CN101189521A - 生物传感器标记基团 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类化合物，该类化合物特别被设计用作分析物如蛋白质、肽、核酸和相关分子的共振拉曼光谱法标记物，尤其是表面增强的共振拉曼光谱法(SERRS)标记物。本发明的共振拉曼光谱法标记物包含共价连接到用于将所述标记物共价连接到分析物上的反应性基团、SERRS表面结合基团和卤素上的茂金属，其中所述卤素与所述茂金属的连接使得当所述标记物经历共振拉曼光谱分析法时，所述卤素导致产生特征性的拉曼峰。在优选的方面中，所述标记物还具有适合于作为电化学传感标记物的第二用途的氧化还原性能。

Description

生物传感器标记基团
本发明涉及一类化合物，该类化合物特别被设计用作分析物如蛋白质、肽、核酸和相关分子的共振拉曼光谱法标记物，尤其是表面增强的共振拉曼光谱(SERRS)标记物。在本发明的优选的方面，这些化合物除了其拉曼光谱性能以外，还具有适合于作为电化学传感标记物的第二用途的氧化还原性能。
当光从分子中散射时，大多数光子被弹性地散射。大部分散射的光子具有与入射光子相同的能量(并且因此具有相同的频率和波长)。然而，小部分的光(每107个光子中约1个)以与入射光子的频率不同的频率散射。当散射的光子损失能量给所述分子时，它具有比入射光子长的波长(称为斯托克斯散射)。相反，当它获得能量时，它具有更短的波长(称为反斯托克斯散射)；参见图1a。
导致这一非弹性散射的过程以于1928年首先描述这一过程的C.V.Raman先生命名，被称为拉曼效应。这一过程与分子的振动、旋转或电子能量的变化有关，从光子转移到分子上的能量通常以热的形式散失。入射光子和拉曼散射的光子之间的能量差等于散射分子的振动态或者电子跃迁的能量，导致与入射激光存在量子化的能量差的散射的光子。散射光的强度对能量或波长差的图被称为拉曼光谱，并且该技术被称为拉曼光谱法(RS)。
表面增强的拉曼光谱法(SERS)是RS分析技术的改良。如果分子物理地接近某些金属表面，由于在分子和金属的表面电子(等离子体振子)之间的额外的能量转移，可以极大地增加拉曼信号的强度。为了进行SERS，将分析物分子吸附在原子糙化的金属表面上，并检测增强的拉曼散射。
来自在金属表面的数埃内的化合物或离子的拉曼散射可以是溶液内的拉曼散射的103-106倍。对于近可见的波长来说，SERS在银上最强，但在金和铜上也可以容易地观察到。最近的研究表明，各种过渡金属也可以给出有用的SERS增强。SERS效应基本上是在所述分子和金属表面附近的电磁场之间的共振能转移。激发激光的电场矢量诱导金属表面内的偶极子，并且恢复力导致在这一激发的共振频率下的振荡的电磁场。在瑞利极限内，这一共振主要由决定所谓的‘等离子体波长’的、在金属表面的自由电子(‘等离子体振子’)的密度以及金属的介电常数及其环境决定。吸附在表面上或者表面近处的分子经历特别大的电磁场，在该电磁场内，与表面垂直的振动模式被最强烈地增强。这是表面等离子体振子共振(SPR)效应，它使得在等离子体振子和靠近表面的分子之间可以发生穿过空间的能量转移。表面等离子体振子共振的强度取决于许多因素，包括入射光的波长和金属表面的形态，因为能量转移的效率依赖于激光波长和金属的等离子体波长之间的良好匹配。
为了更进一步增加所述增强作用，可以使用生色团部分，以提供有助于能量转移的附加的分子共振，即一种被称为表面增强的共振拉曼光谱法(SERRS)的技术。共振拉曼峰的强度与散射截面α的平方成正比。散射截面又与跃迁偶极矩的平方相关，因此通常遵循吸收光谱。如果入射光子具有接近于在它们的吸收光谱内的吸收峰的能量，则当出现散射事件时，分子更可能处于激发态，从而增加反斯托克斯信号的相对强度。表面和共振增强效应的结合意味着SERRS可以提供巨大的信号增强，典型地比常规的拉曼光谱法强109-1014倍。
