CN101172994B - 一种白介素17受体mIL-17RE基因的小干扰RNA及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白介素17受体基因mIL-17RE的小干扰RNA及其编码基因与应用。其目的是提供白介素17受体基因mIL-17RE的小干扰RNA及其编码基因与其在制备与RAS/MAPK信号通路相关疾病的治疗性药物中的应用。该小干扰RNA由正义链和反义链组成，其正义链的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，反义链的碱基序列如SEQ ID NO：6所示。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

Description

一种白介素17受体mIL-17RE基因的小干扰RNA及其编码基因与应用

本申请是2005年11月15日申请的，申请号是200510123226.1，发明名称为“白介素17受体mIL-17RE基因的小干扰RNA及其编码基因与应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及白介素17受体mIL-17RE基因的小干扰RNA及其编码基因与应用，特别是涉及白介素17受体mIL-17RE基因的小干扰RNA及其编码基因与其在制备与RAS/MAPK信号通路相关疾病的治疗性药物中的应用。

背景技术

本发明的发明人经研究获得了一个白介素17受体，名称为mIL-17RE(mIL-17RE1)，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：13；2)将序列表中SEQ ID №：13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且通过激活RAS/MAPK信号通路而具有促有丝分裂作用的蛋白质。序列表中的SEQ ID №：13由637个氨基酸残基组成，其中自氨基端(N端)第1至25位氨基酸残基为信号肽序列；自N端第26至413位氨基酸残基为胞外区序列；自N端第414至439位氨基酸残基为跨膜区序列；自N端第440至637位氨基酸残基为胞内区序列；自N端第352至366位氨基酸残基为Erk1激酶序列；自N端第297至311位氨基酸残基为PDK1结合位点；自N端第4至18位氨基酸残基为Erk D结构域；自N端第578至599位氨基酸残基为典型的亮氨酸拉链序列；自5’端第832至843位碱基以及5’端第919至930位碱基编码保守的N糖基化位点。编码白介素17受体mIL-17RE的基因(mIL-17RE)，是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：14的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：13的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：14限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID №：14由1914个碱基组成，其编码序列为自5’端第1至1914位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。其中，自5′端第1至75位碱基为mIL-17RE信号肽编码序列；自5′端第76至1239位碱基为mIL-17RE胞外区编码序列；自5′端第1240至1317位碱基为mIL-17RE基因跨膜区编码序列；自5′端第1318至1914位碱基为mIL-17RE胞内区的编码序列；自5’端第1054至1098位碱基编码Erk1激酶，自5’端第889至933位碱基编码PDK1结合位点，自5’端第10至54位碱基编码Erk D结构域；自5’端第1732至1797位碱基编码典型的亮氨酸拉链序列；自5’端第832至843位碱基以及5’端第919至930位碱基编码保守的N糖基化位点。实验证明，mIL-17RE在小鼠的肺、肾、胃、小肠及睾丸中具有较高的表达量，并且在个别的肿瘤细胞系(如前列腺癌细胞系DU145、结肠癌细胞T84、和急性单核细胞白血病U937细胞)内也检测到该基因的表达，因此可用RT-PCR方法检测该基因的表达以用于肿瘤的临床诊断；还可以按常规方法制备mIL-17RE的特异性抗体，并用其作为标记物检测肿瘤的发生。此外，mIL-17RE还是一个新型的增殖型受体样分子，通过激活RAS/MAPK信号通路而发挥促有丝分裂效应。

