CN101151363A - 命名为番茄Torrado病毒的植物病毒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒学领域。本发明提供了命名为番茄torrado病毒(ToTV)的分离的植物病毒(ToTV)及其成分。本发明进一步涉及产生ToTV抗性植物的方法，包括如下步骤：鉴别ToTV抗性供体植物，将所述ToTV抗性供体植物与受体植物杂交，从后代植物中选择抗性植物。

Description

命名为番茄Torrado病毒的植物病毒

发明领域

本发明属于植物疾病领域。更具体地，本发明涉及一种从番茄分离的新的植物病毒，涉及检测所述病毒的方法，涉及检测抗性植物的方法以及涉及产生抗性植物的方法。

发明背景

番茄(Solanum lycopersicum)(先前称为Lycopersicon esculentum)对大量病毒种类易感。一些最常见的番茄病毒包括番茄斑萎病毒(TSWV；病毒属：番茄斑萎病毒属(Tospovirus))；凤果花叶病毒(PepMV；病毒属：Potexvirus)，和番茄黄化曲叶病毒(TYLCV；病毒属：Begomovirus)。这些疾病所造成的对植物的损害包括从叶变色和坏死损害到严重的农作物减产和植物死亡。

提供抗性植物的能力对于商业育种者是最重要的，并且针对一些带来严重经济损害的病毒已经产生了抗性植物品种。但是，可对农作物造成显著损害的新的病毒随时会出现。

1996年，一种新的番茄病毒被报道，其自1993年起感染美国和意大利的番茄植物，并被命名为番茄传染性缺绿病毒(TICV；病毒属：长线状病毒属(Crinivirus)；Duffus et al.，1996)。在1998年报道了同一属的另一种新的番茄病毒。自1989年起，显示这一病毒感染美国的番茄植物，并将该病毒命名为番茄缺绿病毒(ToCV；Wisler et al.，1998)。这两个新病毒被证实通过粉虱传播，该昆虫是非常有效的疾病传播介体。

通常认为已知病毒的地理分布会增加并且新病毒会持续出现，部分是由于不同病毒重组形成新的毒株或新的病毒。抗性栽培品种的开发可以在成功控制这些疾病中起重要作用。

发明概述

最近，在来自西班牙的番茄植物上发现了一种新病毒，其导致的症状不能归因于任何已知病毒。植物在叶上显示坏死损害，在果实上有褐色环，并且显示生长降低。血清学测试(ELISA)显示凤果花叶病毒(PepMV)的存在。电子显微镜研究确实揭示了potexvirus常见的杆状颗粒。然而在感染的叶组织中还发现了球形病毒颗粒。发明人能够从与PepMV的复合物中分离该新病毒。该新病毒暂时被命名为番茄torrado病毒(ToTV)。

为了能够追踪其起源，监测其流行病学和防止该疾病的可能传播，非常重要的是能够在早期识别该疾病。只有那时才能采取有效措施隔离植物和启动控制植物病害的预防措施。目前尚未有可利用的诊断工具。结果，需要开发针对这一疾病的诊断工具。另外，目前不知道携带针对这一新病毒的特异性抗性的植物，因此需要开发这种抗性植物。

本发明第一方面提供了暂时被命名为番茄torrado病毒(ToTV)的植物病毒，其于2004年11月24日保藏在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)in Braunschweig，Germany，保藏者参考编号为ToTV-E01(DSM 16999)。

所述病毒在番茄植物和其它植物中导致疾病症状，并且可能由其自身导致症状，或者与其它病毒或疾病复合导致症状。

第一种系统性症状为在植物顶端从小叶的叶基开始产生坏死斑。坏死斑扩展并被浅绿色或黄色区域环绕(见图1)。不是所有系统性感染的叶均显示症状，但是例如通过电子显微镜术可以在这些叶中检测到病毒。由ToTV感染的果实显示坏死环。被感染的植物的生长与未感染的植物相比可以降低。

上述描述涉及被分离的病毒新感染的植物，并不一定反映田间遇到的实际症状。诸如植物物种或品种、发育阶段、另外的疾病压力和非生物因素(abiotic factors)(例如温度和相对湿度)等因素会最终决定症状的表现和特征。

病毒颗粒形状是球形的(二十面体)，直径约为28nm(见图2)。病毒颗粒由至少三种衣壳蛋白组成，所述蛋白分子量大约为23、26和35kDa(见图3)。纯化后，病毒在硫酸铯梯度中显示至少两条可见带。上方的可见带(病毒顶部级分)含有约5.5kb(更精确地为5.2kb)的RNA分子，下方的可见带(底部级分)含有约8kb(更精确地为7.7kb)的RNA分子(见图4)。两条带组合接种在烟草植物上产生感染。

ToTV可机械传播至几个烟草(Nicotiana)物种。标准的接种缓冲液(例如，0.03M磷酸盐缓冲液pH7.7)是合适的。为了ToTV的繁殖，优选的是心叶烟(N.glutinosa)，烟草(N.tabacum)和本塞姆氏烟草(N.benthamina)。香草花烟草(N.hesperis)‘67A’和西方烟‘P1’对于ToTV非常敏感并且在3-4天后显示系统性症状。这些烟草物种在短期内的坏死非常严重并因此比繁殖宿主更适于用作指示植物。心叶烟反应为缺绿病局部损害、系统性缺绿症和叶的轻微变形。本塞姆氏烟草(N.benthamiana)不显示局部症状，反应为系统性缺绿症和叶变形。

本发明进一步提供了一种病毒，其包含选自如下一组的至少一种核酸序列，所述的组由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2以及与其具有至少30％、优选地至少40％、优选地至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、更优选地至少80％、还更优选地至少90％、还更优选地至少95％、还更优选地至少98％、最优选地至少99％的核苷酸序列同源性的序列组成。这类病毒也包含在本文所用术语ToTV中。

在本发明的具有上述序列同源性的病毒的一个优选的实施方案中，所述病毒与已知名称为″Torrado″，″Marchitez″和/或″巧克力斑病″的番茄疾病相关，和/或基于基本上如表1定义的分类学描述符的数值分类学分析，与公共收集中心可获得的任何其它病毒分离株相比，所述病毒显示与权利要求1中定义的病毒更密切相关，所述病毒具有一重要特征，即其与导致番茄中的坏死损害的疾病相关。

在另一方面，本发明提供了分离的或重组的核酸，其包含选自如下一组的核酸序列，所述的组由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2以及与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少50％、优选地至少70％、更优选地至少80％、还更优选地至少90％、还更优选地至少95％、还更优选地至少98％、最优选地至少99％的核苷酸序列同源性的序列，以及它们的互补链及其ToTV特异性片段组成。这种核酸可以得自本发明的病毒。

在另一方面，本发明提供了能在严格条件下与上述本发明的分离的或重组的核酸杂交的多核苷酸。

在另一方面，本发明提供了可得自本发明的病毒的分离的或重组的多肽，或其ToTV特异性片段。在一个优选的实施方案中，所述多肽选自由ToTV的23、26和35kDa衣壳蛋白及其ToTV特异性片段组成的组。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的多肽或其ToTV特异性片段的抗原。

在另一方面，本发明提供了特异性抗本发明的抗原的抗体。

在另一方面，本发明提供了产生抗ToTV抗体的方法，包括如下步骤：a)提供ToTV病毒或其(重组)蛋白质或肽片段；b)用所述病毒、蛋白质或肽片段接种合适的脊椎动物宿主，和c)从所述脊椎动物宿主的血液(包括血清)或脾细胞中收集抗所述病毒、蛋白质或肽片段的抗体。在一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括步骤d)选择一种产生抗体的脾细胞，e)将所述脾细胞与固定化的杂交瘤细胞系融合，和f)使所述杂交瘤融合物产生单克隆抗体。

在另一方面，本发明提供了可通过本发明的产生抗ToTV抗体的方法获得的抗体。

在另一方面，本发明提供了将病毒分离株鉴别为ToTV病毒的方法，包括将所述病毒分离株或其成分与本发明的抗体反应。

在另一方面，本发明提供了将病毒分离株鉴别为ToTV病毒的方法，包括将所述病毒分离株或其成分与本发明的多核苷酸反应。

在另一方面，本发明提供了检测样品中ToTV的存在的方法，包括通过将所述样品与本发明的多核苷酸或抗体反应而确定所述样品中ToTV的存在。

在另一方面，本发明提供了鉴别ToTV抗性植物的方法，包括以下步骤：a)将植物或植物部分暴露于感染剂量的ToTV，和b)当在所述暴露后，i)所述植物或植物部分中的疾病症状保持不出现或被延迟表现或者相对于易感对照植物而言至少严重性降低，和/或ii)ToTV病毒或ToTV基因组序列不存在于所述植物或植物部分中或者相对于易感对照植物在所述植物中ToTV病毒的存在至少在数量上降低，则鉴别所述植物为ToTV抗性植物。步骤a)包括足够长的保温期，以使得在暴露于相当感染剂量的病毒后在易感对照植物中建立可检测的疾病症状。通过进行这一方法，可以在植物中鉴别所有形式的抗性，包括完全抗性、部分抗性、超敏性和耐受性。为了证实耐受性，必须证实病毒在植物(细胞)中的(系统性)存在。步骤b)可包括在本发明所述的植物或植物部分的样品中检测ToTV的存在的方法，其中在本领域技术人员熟知的用于核苷酸杂交测定或免疫测定的标准方法中使用本发明的抗体或多核苷酸。或者，步骤b)可包括将所述暴露的植物部分与易感指示植物接触。以这种方式，可以通过观察指示植物或甚至是与所述第一种接触的指示植物接触的另一种指示植物中疾病的出现而检测所述暴露的植物中的系统性或局部感染的存在。

在另一方面，本发明提供了产生ToTV抗性植物的方法，包括如下步骤：通过进行本发明的鉴别ToTV抗性植物的上述方法而鉴别ToTV抗性供体植物，将所述ToTV抗性供体植物与受体植物(所述受体植物可以是ToTV易感的或ToTV抗性的，但是在抗性表型由一种隐性基因所带来的情况下合适地是ToTV抗性植物)杂交，通过进行上述在植物中鉴别ToTV抗性的方法从后代植物(例如F1、F2和自交植物)选择抗性植物。当抗性性状是隐性性状时，在F1或F2或更进一步代次的自交的后代植物中可以发现抗性植物。在这一方面的优选的实施方案中，所述ToTV抗性供体植物和受体植物是茄科(Solanaceae)或葫芦科(Cucurbitaceae)的植物。在这一方面的其它优选的实施方案中，所述受体植物是番茄植物(tomato plant)、茄子植物(eggplant plant)、胡椒植物(pepper plant)、瓜类植物(melon plant)、西瓜植物(water melon plant)或黄瓜植物(cucumber plant)，更优选地是番茄(Solanum lycopersicum)的植物，最优选地是具有商业所需特征的番茄品系。

在另一方面，本发明提供了可通过本发明的产生ToTV抗性植物的方法获得的ToTV抗性植物，优选番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜类植物、西瓜植物或黄瓜植物，或其部分如种子。

在另一方面，本发明提供了用于检测样品中ToTV的存在或用于鉴别植物中ToTV抗性的诊断试剂盒，包括本发明的病毒、多核苷酸、多肽、抗原和/或抗体。

在另一方面，本发明提供了本发明的病毒、多核苷酸、多肽、抗原或抗体在生产诊断组合物中的应用。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的病毒、多核苷酸、多肽、抗原或抗体的诊断组合物。

在另一方面，本发明提供了ToTV或ToTV病毒基因组的部分作为表达载体的应用。

在另一方面，本发明提供了ToTV或ToTV病毒基因组的一部分用于在植物中产生病原体来源的抗性中的应用。

在另一方面，本发明涉及ToTV病毒的减毒形式或其基因组或其一部分在传染免疫植物中的应用。

发明的详细描述

定义

如本文所用，术语“植物部分”表示植物的一部分，包括单细胞和细胞组织，如植物中的完整植物细胞，细胞团块和从中可再生植物的组织培养物。植物部分的例子包括但不限于来自花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、苗(shoots)和种子的单细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、苗、幼芽(scions)、根茎(rootstocks)、种子、原生质体、愈伤组织等。

