.5±0.2。

-将溶液移到干净的250ml量筒中并用DI H₂O定容到250ml。

-连接500ml无菌乙酸盐真空过滤单元(0.2μm)与真空泵系统并过滤灭菌该溶液。

-除去过滤器并用无菌盖封闭容器。

抗体吸附

-将澄清的上清液(～1L)倒入带有干净的搅棒的干净的4000ml塑料烧杯中。

-添加大约相等量(～1L)的结合缓冲液到干净的4000ml塑料烧杯中，其含有澄清的上清液。加入干净的搅棒。

-用干净的塑料布覆盖烧杯并标记为“抗体结合”。

-使用表1中的数据计算需要的STREAMLINE

A蛋白的大约量。

表1：需要的A蛋白树脂的体积

上清液中IgG的量(μg/ml)	以毫升(ml)计的所需的A蛋白树脂的体积
上清液中IgG的量(μg/ml)	以毫升(ml)计的所需的A蛋白树脂的体积	＞180-≤200	12.0
＞160-≤180	11.0	＞180-≤200	12.0
＞160-≤180	11.0	＞140-≤160	10.0
＞120-≤140	9.0	＞140-≤160	10.0
＞120-≤140	9.0	＞100-≤120	8.0
＞80-≤100	7.0	＞100-≤120	8.0
＞80-≤100	7.0	＞60-≤80	6.0
＞40-≤60	4.5	＞60-≤80	6.0
＞40-≤60	4.5	＞20-≤40	3.5
≤20	2.0	＞20-≤40	3.5

-固定干净的一次性柱和活栓组件到环固定架上并夹紧。关闭活栓。

-通过倒置瓶子几次来混合适当量的STREAMLINE A蛋白小珠。抽取所需的体积并置于一次性柱中。

-用10ml DI H₂O洗涤STREAMLINE A蛋白小珠。打开活栓并允许DI H₂O流出。关闭活栓。用另外的10ml DI H₂O重复。

-用10ml结合缓冲液洗涤STREAMLINE A蛋白小珠。

-打开活栓并允许结合缓冲液流出。关闭活栓。用另外的10ml结合缓冲液重复。

-在～10ml澄清的上清液和结合缓冲溶液(来自4000ml烧杯)中重悬STREAMLINE A蛋白小珠并将小珠转移到含有澄清的上清液和结合缓冲溶液的4000ml烧杯中。根据需要重复以转移任何剩余的小珠。当完成时，弃去柱和活栓。

-允许混合物在2℃到10℃弹力地混合大约18小时。

-当混合完成时，关掉搅拌板并将装有缓冲的上清液和小珠悬液的“抗体结合”烧杯移回到实验台区域中。允许STREAMLINE A蛋白小珠沉降到烧杯的底部(大约5分钟)。

-将干净的，250ml瓶子或适合的容器标记为“柱洗涤后结合”。

-将干净的塑料烧杯标记为“上清液后结合”。

-将来自4000ml烧杯的上清液滗析到干净的，标记的，2升塑料烧杯中，使小珠留在4000ml烧杯的底部。用干净的塑料布覆盖装有“上清液后结合”溶液的2000ml烧杯并于2℃到10℃储存。

-添加大约15ml结合缓冲液到倾出的4000ml“抗体结合”烧杯中。重悬STREAMLINE A蛋白小珠并将它们转移到柱上。打开活栓并使结合缓冲液流入到“柱洗涤后结合”容器中。当流入时，关闭活栓。

-通过添加另外的结合缓冲液，混合，并如同前面步骤转移到柱上，将任何剩余的STREAMLINE A蛋白小珠转移到“抗体结合”烧杯中。当流入时，关闭活栓。

-使用表2中的数据计算洗涤柱中的STREAMLINE A蛋白小珠所需的结合缓冲液的大约量。

表2：用于柱洗涤的结合缓冲液的体积

上清液中IgG的量(μg/ml)	以毫升(ml)计的所需的结合缓冲液的体积
上清液中IgG的量(μg/ml)	以毫升(ml)计的所需的结合缓冲液的体积	＞180-≤200	总共洗涤5个柱子每个用15.0ml
＞160-≤180	总共洗涤5个柱子每个用15.0ml	＞180-≤200	总共洗涤5个柱子每个用15.0ml
＞160-≤180	总共洗涤5个柱子每个用15.0ml	＞140-≤160	总共洗涤5个柱子每个用12.5ml
＞120-≤140	总共洗涤5个柱子每个用12.5ml	＞140-≤160	总共洗涤5个柱子每个用12.5ml
＞120-≤140	总共洗涤5个柱子每个用12.5ml	＞100-≤120	总共洗涤5个柱子每个用12.5ml
＞80-≤100	总共洗涤5个柱子每个用10.0ml	＞100-≤120	总共洗涤5个柱子每个用12.5ml
＞80-≤100	总共洗涤5个柱子每个用10.0ml	＞60-≤80	总共洗涤5个柱子每个用10.0ml
＞40-≤60	总共洗涤5个柱子每个用7.5ml	＞60-≤80	总共洗涤5个柱子每个用10.0ml
＞40-≤60	总共洗涤5个柱子每个用7.5ml	＞20-≤40	总共洗涤5个柱子每个用5.0ml
≤20	总共洗涤5个柱子每个用5.0ml	＞20-≤40	总共洗涤5个柱子每个用5.0ml

-用适当体积的结合缓冲液洗涤柱中的STREAMLINE A蛋白小珠，洗涤适当的次数不断收集流出物到“柱洗涤后结合”容器中。

-当完成时，关闭活栓。于2℃到10℃储存“柱洗涤后结合”容器。

-从表3确定洗脱柱中的STREAMLINE A蛋白小珠所需的洗脱缓冲液和中和缓冲液的总体积。

-将9个无菌锥形离心管标记为“洗脱抗体”，级分#(1到9)。

-将每个级分所需的适当体积的中和缓冲液(如根据上面的表“C”确定的)放入9个“洗脱抗体”级分试管中的每个中并安全地置于柱活栓出口下。

-通过用每个级分所需的适当体积的洗脱缓冲液(如根据上面的表3确定的)，一个级分接一个级分地洗脱柱中的STREAMLINE A蛋白小珠，同时收集洗出液到含有中和缓冲液的“洗脱抗体”试管的每个中。

-当洗脱完成时，通过涡旋几次来轻轻地混合每个“洗脱抗体”级分试管。移出大约50μl的级分#3并置于pH试纸条上以确保洗出液已经被中和到接近pH 6.5到8.5。如果需要，添加使pH达到范围所需的额外的中和缓冲液或洗脱缓冲液。