RNA干扰技术(RNA interference，简称RNAi)是通过小分子双链RNA(ds RNA)特异性互补靶向基因转录本，从而诱导转录后基因沉默的一种方式。将双链RNA降解成长度为21-25nt的小干扰RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，这些小片段会进一步介导与其同源的单链RNA降解。2002年，Brummelkamp等采用RNA聚合酶III的H1-RNA作为启动子，用pSUPER质粒作为表达载体，在细胞内合成siRNA，取得了满意的抑制特异基因表达的效果，而且在细胞中表达的时间较人工合成的双链siRNA长(Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expressionof short interfering RNAs in mammalian cells.Science.2002 Apr19；296(5567)：550-3.)。Shi Yang等利用RNA聚合酶III的U6启动子作为合成siRNA的启动子设计载体，并利用其在细胞内合成siRNAs抑制不同基因的表达，也获得了良好的干扰效果(Sui G，Soohoo C，Affar el B，Gay F，Shi Y，Forrester WC，Shi Y.A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression inmammalian cells.Proc Natl Acad Sci U S A.2002 Apr 16；99(8)：5515-20.)。作为一种新型的治疗学方法，RNA干扰技术已被广泛用于多种人类疾病治疗方法的研发中。

发明内容

本发明的目的是提供白介素17受体基因mIL-17RE的小干扰RNA。

本发明所提供的白介素17受体基因mIL-17RE的小干扰RNA，可为下述双链RNA序列之一：

1)正义链具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，反义链具有序列表中SEQ ID№：2的双链RNA序列；

2)正义链具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列，反义链具有序列表中SEQ ID№：4的双链RNA序列；

3)正义链具有序列表中SEQ ID №：5的核苷酸序列，反义链具有序列表中SEQ ID№：6的双链RNA序列。

将上述三对双链RNA序列依次命名为mIL-17RE siRNA1、siRNA2、siRNA3。mIL-17REsiRNA1的反义链与mIL-17RE mRNA的158-175位置序列互补，序列表中SEQ ID №：1由18个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №：2由18个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；mIL-17RE siRNA2的反义链与mIL-17RE mRNA的248-265位置序列互补，序列表中SEQ ID №：3由18个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №：4由18个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；mIL-17RE siRNA3的反义链与mIL-17REmRNA的1777-1794位置序列互补，序列表中SEQ ID №：5由18个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №：6由18个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

上述白介素17受体基因mIL-17RE小干扰RNA的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述双链核苷酸序列之一：

1)正义链(不做模板的DNA链)具有序列表SEQ ID №：7的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中SEQ ID №：8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

2)正义链具有序列表SEQ ID №：9的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：9限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID №：10的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：10限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

3)正义链具有序列表SEQ ID №：11的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：11限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID№：12的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中SEQ ID №：7由49个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №：8由53个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端；序列表中SEQ ID №：9由49个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №：10由53个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端；序列表中SEQ ID №：11由49个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №：12由53个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

含有白介素17受体基因mIL-17RE小干扰RNA的编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增白介素17受体基因mIL-17RE小干扰RNA的编码基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种抑制机体RAS/MAPK信号通路激活的方法。

本发明所提供的抑制机体RAS/MAPK信号通路激活的方法，是将上述白介素17受体基因mIL-17RE小干扰RNA的编码基因导入宿主中，RAS/MAPK信号通路的激活得到抑制。

所述白介素17受体基因mIL-17RE小干扰RNA的编码基因可通过含有所述白介素17受体基因mIL-17RE小干扰RNA的编码基因的sRNAi干扰载体导入宿主；用于构建所述RNAi干扰载体的出发载体可为任意一种可在宿主中表达外源基因的载体，如pBS/U6(Sui G，Soohoo C，Affar el B，Gay F，Shi Y，Forrester WC，Shi Y.A DNAvector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci U S A.2002 Apr 16；99(8)：5515-20.)、腺病毒载体(FEBS Lett.2003.539，111-114.)、反转录病毒载体(Nat.Genet.2003.33，401-406.)、哺乳细胞稳定表达系统(Science 2002.296，550-553.)、RNA聚合酶II表达系统(Mol.Cell2002.9，1327-1333.)或可调控的RNA干扰系统(Nucleic Acids Res.2003.31，e127.)等。