术语“样品”包括来自植物、来自植物部分或来自传播载体的样品，或土壤、水或空气样品。

本文所用术语“传播载体”是指疾病传播剂或物质。田间ToTV的传播载体可包括但不限于动物如节肢动物门(Arthropoda)(特别是昆虫纲和蛛形纲的动物)、线虫纲(Nematoda)(特别是有腺(Adenophorea)纲的那些动物)，但是也可以是较大动物如鸟、兔和小鼠、真菌(即真菌(Eumycota)门，特别是藻状菌(Phycomycota)纲的真菌)、(寄生)植物(包括菟丝子科(Cuscutaceae)科成员)、花粉、种子、水、土壤颗粒、甚至是人手、仪器和鞋。

术语“后代(offspring)”植物是指作为子代(progeny)从一或多个亲本植物的无性繁殖或有性繁殖产生的任何植物或其后代(descendants)。例如，后代植物可以通过一种亲本植物的克隆或自交获得，或者通过两个亲本植物的杂交而获得，并包括自交系(selfings)和F1或F2或更多代次。F1是从亲本产生的第一代后代，所述亲本的至少一个被首次用作一种性状的供体，而第二代(F2)或后续代次(F3、F4等)的后代是产生自F1、F2等的自交的样本。F1因此可以是(并且经常是)两个真育种亲本(真育种是对于一个性状是纯合的)之间杂交所产生的杂种，而F2可以是(并且经常是)所述F1杂种的自花授粉所产生的后代。

本文所用术语“抗性”是指当植物被病毒感染后能够抵抗所述病毒在其细胞中的增殖和/或抵抗病毒(系统性)移动到其它细胞和/或抵抗疾病症状的出现，其中所述病毒在所述植物的相应非抗性或易感品种中能够感染和增殖。该术语包括抗性的独立可鉴别形式，如“完全抗性”、“免疫性”、“部分抗性”、“超敏性”和“耐受性”。

“完全抗性”是指病毒在感染后完全不能发育，其可以是病毒不能进入细胞的结果(无最初感染)或者可以是病毒不能在细胞中增殖和感染后续细胞的结果(无潜在感染，无传播)。完全抗性的存在可以通过在将植物暴露于感染剂量的病毒后(即“感染”后)，确定在所述植物细胞中不存在病毒颗粒或病毒RNA以及在所述植物中不存在任何疾病症状而确定。在育种者中，这一表型通常被成为“免疫”。因此本文使用的术语“免疫性”是指一种特征在于甚至当病毒通过例如电穿孔被主动转移进细胞时也不存在病毒复制的抗性形式。

“感染剂量”被定义为病毒颗粒或病毒核酸的能感染植物的剂量，所述剂量可根据植物和所测试的ToTV分离株而变化。理论上，约1-10至约500-5000个所述病毒的病毒颗粒或其核酸的量是足够的。以此方式的感染可通过在植物上机械接种纯化的病毒颗粒或病毒核酸而实现。

“部分抗性”是指病毒在细胞中增殖降低、病毒的(系统性)移动降低和/或感染后症状发展降低。部分抗性的存在可以通过确定在植物中低效价病毒颗粒或病毒RNA的系统性存在以及在所述植物暴露于感染剂量的病毒后所述植物中疾病症状的存在减少或延迟而确定。病毒效价可以使用定量检测方法(例如ELISA方法或定量逆转录酶-聚合酶反应(RT-PCR))而确定。在育种者中，这一表型经常被称为“中间抗性(intermediate resistant)”。

术语“超敏性”是指一种抗性形式，其中感染保持在局部不系统性传播，这例如是由于被感染组织的局部坏死或不发生超出被接种组织的系统性移动所导致。超敏植物显示局部的但严重的疾病症状，并且在这种植物中可检测到病毒的局部存在。

“耐受性”是指一种植物表型，其中在所述植物暴露于感染剂量的病毒后不出现疾病症状，但是可以确定存在系统性或局部病毒感染、病毒增殖、至少是在所述植物细胞中存在病毒基因组序列和/或其基因组整合。耐受性植物因此对于症状表现是抗性的，是病毒的无症状携带者。有时候，病毒序列可以存在于植物中，甚至在植物中增殖，而不导致疾病症状。这一现象也已知为“潜伏感染”。一些DNA和RNA病毒在初次感染后会变得不能被检测到，仅在以后重新出现并产生急性疾病。在潜伏感染中，病毒可以以真正潜伏的无感染隐藏形式存在，可能作为整合的基因组或附加型因子(从而病毒颗粒不能在细胞质中被发现，而PCR方案会指示病毒核酸序列的存在)，或者作为感染性和持续复制的因子。重新活化的病毒可在易感接触中传播并起始流行病。“潜伏感染”的存在与植物中的“耐受”表型不能区分开。

本文所用术语“易感的(susceptible)”是指植物对病毒无抗性，导致病毒进入植物细胞并增殖和系统性传播，导致疾病症状。术语“易感的”因此等同于“非抗性的”。易感植物在被感染后在其细胞中显示正常病毒效价。易感性因此可以通过确定植物细胞中病毒颗粒或病毒RNA的正常(即相对于植物中的其它病毒感染而言)效价的存在以及在所述植物暴露于感染剂量的病毒后所述植物中正常疾病症状(即相对于本文所述最初由其分离ToTV的植物的疾病症状而言)的存在而确定。

术语“敏感的(sensitive)”反映了易感植物在病毒感染后的症状反应。根据植物的敏感性水平，反应或症状可以是或多或少严重的。如果植物被病毒损伤或甚至被杀死，则所述植物被认为是“敏感的”。

随后针对密切相关的毒性病毒对用减毒病毒株人工接种的植物进行保护。天然存在的温和毒株或减毒毒株(人工诱导的温和突变株)可以用作保护性病毒。优选地，为了获得抗ToTV的植物的传染免疫(premunition)，可以使用这样的ToTV减毒毒株，其在感染的植物中不引起症状或者相对于ToTV毒性毒株而言表现至少减少的症状表现。产生减毒病毒的方法可以例如包括ToTV基因组的随机诱变以及筛选具有症状减弱的毒株。产生减毒植物病毒的方法可参考如Takeshita et al，2001；Lu et al，2001；Hagiwara，et al，2002；和Hirata et al，2003的文章。

如本文所用，术语“番茄”是指番茄属(Lycopersicon)或茄属(Solanum)的任何植物、品系或群体，其包括但不限于在以下列表中列出的那些。最近，番茄属的命名已被改变。

番茄属的新命名在下列列表中提供(来自：Peralta，Knapp&Spooner，未出版的专论(参见：http://www.sgn.comell.edu″Guide torevised Solanum nomenclature″))。

Name in tomato monograph(Peralta et al.，in preparation for publication inSystematic Botany Monographs)	Lycopersicon equivalent
		Solanum juglandifolium Dunal	Lycopersicon juglandifolium(Dunal)J.M.H.Shaw
Solanum ochranthum Dunal	Lycopersicon ochranthum(Dunal)J.M.H.Shaw
		Solanum sitiens I.M.Johnst.	Lycopersicon sitiens(I.M.Johnst.)J.M.H.Shaw
Solanum lycopersicoides Dunal	Lycopersicon lycopersicoides(Dunal in DC.)A.Child ex J.M.H.Shaw
		Solanum pennellii Correll	Lycopersicon pennellii(Correll)D′Arcy
Solanum habrochaites S.Knapp & D.MSpooner	Lycopersicon hirsutum Dunal
		Solanum ′N peruvianum′to be described byPeralta(4geographic races：humifusum，lomas，Marathon，Chotano-Yamaluc)	Part of Lycopersicon peruvianum(L.)Miller(incl.var.humifusum and Marathon races)
Solanum′Callejon de Huaylas′to be describedby Peralta	Part of Lycopersicon peruvianum(L.)Miller(from Ancash，alogn Rio Santa)
		Solanum neorickii D.M.Spooner，G.J.Anderson & R.K.Jansen	Lycopersicon parviflorum C.M.Rick，Kesicki，Fobes & M.Holle
Solanum chmielewskii(C.M.Rick，Kesicki，Fobes & M.Holle)D.M.Spooner，G.J.Anderson& R.K.Jansen	Lycopersicon chmielewskii，C.M.Rick，Kesicki，Fobes & M.Holle
		Solanum corneliomuelleri J.F.Macbr.(1geographic race：Misti nr.Arequipa)	Part of Lycopersicon peruvianum(L.)Miller；also known as Lycopersiconglandulosum C.F.Mull.
Solanum peruvianum L.	Lycopersicon peruvianum(L.)Miller
		Solanum chilense(Dunal)Reiche	Lycopersicon chilense Dunal
Solanum cheesmaniae(L.Riley)Fosberg	Lycopersicon cheesmaniae L.Riley(published as cheesmanii)
		Solanum galapagense S.Darwin & Peralta	Part of Lycopersicon cheesmaniae L.Riley(previously known as forma or var.minor)
Solanum lycopersicum L.	Lycopersicon esculentum Miller
		Solanum pimpinellifolium L.	Lycopersicon pimpinellifolium(L.)Miller

“表达载体”定义为含有在宿主细胞中表达的基因(通常是异源基因)的核酸分子。通常，这一基因包含蛋白质编码序列。基因表达总是置于启动子的控制下，这样的基因被称为与启动子“可操作地连接”。术语“异源”是指不天然存在于给定宿主细胞中的DNA分子或DNA分子群

本文所用术语“多核苷酸”与“核酸”可互换，是指具有任何数目的核苷酸例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核苷酸多聚体或核苷酸的聚合形式，或合成产生的化合物(例如U.S.Pat.No.5,948,902及其引用的参考文献中所述的PNA)，其可以是双链的，也可以是单链的。多核苷酸可以以类似于两个天然存在的多核苷酸的序列特异性方式与天然存在的多核苷酸杂交，例如可以参与Watson-Crick碱基配对相互作用。该术语还包括修饰的、例如通过甲基化和/或通过加帽修饰的多核苷酸以及未修饰形式的多核苷酸。

本文所用术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸组成的聚合物。

本文所用术语“脱氧核酸”和“DNA”是指有脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。

术语“寡核苷酸”是指通过含磷键(例如磷酸二酯、烷基磷酸和芳基磷酸、硫代磷酸)或非含磷键(例如肽、氨基磺酸酯和其它键)连接的核苷酸单体的短序列(通常6-100个核苷酸)。寡核苷酸可含有修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸具有修饰的碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)和修饰的糖基团(例如2′-O-碱基核糖基，2′-O-甲氧乙基核糖基，2′-氟核糖基，2′-氨基核糖基等)。寡核苷酸可以是具有环状、分支或线性形状的、任选地包括能形成二级结构(例如茎-环、假结(pseudo knots)和kissing环结构)的结构域的天然存在的或合成的双链和单链DNA分子以及双链和单链RNA分子。

本文所用术语“核苷酸序列同源性”是指两个多核苷酸之间存在同源性。如果经最大相应性对比的两个序列中的核苷酸序列是相同的，则多核苷酸是“同源的”。两个或多个多核苷酸之间的序列比较通常是比较两个序列在比较窗的部分以鉴别和比较具有序列相似性的局部区域。比较窗通常为约20至200个连续核苷酸。对于多核苷酸的“序列同源性百分比”如50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同源性可以如下确定：在比较窗比较两个最佳排列序列，其中比较窗中的多核苷酸序列部分与用于两个序列的最佳排列的参考序列(其不包括添加或缺失)相比可以包括额外的添加或缺失(即缺口)。百分比如下计算：(a)确定两个序列中出现相同核酸碱基的位置数以获得匹配位置数；(b)将匹配位置数除以比较窗中的总位置数；和(c)将结果乘以100以获得序列同源性百分比。用于比较的序列的最佳排列可以用已知算法的计算机化执行或通过肉眼观察而进行。可以利用的序列比较和多序列排列算法分别是BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.，1990；Altschul etal.，1997)和ClustalW程序，均可在线获得。其它合适的程序包括但不限于GAP，BestFit，PlotSimilarity，和FASTA in the WisconsinGenetics Software Package(Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI，USA)(Devereux et al.，1984)。