-当pH评估完成时，对来自每个级分的样本在280nm-400nm处进行吸光率扫描，以在进行透析处理之前确定洗出液中IgG的大约浓度。

如果A280-A400值≥0.200，接受级分为洗出液合并物的一部分。

如果A280-A400值＜0.200，拒绝级分为洗出液合并物的一部分。

-将无菌锥形离心管标记为“洗脱抗体”，“洗出液合并物”，并合并作为合并物的一部分接受的全部级分。

-对洗出液合并物的样本进行吸光率扫描，以在进行透析处理之前确定洗出液中IgG的大约浓度。

-估算洗出液合并物的体积并计算IgG的大约总mg数。

-洗出液合并物的体积：_____ml x_____IgG mg/ml＝_____IgG的总mg。

抗体透析

-从2℃到10℃移出“洗脱抗体”试管。

-使用大约体积的洗出液和表4中的数据计算透析抗体洗出液所需的透析管的大约长度。

-切割适当长度的所需的透析管。(Spectra/Por

2再生纤维素膜，12,000-14,000道尔顿分子量截留(MWCO)，16mm直径，SpectrumLaboratories Inc.，目录号132678)。

-在1000ml DI H₂O中水合透析膜化管＞30分钟。

-使用表5中的数据计算透析抗体洗出液所需的透析缓冲液的大约体积。

-将适当量的透析缓冲液置于适宜大小的塑料烧杯中。标记烧杯为“透析抗体”。加入干净的搅棒并于2℃到10℃将烧杯置于冰箱或冷藏室内部的搅拌板上。

-在DI-H₂O中彻底漂洗透析管。在离透析管的一端大约7cm处系两个端结并系得紧紧的。

-添加大约5ml DI-H₂O到透析管中。

-将来自“洗脱抗体”收集管的洗脱抗体填充到透析管中。

-在离透析管剩下的开放端大约7cm处系两个端结并系得紧紧的。确保预留空间大约为如来源于表4的数据。

-将填充并关闭的透析管置于透析容器中，其中装有适当体积的1X PBS(来自表5)。

-用干净的塑料布覆盖烧杯。调节搅拌板的速度，以便透析样本自由地旋转，但是不会被下拉到透析液的涡流中。透析应在2℃到10℃进行，在24小时之内总共更换3次缓冲液。

抗体过滤

-标记无菌收集管为“透析抗体”。

-从透析烧杯中移出透析样本管。在一端割开透析管并将透析样本转移到“透析抗体”离心管中。

-标记另一个无菌收集管为“透析抗体”。

-选择具有足够容量的无菌Luer Lok注射器以容纳最终的透析体积。

-将Acrodisc

针筒式滤器连接到注射器的开口(0.2μm HTTuffryn

膜，低蛋白结合，Gelman Laboratories，目录号4192)。从注射器上除去活塞并同时保持注射器直立，将透析的单克隆抗体从“透析抗体”管转移到注射器中。替换活塞。

-保持Acrodisc

针筒式滤器在打开的，无菌的，标记的“纯化抗体”收集管上方，并下压注射器活塞将纯化抗体过滤到“纯化抗体”管中。

-当过滤完成时，盖上“纯化抗体”管并储存于2℃到10℃。

-使用A280方法确定纯化单克隆抗体的浓度。

实施例3：用于表位作图的一般方法

一般方法

进行表位作图以鉴定抗原蛋白(即，表位)内的线性氨基酸序列，该抗原蛋白由特定的单克隆抗体识别。用于表位作图的一般方法通常需要在异源表达系统中表达全长蛋白，以及该蛋白的各种片段(即，截短形式)。这些不同的重组蛋白然后用于确定特异性单克隆抗体是否能结合一种或多种截短形式的靶蛋白。通过使用反复截短以及产生具有重叠氨基酸区域的重组蛋白，鉴定由研究的单克隆抗体识别的区域是可能的。Western印迹分析或ELISA用于确定研究的特异性单克隆抗体是否能结合一个或多个重组蛋白质片段。这种方法最终能鉴定包含表位的肽区域，而有时候，能将表位精确推敲到8-11个氨基酸序列。

构建体设计和产生

表位作图的第一步是设计嵌套的基因截短。经常，基因被分成4个相等部分用于进一步分析。

基因克隆策略

一般的克隆策略开始于基于PCR的克隆基因片段的产生。为了高效地表达克隆的片段，尤其当使用小的氨基酸区域时，克隆的片段被表达为融合蛋白，即，与系统中稳定表达的另一种载体蛋白融合。绿色荧光蛋白(GFP)常常用作载体蛋白。GFP被包括作为融合伴体以稳定截短片段并在随后的体外蛋白质表达步骤期间提高表达。使用抗GFP抗体，GFP还允许追踪融合蛋白的表达。

使用强引导方法或者通过使用克隆到pScreen-GFP载体中的质粒进行克隆以产生GFP-蛋白质构建体。通常，使用称作强引导的技术，截短片段与GFP以及蛋白质表达所需的调控序列融合。

强引导是通过退火位于各个片段末端的同源区域并用热稳定DNA聚合酶延伸退火的单链DNA来连接两个或多个DNA片段。该过程产生来自两个或多个较小片段的一个大的DNA片段，通过它们的共有序列连接它们。这个大的片段然后使用标准PCR扩增。

如果强引导不能成功地使用，可以将截短片段克隆到含有GFP和蛋白质表达调控序列的质粒中。这种克隆产生表位作图所需的GFP/片段融合体。该方案的剩余部分然后如下所述进行。

蛋白质表达

通过，例如强引导产生的表达构建体然后引入到快速翻译系统(RTS)中。RTS是来源于大肠杆菌裂解物的无细胞蛋白质表达系统。该系统允许从DNA模板快速表达(3-4小时)蛋白质。

如果RTS没有产生足够水平的蛋白质表达，那么将截短片段克隆到GFP蛋白质表达质粒中。这些融合质粒然后转化到对于蛋白质表达最佳的大肠杆菌菌株中。在细菌的生长培养基中诱导蛋白质表达，并在生长晕之后，裂解细胞。然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离复杂细胞裂解物中的蛋白质，而且该方案的剩余部分与下面的相同。

蛋白质检测和表位作图

通过RTS产生的蛋白质片段使用PAGE进行分离并转移到硝酸纤维素膜上。膜结合蛋白然后暴露于溶于溶液中的研究的抗体。使用本领域已知的比色技术鉴定抗体/蛋白质结合。

全长蛋白质以及截短的蛋白质片段的一些亚型的抗体结合构成了阳性结果。如果蛋白质的特定部分的缺乏消除了抗体结合，那么表位位于该片段上。

如果被作图的抗体不能识别与硝酸纤维素膜结合的蛋白质，那么可以使用用于检测抗体/蛋白质相互作用的备选方法，如，例如，ELISA或免疫沉淀法。用于检测抗体/蛋白质相互作用的方法是本领域公知的。

精确表位定位

因为上面描述的方案仅仅将表位的定位缩小到蛋白质的大约四分之一，所以有必要对确定包含该表位的该四分之一蛋白质重复该过程，以便进一步地确定该表位的位置。对于一个非常大的蛋白质，可能需要重复该过程2到3次，以将表位缩小到8-15个氨基酸。

实施例4：MCM2单克隆抗体27C5.6和26H6.19的表位的表征

MCM2单克隆抗体27C5.6与26H6.19的表位作图基本上如实施例3中所述的进行。具体地说，PCR用于产生MCM2基因截短，接着进行RTS以产生重组MCM2蛋白质片段，最后进行Western印迹分析以检测抗体与MCM2的结合。GFP在第二轮PCR中与MCM2基因截短连接，以确保在RTS中强而且稳定的表达。

MCM2的全长编码序列(SEQ ID NO：2；NM_004526)的大小为2715bp。不过，用于表达重组MCM2蛋白质并且在MCM2抗体生产期间用于免疫小鼠的cDNA，其基因大小为2688bp(SEQ ID NO：5)。使用的截短的MCM2 cDNA在MCM2蛋白质的5′末端缺少了27bp区域，具体地说为片段ATGGCGGAATCATCGGAATCCTTCACC(SEQ ID NO：6)。进行下列连续步骤，以便对MCM2-27C5.6抗体进行表位作图。

由于MCM2基因比较大(＞1000bp)并且为了最小化所需的PCR重复的数量，将基因等分成大约400bp的6个区域[1-6]。重叠序列，其包含同源序列以允许在第二个PCR循环过程中强引导以及用于亚克隆到pScreen-GFP质粒中的第二个选择的限制性位点，在第一个PCR期间被添加到目标基因上。第一轮PCR产生截短的MCM2核苷酸序列(SEQID NO：5)的片段，包括：区域[1]是1-426bp，区域[1-2]是1-888bp，区域[1-3]是1-1377bp，区域[1-4]是1-1845bp，区域[1-5]是1-2241bp，区域[1-6]是1-2688bp，最后区域[2-6]是427-2688bp。单独的区域(例示区域[5])没有被表达，以避免缺失存在于两个区域之间的连接序列的表位。