除了拉曼散射的共振增强以外，最近描述了共振去增强(resonance de-enhancement)，其中通过共振能量转移机理，拉曼信号的强度降低。在特定的条件下，能量上接近感兴趣的能量的激发能态可产生拉曼散射的降低。在这种情况下，拉曼强度与截面之和的平方成正比，并且如果它们是相反符号的，则可发生相消干扰，导致观察到的共振去增强。这提供了在拉曼生物传感体系中使用的替代量度-通过使用促进这一去增强效应的激光频率/吸收曲线，可以从拉曼光谱中选择性除去来自特定标记物的信号。本文中使用的术语“共振拉曼光谱法”包括共振去增强。
Park等人(Journal of Organometallic Chemistry 584(1999)140-146)公开了作为Pd-催化的烯丙型取代反应的手性配体的手性1’-取代噁唑啉基二茂铁的合成。在这一文献的流程1中所示的合成涉及1，1’-二溴二茂铁、1-(1’-溴代二茂铁)羧酸和1-溴-1’-(氯羰基)二茂铁的使用。
Sünkel等人(Zeitschrift fuer Naturforschung，B：ChemicalSciences(1993)，48(5)，583-590)公开了在环戊二烯基环上具有一个附加官能团的一些三(羰基)·(η5-环戊二烯基)合锰硫醚(cymantrenethioether)的合成。所公开的化合物包括各种氯取代的三(羰基)·(η5-环戊二烯基)合锰单-和双-硫醚(以下称为氯取代的三(羰基)·(η5-环戊二烯基)合锰基硫醚)、[C5Cl4P(Ph)2]Mn(CO)3]和N，N’-双[(三羰基)(三氯(甲硫基)(thrimethylthio)环戊二烯基)合锰]-脲。
(1-氯-2-甲酰基乙烯基)二茂铁可得自Sigma-Aldrich。
现已了解，使用茂金属基团作为其生色团的一系列分子可以用作用于共振拉曼光谱法，尤其是生物传感应用的标记物。为了与分析物(优选生物分子如肽、蛋白质、核酸或碳水化合物，生物分子的类似物，或者生物分子的特异性结合配偶体)一起使用，通过结合一个或更多个卤素取代基(这导致拉曼散射峰的位移不同于由这样的化合物通常产生的那些位移)，来优化所述分子的拉曼光谱性能。
茂金属基团的存在提供了氧化还原中心，所述氧化还原中心使得这些标记物还可用于电化学分析。
所述标记物可以被设计以与常规的肽结合化学相容，和/或可以被取代以提供用于固定在传感器表面上的表面结合官能度(由此在电极上提供电化学活性的单层或提供拉曼散射的表面增强)，或者在自由溶液内使用。
根据本发明，提供了在所附权利要求书中定义的标记物。
根据本发明，提供了共振拉曼光谱法标记物，它包括共价连接到用于将所述标记物共价连接到分析物上的反应性基团和卤素上的茂金属，这样当所述标记物经历共振拉曼光谱分析法时，所述卤素导致产生特征性的拉曼峰。
本发明的标记物可以排除下述化合物：(1-氯-2-甲酰基乙烯基)二茂铁、1，1’-二溴二茂铁、1-(1’-溴代二茂铁)-羧酸、1-溴-1’-(氯羰基)二茂铁、[C5Cl4P(Ph)2]Mn(CO)3]和氯取代的三(羰基)·(η5-环戊二烯基)合锰基硫醚。
所述反应性基团应当由除卤素以外的基团来提供。优选地，所述反应性基团不是卤素。
根据本发明，还提供了共价连接到分析物上的共振拉曼光谱法标记物，该标记物包含共价连接到茂金属上的卤素，使得当所述标记物经历共振拉曼光谱分析法时，所述卤素导致产生特征性的拉曼峰。
共价连接到分析物上的本发明的标记物可以排除下述化合物：N，N’-双[(三羰基)(三氯(甲硫基)(thrimethylthio)环戊二烯基)合锰]-脲。
茂金属是含有过渡金属离子的一类有机金属络合物，其中二茂铁于1951年首先被发现：
Figure S2006800160729D00041
目前，使用术语茂金属来描述具有夹在两个η5-环戊二烯基(Cp)配体之间的金属离子(M)的络合物：
Figure S2006800160729D00042
金属离子与Cp结合模型的端视图
自从发现二茂铁以来，已经制备出许多种茂金属，并且该术语已经发展以包括很多种有机金属结构，包括具有取代的Cp环的那些，实例显示了所有不同的可能的Cp结合模式，一些弯曲的夹心结构，和甚至半夹心或者单Cp络合物。根据本发明，可以使用任何或所有这些结构。