本文所用术语“基本上互补的(substantially complementary)”是指两个核酸序列相互具有至少约65％、优选地约70％、更优选地约80％、更优选地90％、最优选地约98％的序列互补性。这意味着引物和探针必须分别与它们的模板和靶核酸有足够的互补性以便在严格条件下杂交。因此，引物和探针序列无需是模板上的结合区的精确互补序列，可以使用简并引物。例如，非互补的核苷酸片段可以附着于引物的5’末端，引物序列的其余部分与链互补。或者，非互补的碱基或更长的序列可以间插在引物中，条件是该引物与待扩增的一条链的序列有足够互补性以与其杂交，由此形成双链结构，该双链结构可以被聚合工具延伸。引物的非互补核苷酸序列可包括限制酶位点。将限制酶位点附着于靶序列的一或两个末端对于克隆靶序列特别有帮助。基本上互补的引物序列是与扩增模板有足够序列互补性以产生引物结合和第二链合成的序列。本领域技术人员熟悉对于具有与扩增模板足够的序列互补性的引物的要求。

术语“杂合子”当指核酸时是指由互补的核苷酸碱基之间的氢键形成的双链核酸分子或双链。术语“杂交”或“退火”是指单链核酸序列通过互补碱基之间的氢键形成双螺旋片段的过程。

术语“杂种”当用于植物育种时是指通过不同品系或品种或物种植物的杂交而产生的遗传学上与亲本不相似的后代。

术语“探针”是指单链寡核苷酸序列，其识别并与靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互补序列形成氢键双链。

本文所用术语“引物”是指寡核苷酸，其能与扩增靶退火以允许DNA聚合酶附着，由此当置于如下条件时作为DNA合成的起始点，所述条件为诱导引物延伸产物的合成，即在核苷酸和聚合剂如DNA聚合酶存在时以及在合适的温度和pH下。(扩增)引物优选地是单链的以便于扩增的最大效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在聚合剂存在下引发延伸产物合成。引物的精确长度取决于许多因素，包括温度和引物组成(A/T和GC含量)。一对双方向引物由一个正向和一个反向引物组成，常用于DNA扩增领域如在PCR扩增中。

应理解的是本文所用术语“引物”可以指多于一个的引物，特别是在关于待扩增的靶区域末端序列的信息有不清楚时。因此，“引物”包括引物寡核苷酸的集合，这些引物寡核苷酸含有代表序列中可能的变异的序列或包括允许典型碱基配对的核苷酸。

寡核苷酸引物可以通过任何合适方法制备。制备特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，包括例如克隆和限制消化合适的序列，以及直接化学合成。化学合成方法可包括例如磷酸二酯或三酯方法，二乙基磷酰胺化物方法和固相支持物方法，如U.S.Pat.No.4,458,066所述。如果需要，引物可以通过掺入可通过例如分光光度、荧光、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的工具而进行标记。

寡核苷酸引物的模板依赖性延伸由聚合剂在存在足够量的四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dATP，dGTP，dCTP和dTTP，即dNTPs)或类似物的条件下、在由合适的盐、金属阳离子、和pH缓冲系统组成的反应介质中催化。合适的聚合剂是已知催化引物和模板依赖性DNA合成的酶。已知的DNA聚合酶包括例如大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I或其Klenow片段、T4 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。用这些DNA聚合酶催化DNA合成的反应条件是本领域已知的。

合成的产物是双链分子，其由模板链和引物延伸链组成，其包括靶序列。这些产物随后作为模板进行另一轮复制。在第二轮复制中，第一轮的引物延伸链与其互补引物退火；合成产生“短”产物，其5’和3’末端由引物序列或其互补序列限定。重复循环的变性、引物退火和延伸导致由引物限定的靶区域的指数型积累。进行足够循环以获得希望量的含有核酸靶区域的多核苷酸。希望的量可以变化，由产物多核苷酸要实现的功能来决定。

PCR方法在各种手册中详细描述并是本领域技术人员已知的。

PCR扩增后，靶多核苷酸可以通过与探针多核苷酸杂交而检测，探针多核苷酸在严格至中等严格杂交和洗涤条件下与靶序列形成稳定杂合子。如果预期探针基本上完全(即约99％或更高)与靶序列互补，使用严格条件。如果预期有一些错配，例如预期为变体株，其结果是探针不完全互补，则杂交严格性可降低。但是，条件的选择是为了去除非特异性/偶然结合。影响杂交以及选择去除非特异性结合的条件是本领域已知的，并在例如Sambrook et al.，(2001)中描述。通常，低盐浓度和高温增加结合的严格性。例如，通常认为严格条件是在含有约0.1xSSC，0.1％SDS的溶液中保温，保温/洗涤温度约65℃，中等严格条件是在含有约1-2xSSC，0.1％SDS的溶液中保温和约50℃-65℃的保温/洗涤温度。低严格条件是2xSSC和约30℃-50℃。

术语“严格性”或“严格杂交条件”是指影响杂合子的稳定性的杂交条件，例如温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度等。这些条件凭经验优化至使特异性结合最大化和使引物或探针与其靶核酸序列的非特异性结合最小化。该术语包括这样的条件，其中探针或引物与其靶序列的杂交程度与其它序列相比检测性更高(例如至少超过背景2倍)。严格条件是序列依赖性的并在不同情况下不同。较长序列在较高温度特异性杂交。通常，严格条件的选择是比特异序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是(在限定的离子强度和pH下)至少50％的互补靶序列与完全匹配的探针或引物杂交的温度。通常，严格条件是盐浓度低于约1.0M Na⁺离子、通常约0.01-1.0MNa⁺离子浓度(或其它盐)，pH7.0-8.3，对于短探针或引物(例如10-50个核苷酸)温度是至少约30℃，对于长探针或引物(例如大于50个核苷酸)温度是至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺而实现。示例性的低严格条件或“降低的严格性的条件”包括用30％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS的缓冲溶液在37℃进行杂交以及在2xSSC中在40℃洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺，1MNaCl，1％SDS中在37℃杂交，在0.1xSSC中在60℃洗涤。杂交程序是本领域熟知的并由例如Ausubel et al.，1998和Sambrook et al，2001描述。

术语“抗原”是指能在脊椎动物中引起免疫应答的物质，导致产生抗体以作为抗所述物质的防御的一部分。抗原可以是在例如脊椎动物的血细胞、淋巴结细胞和脾中引起抗体生成的病毒蛋白质。

术语“抗体”包括抗原结合肽，指抗体、单克隆抗体，指完整的免疫球蛋白、或抗体或免疫球蛋白分子的任何功能片段。这种肽的例子包括完整抗体分子、抗体片段如Fab，F(ab′)2，互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)以及它们的任何组合或者抗体肽的任何其它功能部分。术语“抗体”指基本上由一或多种免疫球蛋白基因编码的多肽，或其特异性结合和识别分析物(抗原)的片段。尽管可以根据完整抗体的消化而定义各种抗体片段，但是本领域技术人员了解这类片段可以化学从头合成或者用重组DNA方法学从头合成。因此本文所用术语抗体还包括抗体片段如单链Fv、嵌合抗体(即包含来自不同物种的恒定区和可变区)、人源化抗体(即包含来自非人来源的互补决定区(CDR))和异源偶联抗体(例如双特异性抗体)。

术语“基本上纯的”和“分离的”可互换使用并描述一种蛋白质、肽或核酸基本上与其天然伴随的其它(亚)细胞成分分离。该术语涵盖已从其天然发生环境取出的核酸或蛋白质，并包括重组或克隆的DNA分离物以及化学合成的类似物或由异源系统生物学合成的类似物。通常，该术语是指纯度为至少约75％、例如85％、95％或98％(重量)的纯化的蛋白质和核酸。微小的(minor)变体或化学修饰通常具有相同的多肽或核苷酸序列。基本上纯的蛋白质或核酸通常包含大约85-100％(w/w)的蛋白质或核酸样品，更经常地纯度约95％、优选地将超过约99％。蛋白质或核酸纯度或均质性可以通过本领域熟知的多种手段指示，如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后观察染色后的聚丙烯酰胺凝胶上的单多肽条带，或者核酸样品的琼脂糖凝胶电泳，随后观察染色后的琼脂糖凝胶上的单多核苷酸条带。“染色”可以指使用非特异性(a-specific)肽或核酸染色剂，如银和考马斯染色剂，或溴化乙锭和SYBR_染色剂，或者可以指使用特异性肽或核酸染色剂，如在蛋白质或肽的情况下将肽与抗体接触并用标记的二级抗体(例如与碱性磷酸酶偶联的)显示该抗体，或者将核酸与标记的互补探针接触，以观察核酸和探针之间的杂交的存在。为了一些目的，可以用高效液相色谱(HPLC)或类似的纯化手段提供更高的分辨率。这些方法属于公知常识领域(参见例如Katz，et al，1998)。

鉴别和分类学

本发明提供了分离的病毒，其包含根据SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：2以及与其具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或优选地65％的核苷酸序列同源性的序列中的至少一种核酸序列。如上所述，如果经最大相应性排列的两个序列中的核苷酸序列相同时，多核苷酸具有“同源的”序列。使用得自ToTV病毒分离株的核苷酸序列进行的BLAST检索未发现与GenBank和EMBL数据库中的任何已知病毒或非病毒序列有显著同源性。目前发现的最高的同源性百分比是在相应于ToTV RNA1中SEQ ID NO：2的ORF1中的解旋酶基序与其它植物病毒的解旋酶基序之间的46.5％的同源性(见下述实施例)。

应理解的是当两个序列在一小的比较窗中比较时同源性可能很大，因为当两个长核苷酸序列被比较时经常可以发现局部区域序列相似性。但是，本领域技术人员能理解序列同源性需要确立序列之间的共同基序，其中序列相同性可能局部高达35-100％，但是在同一ORF的基因组序列的其它部分可能低至10-20％。因此，当本文称一个序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少50％的核苷酸序列同源性时，这可以指同源性最高的共同基序中的区域之间的序列同源性，但是也可以指两个同源蛋白质的编码序列之间的同源性。注意序列同源性可能在基因组的不同基因之间不同(见实施例)。

作为新鉴别的ToTV病毒分离株和其它病毒(包括待进行比较的病毒)之间相关性的指示，可基于病毒的基因组序列信息(的一部分)正常进行系统发生分析。

下述实施例中描述了几种这类分析。目前获得的信息表明ToTV显示出与来自Sequivirus和Waikavirus属(Sequiviridae)和Cheravirus和Sadwavirus属的病毒的最高水平同源性。来自这些属的病毒的区分可基于病毒RNA数量-Sequiviridae具有1个RNA而Cheravirus和Sadwavirus具有两个RNA-以及基于衣壳蛋白数量-Sadwavirus具有两个CP，Cheravirus具有三个CP。这些标准提示番茄torrado病毒最可能与Cheravirus属的病毒群相关。但是使用来自推定的RdRp和解旋酶蛋白质的几个不同基序进行的系统发生分析使得ToTV的定位明显不同于Cheravirus和Sadwavirus属，并事实上提示其与Sequiviridae更相关。不幸的是，仅有一个Cheravirus(CRLV)和两个Sadwaviruse(SDV和SMoV)的全序列是目前可获得的。载体传播的初步数据提示ToTV可能通过粉虱传播，而CRLV和Sadwavirus的天然载体是未知的。基于目前可获得的信息，包括序列信息和下表1所列的额外的分类学信息，所述新发现的病毒最可能是一个新的属。

表1：新发现的ToTV病毒的描述符(如手册″Matthew′s PlantVirology″(′Matthew′s Plant Virology″，第4版，Roger Hull(ed.)Academic Press，San Diego，p15，表2.1)的国际认可方法中所列出的)(下表1中采用Matthews′中的列表编号)