将MCM2的第一轮PCR产物亚克隆到pSCREEN-GFP(BamH1-Xhol)中，因为该片段大小对于强引导来说太大。不成功的唯一一个截短是全长区域[1-6]。对用于扩增全长基因和截短的原始引物进行工程操作以包含限制性位点(5′末端BAMH1；3′末端XHOl)，允许直接亚克隆到pSCREEN-GFP中。

将产生的GFP-基因融合体用作使用来自Roche的RTS 100大肠杆菌HY试剂盒的RTS反应中蛋白质生产的模板。对来自RTS的蛋白质产物进行丙酮沉淀，直接加样到变性聚丙烯酰胺凝胶上，并通过Western印迹法进行分析。Western印迹直接用27C5.6单克隆抗体和GFP抗体进行探测。

第一轮RTS产物用GFP抗体和MCM2单克隆抗体27C5.6进行探测。在区域[1-3]中检测到阳性条带。使用区域[1-3]包含的片段作为起始序列，重复上述过程。

在区域MCM2-3Q3(CQSAGPFEVNMEETIYQNYQRIRIQESP(SEQ IDNO：7)；相当于SEQ ID NO：1的氨基酸残基355到382)中，第二轮RTS产生了27C5.6抗体的阳性结果。使用区域MCM2-3Q3包含的片段作为起始序列，重复上述过程。

在区域MCM2-3Q3.2(IYQNYQRIRIQESP(SEQ ID NO：3)；相当于SEQID NO：1的氨基酸残基369到382)中，第三轮RTS产生了27C5.6抗体的阳性结果。在区域MCM2-3Q3.1(CQSAGPFEVNMEET(SEQ ID NO：8)；相当于SEQ ID NO：1的氨基酸残基355到368)中或在MCM2-3Q3.2(EVNMEETIYQNYQR(SEQ ID NO：9)；相当于SEQ ID NO：1的氨基酸残基362到375)中，没有获得阳性结果。

结果

最初的结果表明，MCM2单克隆抗体27C5.6的表位位于MCM2蛋白的N-末端区域内。MCM2蛋白的连续截短表明，27C5.6识别的表位位于14个氨基酸的区域内，具体地说相当于SEQ ID NO：1的氨基酸残基369-382(IYQNYQRIRIQESP(SEQ ID NO：3))。附加轮的RTS也许能进一步地精确表位定位。

将上述的相同过程用于鉴定MCM2单克隆抗体26H6.19的表位。最初的结果表明，该表位位于MCM2蛋白的C-末端区域。表位预先被限定到23个氨基酸的区域，具体地说相当于SEQ ID NO：1的氨基酸残基688-710(PSNKEEEGLANGSAAEPAMPNTY(SEQ ID NO：4))。进一步的分析将MCM2单克隆抗体26H6.19的表位精确到10个氨基酸的区域，其含有SEQ ID NO：1的氨基酸残基683-692(HVRHHPSNKE(SEQ ID NO：14))。

序列表

<110>Fischer，Timothy J.

Malinowski，Douglas P.

Taylor，Adriann J.

<120>单克隆抗体及其用于检测宫颈疾病的方法

<130>46143/310882

<150>60/675,305

<151>2005-04-27

<150>60/718,082

<151>2005-09-16

<160>14

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>904

<212>PRT

<213>智人

<400>1

Met Ala Glu Ser Ser Glu Ser Phe Thr Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln

1 5 10 15

Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser

20 25 30

Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro

35 40 45

Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu

50 55 60

Glu Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ile Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp

65 70 75 80

Tyr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Asp Ala Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala

85 90 95

Leu Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala

100 105 110

Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu

115 120 125

Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp

145 150 155 160

Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp

165 170 175

Leu Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp Val Ser Met Ala Gly Pro Arg

180 185 190

Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn Phe Leu Arg Thr His Val Asp

195 200 205

Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys

210 215 220

Glu Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg

225 230 235 240

Glu His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu

245 250 255

Gln Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu Val Val Leu Ala Met Tyr Pro

260 265 270

Lys Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile His Val Arg Ile Ser His Leu

275 280 285

Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Gln Leu His Leu Asn Gln

290 295 300

Leu Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro

305 310 315 320

Gln Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu

325 330 335

Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys

340 345 350

Pro Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Val Asn Met Glu Glu Thr

355 360 365

Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

Val Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala

385 390 395 400

Asp Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly

405 410 415

Ile Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe

420 425 430

Pro Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala Asn His Val Ala Lys Lys Asp

435 440 445

Asn Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr Asp Glu Asp Val Lys Met Ile

450 455 460

Thr Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser

465 470 475 480

Ile Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala

485 490 495

Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys Asn Pro Gly Gly Lys His Lys

500 505 510

Val Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala

515 520 525

Lys Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile

530 535 540

Phe Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser A]a Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val

545 550 555 560

Gln Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu

565 570 575

Val Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met

580 585 590

Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser

595 600 605

Ile Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys

610 615 620

Thr Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser

625 630 635 640

Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg

645 650 655

Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp Thr Val Asp Pro Val Gln Asp

660 665 670

Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly Ser His Val Arg His His Pro

675 680 685

Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro

690 695 700

Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu

705 710 715 720

Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu Arg Val His Pro Lys Leu Asn

725 730 735

Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys

740 745 750

Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro Ile Thr Val Arg His Ile Glu

755 760 765

Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His Ala Arg Ile His Leu Arg Asp

770 775 780

Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met Ala Ile Arg Val Met Leu Glu

785 790 795 800

Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser Val Met Arg Ser Met Arg Lys

805 810 815

Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu

820 825 830

Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg

835 840 845

Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp

850 855 860

Leu Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn Ile His Asn Leu Ser Ala Phe

865 870 875 880

Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn Lys Phe Ser His Asp Leu Lys

885 890 895

Arg Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe

900

<210>2

<211>3453

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(58)...(2772)

<400>2

acttttcgcg cgaaacctgg ttgttgctgt agtggcggag aggatcgtgg tactgct atg 60

Met

1

gcg gaa tca tcg gaa tcc ttc acc atg gca tcc agc ccg gcc cag cgt 108

Ala Glu Ser Ser Glu Ser Phe Thr Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg

5 10 15

cgg cga ggc aat gat cct ctc acc tcc agc cct ggc cga agc tcc cgg 156

Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg

20 25 30

cgt act gat gcc ctc acc tcc agc cct ggc cgt gac ctt cca cca ttt 204

Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Phe

35 40 45

gag gat gag tcc gag ggg ctc cta ggc aca gag ggg ccc ctg gag gaa 252

Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu Glu

50 55 60 65

gaa gag gat gga gag gag ctc att gga gat ggc atg gaa agg gac tac 300

Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ile Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp Tyr

70 75 80

cgc gcc atc cca gag ctg gac gcc tat gag gcc gag gga ctg gct ctg 348

Arg Ala Ile Pro Glu Leu Asp Ala Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala Leu

85 90 95

gat gat gag gac gta gag gag ctg acg gcc agt cag agg gag gca gca 396

Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala

100 105 110

gag cgg gcc atg cgg cag cgt gac cgg gag gct ggc cgg ggc ctg ggc 444

Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly

115 120 125

cgc atg cgc cgt ggg ctc ctg tat gac agc gat gag gag gac gag gag 492

Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu

130 135 140 145

cgc cct gcc cgc aag cgc cgc cag gtg gag cgg gcc acg gag gac ggc 540

Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly

150 155 160

gag gag gac gag gag atg atc gag agc atc gag aac ctg gag gat ctc 588

Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp Leu

165 170 175

aaa ggc cac tct gtg cgc gag tgg gtg agc atg gcg ggc ccc cgg ctg 636

Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp Val Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu

180 185 190

gag atc cac cac cgc ttc aag aac ttc ctg cgc act cac gtc gac agc 684

Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn Phe Leu Arg Thr His Val Asp Ser

195 200 205

cac ggc cac aac gtc ttc aag gag cgc atc agc gac atg tgc aaa gag 732

His Gly His Asn Val Phe Lys Glu Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys Glu

210 215 220 225

aac cgt gag agc ctg gtg gtg aac tat gag gac ttg gca gcc agg gag 780

Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg Glu

230 235 240

cac gtg ctg gcc tac ttc ctg cct gag gca ccg gcg gag ctg ctg cag 828

His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu Gln

245 250 255

atc ttt gat gag gct gcc ctg gag gtg gta ctg gcc atg tac ccc aag 876

Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu Val Val Leu Ala Met Tyr Pro Lys

260 265 270

tac gac cgc atc acc aac cac atc cat gtc cgc atc tcc cac ctg cct 924

Tyr Asp ArgIle Thr Asn His Ile His Val Arg Ile Ser Hi s Leu Pro

275 280 285

ctg gtg gag gag ctg cgc tcg ctg agg cag ctg cat ctg aac cag ctg 972

Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu

290 295 300 305

atc cgc acc agt ggg gtg gtg acc agc tgc act ggc gtc ctg ccc cag 1020

Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro Gln

310 315 320

ctc agc atg gtc aag tac aac tgc aac aag tgc aat ttc gtc ctg ggt 1068

Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu Gly

325 330 335

cct ttc tgc cag tcc cag aac cag gag gtg aaa cca ggc tcc tgt cct 1116

Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys Pro

340 345 350

gag tgc cag tcg gcc ggc ccc ttt gag gtc aac atg gag gag acc atc 1164

Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile

355 360 365

tat cag aac tac cag cgt atc cga atc cag gag agt cca ggc aaa gtg 1212

Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys Val

370 375 380 385

gcg gct ggc cgg ctg ccc cgc tcc aag gac gcc att ctc ctc gca gat 1260

Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala Asp

390 395 400

ctg gtg gac agc tgc aag cca gga gac gag ata gag ctg act ggc atc 1308

Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly Ile

405 410 415

tat cac aac aac tat gat ggc tcc ctc aac act gcc aat ggc ttc cct 1356

Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe Pro

420 425 430

gtc ttt gcc act gtc atc cta gcc aac cac gtg gcc aag aag gac aac 1404

Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala Asn His Val Ala Lys Lys Asp Asn

435 440 445

aag gtt gct gta ggg gaa ctg acc gat gaa gat gtg aag atg atc act 1452

Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr Asp Glu Asp Val Lys Met Ile Thr

450 455 460 465

agc ctc tcc aag gat cag cag atc gga gag aag atc ttt gcc agc att 1500

Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser Ile

470 475 480

gct cct tcc atc tat ggt cat gaa gac atc aag aga ggc ctg gct ctg 1548

Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala Leu

485 490 495

gcc ctg ttc gga ggg gag ccc aaa aac cca ggt ggc aag cac aag gta 1596

Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys Asn Pro Gly Gly Lys His Lys Val

500 505 510

cgt ggt gat atc aac gtg ctc ttg tgc gga gac cct ggc aca gcg aag 1644

Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala Lys

515 520 525

tcg cag ttt ctc aag tat att gag aaa gtg tcc agc cga gcc atc ttc 1692

Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile Phe

530 535 540 545

acc act ggc cag ggg gcg tcg gct gtg ggc ctc acg gcg tat gtc cag 1740

Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val Gln

550 555 560

cgg cac cct gtc agc agg gag tgg acc ttg gag gct ggg gcc ctg gtt 1788

Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val

565 570 575

ctg gct gac cga gga gtg tgt ctc att gat gaa ttt gac aag atg aat 1836

Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn

580 585 590

gac cag gac aga acc agc atc cat gag gcc atg gag caa cag agc atc 1884

Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile

595 600 605

tcc atc tcg aag gct ggc atc gtc acc tcc ctg cag gct cgc tgc acg 1932

Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr

610 615 620 625

gtc att gct gcc gcc aac ccc ata gga ggg cgc tac gac ccc tcg ctg 1980

Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu

630 635 640

act ttc tct gag aac gtg gac ctc aca gag ccc atc atc tca cgc ttt 2028

Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe

645 650 655

gac atc ctg tgt gtg gtg agg gac acc gtg gac cca gtc cag gac gag 2076

Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu

660 665 670

atg ctg gcc cgc ttc gtg gtg ggc agc cac gtc aga cac cac ccc agc 2124

Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly Ser His Val Arg His His Pro Ser

675 680 685

aac aag gag gag gag ggg ctg gcc aat ggc agc gct gct gag ccc gcc 2172

Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala

690 695 700 705

atg ccc aac acg tat ggc gtg gag ccc ctg ccc cag gag gtc ctg aag 2220

Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys

710 715 720

aag tac atc atc tac gcc aag gag agg gtc cac ccg aag ctc aac cag 2268

Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln

725 730 735

atg gac cag gac aag gtg gcc aag atg tac agt gac ctg agg aaa gaa 2316

Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu

740 745 750

tct atg gcg aca ggc agc atc ccc att acg gtg cgg cac atc gag tcc 2364

Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser

755 760 765

atg atc cgc atg gcg gag gcc cac gcg cgc atc cat ctg cgg gac tat 2412

Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr

770 775 780 785

gtg atc gaa gac gac gtc aac atg gcc atc cgc gtg atg ctg gag agc 2460

Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser

790 795 800

ttc ata gac aca cag aag ttc agc gtc atg cgc agc atg cgc aag act 2508

Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr

805 810 815

ttt gcc cgc tac ctt tca ttc cgg cgt gac aac aat gag ctg ttg ctc 2556

Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu

820 825 830

ttc ata ctg aag cag tta gtg gca gag cag gtg aca tat cag cgc aac 2604

Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg Asn

835 840 845

cgc ttt ggg gcc cag cag gac act att gag gtc cct gag aag gac ttg 2652

Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp Leu

850 855 860 865

gtg gat aag gct cgt cag atc aac atc cac aac ctc tct gca ttt tat 2700

Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn Ile His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr

870 875 880

gac agt gag ctc ttc agg atg aac aag ttc agc cac gac ctg aaa agg 2748

Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn Lys Phe Ser His Asp Leu Lys Arg

885 890 895

aaa atg atc ctg cag cag ttc tga ggccctatgc catccataag gattccttgg 2802

Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe *

900

gattctggtt tggggtggtc agtgccctct gtgctttatg gacacaaaac cagagcactt 2862

gatgaactcg gggtactagg gtcagggctt atagcaggat gtctggctgc acctggcatg 2922

actgtttgtt tctccaagcc tgctttgtgc ttctcacctt tgggtgggat gccttgccag 2982

tgtgtcttac ttggttgctg aacatcttgc cacctccgag tgctttgtct ccactcagta 3042

ccttggatca gagctgctga gttcaggatg cctgcgtgtg gtttaggtgt tagccttctt 3102

acatggatgt caggagagct gctgccctct tggcgtgagt tgcgtattca ggctgctttt 3162

gctgcctttg gccagagagc tggttgaaga tgtttgtaat cgttttcagt ctcctgcagg 3222

tttctgtgcc cctgtggtgg aagagggcac gacagtgcca gcgcagcgtt ctgggctcct 3282

cagtcgcagg ggtgggatgt gagtcatgcg gattatccac tcgccacagt tatcagctgc 3342

cattgctccc tgtctgtttc cccactctct tatttgtgca ttcggtttgg tttctgtagt 3402

tttaattttt aataaagttg aataaaatat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3453