在本文中使用的术语“茂金属”包括包含络合到过渡金属离子上的环戊二烯基环的任何化合物。以下显示了根据本发明可以使用的茂金属结构的优选实例：
M：过渡金属离子          E：杂原子            L：配体
因为一些茂金属可以在一个或者两个环内包括杂原子，因此本文中使用的术语“环戊二烯基”包括其中环碳之一被杂原子如氮、硫、硅或氧替代的环戊二烯基环。
大多数过渡金属离子可以有多种氧化态，所以茂金属能起氧化还原中心的作用，并且因此在电化学研究中作为标记物是公知的。对于大多数的d-区和镧系元素来说，茂金属化合物是可商购的，所以对于选择具有合适的氧化还原和光谱性能的化合物来说可以有很多种选择。优选的茂金属是其中过渡金属离子是钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜或锌过渡金属离子的茂金属。更优选地，过渡金属离子是钪、钛、钒、铬、铁、钴、镍、铜或锌过渡金属离子。
多个卤素可以被共价连接到茂金属上。每个卤素可以共价连接到茂金属的过渡金属离子上，或者共价连接到茂金属的环戊二烯基环上。
对于共振拉曼光谱法来说，在拉曼激发激光的光谱范围内(典型地这是紫外/可见/近红外区域)，所述标记物应当具有至少一个强的吸收峰。由于茂金属含有过渡金属离子，它们在光谱的这一区域内典型地显示出由d轨道电子跃迁引起的强的吸收峰。它们是强烈着色的分子，并且因此被预期是提供共振拉曼光谱法所需要的生色团官能度的良好候选基团。
对光谱标记物的一个关键要求是提供遭受最小背景干扰的光谱信号。由于在拉曼光谱内的峰主要是由来自特定化学基团的振动模式引起的，因此拉曼活性标记物应当理想地含有通常不存在于待分析样品内的化学基团。蛋白质样品在这一区域内确实显示出一些弱的峰(主要是由半胱氨酸、二硫化物键和芳环引起的)，但这些峰比在光谱的其余部分中的那些峰弱得多。对于典型的蛋白质来说，大多数拉曼散射出现在800-1700cm-1区域内，在2000-3000cm-1区域内具有第二窗口。
图1b中显示了胰岛素的拉曼光谱。胰岛素具有相对高比例的二硫化物键(在51个氨基酸分子内有三个二硫化物)。与光谱的其余部分相比，500-800cm-1的光谱区域是“平静的”。因此这将是在其中从拉曼活性的标记物获得信号的优异的窗口。
碳-卤素键在生物样品内是极其稀少的，并且已知碳-卤素键在低于900cm-1的区域内导致强的拉曼发射峰。图2中显示了2-卤代乙醇的拉曼光谱。由于存在卤素原子导致的峰的强度从周期表往下按序增加。
图2中所示的拉曼光谱被归一化到最高峰。在未取代的乙醇中，这是由于在约2930cm-1处的C-H键振动所致。确实，在2000-3000cm-1区域内存在一系列的特征峰，这些峰是由于在所有化合物之间共享的共同的C-H键组所致。由于由取代的分子内C-卤素键引起的峰的增加的强度，这组峰看起来强度降低。在氟取代的分子内，C-卤素峰出现在860cm-1处，具有与C-H峰大致相等的强度。在氯取代的分子中，这一峰偏移到665cm-1，且强度大约是C-H峰的1.5倍。在溴取代的分子中，峰在590cm-1处并且具有2.8倍大的强度，和在碘取代的分子中，峰在520cm-1处并且具有3倍大的强度。除了所述最强的峰以外，在卤代乙醇光谱中，在低于800cm-1的区域内存在额外的峰，这些峰是由C-卤素键的替代振动模式导致的。
图3显示了拉曼位移和C-卤素主峰相对于C-H主峰的强度。显然，主峰的位置和强度遵守周期表内卤素的顺序。碘和溴在最低的拉曼位移处给出最强的峰。然而，C-I峰位置非常接近在胰岛素光谱内在516cm-1处观察到的二硫化物S-S峰，因此可能比C-Br峰(它占据与胰岛素光谱内的谷相同的区域)更容易受到来自蛋白质组分的背景干扰。因此，对于标记蛋白质和肽来说，溴取代的基团是优选的，尽管任何卤素都将给出可接受的结果。