I病毒粒子性质
	A.病毒粒子的形态学性质
1.大小为28nm
	2.球形(二十面体)
3.无包膜
B.病毒粒子的物理性质
	(未研究)
	C.基因组性质
1.RNA型核酸
	2.单链RNA
3.线性RNA
	4.正有义链编码
5.至少2个节段(RNA 2：SEQ ID NO：1，RNA 1：SEQ ID NO：2)
	6.5.5kb(不包括聚(A)尾更精确为5.2kb或5389个核苷酸)和8kb(不包括聚(A)尾更精确为7.7kb或7793个核苷酸)
7.5’末端帽未知
	8.5’末端共价连接的多肽未知
9.在两个节段均有聚(A)序列
	10.核苷酸序列比较：
-RNA1含有ORF1，其具有解旋酶(Hel)、蛋白酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的典型基序。与其它病毒的解旋酶和RdRp基序的同源性水平在实施例中详细描述。
	-RNA2含有两个ORF，其中一个在N末端具有推定的移动蛋白(MP)的典型基序并且在C末端含有3个衣壳(外壳)蛋白(CP)的序列。与其它病毒的衣壳蛋白的同源性水平在实施例中详细描述。

D.蛋白质性质
				1.3xCP；Hel；RdRp；蛋白酶：推定的MP
2.CP：35、26和23kDa
				3.(对于功能活性，见上述和下述实施例)
4.(对于氨基酸序列比较，见下述实施例)
II.基因组结构和复制
				1.基因组结构见图7
6.细胞病理学：至少叶肉细胞的表皮或者韧皮部伴随细胞
III.抗原性质
				1.未知血清学关系
				IV.生物学性质
1a.天然宿主范围：番茄
				1b.实验宿主范围：
	所测试的ToTV的替代宿主植物	局部症状/系统性症状
				昆诺藜(Chenopodium quinoa)	-/-
	千日红(Gomphrena globosa)	-/-
				本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)	-/c
	克利夫兰烟(Nicotiana clevelandii)	-/c
				心叶烟(Nicotiana glutinosa)	-/c
	香草花烟草(Nicotiana hesperis)67A	nl/c，n，mf
				西方烟(Nicotiana occidentalis)P1	nl/c，n，mf
	罗斯奇卡烟草(Nicotiana rustica)	-/-(la)
				烟草(Nicotiana tabacum)‘白肋烟(WhiteBurley)’	-/-(la)
	洋酸浆(Physalis floridana)	nl/c，n，mf，do
				c＝缺绿；n＝坏死；l＝损害；mf＝变形；do＝死亡；la＝潜伏感染；-＝无症状
2.病原学
				在天然宿主植物上的症状：坏死损害最终为植物材料的烧焦状、完全坏死和植物死亡；在果实上的同心环状坏死斑。
与疾病的相关性：Torrado；还推测为巧克力斑；还推测为Marchitez
				3.组织向性：至少叶肉细胞的表皮或者韧皮部伴随细胞
4.在自然界的传播模式未知
				5.介体相关性：推测为粉虱
6.地理分布：地中海；美洲(中美洲、墨西哥和北美洲南部)

本发明人最近发现中美洲(例如墨西哥和危地马拉)称为“巧克力斑病”、“巧克力”或“Marchitez”的番茄疾病的相关病毒的基因组序列与本文描述的ToTV的基因组序列相同(见实施例2)。因此，与这一疾病相关的病因是本发明的一个方面。

随着有更多的来自可能与或可能不与其密切相关的非ToTV病毒或来自与ToTV病毒密切相关或者基本上类似于ToTV病毒的病毒的病毒序列可获得，系统发生分析将是一种有价值的方式来基于分离株之间的系统发生相关性确定ToTV的分类单位或进化枝。

系统发生相关性可以例如基于病毒基因组的RNA1和/或RNA2的任一或全部核苷酸序列或基于衣壳蛋白(基因)序列数据而确定。系统发生分析是本领域技术人员熟知的并且可例如包括通过基于距离的树-重构(distance-based tree-reconstruction)(例如相邻连接(neighborjoining))进行分析，使用如ClustalX(Thompson et al.，1997)，PAUP(Swofford，2000)或PHYLIP(Felsenstein，1989)程序的最大似然或简约性分析方法。

为了进行本文提供的ToTV序列的新分离株与来自例如GenBank，EMBL或DDBJ数据库的病毒株的参考序列之间的系统发生相关性分析，可直接从感染植物提取所述新分离株的基因组RNA，可以从其扩增基因组序列。逆转录PCR扩增方法(RT-PCR)可以例如用简并寡核苷酸引物进行，所述引物例如能作为扩增引物从不同的ToTV分离株的基因组扩增核酸序列以及从密切相关的病毒物种的基因组扩增核酸序列。优选地但不是必须地，由此可从参考毒株(例如不同的分离株)、测试毒株(ToTV疑似分离株)和密切相关物种获得全长基因组扩增产物。优选地，扩增感兴趣的特异性基因区域以进行比较。扩增产物(DNA)随后可通过例如直接双链核苷酸测序进行测序，测序使用荧光标记的双脱氧核苷酸终止子(Smith et al.，1986)和用于RT-PCR的简并寡核苷酸引物。核苷酸序列编辑、分析、氨基酸序列的任选预测以及对比可用已知软件包如LaserGene序列分析软件包版本5(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.)和IntelliGenetics Gene Works version2.5.1(IntelliGenetics，Mountain View，Calif.)软件进行。系统发生分析随后可用如下系统发生分析完成，所述系统发生分析使用例如采用neighbor-joining算法的简约性(PAUP)软件，在启发式搜索和1000bootstrap replicates后使用绝对距离，并且系统发生树可以用对比的连续核苷酸或氨基酸序列的简约分析而产生，其中在这种树中，数字通常代表bootstrap置信水平。在1,000次重复后，在系统发生树内的大于60％、优选地大于70％、更优选地大于80％、90％、95％或98％的置信水平被认为是足以证实正确的系统发生推论(将分离株置于某一进化枝)，条件是树有足够的分支，由此任选地分支可以通过生根至(rooting to)合适地群体外物种而改善。以此方式，可以确定哪些分离株是与本文提供的ToTV序列最密切相关的。相关性通常以序列相似性(本文称为序列同源性)百分比表示。

尽管系统发生分析提供了一种在与已知病毒有足够的核酸同源性的情况下鉴别病毒的方便方法，但是本发明还提供了几种其它的可能更直接的但稍微更粗略的鉴别所述病毒或来自所述病毒的病毒蛋白质或核酸的方法。根据经验法则，ToTV病毒可以通过待鉴别病毒蛋白质或核酸与本文经序列鉴别的病毒蛋白质或核酸相比而言的同源性百分比而鉴别。通常已知的是病毒物种、特别是RNA病毒物种经常构成准种(quasi species)，其中一群所述病毒在其成员间显示异质性。因此预期每个分离株可能与本文提供的分离株的序列的同源性百分比略微不同。因此，显示与ToTV足够的序列同源性(例如大于30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，或99％序列同源性)的其它病毒分离株被认为属于同一种病毒。本发明的ToTV病毒因此是与本文提供的蛋白质或核酸序列有至少50％或60％同源性、优选地至少70％、更优选地至少80％、还更优选地至少90％、还更优选地至少95％、还更优选地至少98％、最优选地至少99％同源性的病毒，并在茄科(Solanaceae)中、更具体地在茄属和烟草属(Nicotiana)中导致ToTV诱导的鉴别症状，所述疾病症状可能类似于或可能不类似于本文描述的那些。在葫芦科(Cucurbitaceae)中，病毒似乎不导致可见的症状，但病毒能在所述植物中繁殖。

当希望比较独立的病毒分离株与本文描述的蛋白质或核酸序列时，本发明提供了分离的病毒(ToTV)，通过确定所述独立的病毒分离株的蛋白质或核酸序列并确定所述蛋白质或核酸序列与本文列出的序列有至少60％、优选地至少70％，更优选地至少80％、还更优选地至少90％、还更优选地至少95％、还更优选地至少98％、最优选地至少99％序列同源性百分比，所述分离的病毒可被鉴别为系统发生地相应于ToTV。

具有比这些提到的最大值更高的同源性的各个蛋白质或核酸的病毒分离株被认为是系统发生相应的，并因此分类学上相应于ToTV病毒，通常蛋白质会由结构上相应于本文所列序列的核酸序列编码。本发明提供了系统发生上相应于本文列出序列的分离的病毒。

应注意的是，与其它病毒类似，在从不同来源分离的ToTV病毒之间可以预期发现一定程度的变异。

另外，本文提供的病毒的核苷酸或氨基酸序列或其片段例如显示与任何非ToTV病毒或最密切相关的各种核苷酸或氨基酸序列的核苷酸序列同源性小于95％、优选地小于90％、更优选小于80％、更优选小于70％、最优选地小于60％，或小于95％、优选地小于90％、更优选小于80％、更优选小于70％、最优选地小于60％。

世界范围内的ToTV毒株的序列差异可以略高，与其它植物病毒类似。

本发明提供了分离的病毒(ToTV)，可通过以下方法鉴定为与其系统发生上相应：确定病毒的合适片段的核酸序列，在系统发生分析中进行检测，其中最大似然树是如上述用例如1000个自展(bootstrap)产生的，发现与其同非ToTV参考毒株或最密切相关毒株的病毒分离株的相关性相比，其在系统发生上更密切相关于包含本文针对ToTV所列的序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的病毒分离株。

可用于这种系统发生分析的合适的核酸基因组片段是例如实施例所述的5.5kb或8kb RNA片段(本文分别称为RNA2和RNA1)的核酸序列的任何部分。

通过提供该ToTV病毒的序列信息，本发明提供了用于检测样品中ToTV病毒的诊断工具和方法。优选地，ToTV的检测是用最特异于ToTV病毒的试剂进行。然而这不意味着排除使用特异性较低但足以交叉反应的试剂的可能性，例如，因为它们更易于获得并且足以完成任务。

本发明例如提供了在植物中、优选地在番茄植物中、更优选地在S.lycopersicum植物中检测ToTV的存在的方法。所述方法可以例如包括通过将所述样品与本发明的ToTV特异性核酸或抗体反应而确定所述样品中ToTV病毒或其成分的存在。但指示(indicator)植物的接触感染也是一种检测测试植物中病毒存在的合适方法。

本发明提供了新分离的病毒(本文也称为ToTV病毒)的部分核苷酸序列及ToTV病毒特异性成分或其合成类似物。本文提供的序列以外的ToTV病毒的额外的基因组序列可以通过本领域技术人员已知的测序方法确定。鉴于本发明提供了ToTV病毒以及其部分基因组序列，基因组序列测定在本领域技术人员的技术范畴内。这些方法包括例如实施例所述的那些。通常，这类测序方法包括通过核酸分离程序分离病毒基因组核酸，以及例如通过双脱氧链终止法(Sanger et al.，1977)测定分离的核酸的核苷酸序列，任选地之前为将RNA逆转录为DNA。

本发明还提供了可得自本发明的病毒的分离的或重组的核酸或其病毒特异性功能片段。所述分离的或重组的核酸包括本文所列序列或能与其在严格条件下杂交的同系物序列。特别地，本发明提供了适于鉴别ToTV病毒核酸的引物和/或探针。能与ToTV病毒的核酸序列杂交的另外的探针和引物可通过本领域技术人员已知的方法开发。

表达载体及病毒编码基因的表达

另外，本发明涉及一种包含本发明的核酸的表达载体。因此表达载体如含有ToTV病毒基因组的双链序列(的部分)的质粒载体、含有ToTV基因组(的部分)病毒载体(例如但非限于痘苗病毒、逆转录病毒、杆状病毒)，或者含有其它病毒或其它病原体的基因组(的部分)的ToTV病毒是本发明的一部分。

所述表达载体可包含在调节元件如启动子控制下或与其可操作地连接的ToTV基因组序列。称作启动子的DNA节段可以调节DNA转录为mRNA。所述表达载体可包含适于基因、优选病毒蛋白质编码基因在植物细胞、真菌细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或其它真核细胞中表达的一或多个启动子。本发明的表达载体非常适于在基因表达系统中提供病毒抗原。

本发明还涉及包含本发明的核酸或表达载体的宿主细胞。含有ToTV病毒的蛋白质成分的编码核酸的质粒或病毒载体可以在原核细胞中产生，以在相关类型细胞(植物细胞、真菌细胞、细菌、昆虫细胞、植物细胞或其它真核细胞)中表达所述成分。含有ToTV病毒基因组的全长或部分拷贝的质粒或病毒载体可以在原核细胞中产生，以在体外或体内表达病毒核酸。