<210>3

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>单克隆抗体27C5.6的MCM2表位的氨基酸序列

<400>3

Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg Ile Gln Glu Ser Pro

1 5 10

<210>4

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>单克隆抗体26H6.19的MCM2表位的氨基酸序列(初步的)

<400>4

Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu

1 5 10 15

Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr

20

<210>5

<211>2688

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>截短的MCM2基因的核苷酸序列

<221>CDS

<222>(1)...(2688)

<223>5’端缺乏27bp的截短的MCM2基因

<400>5

atg gca tcc agc ccg gcc cag cgt cgg cga ggc aat gat cct ctc acc 48

Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr

1 5 10 15

tcc agc cct ggc cga agc tcc cgg cgt act gat gcc ctc acc tcc agc 96

Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser

20 25 30

cct ggc cgt gac ctt cca cca ttt gag gat gag tcc gag ggg ctc cta 144

Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu

35 40 45

ggc aca gag ggg ccc ctg gag gaa gaa gag gat gga gag gag ctc att 192

Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ile

50 55 60

gga gat ggc atg gaa agg gac tac cgc gcc atc cca gag ctg gac gcc 240

Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp Tyr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Asp Ala

65 70 75 80

tat gag gcc gag gga ctg gct ctg gat gat gag gac gta gag gag ctg 288

Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala Leu Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu

85 90 95

acg gcc agt cag agg gag gca gca gag cgg gcc atg cgg cag cgt gac 336

Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp

100 105 110

cgg gag gct ggc cgg ggc ctg ggc cgc atg cgc cgt ggg ctc ctg tat 384

Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr

115 120 125

gac agc gat gag gag gac gag gag cgc cct gcc cgc aag cgc cgc cag 432

Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln

130 135 140

gtg gag cgg gcc acg gag gac ggc gag gag gac gag gag atg atc gag 480

Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu

145 150 155 160

agc atc gag aac ctg gag gat ctc aaa ggc cac tct gtg cgc gag tgg 528

Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp

165 170 175

gtg agc atg gcg ggc ccc cgg ctg gag atc cac cac cgc ttc aag aac 576

Val Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn

180 185 190

ttc ctg cgc act cac gtc gac agc cac ggc cac aac gtc ttc aag gag 624

Phe Leu Arg Thr His Val Asp Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu

195 200 205

cgc atc agc gac atg tgc aaa gag aac cgt gag agc ctg gtg gtg aac 672

Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys Glu Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn

210 215 220

tat gag gac ttg gca gcc agg gag cac gtg ctg gcc tac ttc ctg cct 720

Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg Glu His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro

225 230 235 240

gag gca ccg gcg gag ctg ctg cag atc ttt gat gag gct gcc ctg gag 768

Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu Gln Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu

245 250 255

gtg gta ctg gcc atg tac ccc aag tac gac cgc atc acc aac cac atc 816

Val Val Leu Ala Met Tyr Pro Lys Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile

260 265 270

cat gtc cgc atc tcc cac ctg cct ctg gtg gag gag ctg cgc tcg ctg 864

His Val Arg Ile Ser His Leu Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu

275 280 285

agg cag ctg cat ctg aac cag ctg atc cgc acc agt ggg gtg gtg acc 912

Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr

290 295 300

agc tgc act ggc gtc ctg ccc cag ctc agc atg gtc aag tac aac tgc 960

Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro Gln Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys

305 310 315 320

aac aag tgc aat ttc gtc ctg ggt cct ttc tgc cag tcc cag aac cag 1008

Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln

325 330 335

gag gtg aaa cca ggc tcc tgt cct gag tgc cag tcg gcc ggc ccc ttt 1056

Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys Pro Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe

340 345 350

gag gtc aac atg gag gag acc atc tat cag aac tac cag cgt atc cga 1104

Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg

355 360 365

atc cag gag agt cca ggc aaa gtg gcg gct ggc cgg ctg ccc cgc tcc 1152

Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys Val Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser

370 375 380

aag gac gcc att ctc ctc gca gat ctg gtg gac agc tgc aag cca gga 1200

Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala Asp Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly

385 390 395 400

gac gag ata gag ctg act ggc atc tat cac aac aac tat gat ggc tcc 1248

Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly Ile Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser

405 410 415

ctc aac act gcc aat ggc ttc cct gtc ttt gcc act gtc atc cta gcc 1296

Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe Pro Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala

420 425 430

aac cac gtg gcc aag aag gac aac aag gtt gct gta ggg gaa ctg acc 1344

Asn His Val Ala Lys Lys Asp Asn Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr

435 440 445

gat gaa gat gtg aag atg atc act agc ctc tcc aag gat cag cag atc 1392

Asp Glu Asp Val Lys Met Ile Thr Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile

450 455 460

gga gag aag atc ttt gcc agc att gct cct tcc atc tat ggt cat gaa 1440

Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu

465 470 475 480

gac atc aag aga ggc ctg gct ctg gcc ctg ttc gga ggg gag ccc aaa 1488

AspIle Lys Arg Gly Leu Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys

485 490 495

aac cca ggt ggc aag cac aag gta cgt ggt gat atc aac gtg ctc ttg 1536

Asn Pro Gly Gly Lys His Lys Val Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu

500 505 510

tgc gga gac cct ggc aca gcg aag tcg cag ttt ctc aag tat att gag 1584

Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala Lys Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu

515 520 525

aaa gtg tcc agc cga gcc atc ttc acc act ggc cag ggg gcg tcg gct 1632

Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile Phe Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala

530 535 540

gtg ggc ctc acg gcg tat gtc cag cgg cac cct gtc agc agg gag tgg 1680

Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val Gln Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp

545 550 555 560

acc ttg gag gct ggg gcc ctg gtt ctg gct gac cga gga gtg tgt ctc 1728

Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu

565 570 575

att gat gaa ttt gac aag atg aat gac cag gac aga acc agc atc cat 1776

Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His

580 585 590

gag gcc atg gag caa cag agc atc tcc atc tcg aag gct ggc atc gtc 1824

Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val

595 600 605

acc tcc ctg cag gct cgc tgc acg gtc att gct gcc gcc aac ccc ata 1872

Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile

610 615 620

gga ggg cgc tac gac ccc tcg ctg act ttc tct gag aac gtg gac ctc 1920

Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu

625 630 635 640

aca gag ccc atc atc tca cgc ttt gac atc ctg tgt gtg gtg agg gac 1968

Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp

645 650 655

acc gtg gac cca gtc cag gac gag atg ctg gcc cgc ttc gtg gtg ggc 2016

Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly

660 665 670

agc cac gtc aga cac cac ccc agc aac aag gag gag gag ggg ctg gcc 2064

Ser His Val Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala

675 680 685

aat ggc agc gct gct gag ccc gcc atg ccc aac acg tat ggc gtg gag 2112

Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu

690 695 700

ccc ctg ccc cag gag gtc ctg aag aag tac atc atc tac gcc aag gag 2160

Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu

705 710 715 720

agg gtc cac ccg aag ctc aac cag atg gac cag gac aag gtg gcc aag 2208

Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys

725 730 735

atg tac agt gac ctg agg aaa gaa tct atg gcg aca ggc agc atc ccc 2256

Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro

740 745 750

att acg gtg cgg cac atc gag tcc atg atc cgc atg gcg gag gcc cac 2304

Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His

755 760 765

gcg cgc atc cat ctg cgg gac tat gtg atc gaa gac gac gtc aac atg 2352

Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met

770 775 780

gcc atc cgc gtg atg ctg gag agc ttc ata gac aca cag aag ttc agc 2400

Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser

785 790 795 800

gtc atg cgc agc atg cgc aag act ttt gcc cgc tac ctt tca ttc cgg 2448

Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg

805 810 815

cgt gac aac aat gag ctg ttg ctc ttc ata ctg aag cag tta gtg gca 2496

Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala

820 825 830

gag cag gtg aca tat cag cgc aac cgc ttt ggg gcc cag cag gac act 2544

Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr

835 840 845

att gag gtc cct gag aag gac ttg gtg gat aag gct cgt cag atc aac 2592

Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp Leu Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn

850 855 860

atc cac aac ctc tct gca ttt tat gac agt gag ctc ttc agg atg aac 2640

Ile His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn

865 870 875 880

aag ttc agc cac gac ctg aaa agg aaa atg atc ctg cag cag ttc tga 2688

Lys Phe Ser His Asp Leu Lys Arg Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe *

885 890 895

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>从截短的MCM2核苷酸序列省略的5’核苷酸序列

<400>6

atggcggaat catcggaatc cttcacc 27

<210>7

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>相应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基355到382的MCM2片段

<400>7

Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile Tyr

1 5 10 15

Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg Ile Gln Glu Ser Pro

20 25

<210>8

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>相应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基355到368的MCM2片段

<400>8

Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Val Asn Met Glu Glu Thr

1 5 10

<210>9

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>相应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基362到375的MCM2片段

<400>9

Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg

1 5 10

<210>10

<211>2718

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码六组氨酸标记的MCM2免疫原性多肽的核苷酸序列

<221>misc_feature

<222>(2698)...(2715)

<223>编码六组氨酸标记的核苷酸序列

<400>10

atggcatcca gcccggccca gcgtcggcga ggcaatgatc ctctcacctc cagccctggc 60

cgaagctccc ggcgtactga tgccctcacc tccagccctg gccgtgacct tccaccattt 120

gaggatgagt ccgaggggct cctaggcaca gaggggcccc tggaggaaga agaggatgga 180

gaggagctca ttggagatgg catggaaagg gactaccgcg ccatcccaga gctggacgcc 240

tatgaggccg agggactggc tctggatgat gaggacgtag aggagctgac ggccagtcag 300

agggaggcag cagagcgggc catgcggcag cgtgaccggg aggctggccg gggcctgggc 360

cgcatgcgcc gtgggctcct gtatgacagc gatgaggagg acgaggagcg ccctgcccgc 420

aagcgccgcc aggtggagcg ggccacggag gacggcgagg aggacgagga gatgattgag 480

agcatcgaga acctggagga tctcaaaggc cactctgtgc gcgagtgggt gagcatggcg 540

ggcccccggc tggagatcca ccaccgcttc aagaacttcc tgcgcactca cgtcgacagc 600

cacggccaca acgtcttcaa ggagcgcatc agcgacatgt gcaaagagaa ccgtgagagc 660

ctggtggtga actatgagga cttggcagcc agggagcacg tgctggccta cttcctgcct 720

gaggcaccgg cggagctgct gcagatcttt gatgaggctg ccctggaggt ggtactggcc 780

atgtacccca agtacgaccg catcaccaac cacatccatg tccgcatctc ccacctgcct 840

ctggtggagg agctgcgctc gctgaggcag ctgcatctga accagctgat ccgcaccagt 900

ggggtggtga ccagctgcac tggcgtcctg ccccagctca gcatggtcaa gtacaactgc 960

aacaagtgca atttcgtcct gggtcctttc tgccagtccc agaaccagga ggtgaaacca 1020

ggctcctgtc ctgagtgcca gtcggccggc ccctttgagg tcaacatgga ggagaccatc 1080

tatcagaact accagcgtat ccgaatccag gagagtccag gcaaagtggc ggctggccgg 1140

ctgccccgct ccaaggacgc cattctcctc gcagatctgg tggacagctg caagccagga 1200

gacgagatag agctgactgg catctatcac aacaactatg atggctccct caacactgcc 1260

aatggcttcc ctgtctttgc cactgtcatc ctagccaacc acgtggccaa gaaggacaac 1320

aaggttgctg taggggaact gaccgatgaa gatgtgaaga tgatcactag cctctccaag 1380

gatcagcaga tcggagagaa gatctttgcc agcattgctc cttccatcta tggtcatgaa 1440

gacatcaaga gaggcctggc tctggccctg ttcggagggg agcccaaaaa cccaggtggc 1500

aagcacaagg tacgtggtga tatcaacgtg ctcttgtgcg gagaccctgg cacagcgaag 1560

tcgcagtttc tcaagtatat tgagaaagtg tccagccgag ccatcttcac cactggccag 1620

ggggcgtcgg ctgtgggcct cacggcgtat gtccagcggc accctgtcag cagggagtgg 1680

accttggagg ctggggccct ggttctggct gaccgaggag tgtgtctcat tgatgaattt 1740

gacaagatga atgaccagga cagaaccagc atccatgagg ccatggagca acagagcatc 1800

tccatctcga aggctggcat cgtcacctcc ctgcaggctc gctgcacggt cattgctgcc 1860

gccaacccca taggagggcg ctacgacccc tcgctgactt tctctgagaa cgtggacctc 1920

acagagccca tcatctcacg ctttgacatc ctgtgtgtgg tgagggacac cgtggaccca 1980

gtccaggacg agatgctggc ccgcttcgtg gtgggcagcc acgtcagaca ccaccccagc 2040

aacaaggagg aggaggggct ggccaatggc agcgctgctg agcccgccat gcccaacacg 2100

tatggcgtgg agcccctgcc ccaggaggtc ctgaagaagt acatcatcta cgccaaggag 2160

agggtccacc cgaagctcaa ccagatggac caggacaagg tggccaagat gtacagtgac 2220

ctgaggaaag aatctatggc gacaggcagc atccccatta cggtgcggca catcgagtcc 2280

atgatccgca tggcggaggc ccacgcgcgc atccatctgc gggactatgt gatcgaagac 2340

gacgtcaaca tggccatccg cgtgatgctg gagagcttca tagacacaca gaagttcagc 2400

gtcatgcgca gcatgcgcaa gacttttgcc cgctaccttt cattccggcg tgacaacaat 2460

gagctgttgc tcttcatact gaagcagtta gtggcagagc aggtgacata tcagcgcaac 2520

cgctttgggg cccagcagga cactattgag gtccctgaga aggacttggt ggataaggct 2580

cgtcagatca acatccacaa cctctctgca ttttatgaca gtgagctctt caggatgaac 2640

aagttcagcc acgacctgaa aaggaaaatg atcctgcagc agttcctcga gggtggtcat 2700

catcatcatc atcattga 2718

<210>11

<211>905

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>六组氨酸标记的MCM2免疫原性多肽的氨基酸序列

<223>六组氨酸标记

<400>11

Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr

1 5 10 15

Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser

20 25 30

Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu

35 40 45

Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ile

50 55 60

Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp Tyr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Asp Ala

65 70 75 80

Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala Leu Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp

100 105 110

Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr

115 120 125

Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln

130 135 140

Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu

145 150 155 160

Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp

165 170 175

Val Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn

180 185 190

Phe Leu Arg Thr His Val Asp Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu

195 200 205

Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys Glu Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn

210 215 220

Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg Glu His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro

225 230 235 240

Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu Gln Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu

245 250 255

Val Val Leu Ala Met Tyr Pro Lys Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile

260 265 270

His Val Arg Ile Ser His Leu Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu

275 280 285

Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr

290 295 300

Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro Gln Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys

305 310 315 320

Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln

325 330 335

Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys Pro Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe

340 345 350

Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg

355 360 365

Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys Val Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser

370 375 380

Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala Asp Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly

385 390 395 400

Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly Ile Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser

405 410 415

Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe Pro Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala

420 425 430

Asn His Val Ala Lys Lys Asp Asn Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr

435 440 445

Asp Glu Asp Val Lys Met Ile Thr Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile

450 455 460

Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu

465 470 475 480

Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys

485 490 495

Asn Pro Gly Gly Lys His Lys Val Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu

500 505 510

Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala Lys Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu

515 520 525

Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile Phe Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala

530 535 540

Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val Gln Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp

545 550 555 560

Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu

565 570 575

Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His

580 585 590

Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val

595 600 605

Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile

610 615 620

Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu

625 630 635 640

Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp

645 650 655

Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly

660 665 670

Ser His Val Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala

675 680 685

Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu

690 695 700

Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu

705 710 715 720

Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys

725 730 735

Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro

740 745 750

Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His

755 760 765

Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met

770 775 780

Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser

785 790 795 800

Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg

805 810 815

Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala

820 825 830

Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr

835 840 845

Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp Leu Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn

850 855 860

Ile His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn

865 870 875 880

Lys Phe Ser His Asp Leu Lys Arg Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe Leu

885 890 895

Glu Gly Gly His His His His His His

900 905

<210>12

<211>2718

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码MCM2-FLAG多肽的核苷酸序列

<400>12

atggcatcca gcccggccca gcgtcggcga ggcaatgatc ctctcacctc cagccctggc 60

cgaagctccc ggcgtactga tgccctcacc tccagccctg gccgtgacct tccaccattt 120

gaggatgagt ccgaggggct cctaggcaca gaggggcccc tggaggaaga agaggatgga 180

gaggagctca ttggagatgg catggaaagg gactaccgcg ccatcccaga gctggacgcc 240

tatgaggccg agggactggc tctggatgat gaggacgtag aggagctgac ggccagtcag 300

agggaggcag cagagcgggc catgcggcag cgtgaccggg aggctggccg gggcctgggc 360

cgcatgcgcc gtgggctcct gtatgacagc gatgaggagg acgaggagcg ccctgcccgc 420

aagcgccgcc aggtggagcg ggccacggag gacggcgagg aggacgagga gatgattgag 480

agcatcgaga acctggagga tctcaaaggc cactctgtgc gcgagtgggt gagcatggcg 540

ggcccccggc tggagatcca ccaccgcttc aagaacttcc tgcgcactca cgtcgacagc 600

cacggccaca acgtcttcaa ggagcgcatc agcgacatgt gcaaagagaa ccgtgagagc 660

ctggtggtga actatgagga cttggcagcc agggagcacg tgctggccta cttcctgcct 720

gaggcaccgg cggagctgct gcagatcttt gatgaggctg ccctggaggt ggtactggcc 780

atgtacccca agtacgaccg catcaccaac cacatccatg tccgcatctc ccacctgcct 840

ctggtggagg agctgcgctc gctgaggcag ctgcatctga accagctgat ccgcaccagt 900

ggggtggtga ccagctgcac tggcgtcctg ccccagctca gcatggtcaa gtacaactgc 960

aacaagtgca atttcgtcct gggtcctttc tgccagtccc agaaccagga ggtgaaacca 1020

ggctcctgtc ctgagtgcca gtcggccggc ccctttgagg tcaacatgga ggagaccatc 1080

tatcagaact accagcgtat ccgaatccag gagagtccag gcaaagtggc ggctggccgg 1140

ctgccccgct ccaaggacgc cattctcctc gcagatctgg tggacagctg caagccagga 1200

gacgagatag agctgactgg catctatcac aacaactatg atggctccct caacactgcc 1260

aatggcttcc ctgtctttgc cactgtcatc ctagccaacc acgtggccaa gaaggacaac 1320

aaggttgctg taggggaact gaccgatgaa gatgtgaaga tgatcactag cctctccaag 1380

gatcagcaga tcggagagaa gatctttgcc agcattgctc cttccatcta tggtcatgaa 1440

gacatcaaga gaggcctggc tctggccctg ttcggagggg agcccaaaaa cccaggtggc 1500

aagcacaagg tacgtggtga tatcaacgtg ctcttgtgcg gagaccctgg cacagcgaag 1560

tcgcagtttc tcaagtatat tgagaaagtg tccagccgag ccatcttcac cactggccag 1620

ggggcgtcgg ctgtgggcct cacggcgtat gtccagcggc accctgtcag cagggagtgg 1680

accttggagg ctggggccct ggttctggct gaccgaggag tgtgtctcat tgatgaattt 1740

gacaagatga atgaccagga cagaaccagc atccatgagg ccatggagca acagagcatc 1800

tccatctcga aggctggcat cgtcacctcc ctgcaggctc gctgcacggt cattgctgcc 1860

gccaacccca taggagggcg ctacgacccc tcgctgactt tctctgagaa cgtggacctc 1920

acagagccca tcatctcacg ctttgacatc ctgtgtgtgg tgagggacac cgtggaccca 1980

gtccaggacg agatgctggc ccgcttcgtg gtgggcagcc acgtcagaca ccaccccagc 2040

aacaaggagg aggaggggct ggccaatggc agcgctgctg agcccgccat gcccaacacg 2100

tatggcgtgg agcccctgcc ccaggaggtc ctgaagaagt acatcatcta cgccaaggag 2160

agggtccacc cgaagctcaa ccagatggac caggacaagg tggccaagat gtacagtgac 2220

ctgaggaaag aatctatggc gacaggcagc atccccatta cggtgcggca catcgagtcc 2280

atgatccgca tggcggaggc ccacgcgcgc atccatctgc gggactatgt gatcgaagac 2340

gacgtcaaca tggccatccg cgtgatgctg gagagcttca tagacacaca gaagttcagc 2400

gtcatgcgca gcatgcgcaa gacttttgcc cgctaccttt cattccggcg tgacaacaat 2460

gagctgttgc tcttcatact gaagcagtta gtggcagagc aggtgacata tcagcgcaac 2520

cgctttgggg cccagcagga cactattgag gtccctgaga aggacttggt ggataaggct 2580

cgtcagatca acatccacaa cctctctgca ttttatgaca gtgagctctt caggatgaac 2640

aagttcagcc acgacctgaa aaggaaaatg atcctgcagc agttcctcga ggactacaaa 2700

gacgacgacg acaagtag 2718

<210>13

<211>905

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>MCM2-FLAG多肽的氨基酸序列

<400>13

Met Ala Ser Ser Pro Ala Gln Arg Arg Arg Gly Asn Asp Pro Leu Thr

1 5 10 15

Ser Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Thr Asp Ala Leu Thr Ser Ser

20 25 30

Pro Gly Arg Asp Leu Pro Pro Phe Glu Asp Glu Ser Glu Gly Leu Leu

35 40 45

Gly Thr Glu Gly Pro Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Glu Glu Leu Ile

50 55 60

Gly Asp Gly Met Glu Arg Asp Tyr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Asp Ala

65 70 75 80

Tyr Glu Ala Glu Gly Leu Ala Leu Asp Asp Glu Asp Val Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Ala Ser Gln Arg Glu Ala Ala Glu Arg Ala Met Arg Gln Arg Asp

100 105 110

Arg Glu Ala Gly Arg Gly Leu Gly Arg Met Arg Arg Gly Leu Leu Tyr

115 120 125

Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu Arg Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gln

130 135 140

Val Glu Arg Ala Thr Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu Glu Met Ile Glu

145 150 155 160

Ser Ile Glu Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly His Ser Val Arg Glu Trp

165 170 175

Val Ser Met Ala Gly Pro Arg Leu Glu Ile His His Arg Phe Lys Asn

180 185 190

Phe Leu Arg Thr His Val Asp Ser His Gly His Asn Val Phe Lys Glu

195 200 205

Arg Ile Ser Asp Met Cys Lys Glu Asn Arg Glu Ser Leu Val Val Asn

210 215 220

Tyr Glu Asp Leu Ala Ala Arg Glu His Val Leu Ala Tyr Phe Leu Pro

225 230 235 240

Glu Ala Pro Ala Glu Leu Leu Gln Ile Phe Asp Glu Ala Ala Leu Glu

245 250 255

Val Val Leu Ala Met Tyr Pro Lys Tyr Asp Arg Ile Thr Asn His Ile

260 265 270

His Val Arg Ile Ser His Leu Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu

275 280 285

Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu Ile Arg Thr Ser Gly Val Val Thr

290 295 300

Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro Gln Leu Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys

305 310 315 320

Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu Gly Pro Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln

325 330 335

Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys Pro Glu Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe

340 345 350

Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile Tyr Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg

355 360 365

Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys Val Ala Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser

370 375 380

Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala Asp Leu Val Asp Ser Cys Lys Pro Gly

385 390 395 400

Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly Ile Tyr His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser

405 410 415

Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe Pro Val Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala

420 425 430

Asn His Val Ala Lys Lys Asp Asn Lys Val Ala Val Gly Glu Leu Thr

435 440 445

Asp Glu Asp Val Lys Met Ile Thr Ser Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile

450 455 460

Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu

465 470 475 480

Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys

485 490 495

Asn Pro Gly Gly Lys His Lys Val Arg Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu

500 505 510

Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala Lys Ser Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu

515 520 525

Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile Phe Thr Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala

530 535 540

Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val Gln Arg His Pro Val Ser Arg Glu Trp

545 550 555 560

Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu

565 570 575

Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn Asp Gln Asp Arg Thr Ser Ile His

580 585 590

Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile Ser Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val

595 600 605

Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile

610 615 620

Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu Thr Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu

625 630 635 640

Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe Asp Ile Leu Cys Val Val Arg Asp

645 650 655

Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu Met Leu Ala Arg Phe Val Val Gly

660 665 670

Ser His Val Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala

675 680 685

Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu

690 695 700

Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Lys Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu

705 710 715 720

Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln Met Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys

725 730 735

Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro

740 745 750

Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser Met Ile Arg Met Ala Glu Ala His

755 760 765

Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr Val Ile Glu Asp Asp Val Asn Met

770 775 780

Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser Phe Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser

785 790 795 800

Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe Ala Arg Tyr Leu Ser Phe Arg

805 810 815

Arg Asp Asn Asn Glu Leu Leu Leu Phe Ile Leu Lys Gln Leu Val Ala

820 825 830

Glu Gln Val Thr Tyr Gln Arg Asn Arg Phe Gly Ala Gln Gln Asp Thr

835 840 845

Ile Glu Val Pro Glu Lys Asp Leu Val Asp Lys Ala Arg Gln Ile Asn

850 855 860

Ile His Asn Leu Ser Ala Phe Tyr Asp Ser Glu Leu Phe Arg Met Asn

865 870 875 880

Lys Phe Ser His Asp Leu Lys Arg Lys Met Ile Leu Gln Gln Phe Leu

885 890 895

Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

900 905

<210>14

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>单克隆抗体26H6.19的MCM2表位的氨基酸序列(精确的)

<400>14

His Val Arg His His Pro Ser Asn Lys Glu

1 5 10

Claims

1.一种能特异性结合MCM2，或其变体或片段的单克隆抗体，其中该抗体选自：

(a)由以专利保藏号PTA-6668保藏在ATCC的杂交瘤细胞系27C5.6产生的单克隆抗体；

(b)由以专利保藏号PTA-6667保藏在ATCC的杂交瘤细胞系26H6.19产生的单克隆抗体；

(c)具有由杂交瘤细胞系27C5.6或26H6.19产生的单克隆抗体的结合特性的单克隆抗体；

(d)与能结合由杂交瘤细胞系27C5.6或26H6.19产生的单克隆抗体的表位结合的单克隆抗体；

(e)与含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的表位结合的单克隆抗体；

(f)与含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的表位结合的单克隆抗体；

(g)在竞争性结合测定中与由杂交瘤细胞系27C5.6或26H6.19产生的单克隆抗体竞争的单克隆抗体；和，

(h)为(a)-(g)的单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，其中该片段保留特异性结合MCM2，或其变体或片段的能力。

2.杂交瘤细胞系27C5.6，其以专利保藏号PTA-6668保藏在ATCC。

3.杂交瘤细胞系26H6.19，其以专利保藏号PTA-6667保藏在ATCC。

4.能产生权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

5.一种用于诊断高度宫颈疾病的试剂盒，其包含至少一种权利要求1的单克隆抗体。

6.权利要求5的试剂盒，其中该单克隆抗体是由杂交瘤细胞系27C5.6产生的单克隆抗体，该杂交瘤细胞系27C5.6以专利保藏号PTA-6668保藏在ATCC，或由杂交瘤细胞系26H6.19产生的单克隆抗体，该杂交瘤细胞系26H6.19以专利保藏号PTA-6667保藏在ATCC。

7.权利要求5的试剂盒，其包含至少两种抗体，其中第一抗体是由杂交瘤细胞系27C5.6产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞系27C5.6以专利保藏号PTA-6668保藏在ATCC，第二抗体是由杂交瘤细胞系26H6.19产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞系26H6.19以专利保藏号PTA-6667保藏在ATCC。

8.权利要求7的试剂盒，进一步包含特异性结合Topo2A的抗体。

9.权利要求7的试剂盒，其中每个抗体都以单独的抗体试剂提供。

10.权利要求7的试剂盒，其中所有的抗体都以抗体混合物提供。

11.权利要求5的试剂盒，其中所述的试剂盒进一步包含过氧化物酶封闭试剂，蛋白质封闭试剂，用于检测与所述的生物标记蛋白结合的抗体的化学药品，复染剂，涂蓝剂，和使用说明。

12.权利要求5的试剂盒，进一步包含用于Pap染色的试剂。

13.权利要求12的试剂盒，其中用于Pap染色的试剂包括EA50和橙黄G。

14.一种用于在患者中诊断高度宫颈疾病的方法，该方法包括：

a)从患者获得宫颈样本；

b)使样本与至少一种特异性结合MCM2的权利要求1的单克隆抗体接触；和，

c)检测抗体与MCM2的结合。

15.权利要求14的方法，其中该单克隆抗体是由杂交瘤细胞系27C5.6产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞系27C5.6以专利保藏号PTA-6668保藏在ATCC，或由杂交瘤细胞系26H6.19产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞系26H6.19以专利保藏号PTA-6667保藏在ATCC。

16.权利要求14的方法，包括使样本与特异性结合MCM2的至少两种单克隆抗体接触，其中第一抗体是由杂交瘤细胞系27C5.6产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞系27C5.6以专利保藏号PTA-6668保藏在ATCC，第二抗体是由杂交瘤细胞系26H6.19产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞系26H6.19以专利保藏号PTA-6667保藏在ATCC。

17.权利要求16的方法，进一步包括使样本与特异性结合Topo2A的抗体接触。

18.权利要求16的方法，其中该抗体作为单独的抗体试剂连续地或作为抗体混合物同时与样本接触。

19.一种包含用于结合MCM2单克隆抗体的表位的分离的多肽，其中该多肽含有选自以下的氨基酸序列：

(a)含有SEQ ID NO：3或14所示的氨基酸序列的多肽；和，

(b)与SEQ ID NO：3或14具有至少90％序列同一性的多肽，其中该多肽具有抗原活性。

20.一种用于生产MCM2抗体的方法，包括用权利要求19的多肽免疫动物。

21.一种用于生产MCM2单克隆抗体的方法，包括：

(a)在引起免疫应答的条件下，用权利要求19的多肽免疫动物；

(b)从动物分离抗体生成细胞；

(c)融合抗体生成细胞与培养物中的无限增殖化细胞，以形成单克隆抗体生成杂交瘤细胞；

(d)培养该杂交瘤细胞；和，

(e)从培养物中分离单克隆抗体。