以pBS/U6为出发载体，构建的sRNAi干扰载体为pBS/U6-siRNA1，pBS/U6-siRNA2和pBS/U6-siRNA3。

本发明提供了白介素17受体基因mIL-17RE的小干扰RNA及其编码基因。实验证明，将编码本发明mIL-17RE的小干扰RNA的编码基因导入宿主，使宿主细胞内mIL-17RE沉默，进而可抑制RAS/MAPK信号通路的激活。因此可以mIL-17RE干扰RNA的编码基因作为活性成分制备成药物，用于治疗与RAS/MAPK信号通路相关的疾病，如前列腺肿瘤、白血病、及甲状腺肿瘤等疾病。本发明在医学和生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为三种mIL-17REsiRNA表达质粒对mIL-17RE表达抑制作用的实验结果

图2为利用荧光酶报告系统检测三种siRNA对mIL-17RE介导的RAS/MAPK信号通路激活的抑制作用的实验结果

图3为检测三种mIL-17RE siRNA对mIL-17RE介导的RAS/MAPK信号通路激活的抑制作用剂量效应的实验结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物由上海生工生物技术有限公司合成。

实施例1、白介素17受体基因mIL-17RE特异性siRNA干扰载体的构建

根据白介素17受体基因mIL-17RE的mRNA序列设计其siRNA序列，得到三条双链RNA序列，分别命名为mIL-17RE siRNA1、siRNA2、siRNA3，序列如下：

1)siRNA1

正义链：5’-ggggcugguucccucucu-3’  (序列表中SEQ ID №：1)

反义链：5’-agagagggaaccagcccc-3’  (序列表中SEQ ID №：2)；

2)siRNA2

正义链：5’-ggaagcugcuaggcagcc-3’(序列表中SEQ ID №：3)

反义链：5’-ggcugccuagcagcuucc-3’(序列表中SEQ ID №：4)；

3)siRNA3

正义链：5’-gccuccagcuggagucac-3’  (序列表中SEQ ID №：5)

反义链：5’-gugacuccagcuggaggc-3’  (序列表中SEQ ID №：6)。

再根据上述三对siRNA序列合成构建mIL-17RE特异性siRNA干扰载体所需的互补DNA序列，序列如下：

1)针对siRNA1合成的两对互补序列：

1a：5′-ggggctggttccctctcta-3′

1b：5′-agcttagagagggaaccagcccc-3′；

1c：5′-agcttagagagggaaccagccccctttttg-3′

1d：5′-aattcaaaaagggggctggttccctctcta-3′；

2)针对siRNA2合成的两对互补序列：

2a：5′-ggaagctgctaggcagcca-3′

2b：5′-agcttggctgcctagcagcttcc-3′；

2c：5′-agcttggctgcctagcagcttccctttttg-3′

2d：5′-aattcaaaaagggaagctgctaggcagcca-3′；

3)针对siRNA3合成的两对互补序列：

3a：5′-gcctccagctggagtcaca-3′

3b：5′-agcttgtgactccagctggaggc-3′；

3c：5′-agcttgtgactccagctggaggcctttttg-3′

3d：5′-aattcaaaaaggcctccagctggagtcaca-3′。

以pBS/U6(参考文献Sui G，Soohoo C，Affar el B，Gay F，Shi Y，ForresterWC，Shi Y.A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expressionin mammalian cells.Proc Natl Acad Sci U S A.2002 Apr 16；99(8)：5515-20.)为构建mIL-17RE特异性siRNA干扰质粒的出发载体，将质粒pBS/U6经限制性内切酶Apa I酶切后，用Klenow酶(购自TaKaRa)处理使其平端化，然后再用限制性内切酶Hind III进行酶切，用胶回收试剂盒(购自博大公司)回收3.2kbp的酶切片段，备用。将等量的1a和1b，2a和2b，3a和3b分别两两混合于95℃进行退火，然后将三组退火的寡聚核苷酸混合物分别亚克隆到经上述酶切处理后回收的pBS/U6线性质粒中，形成三种重组质粒，分别命名为pBS/U6-1a1b，pBS/U6-2a2b和pBS/U6-3a3b。将上述三种质粒用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，用胶回收试剂盒回收三条大片段，备用。再将等量的1c和1d，2c和2d，3c和3d分别两两混合于95℃进行退火，然后将三种退火的寡聚核苷酸混合物分别亚克隆到经上述酶切处理后回收的线性质粒pBS/U6-1a1b，pBS/U6-2a2b和pBS/U6-3a3b中，得到三种mIL-17RE siRNA表达质粒，分别命名为pBS/U6-siRNA1，pBS/U6-siRNA2和pBS/U6-siRNA3。