ToTV的分离和纯化方法

可以通过任何可利用的方法从感染的植物或其它来源中分离ToTV病毒。分离可包含从合适来源中纯化或部分纯化ToTV病毒颗粒。许多方法可用于进行病毒分离和纯化(例如见Dijkstra and De Jager，1998所述)。ToTV的纯化例如可通过使用针对例如nepoviruses或luteoviruses的标准方法(借助于有机溶剂)进行(见例如Walker，2004所述)。尽管这种方法可导致病毒感染性丧失，但这些方法仍可用于获得用于其它目的的病毒材料。

优选地，为了维持病毒的完整性，使用温和的纯化方法纯化ToTV。这种温和的纯化方法可例如包括将感染的植物材料(如叶)在均质缓冲液(包含例如0.1M TRIS-HCl缓冲液，pH大约为8，大约20mM的亚硫酸钠[Na₂SO₃]，大约10mM的二硫代氨基甲酸钠[Na-DIECA]及大约5mM乙二胺四乙酸钠(Na-EDTA))中匀浆，通过离心分离碎片(例如在49,000g离心30分钟)，将上清置于合适的蔗糖缓冲垫上(例如20％)并沉淀病毒颗粒(例如在70,000g离心1.5小时)。之后，将包含病毒颗粒的沉淀再悬浮于合适的缓冲液中(例如于TRIS-HCl，pH8中)，通过在蔗糖梯度中使用密度离心方法可以从悬浮液的剩余物中分离出含有病毒的级分(例如10-40％蔗糖于均质缓冲液中，在110,000g离心2小时)。使用感染实验对含有病毒的级分进行测定。进一步的纯化可在硫酸铯梯度中使用密度离心方法进行(例如10-40％硫酸铯梯度于TRIS-HCl，pH8中，在125,000g离心16小时)。然后从所述梯度中收集富集的病毒条带，通过离心或透析(例如用0.1M TRIS-HCl，pH8透析)进一步浓缩。

纯化后ToTV的感染性可以通过在敏感的植物(例如香草花烟草67A)上接种而检测。

ToTV相关蛋白的纯化及氨基酸测序方法

基于已经制备了纯化或部分纯化的ToTV，可以制备基本纯的病毒相关蛋白制品(例如病毒编码的蛋白质)。尽管本领域已知许多蛋白质纯化的方法和策略，但最常用的是通过使用例如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳或通过亲和性层析以纯化ToTV病毒蛋白质，如病毒外壳蛋白。这些方法在下文描述。

感兴趣的ToTV蛋白质可以通过电泳分离，使用例如Tricine-SDS-PAGE(Schagger and Von Jagow，1987)或者甘氨酸-SDS-PAGE(Laemmli，1970)进行。当然也可以使用能分解病毒分离株中包含的各种蛋白质或者从其基因组中转录及在合适表达系统表达的其它电泳系统，如非变性凝胶电泳。可以切离包含靶蛋白的PAGE凝胶区域，从中洗脱靶多肽，例如使用Elutrap_设备(Schleicher &Schuell，Dassel，Germany)进行。靶蛋白可以通过其在凝胶中相对于参考多肽的迁移性而加以鉴别。为了提高纯度，可以将洗脱的蛋白质在SDS-PAGE进行第二次电泳并进行第二次洗脱。然后可以将切离的凝胶片段中含有的蛋白质或肽载体洗脱，其适用于免疫接种或蛋白质测序中。

感兴趣的ToTV蛋白质也可以通过亲和性层析纯化，使用特异性结合ToTV蛋白的抗体(如单克隆抗体)进行。所述抗体可以通过使用双官能结合剂而与固体支持物如纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、交联的葡聚糖、珠状琼脂糖或者可控多孔玻璃共价结合，所述双官能结合剂与支持物上的官能团及与所述抗体分子上的官能团(即反应性氨基酸侧链)均反应。这种方法易于为技术人员所利用。将所得携带抗体的固相与纯化或部分纯化的病毒在还原条件下接触，利用的pH、离子浓度、温度和接触时间允许感兴趣的蛋白质与固定的抗体结合。通过使解离氢键的洗脱液流过床将所述病毒或蛋白质从柱中洗脱。通常使用的洗脱液是具有特定pH的缓冲液或者高于大约2M的NaCl溶液。

本领域熟知使用抗体进行亲和性层析的方法以及蛋白质(如病毒衣壳蛋白)的免疫亲和性纯化的其它方法(见例如，Harlow and Lane，1988)。

通过本文教导，技术人员能分离ToTV的病毒特异性蛋白质，确定例如所述蛋白质N-末端部分的氨基酸序列，设计一系列简并探针(针对遗传密码的简并性)以杂交编码所述蛋白质区域的DNA，在从所述病毒产生的基因组文库中的基因阵列上使用这些探针，获得阳性杂交及定位于相应的基因。然后，技术人员能鉴别所述基因的结构区及任选其上游和下游序列。之后，技术人员能确定形成所述蛋白质的正确氨基酸残基序列。

抗体产生

可以产生抗ToTV病毒的纯化或部分纯化的蛋白质或肽片段的单克隆或多克隆抗体，这通过暴露于技术人员已知的多种方法进行，包括将所述蛋白质作为抗原注射进动物中、通过杂交瘤融合及通过包含细菌和噬菌体系统的重组方法进行(参见Marks et al.，1992a；Marks etal.，1992b；Lowman et al.，1991；Lerner et al.，1992揭示的合适方法)。

对抗病毒颗粒、病毒的蛋白质或肽的抗体可以通过单独用所述颗粒、蛋白质或肽或与佐剂联合免疫合适的脊椎动物优选哺乳动物宿主而产生，所述宿主例如是兔、山羊、大鼠、鸡和小鼠。通常包括两或多次免疫，在最后的注射后几天收获血液或脾。对于多克隆抗血清，可以将免疫球蛋白沉淀、分离及(亲和性)纯化。对于单克隆抗体，将脾细胞与永生化淋巴细胞例如骨髓细胞系在杂交瘤选择性条件下融合。然后将杂交瘤在限制稀释条件下克隆，筛选其上清中具有希望特异性的抗体。产生(单克隆)抗体及其制备和使用方法可见于文献描述(见例如美国专利Nos.4,381,292、4,451,570和4,618,577；Harlow andLane，1988；Ausubel，et al，1998；Rose et al，1997；Coligan et al，1997)。通常，对抗病毒相关蛋白的抗体具有至少1×10⁵至1×10⁷/M的结合亲和性。

衍生自ToTV病毒的重组蛋白质，如可以通过在合适的表达系统中表达病毒的蛋白质编码基因组序列而获得的重组蛋白质，优选将其作为抗原。然而，也可以使用纯化的蛋白质。适于抗体检测的抗原包括与暴露于或用ToTV病毒感染的哺乳动物的任何ToTV特异性抗体组合的任何ToTV蛋白。本发明优选的抗原包括在暴露于ToTV的哺乳动物中引起免疫应答并因此通常最容易由哺乳动物的抗体识别的那些抗原。特别优选的抗原包括ToTV的衣壳蛋白。最优选的是来自纯化的病毒的结构蛋白。

本领域熟知克隆基因组序列、操纵表达载体的基因组序列、及在异源宿主中表达由所述基因组序列编码的蛋白质的技术，这些技术可用于提供表达载体、宿主细胞及编码抗原的克隆的基因组序列，将所述序列在宿主中表达以产生抗体，用于诊断分析中(见例如Sambrooket al.，2001 and Ausubel，et al，1998)。

可以使用多种表达系统以产生ToTV抗原。例如，本领域已经描述了适于在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞中产生蛋白质的许多表达载体，所述任何表达载体均可以用于制备适于产生抗ToTV抗体或其片段的ToTV抗原。当然，ToTV自身为此也可以用作表达载体。

本发明抗体的一个用途是筛选cDNA表达文库以鉴别含有这样的cDNA插入体的克隆，所述插入体编码感兴趣的蛋白质或者结构相关的免疫交叉反应性蛋白质。这种cDNA表达文库的筛选为本领域所熟知(见例如Young and Davis，1983及其中的参考文献，以及其它出版物所述)。这些抗体的另一用途是用于亲和层析中以纯化ToTV蛋白质。这些抗体也可用于分析ToTV感染。

本发明因此提供了在后文称作蛋白质样(proteinaceous)分子的ToTV-同源性病毒蛋白或其片段。可用的蛋白质样分子例如衍生自可衍生自本发明的病毒的任何基因组序列或其片段。如本发明所提供，这种蛋白质样分子或其抗原性片段例如可用于诊断方法或试剂盒及诊断组合物中。特别有用的是由下述重组核酸片段编码的那些蛋白质样分子，所述的重组核酸片段经鉴别在体内(例如提供诊断抗体)或在体外(例如通过噬菌体展示技术或用于产生合成的抗体或其一部分的另一种技术)诱导ToTV病毒同源性抗体产生。

本发明还提供了与包含本发明的蛋白质样分子或ToTV病毒特异性功能片段如衣壳蛋白的抗原特异性反应的抗体，所述抗体是天然多克隆或单克隆抗体，或者是合成的抗体(例如(噬菌体)文库衍生的结合分子)。

鉴别病毒分离株为ToTV病毒的方法

除了检测ToTV病毒(包括诊断方法)之外，本发明还涉及鉴别方法，即确认所述分离株是ToTV。这种方法可基于上述系统发生学推论，确定未鉴别的病毒分离株与证实为ToTV病毒及非ToTV病毒的一或多个参考毒株之间核苷酸或氨基酸序列同源性水平。这种方法可例如包括对病毒分离株的(部分)基因组或衣壳蛋白进行测序，比较所述序列与本发明提供的ToTV的序列的同源性水平。与本文提供的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列具有50％以上的序列同源性的分离株被认为是在分类学上相应于ToTV或者属于ToTV病毒类群。这种病毒是本发明的一部分。

为了鉴别一病毒为番茄torrado病毒(ToTV)，也可以使用如上表1所示的分类学描述符，通过对比发现该新分离株属于假定的新属，其中ToTV毒株通过SEQ ID NO：1和2所示核酸序列鉴别，所述病毒于2004年11月24日保藏在德国微生物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，保藏号为ToTV-E01(DSM 16999)。因此，并非必需进行序列对比以评定病毒是ToTV。鉴别病毒为番茄torrado病毒(ToTV)的方法还可包括评定选自下组的分类学描述符的组合的存在的步骤：

a)形态学描述符，如直径为大约28nm的球形、无包被的病毒颗粒；

b)基因组性质描述符，如基于两个RNA节段具有单链线性阳性有义RNA病毒性质，所述RNA节段包含聚A尾，编码分别为5.5和8kDa的多蛋白，并包含3个衣壳蛋白、解旋酶、蛋白酶、RdRP及推定的运动蛋白的编码区或基序，所述RNA节段和/或多蛋白和/或基序基于基本上如本文所述的序列对比具有同源性，

c)生物学性质描述符，如在番茄中产生坏死性损害和烧伤样症状，具有如本文所述的宿主范围、载体关系和/或地理学分布，与当地已知称作torrado、marchitez和/或巧克力色斑病的番茄植物疾病相关。

导致病毒分离株被阳性地鉴别为番茄torrado病毒(ToTV)的分类学描述符的组合是这样的组合，其可示出所述分离株与其它病毒相比与本文所述ToTV更密切相关(基于本领域技术人员熟知的数字分类学方法)并且其中所述分离株优选在番茄中产生本文所述的torrado典型疾病症状。

因此，认为这样的病毒是ToTV：基于基本如表1所示分类学描述符的数字分类分析，显示与在提请本申请书时已知的任何其它病毒相比与本申请权利要求1所述病毒更密切相关，并且与导致番茄坏死性损害的疾病相关，所述的病毒在本发明的范围内。

在这种方式中，本发明提供了一种病毒分离株，其通过本发明的方法鉴别这样的植物病毒，其在分类学上相应于属于ToTV病毒类别的病毒。基于系统发生学的关联性或者与其它病毒类别的不同，ToTV病毒类群可以是病毒分离株、种、属或者甚至病毒科。