为了使共振效应最大化，在导致生色团吸收特征的电子和在其振动导致拉曼散射光子的能量位移的化学键内涉及的那些电子之间应当存在强的相互作用。这样的安排将确保在来自激发态生色团的电子跃迁和来自拉曼活性振动模式的能量跃迁之间存在强的耦合。如果一个或更多个卤素原子直接取代在Cp环上，或者仅通过少量的居间原子(优选单个原子，更优选单个碳、硅或氮原子)或通过具有离域电子体系的基团连接到Cp环上，则存在形成分子轨道的可能性，在所述分子轨道内过渡金属电子也被包含在连接到卤素原子的化学键内。
例如，完全溴取代的二茂钴：
的最高已占分子轨道和最低未占分子轨道显示，它们在分子的大多数原子上离域(参见图4a)。电子分别被在钴离子、所有10个碳原子和10个溴原子中的4或6个溴原子之间共享。HOMO和LUMO在C-Br键上均显示出反键特征。如果入射激光激发这些电子进入更高的能态，则C-Br键的振动特征也将被改变，从而提供用于共振拉曼信号的有效的能量偶联机理。
对于三溴甲基二茂钴来说，观察到了类似的效果(图4b)。即使溴原子与Cp环被碳原子隔开，分子轨道显示电子在整个分子上离域，并且因此在生色团和分子的拉曼活性区域之间存在有效的耦合。
在本发明的优选实施方案中，多个卤素共价连接到茂金属上，使得当所述标记物(优选SERRS标记物)经历共振拉曼光谱分析法(优选SERRS)时，产生特征性的拉曼峰信号。所述多个卤素可以包括不同的卤素。这样的实施方案可以被用于多种不同分析物的同时的共振拉曼光谱检测，每种不同的分析物用不同的本发明标记物标记。应该理解，通过合适地选择茂金属内的过渡金属和卤素取代方案，使得每一标记物产生可区别于其它标记物的特征拉曼峰信号的特征拉曼峰信号，可以调节标记物的共振拉曼光谱特征。鉴于可以制造的不同标记物的庞大数量，原则上这样的实施方案可以被用于检测非常大数量的不同分析物(可能超过49种分析物)。
本发明的标记物可以被用于通过共振拉曼光谱法检测样品内一种目标化合物或者多种目标化合物的存在或量。目标化合物可以是分析物(即，在目标化合物用本发明的标记物直接标记的情况)，或者分析物可以被用于指示样品内目标化合物的存在或量(例如，通过特异性键合到目标化合物上，或者通过是目标化合物类似物，该目标化合物类似物因目标化合物的存在而被从目标化合物结合物种中置换出来)。
合适的目标化合物的实例包括：生物分子(例如蛋白质、核酸、碳水化合物、蛋白多糖、类脂或激素)，药物或其它治疗剂及它们的代谢物，滥用的药物(例如苯丙胺、鸦片制剂、苯并二氮单类、巴比妥类药物、大麻素、可卡因、LSD及它们的代谢物)，炸药(例如硝基甘油和硝基甲苯，包括TNT、RDX、PETN和HMX)，和环境污染物(例如除草剂、杀虫剂)。
样品是希望测试目标化合物的存在或量的任何样品。存在希望测试目标化合物的存在或量的许多情况。实例包括临床应用(例如检测在生物样品如血液或尿液样品内抗原的存在)，检测滥用的药物的存在(例如在违法样品或生物样品如体液或呼吸样品内)，检测炸药，或者检测环境污染物(例如在液体、空气、土壤或植物样品内)。
在本发明的优选实施方案中，分析物是生物分子，生物分子的特异性结合配偶体，或可以被生物分子的特异性结合配偶体特异性地键合的生物分子的类似物。特异性结合配偶体可以是特异性地识别生物分子的抗体。或者，特异性结合配偶体可以是设计用于特异性地杂交到目标核酸上(典型地在苛刻的杂交条件下)的核酸探针。小分子底物类似物也可能适合于按照本发明标记，使得能进行电化学监测，所述小分子底物包括代谢物、类脂、磷脂和非肽激素。
此处使用的术语“特征拉曼峰”是指由卤素的存在引起的拉曼峰，它可以区别于当包含标记物和分析物(和在目标化合物不同于分析物时的目标化合物)的样品经历共振拉曼光谱分析法时所产生的其它拉曼峰以及背景。
连接到茂金属上的反应性基团优选包括可与分析物直接反应的基团。在分析物是肽或蛋白质的情况下，优选反应性基团包括羧酸基。在分析物是核酸的情况下，优选反应性基团包括胺基。