实施例2、检测三种mIL-17RE siRNA表达质粒对mIL-17RE表达的抑制作用

一、mIL-17RE的克隆

按常规方法提取小鼠结肠组织的总RNA并以此为模板，在引物P1(上游引物)：5′-cagacaggaaagacatggtctc-3′和P2(下游引物)：5′-agacagctgaaaccacagggac-3′的引导下用TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒并参照试剂盒说明书进行RT-PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化1914bp的目的片段。由于经Taq聚合酶扩增后产物的5′末端被加有一个A碱基，因此，将目的片段直接亚克隆到载体pGEM-T(购自Promega公司)中，将重组产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经蓝白斑筛选得到阳性克隆，挑选阳性克隆摇菌提质粒，将含有目的片段的质粒载体命名为pGEM-T-mIL-17RE，用限制性内切酶Kpn I和BamH I对其进行酶切鉴定，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经酶切获得了5493bp和1914bp的酶切片段，表明扩增片段正确插入到载体中。对经酶切鉴定正确的阳性克隆质粒用测序的方法做进一步的鉴定，测序的结果表明所克隆到了序列正确的mIL-17RE。

二、检测三种mIL-17RE siRNA表达质粒对mIL-17RE表达的抑制作用

将步骤一克隆的全长mIL-17RE cDNA用限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切后，与经相同酶双酶切的载体pcDNA3.1-Myc/his(购自Invitrogen)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选得到阳性克隆，挑选阳性克隆摇菌提质粒，经鉴定后得到带有Myc标签的mIL-17RE的重组表达质粒，命名为pcDNA3.1(mIL-17RE)。将约1μg的质粒pcDNA3.1(mIL-17RE)分别与0μg，0.5μg，1.0μg和2.0μg的pBS/U6-siRNA1(或pBS/U6-siRNA2，或pBS/U6-siRNA3)混合，用磷酸钙试剂(购自Clontech)分别转染293T细胞。将转染细胞的细胞裂解液经10％SDS-PAGE分离后转到硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences)上，然后以鼠源抗Myc标签单克隆抗体(购自Santa Cruz公司)为一抗进行杂交，以荧光素标记的羊源抗鼠抗体(Amersham Biosciences UK Limited)为二抗，最后用ECL化学发光的底物(AmershamBiosciences)进行杂交信号放大，结果如图1所示(anti：Myc表示鼠源抗Myc标签的单克隆抗体；“+”“-”分别表示转染时添加或不添加相应的质粒；渐进符号代表siRNA的转染剂量从0.5μg，1.0μg递增到2.0μg)，结果表明siRNA1，siRNA2和siRNA3对mIL-17RE蛋白的表达均有显著抑制作用，并且这种抑制效应具有剂量依赖性的特点，此外，siRNA1的抑制效应略高于siRNA2和siRNA3。