或者，鉴别病毒分离株为ToTV病毒的方法可基于症候学，即通过其疾病症状而识别病毒。

然而，在一个优选的实施方案中，本发明的抗体用于鉴别病毒分离株为ToTV病毒的方法中，条件是这种抗体与相关的非ToTV毒株的交叉反应性被有效排除。这种方法包括将所述病毒分离株或其成分与本发明提供的抗体反应的步骤。反应在此是指使得抗体-抗原结合发生。这个目的可例如通过使用纯化的或非纯化的ToTV病毒或其一部分(蛋白质、肽)而实现。优选地，利用任何合适的免疫学方法，使用感染的细胞或细胞培养物鉴别病毒抗原。在这方面特别有用的是抗ToTV病毒衣壳蛋白产生的抗体。

鉴别病毒分离株为ToTV的其它优选方法包括将所述病毒分离株或其成分与本发明的病毒特异性多核苷酸反应，所述多核苷酸能在严格条件下与选自如下的核酸序列杂交：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少60％同源性的核苷酸序列的序列，及其互补链或ToTV特异性片段。这种杂交反应可以技术人员可利用的任何形式进行，通常包括组织印迹(printing)、斑点印迹法、Southern/Northern印迹或杂交、原位杂交、PCR、RT-PCR等。

免疫学检测方法

本发明的检测抗原的方法原则上可以通过使用任何免疫学方法进行，例如传统的免疫荧光方法(IF)、免疫组织化学技术或者可对比的抗原检测分析方法。优选的基于病毒外壳蛋白检测的ToTV检测方法可例如包括如沉淀和凝集试验、放射性免疫分析(RIA)、免疫胶体金标记、免疫吸附电镜(ISEM)，、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹和免疫印迹。可利用本发明抗体的免疫分析的类型例如是直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫分析。在液相或与固相载体结合的免疫分析中可利用抗体。另外，这些免疫分析中的抗体可以各种方式可检测地标记。本领域技术人员已知或者易于确定合适的免疫分析方法而不用进行不必要的实验。分析方法可以在文献中获知，例如Harlow and Lane(1988)所述。

可以使用多种免疫分析方法以选择与本发明特定多肽如ToTV病毒外壳蛋白特异性反应的抗体。例如，为此常规使用固相ELISA免疫分析。Harlow and Lane(1988)描述了可用于确定选择性结合的免疫分析方法和条件。

抗体可以与许多不同的载体结合并用于检测靶分子的存在。或者，抗原可以与不同的载体结合并用于检测抗体的存在。熟知的载体例如包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁。对于本发明，所述载体的性质可以是可溶的或不溶的。本领域技术人员已知结合抗体的其它合适的载体，或者可以使用常规实验而确定。

Westem印迹分析在Harlow and Lane(1988)中描述。根据这种方法，可以通过凝胶电泳分离病毒蛋白质(及病毒制品中的其它蛋白质)，并将其移至固相(即膜如硝基纤维素膜)。将固定的抗原随后与抗体和检测系统(例如碱性磷酸酶偶联的二级抗体)反应。如本领域技术人员所已知，在所述分析中包含合适的阴性和阳性对照物(如基本纯化的抗原或ToTV病毒)是有利的。

酶联免疫吸附测定(ELISA)在Harlow and Lane(1988)中描述。该测定包括病毒成分(例如衣壳蛋白)与抗体的反应。在一个实施方案中，所述样品可包含经研磨并与已经包被在固相如测试平板上的抗体反应的植物组织。如果所述病毒存在于样品中，则酶标记的特异性抗体将结合所述抗体-病毒复合体，这可通过产生生色反应的酶底物反应检测。优选的ELISA方法是直接双抗体夹心(DAS)ELISA(Clarkand Adams，1977)、DAS间接ELISA(Vela et al.1986)或者TAS-ELISA。本领域技术人员知道在ELISA或任何其它类型分析中，有时需要在一个反应中确定一种以上的病毒衣壳蛋白的存在，例如通过混合具有不同特异性的两或多种抗体，分析本发明保护性衣壳相关的蛋白的任一种或全部。

基于核酸的检测方法

ToTV由至少两个核糖核酸(RNA)组成。有明显的指征表明存在三种保护性衣壳蛋白。上述方法的焦点在于对病毒蛋白进行免疫学检测从而检测病毒。通过重组DNA技术可以产生与病毒RNA(或其互补体)或者通过逆转录从中产生的cDNA直接或间接杂交的探针，其可用于病毒的检测方法中。核酸扩增技术可以扩增极少量存在的病毒核酸的片段。

为了开发基于核酸的检测方法，必须确定病毒特异性序列，然后可以针对所述序列制备引物或探针。为了通过核酸扩增和/或探针杂交检测ToTV，可以对ToTV的衣壳蛋白进行测序，或者病毒基因组可以分离自纯化的病毒，逆转录为cDNA并直接克隆和/或测序。使用克隆的核酸作为杂交探针、使用衍生自所述克隆的序列信息、或者通过基于ToTV蛋白的氨基酸序列设计简并引物，则可以设计核酸杂交探针和/或核酸扩增引物，用于检测样品中病毒存在情况的检测分析中。

本发明的检测核酸的方法原则上可以使用任何核酸扩增方法，如聚合酶链反应(PCR；Mullis and Faloona，1987；美国专利No.4,683,195；4,683,202和4,800,159)，或者使用扩增反应如连接酶链反应(LCR；Barany，1991；EP 0320308)、自动维持序列扩增(3SR；Guatelliet al.，1990)、标准置换扩增(SDA；Walker et al.，1992；美国专利Nos.5,270,184和5,455,166)、转录扩增系统(TAS；Kwoh et al，1989)、Q-Beta复制酶(Lizardi et al.，1988)、滚环扩增(RCA；美国专利No.5,871,921)、基于核酸序列的扩增(NASBA；Compton，1991)、切割酶(Cleavase)片段长度多态性(美国专利No.5,719,028)、核酸的等温及嵌合引物起始的扩增(ICAN)、分支延伸扩增方法(RAM；美国专利Nos.5,719,028和5,942,391)或者其它合适的核酸扩增方法。

由于所述病毒是RNA病毒(即图5和6的序列是与病毒RNA基因组相同的DNA)，因此合适的检测方法可包括从样品例如感染的植物中分离病毒核酸，其可使用本领域技术人员已知的方法(例如Chomczynski and Sacchi，1987；Boom et al.，1990)或者商购的系统(例如德国QIAGEN GmbH，Hilden公司的RNeasy总RNA分离试剂盒或者RNeasy植物RNA分离试剂盒，或者High-Pure-RNA-Isolation-Kit_(Roche Diagnostics，a division of F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel，Switzerland)进行。

总RNA可例如从叶材料或植物细胞的原生质体中提取，然后可以通过使用例如鸟原粒细胞增多症病毒(AMV)逆转录酶或者莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(M-MuLV)逆转录酶，将所述总RNA或者特别是病毒基因组RNA或其一部分逆转录为cDNA。合适的方法可例如包括将适量的总RNA(例如1-5μg)、适量(例如10pmol)的逆转录引物、适量的dNTP及逆转录酶在合适的液相缓冲系统(例如商购的RT缓冲液)中混合，通过沸腾1分钟使所述核酸变性，将其在冰上冷却，随后根据所用的特异性逆转录酶如推荐的那样在例如45℃进行逆转录1小时，获得病毒序列的cDNA拷贝。

作为逆转录引物，可以使用本发明的多核苷酸，例如包含与ToTV基因组序列互补的核苷酸序列的18-25-mer的寡核苷酸，或者优选至少能在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示核酸序列或其ToTV特异性片段杂交的序列。或者，可以使用特异性聚T引物(寡dT引物)，以起始从聚A RNA基序的逆转录。

在RT-步骤之后，对获得的cDNA可以通过使用例如Pfu和TaqDNA聚合酶及特异于病毒基因组cDNA序列的引物进行PCR扩增。完全商购的系统也可以用于RT-PCR(例如the Access andAccessQuick^TM RT-PCR Systems of Promega[Madison WI，USA]，或者Roche Diagnostics[a division of F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel，Switzerland]提供的Titan^TM One Tube RT-PCR系统或者two-stepRT-PCR系统)。

为了扩增与一或多种扩增引物具有少量错配的核酸，可以在降低的严格性条件(例如PCR扩增，其使用退火温度为38℃，或者存在3.5mM MgCl₂)下进行扩增反应。本领域技术人员可以选择合适严格性的条件。

本发明选择的引物与存在于被扩增的每种特异性序列不同链上的其靶区域“基本上”互补(即至少65％、更优选至少80％及完全互补)。可以使用含有例如肌醇残基或二价碱基的引物序列或者甚至与靶序列相比含有一或多个错配的引物。通常认为与靶DNA或RNA寡核苷酸序列至少65％、更优选至少80％同源的序列适合用于本发明的方法中。当使用低严格杂交条件时，序列错配也不是关键的。

扩增产物的检测原则上可以通过本领域已知的任何合适方法实现。扩增的片段可以直接染色或用放射性标记、抗体、发光染料、荧光染料或酶试剂进行标记。直接DNA染色包括例如添入染料如吖啶橙、溴化乙锭、溴乙非啶单叠氮化物(ethidium monoazide)或Hoechst染料。

或者，所述DNA或RNA片段可以通过将标记的dNTP碱基掺入合成的片段中而进行检测。可以与核苷酸碱基结合的检测标记包括例如荧光素、花青染料、毛地黄毒苷(DIG)或溴脱氧尿苷(BrdUrd)。

当使用基于探针的检测系统时，本发明中使用的合适检测方法可例如包括酶联免疫测定(EIA)方式(Jacobs et al，1997)。为了利用EIA方法进行检测，扩增反应中使用的正向或反向引物可包含捕获基团，如生物素基团，以将靶DNAPCR扩增子固定在例如链亲和素包被的微滴定平板孔上或者链亲和素包被的Dynabeads_(Dynal Biotech，Oslo，Norway)上，随后对靶DNA-扩增子进行EIA检测。技术人员理解可以应用其它基团以在EIA方式中固定靶DNAPCR扩增子。

如本文所揭示用于检测靶核酸序列的探针优选仅结合通过核酸扩增方法扩增的至少一部分核酸序列区。本领域技术人员可以基于靶核酸的核苷酸序列而不用进行不必要的实验而制备合适的探针进行检测。靶核酸的互补核苷酸序列、无论是DNA或RNA或化学合成的相似物，均可适用作为本发明方法中的类型特异性检测探针，条件是将这个互补链在所用的扩增反应中扩增。

本发明使用的合适的检测方法可例如包括固定扩增子及通过例如Northern和Southern印迹探查核酸序列。其它形式的检测方法可包括如上述EIA形式。为了便于检测结合情况，所述特异性扩增子检测探针可包含标记组分如荧光团、生色团、酶或放射性标记，以便于监测探针与扩增反应产物的结合。这种标记为本领域技术人员所熟知，包括例如异硫氰酸荧光素(FITC)、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、链亲和素、生物素、毛地黄毒苷、³⁵S、¹⁴C、³²P、或¹²⁵I。其它实例为本领域技术人员所显而易见。

检测也可以通过所谓的reverse line blot(RLB)分析进行，例如Vanden Brule et al.(2002)所述。为此，RLB探针优选使用随后固定在例如羧基包被的尼龙膜上的5’氨基基团合成。RLB的优势是系统的简便性及其速度，因此可以进行高产量样品处理。

本领域熟知检测RNA或DNA片段的核酸探针的应用。这些方法主要包括将靶核酸与所述探针杂交，随后进行杂交后洗涤。特异性通常是杂交后洗涤的函数(function)，关键因素是离子浓度和最终洗涤溶液的温度。对于核酸杂交体而言，Tm可以近似地通过Meinkoth andWahl(1984)等式计算：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是核酸中鸟苷与胞嘧啶的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是碱基对中杂交体的长度。Tm是在此温度下50％互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在指定离子浓度和pH条件下)。对于每1％的错配，Tm降低大约1℃；对杂交和/或洗涤条件可以进行调节以便与具有希望的相同性的序列杂交。例如，如果序列相同性＞90％，则Tm可以降低10℃。通常地，选择这样的严格杂交条件，其比特异性序列及其互补序列在指定的离子浓度和pH下的热解链温度低大约5℃。然而，极其严格的条件可以利用在低于热解链点(Tm)1、2、3或4℃的温度进行的杂交和/或洗涤；中等严格条件可利用在低于热解链点(Tm)6、7、8、9或10℃的温度进行的杂交和/或洗涤；低严格条件可利用在低于热解链点(Tm)11、12、13、14、15或20℃的温度进行的杂交和/或洗涤。使用这个等式、杂交和洗涤成分及希望的Tm，技术人员可理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果希望的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或者32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以便可以使用较高的温度。关于核酸杂交的详细指导见Tijssen，1993；Ausubel et al.，1998所述。