在本发明的优选实施方案中，标记物与常规的肽结合化学相容。常规的肽合成化学典型地涉及按序添加氨基酸基团到增长的链中。该链携带数个保护基，以掩盖任何反应性官能团，仅在N-端留下一个反应性胺。通过使这一胺与单一羧酸基(带有掩盖它可能含有的任何额外的反应性羧酸盐基的类似保护基)反应来生成肽键，从而添加后续的氨基酸。在所述偶联过程中，典型地通过使该单一羧酸与偶联剂，例如N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物(HBTU)、N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)、7-氮杂苯并三唑-1-基-N-氧-三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyAOP)或类似分子缀合，来活化所述单一羧酸。因此，用于标记肽或蛋白质的本发明的SERRS标记物要求单一的反应性羧酸基，以使得可以使用常规的肽合成化学(并且事实上用在常规的自动化肽合成仪中)将它连接到肽上。另外，它必须不含有任何将干扰这一缀合反应的潜在活性的位点。含有单一反应性羧酸基团的茂金属化合物可以容易地合成，因此与常规的肽合成技术相容。
根据本发明，还提供了共振拉曼光谱法标记物，所述标记物包含共价连接到卤素上的茂金属。优选地，卤素直接取代在茂金属的Cp环上，或者仅通过一个原子连接到Cp环上。根据本发明，进一步提供了共价连接到卤素上的茂金属作为共振拉曼光谱法标记物的用途。当所述标记物经历共振拉曼光谱分析法时，所述卤素应当导致产生特征拉曼峰。可以由本发明的标记物提供共价连接到卤素上的茂金属。
茂金属基团的存在提供了氧化还原中心，所述氧化还原中心使得本发明的标记物还可以用于电化学分析。电化学标记物需要容易接受和给出电子，以便可以通过电化学技术如循环伏安法、电流分析法和线性扫描伏安法检测。在各种不同的氧化态下，茂金属中的过渡金属离子通常能够维持稳定的茂金属结构，因此可容易地通过电化学方法检测。过渡金属离子和键合到其上的配体的性质的精确选择将影响该基团整体的氧化还原电势，因此通过仔细选择这些组分，微调氧化还原电势是可能的。
本发明的标记物可以被用作电化学标记物，来标记酶反应的底物(优选肽底物)，使得可以电化学监测该反应。在这样的实施方案中，可以用本发明的标记物(即用共价连接到卤素上的茂金属)，(共价或非共价地)涂布用于电化学监测所述反应的电极，以在电极上提供保护层，所述保护层将防止或减少酶在电极表面上的变性。
在其它实施方案中，本发明的标记物可以在电化学传感分析中用作电化学介体，以将电子从电极转移到希望电化学监测的反应的组分(例如酶或底物)上。所述标记物在溶液内可以是游离的。或者，所述标记物可以被共价连接到反应组分上和/或(共价或非共价地)固定到电极上。在标记物被固定到电极上的情况下，这将在电极上提供电化学活性的层。如果反应组分包含肽或蛋白质，则所述电化学活性的层可以提供一种保护层，该保护层防止或减少蛋白质在电极表面上的变性。
根据本发明的某些实施方案，可以使用电极来改变本发明的标记物的氧化还原态，并由此影响所述标记物在共振拉曼光谱法中的可视性。这提供了对所述标记物的可视性的电子控制。这尤其可用于其中使用不同的本发明标记物检测多种不同分析物的本发明实施方案中。通过改变标记物的可视性，可以简化样品的拉曼光谱。
在许多情况下，希望将标记物固定在电极(典型地金属电极)的表面上或者提供拉曼表面增强的表面(SERRS表面)上。SERRS表面优选是金属，典型地为金、银或铜。
根据本发明，提供了一种共振拉曼光谱法标记物，它包含共价连接到用于将标记物共价连接到分析物上的反应性基团、SERRS表面结合基团和卤素上的茂金属，其中所述卤素与茂金属的连接使得当该标记物经历共振拉曼光谱分析法时，所述卤素导致产生特征拉曼峰。
根据本发明，还提供了SERRS标记物，它包含共价连接到卤素和SERRS表面结合基团上的茂金属。根据本发明，进一步提供了共价连接到卤素和SERRS表面结合基团上的茂金属作为SERRS标记物的用途。所述SERRS标记物可以由包含SERRS表面结合基团的本发明标记物提供。
SERRS表面结合基团对SERRS表面的结合常数优选是样品内目标化合物的天然存在浓度的至少一半。
