CN101173941A - 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法 - Google Patents

无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101173941A
CN101173941A CNA2006100973181A CN200610097318A CN101173941A CN 101173941 A CN101173941 A CN 101173941A CN A2006100973181 A CNA2006100973181 A CN A2006100973181A CN 200610097318 A CN200610097318 A CN 200610097318A CN 101173941 A CN101173941 A CN 101173941A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
sucrose
coenzyme
stabilizing agent
damping fluid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006100973181A
Other languages
English (en)
Inventor
王尔中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Original Assignee
Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou ANJ Biotech Co Ltd filed Critical Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority to CNA2006100973181A priority Critical patent/CN101173941A/zh
Publication of CN101173941A publication Critical patent/CN101173941A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出无机磷的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。

Description

无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
人体内磷的87％都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积为3540。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，＞70时，可发生转移性钙化。当乘积＜35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、[Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。
由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴离子(H2PO4 1-，HPO4 2-)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。
磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明无机磷浓度测定方法原理如下：
磷酸根+蔗糖 蔗糖磷酸化酶 D-果糖+葡萄糖-1-磷酸
果糖+辅酶 果糖脱氢酶 脱氢果糖+还原型辅酶
这种方法应用蔗糖磷酸化酶(Disaccharide phosphorylases；EC2.4.1.7)酶(偶)联果糖脱氢酶(Fructose dehydrogenase；EC 1.1.1.124；EC 1.1.99.11)酶促反应速率比色法/终点法。蔗糖磷酸化酶酶解蔗糖反应产生果糖，再通过(偶)联合果糖脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算无机磷的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液                100mmol/L
稳定剂                50mmol/L
辅酶                  3mmol/L
蔗糖                  30mmol/L
蔗糖磷酸化酶          12000U/L
果糖脱氢酶            16000U/L
本发明的无机磷诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖。
试剂2
缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶。
辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、蔗糖。
试剂3
缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶。
辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定无机磷浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
辅酶                             3mmol/L
蔗糖                             30mmol/L
蔗糖磷酸化酶            12000U/L
果糖脱氢酶              16000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷的浓度大小。
实施例二
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
辅酶                             3mmol/L
蔗糖                             40mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
蔗糖磷酸化酶                     3000U/L
果糖脱氢酶            20000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷的浓度大小。
实施例三
本实施例的无机磷诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液       100mmol/L
稳定剂                              50mmol/L
辅酶                                3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液       100mmol/L
蔗糖                                10mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液       100mmol/L
稳定剂                              50mmol/L
蔗糖磷酸化酶                        24000U/L
果糖脱氢酶            36000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定无机磷浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。

Claims (6)

1.一种酶比色法及酶联法的无机磷(磷酸根)的浓度测定方法，其方法原理如下：
磷酸根+蔗糖 蔗糖磷酸化酶 D-果糖+葡萄糖-1-磷酸
果糖+辅酶 果糖脱氢酶 脱氢果糖+还原型辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出无机磷的浓度大小测定结果。
2.一种无机磷诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液          20-500mmol/L
稳定剂          1-50mmol/L
辅酶            1-6mmol/L
蔗糖            1-50mmol/L
蔗糖磷酸化酶    1000-80000U/L
果糖脱氢酶      1000-80000U/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶组成。辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、蔗糖组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶组成。辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、果糖脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述无机磷诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
CNA2006100973181A 2006-10-30 2006-10-30 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法 Pending CN101173941A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2006100973181A CN101173941A (zh) 2006-10-30 2006-10-30 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2006100973181A CN101173941A (zh) 2006-10-30 2006-10-30 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101173941A true CN101173941A (zh) 2008-05-07

Family

ID=39422575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006100973181A Pending CN101173941A (zh) 2006-10-30 2006-10-30 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101173941A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101173941A (zh) 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法
CN101324613A (zh) 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法
CN101620130A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101609024A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101620141A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101620153A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)浓度测定方法
CN101173942A (zh) 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度测定方法
CN101324610A (zh) 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法
CN101324614A (zh) 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法
CN101173940A (zh) 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度的测定方法
CN101324612A (zh) 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度测定方法
CN101620149A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101620152A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101620128A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101324609A (zh) 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度测定方法
CN101620127A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101609029A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101620102A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101609036A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101620134A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101620132A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101620129A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101609023A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
CN101324616A (zh) 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度测定方法
CN101620135A (zh) 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
DD01 Delivery of document by public notice

Addressee: Aijie Biological Science & Technology Co., Ltd., Suzhou City Yang Yan

Document name: the First Notification of an Office Action

DD01 Delivery of document by public notice

Addressee: Yang Yan

Document name: Notification that Application Deemed to be Withdrawn

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20080507