实施例3、检测三种mIL-17REsiRNA对mIL-17RE介导的RAS/MAPK信号通路激活的抑制作用

利用荧光酶(Luciferase)报告系统检测三种siRNA对mIL-17RE介导的RAS/MAPK信号通路激活的抑制作用。转录因子Elk1是RAS/MAPK信号通路激活的靶基因。若IL-17RE可以激活RAS/MAPK信号通路，则Elk1-Luciferase的表达水平就会上调。具体方法为：将每孔4×10⁵个293T细胞铺于6孔板，使其密度长到80％。用磷酸钙转染试剂(购自Clontech)将1.5μg的pcDNA3.1空载体，pcDNA3.1(mIL-17RE)，pcDNA3.1(mIL-17RE)加pBS/U6，pcDNA3.1(mIL-17RE)加pBS/U-siRNA1，pcDNA3.1(mIL-17RE)加pBS/U-siRNA2，pcDNA3.1(mIL-17RE)加pBS/U-siRNA3分别转染到不同孔的293细胞中，外加荧光酶报告系统质粒PFA-Elk-1、PFR-luciferase(参考文献：J Biol Chem.2001 Sep 28；276(39)：36804-8)。与此同时，用海肾(Renilla)萤光素酶质粒(购自Promega)为内参照来进行定量标准化，荧光素酶活性检测结果如图2所示(p3表示：pcDNA3.1空载体组，mIL17RE表示：pcDNA3.1(mIL-17RE)组，mIL17RE+U6表示：pcDNA3.1(mIL-17RE)加pBS/U6组，mIL17RE+RNAi I表示：pcDNA3.1(mIL-17RE)加pBS/U-siRNA1组，mIL17RE+RNAiII表示：pcDNA3.1(mIL-17RE)加pBS/U-siRNA2组，mIL17RE+RNAiIII表示：pcDNA3.1(mIL-17RE)加pBS/U-siRNA3组；“+”“-”分别表示转染时添加或不添加相应的质粒)，表明三种siRNA对mIL-17RE介导的Elk1-荧光素酶基因表达的激活具有明显的抑制作用。

实施例4、检测三种mIL-17REsiRNA对mIL-17RE介导的RAS/MAPK信号通路激活抑制的剂量效应

以siRNA1为例，检测三种mIL-17RE siRNA对mIL-17RE介导的RAS/MAPK信号通路激活的抑制作用的剂量效应。具体方法为：将等量的分别转染有pBS/U6空载体或pcDNA3.1(mIL-17RE)与不同剂量的pBS/U-siRNA1混合质粒(分别为0.5μg，1.0μg，或2.0μg)的293细胞裂解液，经10％SDS-PAGE分离后转到硝酸纤维素膜(AmershamBiosciences)上，然后分别以鼠源抗Myc标签、抗ERK、抗磷酸化ERK的单克隆抗体为一抗(购自Santa Cruz公司)进行杂交，以荧光素标记的羊源抗鼠抗体(AmershamBiosciences UK Limited)为二抗，最后用ECL化学发光的底物(AmershamBiosciences)进行杂交信号放大，结果如图3所示(anti：p-ERK、anti：ERK、anti：Myc分别表示抗磷酸化ERK、抗ERK、鼠源抗Myc标签的单克隆抗体的实验组，pBS/U6、mIL17RE-myc，mIL-17RE-siRNA1分别表示转染有pBS/U6空载体、pcDNA3.1(mIL-17RE)和pBS/U6-siRNA1的293细胞；“+”“-”分别表示转染时添加或不添加的质粒；渐进符号代表siRNA的转染剂量从0.5μg，1.0μg到2.0μg)，表明siRNA1可显著抑制mIL-17RE对胞内RAS/MAPK信号通路激活，证明本发明的三种mIL-17RE siRNA可特异性抑制与mIL-17RE相关的生物学作用及功能。

序列表

<160>14

<210>1

<211>18

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ggggcugguu cccucucu

18

<210>2

<211>18

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

agagagggaa ccagcccc

18

<210>3

<211>18

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggaagcugcu aggcagcc

18

<210>  4

<211>18

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ggcugccuag cagcuucc

18

<210>5

<211>18

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gccuccagcug gagucac

18

<210>6

<211>18

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gugacucca gcuggaggc

18

<210>7

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ggggctggtt ccctctctaa gcttagagag ggaaccagcc ccctttttg    49