有数种已知提供金属结合特性的官能团，其中大多数官能团通过孤电子对(常常来自氮或氧原子)或者共价键(典型地来自硫醇或硫醇盐基团)与金属形成化学键。硫醚基团(例如-SMe基团或-SPh基团)或-PPh2基团不被认为是SERRS表面结合基团。在茂金属内的Cp环可以用合适的基团取代，以提供金属结合官能度。当标记物用于标记肽或蛋白质分析物时，应当选择这一基团，使得它与用于标记分析物的肽结合化学相容(即，它不应当含有游离羧酸根或电子密度非常大的基团)。
本发明的标记物可以被用在使用共振拉曼光谱法的已知检测方法中，以检测样品内的一种目标化合物或者多种目标化合物的存在或量。优选的方法是SERRS置换分析，尤其SERRS置换免疫分析。
按照优选的SERRS置换分析，将样品暴露于一种络合物下，该络合物包含被固定的目标化合物结合物种(它能够特异性地结合目标化合物)和共价连接到分析物及SERRS表面结合基团上的本发明的标记物。所述标记物的分析物是目标化合物的类似物，使得所述目标化合物结合物种特异性地结合到所述标记物的分析物部分上。如果目标化合物存在于样品内，则这将从目标化合物结合物种中置换所述标记物。将任何被置换的标记物暴露于SERRS表面，并使其通过SERRS表面结合基团结合到所述表面上。然后可以通过SERRS检测被置换的标记物。
优选地，SERRS置换分析是SERRS置换免疫分析，其中目标化合物结合物种是特异性地识别目标化合物的抗体(或抗体片段或衍生物)。
优选地，本发明的标记物的环戊二烯基环具有下述结构：
Figure S2006800160729D00121
其中：
R1是分析物或者用于共价连接到分析物上的反应性基团；
R2、R3、R4和R5独立地为X或YRxRyRz；
Y是C、Si或N；
Rx、Ry和Rz独立地为X或H；和
X是卤素；
任选地，R2-R5之一是金属结合基团；
任选地，环碳之一被杂原子(优选氮、硫、硅或氧)替代；
条件是R2-R5中的至少一个包含X。
此处仅显示了环戊二烯基环的结构。标记物的其余部分可以包含以上所示的任何茂金属结构。
或者，优选地，本发明的标记物包含具有下述结构的第一环戊二烯基环：
Figure S2006800160729D00131
其中R’1、R’2、R’3、R’4和R’5独立地为X或YRxRyRz；
Y是C、Si或N；
Rx、Ry和Rz独立地为X或H；和
X是卤素；
任选地，环碳之一被杂原子(优选氮、硫、硅或氧)替代；
条件是R’1-R’5中的至少一个包含X；
和具有下述结构的第二环戊二烯基环：
Figure S2006800160729D00132
其中R”1是分析物或者用于共价连接到分析物上的反应性基团，并且任选地，R”1-R”5之一包含金属结合基团。
优选的金属结合基团的一个实例是苯并三唑基。
本发明的优选方面是：
1)使用茂金属基团作为共振拉曼光谱法的生色团。
2)结合一个或更多个卤素取代基，以产生与由蛋白质和肽或者由核酸或碳水化合物或其它生物分子产生的那些拉曼散射峰不同的拉曼散射峰。
3)通过合适地选择茂金属基团内的过渡金属和取代方案，调节共振拉曼光谱的特征。
4)所述标记物作为用于电化学分析的氧化还原活性基团的第二用途。
5)所述标记物的官能化，以使得可以使用常规的肽结合化学连接到肽上。
6)所述标记物的官能化，以提供用于表面固定的金属结合和随之发生的用于拉曼散射的表面增强和/或在电极表面上形成单层。
在本发明的其它方面中，本发明的标记物可以包含共价连接到除了卤素以外的基团上的茂金属，当所述标记物经历共振拉曼光谱分析法时，所述除了卤素以外的基团将导致产生特征拉曼峰(即不同于分析物或目标化合物所产生的拉曼峰的峰)。
在以下实施例中参考附图描述了本发明的实施方案，其中：
图1a示意性地显示了斯托克斯和反斯托克斯散射的光子的能量变化；
图1b显示了胰岛素的拉曼光谱(C.Ortiz等人(2004)，Anal.Biochem.332；245-252)；
图2显示了乙醇和2-卤代乙醇的拉曼光谱；
图3显示了拉曼位移和C-卤素主峰相对于C-H主峰的强度；
图4a显示了1，2，3，4，5，1’，2’，3’，4’，5’-十溴二茂钴(10-BrCc)的最高已占(上方)和最低未占(下方)分子轨道；