另一方面，本发明提供了检测ToTV RNA或cDNA的寡核苷酸探针。在此选择的检测探针与通过本发明的扩增反应产生的单链RNA分子或者双链核酸的一条链“基本上”互补。优选所述探针与从靶RNA或DNA中所产生扩增子的任选固定的(例如生物素标记的)反义链基本上互补。

本发明的检测探针含有与其靶序列的一或多个错配。通常认为与靶寡核苷酸序列呈现至少65％、优选至少80％同源性的序列适合用于本发明的方法中。

ToTV抗性植物

本发明进一步涉及一种鉴别ToTV-抗性植物或其一部分的方法。鉴别ToTV-抗性植物有许多可能性。在这种方法的第一组实施方案中，可以使用活性/感染性病毒或全长感染性克隆，而在另一个实施方案中仅使用病毒检测工具。

使用活性/感染性病毒鉴别ToTV抗性植物的方法的第一个步骤包括将植物或植物部分如叶或茎节暴露于感染剂量的ToTV，目的是实现感染。所述暴露在许多情况中可包括进行物理接触。感染剂量在植物和测试的ToTV分离株之间而有所不同。理论上，大约1-10至大约500-5000个所述病毒的病毒颗粒或其核酸的量是足够的。这种方式的感染可通过将纯化的病毒颗粒或病毒核酸机械接种于健康植物上而实现。或者，感染可通过例如如下方式而实现：

-将健康幼芽在ToTV-感染的根茎上生长，反之亦然；

-将健康植物暴露于含有所述病毒的传播载体(包括感染的植物，例如寄生植物如Cuscuta spp.)；

-向健康植物中导入具有ToTV病毒基因组的编码区的表达载体；

-使用农业感染性克隆，如含有具有ToTV病毒基因组的编码区的表达载体的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株。

在本发明中，将植物或植物部分暴露于感染剂量的ToTV的方法不限于任何特定方法。

正如所阐述的，感染可包含在健康植物上机械接种病毒。例如，可以将患病叶的一部分直接涂擦在待感染的植物叶上。在另一种方法中，接种物可例如通过用研钵和研杵或者任何其它合适的匀浆器在例如适于接种的缓冲液(例如0.03M磷酸盐缓冲液，pH7.7)中研磨含有病毒的植物组织、优选出现症状的幼叶而制备。在研磨之后，优选将获得的匀浆(汁液)例如通过粗滤布过滤。然后例如通过将叶与一定量的所述汁液接触而接种汁液。所述叶优选进行预处理，以破坏下面的表皮及增强病毒的进入。这个目的例如可通过将所述叶用金刚砂粉末进行预涂擦而实。优选避免过度的创伤。优选使用碳化硅的细的有角颗粒(400-500目)。金刚砂粉末也可以直接加入汁液中，在这种情况中省略预处理步骤。所述汁液可例如通过食指、浸透汁液的泡沫或布，或者甚至用研杵、玻璃刀、硬刷子或者喷枪来施用。在接种后，优选立即用水洗涤叶片。

鉴别ToTV抗性植物的方法的第二个步骤包括在所述暴露之后，当出现如下情况时鉴别所述植物为ToTV抗性植物：i)相对于易感和/或敏感对照植物，所述植物或植物部分中疾病症状保持不出现或者延迟出现或者严重程度降低或者在局部出现，和/或ii)ToTV病毒或ToTV基因组序列在所述植物或植物部分中不存在，或者所述植物中ToTV的存在相对于易感对照植物而言至少在数量上降低。如本文所用，术语局部意味着限于接种的叶。

确定感染的植物中ToTV诱导的疾病症状的出现可通过定量方法进行，例如其中记录产生可辨别的(例如明显的)疾病症状需要的时间，或者通过定性方法进行，其中在经过一段时间之后，检验植物症状的出现或示出症状的严重性。

除了根据被检测的ToTV抗性的类型确定ToTV诱导的疾病症状的出现之外，在所述植物或植物部分中检测所述病毒的存在。为了检出测试样品中不存在病毒，原则上可以使用任何方法。例如，可以应用其中使用本发明的ToTV特异性抗体、引物系列或者探针的方法。或者，可以将测试植物部分与易感指示植物(例如香草花烟草(N.hesperis)67A)接触，以确定测试植物中病毒的存在与否。技术人员知道对于这种方法重要的是去除测试植物表面的杂质，以辨别传播载体、耐受测试植物及抗性测试植物，因为仅需要确定植物细胞中病毒的存在。

在进行鉴别ToTV抗性植物的方法的第二个步骤中，可以获得如下结果。如果在成功接种之后(例如在导致易感和敏感对照植物感染的条件下进行植物-病毒接触之后)，

i)疾病症状保持不出现；或者病毒颗粒或病毒RNA不能检测到，则所述植物是抗性的；

ii)疾病症状被延缓或严重性降低；或者可以检测到系统性低效价的病毒颗粒或病毒，则所述植物是部分抗性的；

iii)疾病症状严重，但保持在局部，限于接种的叶并且不超过接种组织而全身性传播；或者仅在局部可以检测到病毒颗粒或病毒RNA，则所述植物是高度敏感的；

iv)如果疾病症状保持不出现，但可以检测到病毒颗粒或病毒RNA，则所述植物耐受所述病毒；

v)如果植物出现疾病症状并且具有高度系统性病毒效价，则所述植物是易感及敏感的。这种植物例如是从中分离本发明的病毒的植物。这些植物在本发明的方法中可作为合适的对照植物。

为了产生抗性植物及从植物卫生(phytosanitation)的观点出发，只有结果i)、ii)和iii)可认为是感兴趣的。为了获得适于生产无症状的农作物和产品的植物，结果iv)也可以是在商业上特别感兴趣的。

在鉴别ToTV抗性植物的方法的另一个实施方案中，仅使用病毒检测方式。例如，可以通过从有症状植物中观测或检出无症状植物，并通过本发明的任何病毒检测方法确定所述植物中不存在病毒而在田间鉴别ToTV抗性植物。事实上，这相当于鉴别ToTV抗性植物的方法，其中被动地(例如自然地)进行将植物或植物部分暴露于感染剂量的ToTV的步骤a)。当进行这种方法时，优选使用本发明所述检测样品中ToTV存在的方法，其中通过将所述样品与本发明的多核苷酸或抗体反应而鉴别ToTV病毒或其成分的存在与否。优选地，鉴别ToTV抗性植物的方法需要使用本发明的病毒或者本发明的多核苷酸或抗体。

本发明进一步涉及一种产生ToTV抗性植物或其部分的方法。一旦鉴别出ToTV-抗性植物，则该植物可作为遗传物质的供体植物，将所述遗传物质从所述供体植物转移至受体植物以提供具有所述遗传物质的受体植物。遗传物质从供体植物向受体植物的转移可以通过本领域已知的任何合适的方法进行。所述遗传物质在大多数情况中是基因组物质。然而，重要的是供体基因组的至少赋予抗性的部分被转移。在缺乏确定供体植物基因组的哪部分赋予ToTV抗性的方法的情况中，所述转移可通过转移全部的染色体而进行。优选地，ToTV-抗性植物在杂交中作为雄性或雌性亲代植物以产生抗性后代植物，所述后代植物从而接受了来自抗性供体的基因组物质并且作为受体植物。尽管在杂交中易感的亲代不必需是受体植物，但是受体植物如易感亲代也包括在术语受体植物中。

在生产ToTV抗性植物的方法中，可以使用原生质体融合体将赋予抗性的基因组物质从供体植物转移至受体植物，即作为使所述植物杂交的方式。原生质体融合体是诱导的或自发的连接体，如两或多个原生质体(其细胞壁通过酶学处理除去的细胞)之间的体细胞杂交产生双核或多核的单个细胞。甚至可以用自然不能杂交的植物物种获得的融合细胞进行组织培养，产生呈现希望的性状组合的杂交植物。更特别地，第一个原生质体可得自番茄植物或者呈现对ToTV感染的抗性的其它植物系。例如，可以使用来自ToTV抗性品系(番茄、茄子、胡椒、瓜类、西瓜或黄瓜)的原生质体。第二个原生质体可得自易感的第二种植物品系，任选得自另一种植物物种或品种，优选得自具有商业上希望特性的相同植物物种或品种，所述特性例如但非限于疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特性等。然后将所述原生质体使用本领域已知的进行杂交的传统的原生质体融合程序进行融合。

或者，在将赋予抗性的基因组物质从供体植物转移至受体植物中(即作为使所述植物杂交的方式)，可以应用胚拯救(embryo rescue)。胚拯救可用作从杂种中分离胚的方法，其中植物不能产生可存活的种子。在这种方法中，植物的授粉子房或不成熟的种子是进行培养以产生新植物的组织(这种方法在Pierik，1999中详细描述)。

生产ToTV抗性植物的方法因此在一个实施方案中包括：如上述鉴别ToTV抗性供体植物及将所述ToTV抗性供体植物与受体植物杂交，从而产生抗性后代植物。

生产ToTV抗性植物的方法进一步包括从后代植物中选择抗性植物的方法，其通过进行如前所述鉴别ToTV抗性植物的方法进行。

优选地，所述ToTV抗性供体植物是茄科或葫芦科植物，更优选番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜类植物、西瓜植物或黄瓜植物。

优选地，所述受体植物是茄科或葫芦科植物，更优选是番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜类植物、西瓜植物或者黄瓜植物。更优选地，所述受体植物是Solanum lycopersicum物种的番茄植物，更优选的是具有商业希望特性的S.lycopersicum植物。所述受体植物可以是ToTV-易感植物、ToTV敏感植物或者ToTV抗性受体植物。如上所述，所述植物的选择主要通过所述抗性性状是否是显性还是阴性的而确定。技术人员知道可以利用许多方法解决这个问题。

本发明的另一方面是通过本发明方法可获得的ToTV抗性植物或其一部分。

正如所阐述的，产生ToTV抗性植物的方法的一个优选实施方案包括通过将所述植物进行杂交而将所述赋予抗性的核酸序列通过基因渗入(introgression)方法从ToTV抗性供体植物中转移至受体植物中。根据这个优选的实施方案产生的抗性植物可有利地从受体植物中衍生出其大多数性状，及从所述供体植物中产生ToTV抗性。

在称作谱系选择的一种方法中，将呈现ToTV抗性的供体植物与优选呈现商业上希望的特性的受体植物杂交，所述特性例如但非限于疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特性等。然后将所得植物群体(代表F1杂种)自身授粉并使其产生种子(F2种子)。然后筛选从F2种子中生长的F2植物的ToTV抗性。所述种群可以多种不同方式筛选，优选通过本发明的目测方法筛选。

由于ToTV抗性植物的鉴别是由本发明首先践行的，因此产生抗性植物的方法是本发明的一个方面。通过本发明的方法可获得的ToTV抗性植物或其一部分也是本发明的一方面。

本发明提供了防止ToTV感染在番茄植物中传播的方法，通过提供抗性番茄植物以及通过消除携带ToTV病毒的植物而进行。这些措施可组成一般策略的一部分，以改良ToTV病毒相关的植物卫生状况(phytosanitation)。因此可鉴别及消除耐受植物，以消除ToTV病毒的这种来源。

在产生ToTV抗性植物或植物部分的方法的一个实施方案中，本发明提供了一种产生ToTV耐受植物的方法。耐受植物可提供有价值的农作物、果实和种子，因为尽管所述植物也许携带所述病毒，但其不出现疾病症状。这种方法包括鉴别耐受植物，及使用这种耐受植物作为希望的遗传物质的来源或供体。本发明的目的不是提供能抵抗所述病毒进入其细胞或在其细胞中增殖的植物，而是提供不出现症状的植物。