<210>8

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ccccgaccaa gggagagatt  cgaatctctc ccttggtcgg gggaaaaact  taa    53

<210>9

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

ggaagctgct aggcagccaa gcttggctgc ctagcagctt ccctttttg           49

<210>10

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

ccttcgacga tccgtcggtt cgaaccgacg gatcgtcgaa gggaaaaact taa      53

<210>11

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

gcctccagct ggagtcacaa gcttgtgact ccagctggag gcctttttg        49

<210>12

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

cggaggtcga cctcagtgtt cgaacactga ggtcgacctc cggaaaaact taa    53

<210>13

<211>637

<212>PRT

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>13

Met Gly Ser Pro Arg Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ser Leu Pro Leu Leu

1               5                   10                  15

Leu Ile Gly Leu Ala Val Ser Ala Arg Val Ala Cys Pro Cys Leu Arg

            20                  25                  30

Ser Trp Thr Ser His Cys Leu Leu Ala Tyr Arg Val Asp Lys Arg Phe

        35                  40                  45

Ala Gly Leu Gln Trp Gly Trp Phe Pro Leu Leu Val Arg Lys Ser Lys

    50                  55                  60

Ser Pro Pro Lys Phe Glu Asp Tyr Trp Arg His Arg Thr Pro Ala Ser

65                  70                  75                  80

Ser Gln Arg Lys Leu Leu Gly Ser Pro Ser Leu Ser Glu Glu Ser His

                85                  90                  95

Arg Ile Ser Ile Pro Ser Ser Ala Ile Ser His Arg Gly Gln Arg Thr

            100                 105                 110

Lys Arg Ala Gln Pro Ser Ala Ala Glu Gly Arg Glu His Leu Pro Glu

        115                 120                 125

Ala Gly Ser Gln Lys Cys Gly Gly Pro Glu Phe Ser Phe Asp Leu Leu

    130                 135                 140

Pro Glu Val Gln Ala Val Arg Val Thr Ile Pro Ala Gly Pro Lys Ala

145                 150                 155                 160

Ser Val Arg Leu Cys Tyr Gln Trp Ala Leu Glu Cys Glu Asp Leu Ser

                165                 170                 175

Ser Pro Phe Asp Thr Gln Lys Ile Val Ser Gly Gly His Thr Val Asp

            180                 185                 190

Leu Pro Tyr Glu Phe Leu Leu Pro Cys Met Cys Ile Glu Ala Ser Tyr

        195                 200                 205

Leu Gln Glu Asp Thr Val Arg Arg Lys Lys Cys Pro Phe Gln Ser Trp

    210                 215                 220

Pro Glu Ala Tyr Gly Ser Asp Phe Trp Gln Ser Ile Arg Phe Thr Asp

225                 230                 235                 240

Tyr Ser Gln His Asn Gln Met Val Met Ala Leu Thr Leu Arg Cys Pro

                245                 250                 255

Leu Lys Leu Glu Ala Ser Leu Cys Trp Arg Gln Asp Pro Leu Thr Pro

            260                 265                 270

Cys Glu Thr Leu Pro Asn Ala Thr Ala Gln Glu Ser Glu Gly Trp Tyr

        275                 280                 285

Ile Leu Glu Asn Val Asp Leu His Pro Gln Leu Cys Phe Lys Phe Ser

    290                 295                 300

Phe Glu Asn Ser Ser His Val Glu Cys Pro His Gln Ser Gly Ser Leu

305                 310                 315                 320

Pro Ser Trp Thr Val Ser Met Asp Thr Gln Ala Gln Gln Leu Thr Leu

                325                 330                 335

His Phe Ser Ser Arg Thr Tyr Ala Thr Phe Ser Ala Ala Trp Ser Asp

            340                 345                 350

Pro Gly Leu Gly Pro Asp Thr Pro Met Pro Pro Val Tyr Ser Ile Ser

        355                 360                 365

Gln Thr Gln Gly Ser Val Pro Val Thr Leu Asp Leu Ile Ile Pro Phe

    370                 375                 380

Leu Arg Gln Glu Asn Cys Ile Leu Val Trp Arg Ser Asp Val His Phe

385                 390                 395                 400

Ala Trp Lys His Val Leu Cys Pro Asp Val Ser His Arg His Leu Gly

                405                 410                 415

Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Thr Leu Thr Ala Leu Val Gly Val Val