图4b显示了三溴甲基二茂钴的最高已占(上方)和最低未占(下方)分子轨道；
图5显示了根据本发明的一个优选实施方案的标记物；
图6显示了根据本发明的另一个优选的实施方案的标记物(染料A)的化学结构；
图7显示了染料A的UV/可见吸收光谱；
图8显示了染料A的SERRS光谱；
图9显示了根据本发明的另一个优选的实施方案的标记物(染料B)的化学结构；
图10显示了染料B的SERRS光谱；
图11显示了根据本发明的另一个优选的实施方案的肽缀合物的化学结构；和
图12显示了图11所示的肽缀合物的SERRS光谱。
实施例1
图5显示了根据本发明的一个优选实施方案的标记物，该标记物还具有氧化还原性能，该氧化还原性能适合于作为用于电化学传感的标记物的第二用途。溴取代的二茂钴，其中一个Cp环被取代以携带用于肽缀合的游离的羧酸根，并且另一个Cp环被硫代甲基取代，以提供金属结合。与Cp结合的钴离子提供了生色团和氧化还原中心特征，并且与环结合的溴在不应当遭受来自肽或蛋白质(标记物可连接于其上)的显著干扰的光谱区域内提供拉曼散射峰。
实施例2
染料A
图6显示了被称为染料A的本发明的一个优选实施方案的化学结构。图7显示了染料A的UV/可见吸收光谱。在光谱中从～400到550nm可以观察到一个宽峰。从这一点上将可以明白，这一化合物(及其衍生物)适合于与各种可见波长的激光一起使用。在355、430、457、473、501、514、523、532、556和561nm的波长处可以获得合适的可商购的激光。图8显示了染料A的SERRS光谱。在＜1100波数处存在染料A的溴引起的特征拉曼峰。
实施例3
染料B
图9显示了被称为染料B的本发明另一个优选实施方案的化学结构。它包含用作SERRS表面结合基团的苯并三唑基。图10显示了染料B的SERRS光谱。在＜1100波数处存在染料B的溴引起的特征拉曼峰。
实施例4
肽缀合物
图11显示了被称为“肽缀合物”的本发明另一个优选实施方案的化学结构。在这一化合物中，苯并三唑基(它用作SERRS表面结合基团)通过一个连接基团共价连接到茂金属的Cp环上，所述连接基团已经与肽(序列GGVYLLPRRGPR(SEQ ID NO：1))反应。图12显示了所述肽缀合物的SERRS光谱。可以观察到由所述肽引起的光谱背景，但由溴引起的特征拉曼峰存在在＜1100波数处，并且可以与光谱背景区别开。

Claims (28)

1.共振拉曼光谱法标记物，它包含共价连接到用于将所述标记物共价连接到分析物上的反应性基团、SERRS表面结合基团和卤素上的茂金属，其中所述卤素与所述茂金属的连接使得当所述标记物经历共振拉曼光谱分析法时，所述卤素导致产生特征性的拉曼峰。
2.共振拉曼光谱法标记物，它包含共价连接到用于将所述标记物共价连接到分析物上的反应性基团和卤素上的茂金属，其中所述卤素共价连接到茂金属的环戊二烯基环[如本文所定义]上，使得当所述标记物经历共振拉曼光谱分析法时，所述卤素导致产生特征性的拉曼峰，但是排除(1-氯-2-甲酰基乙烯基)二茂铁、1，1’-二溴二茂铁、1-(1’-溴代二茂铁)-羧酸、1-溴-1’-(氯羰基)二茂铁、[C5Cl4P(Ph)2]Mn(CO)3]和氯取代的三(羰基).(η5-环戊二烯基)合锰基硫醚。
3.共价连接到分析物上的共振拉曼光谱法标记物，该标记物包含共价连接到茂金属上的卤素，使得当所述标记物经历共振拉曼光谱分析法时，所述卤素导致产生特征性的拉曼峰，但是排除N，N’-双[(三羰基)(三氯(甲硫基)(thrimethylthio)-环戊二烯基)合锰]-脲。
4.权利要求2或3的标记物，其中所述茂金属共价连接到表面增强的共振拉曼光谱法(SERRS)表面结合基团上。
5.权利要求1或3的标记物，其中所述卤素共价连接到茂金属的环戊二烯基环[如本文所定义]上。
6.权利要求1或3的标记物，其中所述卤素共价连接到茂金属的过渡金属离子上。
7.权利要求2或5的标记物，其中所述卤素直接共价连接到环戊二烯基环的环原子上。
8.权利要求2或5的标记物，其中所述卤素通过碳、硅或氮原子共价连接到环戊二烯基环上。
9.权利要求2或5的标记物，其中所述卤素通过包含离域电子体系的基团共价连接到环戊二烯基环上。
10.前述任何一项权利要求的标记物，其中多个卤素共价连接到茂金属上，使得当所述标记物经历共振拉曼光谱分析法时产生特征性的拉曼峰信号。
11.权利要求10的标记物，其中所述多个卤素包括不同的卤素。
12.前述任何一项权利要求的标记物，其中所述环戊二烯基环具有下述结构：
Figure S2006800160729C00021
其中
R1是分析物或者用于共价连接到分析物上的反应性基团；
R2、R3、R4和R5独立地为X或YRxRyRz；
Y是C、Si或N；
Rx、Ry和Rz独立地为X或H；和
X是卤素；
任选地，R2-R5之一是金属结合基团；
任选地，环碳之一被杂原子(氮、硫、硅或氧)替代；
条件是R2-R5中的至少一个包含X。
13.前述任何一项权利要求的标记物，其中所述分析物是生物分子，生物分子的类似物，或者生物分子的特异性结合配偶体。
14.权利要求13的标记物，其中所述生物分子是肽、核酸或碳水化合物。
15.权利要求13的标记物，其中所述生物分子的特异性结合配偶体是抗体或核酸。
16.权利要求1或2的标记物，其中所述反应性基团包括用于与肽分析物反应的羧酸基，或者用于与核酸分析物反应的胺基。
17.前述任何一项权利要求的标记物，其中可以改变所述标记物的氧化还原态，以影响所述标记物在共振拉曼光谱法中的可视性。
18.用于通过共振拉曼光谱法检测多种不同分析物的多种不同标记物，其中每种不同的标记物如前面任何一项权利要求所述，并且所述每种不同的标记物在经历共振拉曼光谱法时产生特征性的拉曼峰信号，所述特征性的拉曼峰信号可以被用于区分该标记物与其它标记物。
19.多种不同标记物用于通过共振拉曼光谱法检测多种不同分析物的用途，其中每一种标记物如权利要求1-17中任何一项所述。
20.共价连接到卤素上的茂金属作为共振拉曼光谱法标记物的用途。
21.权利要求20的用途，其中所述卤素直接取代在茂金属的环戊二烯基环上，或者通过单一原子连接到环戊二烯基环上。
22.权利要求20或21的用途，其中由权利要求1-17任何一项所述的标记物提供所述共价连接到卤素上的茂金属，或者由(1-氯-2-甲酰基乙烯基)二茂铁、1，1’-二溴二茂铁、1-(1’-溴代二茂铁)-羧酸、1-溴-1’-(氯羰基)二茂铁、[C5Cl4P(Ph)2]Mn(CO)3]、氯取代的三(羰基)·(η5-环戊二烯基)合锰基硫醚或N，N’-双[(三羰基)(三氯(甲硫基)(thrimethylthio)-环戊二烯基)合锰]-脲提供所述共价连接到卤素上的茂金属。
23.作为SERRS标记物的权利要求20或21的用途，其中SERRS表面结合基团还共价连接到所述茂金属上。
24.权利要求23的用途，其中由权利要求1或4-17中任何一项所述的标记物来提供所述共价连接到卤素和SERRS表面结合基团上的茂金属。
25.共价连接到卤素上的茂金属作为标记物或者电化学传感用电化学介体的用途。
26.权利要求25的用途，其中由权利要求1-17任何一项所述的标记物提供所述共价连接到卤素上的茂金属，或者由(1-氯-2-甲酰基乙烯基)二茂铁、1，1’-二溴二茂铁、1-(1’-溴代二茂铁)-羧酸、1-溴-1’-(氯羰基)二茂铁、[C5Cl4P(Ph)2]Mn(CO)3]、氯取代的三(羰基)·(η5-环戊二烯基)合锰基硫醚或N，N’-双[(三羰基)(三氯(甲硫基)(thrimethylthio)-环戊二烯基)合锰]-脲提供所述共价连接到卤素上的茂金属。
27.权利要求25或26的用途，其中所述茂金属还共价连接到用于将茂金属固定到金属电极上的金属结合基团上。
28.权利要求27的用途，其中所述金属结合基团是SERRS表面结合基团。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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