            420                 425                 430

Leu Val Leu Leu Gly Arg Arg Leu Leu Pro Gly Ser Gly Arg Thr Arg

        435                 440                 445

Pro Val Leu Leu Leu His Ala Ala Asp Ser Glu Ala Gln Arg Arg Leu

    450                 455                 460

Val Gly Ala Leu Ala Glu Leu Leu Arg Thr Ala Leu Gly Gly Gly Arg

465                 470                 475                 480

Asp Val Ile Val Asp Leu Trp Glu Gly Thr His Val Ala Arg Ile Gly

                485                 490                 495

Pro Leu Pro Trp Leu Trp Ala Ala Arg Glu Arg Val Ala Arg Glu Gln

            500                 505                 510

Gly Thr Val Leu Leu Leu Trp Asn Cys Ala Gly Pro Ser Thr Ala Cys

        515                 520                 525

Ser Gly Asp Pro Arg Ala Ala Ser Leu Arg Thr Leu Leu Cys Ala Ala

    530                 535                 540

Pro Arg Pro Leu Leu Leu Ala Tyr Phe Ser Arg Leu Cys Ala Lys Gly

545                 550                 555                 560

Asp Ile Pro Arg Pro Leu Arg Ala Leu Pro Arg Tyr Arg Leu Leu Arg

                565                 570                 575

Asp Leu Pro Arg Leu Leu Arg Ala Leu Asp Ala Gln Pro Ala Thr Leu

            580                 585                 590

Ala Ser Ser Trp Ser His Leu Gly Ala Lys Arg Cys Leu Lys Asn Arg

        595                 600                 605

Leu Glu Gln Cys His Leu Leu Glu Leu Glu Ala Ala Lys Asp Asp Tyr

    610                 615                 620

Gln Gly Ser Thr Asn Ser Pro Cys Gly Phe Ser Cys Leu

625                 630                 635

<210>14

<211>1914

<212>DNA

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>14

atggggagcc ccagactggc agccttgctc ctgtctctcc cgctactgct catcggcctc    60

gctgtgtctg ctcgggttgc ctgcccctgc ctgcggagtt ggaccagcca ctgtctcctg   120

gcctaccgtg tggataaacg ttttgctggc cttcagtggg gctggttccc tctcttggtg   180

aggaaatcta aaagtcctcc taaatttgaa gactattgga ggcacaggac accagcatcc   240

tcccagagga agctgctagg cagcccttcc ctgtctgagg aaagccatcg aatttccatc   300

ccctcctcag ccatctccca cagaggccaa cgcaccaaaa gggcccagcc ttcagctgca   360

gaaggaagag aacatctccc tgaagcaggg tcacaaaagt gtggaggacc tgaattctcc   420

tttgatttgc tgcccgaggt gcaggctgtt cgggtgacta ttcctgcagg ccccaaggcc   480

agtgtgcgcc tttgttatca gtgggcactg gaatgtgaag acttgagtag cccttttgat   540

acccagaaaa ttgtgtctgg aggccacact gtagacctgc cttatgaatt ccttctgccc   600

tgcatgtgca tagaggcctc ctacctgcaa gaggacactg tgaggcgcaa aaagtgtccc   660

ttccagagct ggcctgaagc ttatggctca gacttctggc agtcaatacg cttcactgac   720

tacagccagc acaatcagat ggtcatggct ctgacactcc gctgcccact gaaactggag   780

gcctccctct gctggaggca ggacccactc acaccctgcg aaacccttcc caacgccaca   840

gcacaggagt cagaaggatg gtatatcctg gagaatgtgg acttgcaccc ccagctctgc   900

tttaagttct catttgaaaa cagcagccac gttgaatgtc cccaccagag tggctctctc   960

ccatcctgga ctgtgagcat ggatacccag gcccagcagc tgacgcttca cttttcttcg  1020

aggacatatg ccaccttcag tgctgcctgg agtgacccag gtttggggcc ggataccccc  1080

atgcctcctg tgtacagcat cagccagacc cagggctcag tcccagtgac gctagacctc  1140

atcatcccct tcctgaggca ggagaattgc atcctggtgt ggaggtcaga tgtccatttt  1200

gcctggaagc acgtcttgtg tcctgatgtc tcccatagac acctcgggct cttgatcctg  1260

gcactgctga ctctcaccgc tctagtgggt gtagttctgg tcctcctcgg ccggcgccta  1320

ctgccaggct ccggtcgaac aaggccagtt ttactcctac atgcagcgga ctcagaggca  1380

cagcgacgcc tggtgggagc tttggccgaa ctgctgcgga cggcgctggg aggtggacgc    1440

gacgtgatcg tggatctctg ggaagggacg cacgtagcac gcattggacc actgccgtgg    1500

ctttgggcag cgcgggagcg cgtggcgcgg gagcagggca cagtgctgct cctgtggaac    1560

tgtgcgggtc ccagcaccgc ctgcagcggt gacccgcggg ctgcgtccct tcgcaccttg    1620

ttgtgcgctg ctccacgtcc gctgctgctc gcctacttca gtcgcctctg cgccaaaggc    1680

gacatccccc ggccgctgcg cgctctgcca cgctaccgcc tgcttcgtga cctgccgcgc    1740

ctgctgagag cactggatgc tcagcctgcc accctagcct ccagctggag tcaccttggg    1800

gctaagcggt gcttgaaaaa ccgtctggag cagtgtcacc tgctggaact tgaggctgcc    1860

aaagatgact accaaggctc aaccaatagt ccctgtggtt tcagctgtct gtag          1914

Claims (10)

1.白介素17受体mIL-17RE基因的小干扰RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的碱基序列如SEQID NO：5所示，反义链的碱基序列如SEQ ID NO：6所示。

2.权利要求1所述的白介素17受体mIL-17RE基因的小干扰RNA的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述基因的正义链为序列表SEQ ID NO：11的核苷酸序列；反义链为序列表中SEQ ID NO：12的核苷酸序列。

4.含有权利要求2所述白介素17受体mIL-17RE基因小干扰RNA编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

5.一种抑制RAS/MAPK信号通路激活的方法，是将权利要求2所述的白介素17受体mIL-17RE基因小干扰RNA的编码基因导入离体的宿主细胞中，RAS/MAPK信号通路的激活得到抑制。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述白介素17受体mIL-17RE基因小干扰RNA的编码基因通过含有所述白介素17受体mIL-17RE基因小干扰RNA的编码基因的sRNAi干扰载体导入宿主；用于构建所述sRNAi干扰载体的出发载体为pBS/U6、腺病毒载体、反转录病毒载体或哺乳细胞稳定表达系统。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：用于构建所述sRNAi干扰载体的出发载体为pBS/U6。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述sRNAi干扰载体为pBS/U6-siRNA3。

9.权利要求1所述的白介素17受体mIL-17RE基因的小干扰RNA在制备与RAS/MAPK信号通路相关疾病的治疗性药物中的应用。

10.权利要求2或3所述的白介素17受体mIL-17RE基因的小干扰RNA的编码基因在制备与RAS/MAPK信号通路相关疾病的治疗性药物中的应用。

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