因此，本发明涉及一种鉴别ToTV耐受植物的方法，包括如下步骤：a)将植物或植物部分暴露于感染剂量的ToTV，b)在所述暴露后，当所述植物或植物部分中疾病症状保持不存在且ToTV存在于所述植物或植物部分中时，则将所述植物鉴别作ToTV耐受植物。

确定感染的植物中ToTV诱导的疾病症状的产生可通过定量方法进行(例如可记录产生可辨别的(例如明显的)疾病症状需要的时间)，或者通过定性方法进行(其中在经过一段时间之后，检验到植物症状不出现或症状的严重性降低)。

在一个优选的实施方案中，所述植物或植物部分中ToTV的存在通过以下方法在步骤b)中确定：通过将所述植物或植物部分与本发明的多核苷酸或本发明的抗体反应，以确定所述植物或植物部分中ToTV病毒或其成分的存在。

诊断试剂盒

本发明提供的方法和方式特别可用于诊断试剂盒中，以通过病毒学诊断方法诊断ToTV病毒感染情况。这种试剂盒或分析可例如包含病毒、核酸、蛋白质样分子或其片段，和/或本发明的抗体。

本发明还提供了诊断试剂盒以诊断ToTV感染情况，所述试剂盒包含ToTV病毒、ToTV病毒特异性核酸、蛋白质样分子或其片段和/或本发明的抗体，及优选包含检测ToTV病毒、ToTV病毒特异性核酸、蛋白质样分子或其片段和/或抗体的工具，所述工具例如包含一个可激发基团如本领域使用的荧光团或酶学检测系统(例如合适的诊断试剂盒形式包含IF、ELISA、中和分析、RT-PCR分析、杂交分析)。合适的检测分析包括直接和间接分析、夹心分析，固相分析如使用平板或珠，及液相分析。合适的分析方法包括使用初级和二级抗体的那些方法，及使用抗体结合试剂如蛋白质A的那些方法。另外，本发明可以使用多种检测方法，包括比色、荧光、磷光、化学发光、发光和放射活性方法。

为了确定仍未鉴别的病毒成分或其合成相似物如核酸、蛋白质样分子或其片段是否可以被鉴别为是ToTV病毒特异性的，可分析所述成分的核酸或氨基酸序列，例如通过序列同源性对比将所述核酸或氨基酸的一段序列，优选至少10个、更优选至少25个、更优选至少40个核苷酸或氨基酸(分别)与提供的ToTV病毒序列及已知的非ToTV病毒序列(优选使用在系统发生学上与ToTV最接近的病毒序列)进行对比，使用例如本文提供的系统发生分析方法进行。根据所述ToTV或非ToTV病毒序列的关系程度，可以鉴别所述成分或合成的相似物。

根据分析形式的不同，检测ToTV病毒的试剂盒包括一或多种特异于蛋白质优选特异于ToTV的至少一种衣壳蛋白质的抗体，优选还包括基本纯化的蛋白或抗独特型抗体以用作阳性对照。

抗病毒剂

本发明还提供了获得可用于治疗植物中ToTV感染的抗病毒剂的方法，所述方法包括建立包含本发明病毒的细胞培养物或实验植物，用候选抗病毒剂处理所述培养物或植物，确定所述制剂对所述病毒或该病毒对所述培养物或植物的感染的作用。这种抗病毒剂例如包含ToTV-中和抗体，或如本文提供的其功能成分，但是也可以获得其它种类的抗病毒剂。

有不同的抗病毒剂用于植物中，如化学产物、细菌、真菌、昆虫和病毒。其中大多数与系统性获得性抗性相关(SAR)。本发明涵盖了ToTV基因组或其一部分作为植物中系统性获得性抗性诱导物的应用。所述系统性获得性抗性可涉及ToTV或其它疾病。在这方面，ToTV、其基因组或其抗性赋予部分可用作抗病毒剂。

本发明还提供了本发明的抗病毒剂在制备治疗组合物、特别是治疗植物中ToTV感染的治疗组合物中的应用，本发明提供了一种包含本发明的抗病毒剂的药物组合物，其可用于治疗或预防ToTV病毒感染的方法中，所述方法包括为各个植物提供这种治疗组合物。

本发明还涉及可用于检测治疗方法和/或组合物的植物模型。看起来一些Nicotiana物种可以用ToTV病毒感染，从而示出与在ToTV病毒感染的马铃薯中发现的不同的疾病症状。在用病毒感染之前或期间对Nicotiana植物进行抗病毒处理对于这种抗病毒剂在番茄植物中的应用具有预测价值。

本发明还涉及ToTV或者ToTV的病毒基因组的一部分作为表达载体的应用，例如用于病毒诱导的基因沉默(VIGS)中。VIGS是利用植物中RNA介导的抗病毒防御机制的技术。在用未修饰的病毒感染的植物中，所述机制特异性靶向病毒基因组。通过使用携带衍生自宿主基因的插入体的病毒表达载体，所述机制也可用于靶向相应的植物RNA。VIGS已经广泛用于植物中以分析基因功能并适合用于高产量功能性基因组。迄今为止，VIGS主要用于塞姆氏烟草中，然而，本发明涵盖了ToTV作为新的表达载体系统在其它植物中分析基因功能的应用，如在番茄或茄科科其它物种如胡椒和马铃薯及在葫芦科的种中的应用。

本发明在如下非限制性实施例中进一步解释。

实施例

实施例1：从番茄植物中分离和鉴定ToTV

方法

导论

来自西班牙的番茄植物样品用作诊断研究。番茄植物的症状包括叶上坏死斑和缺绿症及果实上褐色环。血清学测试(ELISA)指出Pepino花叶病毒(PepMV)的存在，但是考虑到所述症状，很可能存在另一种未确定的因素。

在对感染的叶组织进行的电子显微镜研究中发现球形病毒颗粒。

随后进行感染测试，发现对番茄经多次接触对ToTV易感，其中一些与明确的症状相关(叶的坏死，在各个小叶的基底处开始，见图1)。

病毒传播和增殖

如下所述从得自西班牙的患病植物中分离ToTV。可将ToTV机械性感染一些烟草种植物。标准的接种缓冲液(例如0.03M磷酸盐缓冲液，pH7.7)经证实是合适的。在这个实施例中，将ToTV机械接种于心叶烟或本塞姆氏烟草中并增殖。在接种后大约14天进行病毒纯化。

病毒纯化

根据针对例如多面体病毒(nepoviruses)或黄化病毒(luteoviruses)的标准方案进行一些尝试，以纯化ToTV(借助于有机溶剂)。这些方案总是导致病毒感染性丧失。另外，当在离心步骤中使用较低温度(低于5℃)时，ToTV趋于聚集。

最后，通过非常温和的纯化方法产生具有合理清洁度的病毒制品，对其可以进行进一步实验。

使用如下程序纯化ToTV(所有离心步骤均在6℃进行)。将感染的心叶烟或本塞姆氏烟草叶在5份0.1M TRIS-HCl(pH8)+20mMNa₂SO₃、10mM Na-DIECA于5mM Na-EDTA(均质缓冲液)中均质化，将所述匀浆物在49,000×g离心30分钟。将上清置于20％蔗糖缓冲垫中，在70,000×g离心1.5小时。将沉淀再悬浮于2mlTRIS-HCl、pH8中，将此悬浮液置于蔗糖梯度(于均质缓冲液中10-40％蔗糖)并在110,000×g离心2小时。由于未观测到病毒条带，因此将该梯度等分成分离的级分，每个级分中病毒的存在通过将所述级分的一部分接种于香草花烟草67A叶上并观测感染的发生而确定。将含有病毒的级分置于10-40％硫酸铯梯度(TRIS-HCl，pH8)及在125,000×g离心16小时。收集病毒条带，通过离心或用0.1MTRIS-HCl、pH8透析而浓缩。

每个纯化步骤后ToTV的感染性通过将其接种于香草花烟草67A上而检测(在接种之前将硫酸色梯度用TRIS-HCl、pH8透析)。

电子显微镜检法

将病毒悬浮液“嵌于”用Formvar^_(也称作聚乙烯醇缩甲醛)包被的载网上，用2％乙酸铀酰染色，在Philips CM12电子显微镜中检测。

PAGE分析

将病毒蛋白质通过12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，Laemmli，1970)分离并进行银染色。

核酸分离及评估

将纯化的病毒通过离心(在115,000×g离心2小时)浓缩。根据Qiagen RNeasy MinElute Cleanup程序(Qiagen，Hilden，Germany)所述，对沉淀进行RNA提取。RNA浓度在UV-分光光度计(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，USA)中确定。

RNA完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测。在60V电泳2小时后，将RNA用正甲苯胺蓝染色。

cDNA合成及克隆

使用用于cDNA合成的Invitrogen Superscript选择系统(Invitrogen，Breda，The Netherlands)根据厂商指导合成cDNA。cDNA第一链使用Oligo-d(T)或随机六聚体引物引发。在第二链合成后，连接EcoRI衔接物以便于克隆。在EcoRI-衔接的cDNA的磷酸化之后，未连接的接头通过柱层析法除去。将所得cDNA在pBluescript IIEcoRI预消化的表达载体(Stratagene，La Jolla，USA)中连接，并用连接混合物转化Top 10感受态细胞(Invitrogen)。

ToTV序列的5’末端利用5′RACE System for Rapid Amplificationof cDNA Ends(LifeTechnologies)，使用dCTP根据厂商指导确定。

cDNA的分析

在转化后，使用T3和T7特异性引物通过PCR分析重组克隆中插入体的存在。在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物的大小。含有大约1500个核苷酸的插入体的克隆用于进一步序列分析。所得序列数据使用DNASTAR程序包分析。

ToTV的三种衣壳蛋白的氨基酸序列的确定

将纯化的ToTV颗粒加样于变性PAGE凝胶上，分离衣壳蛋白。将分离的衣壳蛋白条带从凝胶中分离，用胰蛋白酶处理，消化物用基本如Kinter & Sherman，2000所述方法使用串联质谱仪(MSMS)分析。由此产生小肽的氨基酸(AA)序列，每个序列均显示与从ToTV的RNA2核苷酸序列预测的氨基酸序列同源。使用PHYLIP程序包的程序与其它病毒序列对比。

结果

病毒传播和增殖

对于ToTV增殖，可以使用心叶烟和N.benthamina。香草花烟草67A和西方烟P1对ToTV非常易感，并且在3-4天后出现症状。这些烟草物种在短时间内变得极度坏死并因此认为是比增殖宿主更合适的指示植物。心叶烟和本塞姆氏烟草表现为缺绿症局部损害及系统缺绿症及叶轻度变形。

病毒纯化

从感染的叶组织中纯化病毒粒更困难。ToTV不能抵抗有机溶剂，当在较低温度离心时趋于聚集。使用的纯化方案(见1.2.)在硫酸铯梯度产生两个可观测到的含有病毒的条带。所述条带在所述梯度底部出现，指示等于或高于1.4g/cm²的、在CS₂SO₄中的高浮力密度。ToTV的感染性受到硫酸铯的影响，但是当起始物中病毒浓度较高时不完全丧失。含有所述两个病毒条带的硫酸铯梯度级分是感染性的。各个条带的感染性未确定。

电子显微镜检法

通过电子显微镜检测所述两个条带，这两个条带均含有直径为大约28nm的病毒颗粒(图2)。

PAGE分析

对纯化的病毒级分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及随后的银染色，显示大约23、26和35kDa的三个衣壳蛋白(CP)(见图3，表示纯化的病毒上部(TAgV-T)和底部(TAgV-B)级分)。

cDNA的核酸分离和分析

对所述两个病毒条带进行RNA分离共同揭示了两个RNA：大约5.5kb和8kb(见图4)。上部的条带的RNA分离仅产生5.5kb RNA片段。

将得自上部条带的5.5kb RNA用作cDNA合成及克隆的模板。使用正向和反向序列引物(T3/T7或M13F/M13R)对不同的克隆进行测序反应。进行cDNA末端的5′快速扩增(RACE)以确定所述RNA的精确5’末端。使用Lasergene_软件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI，USA)分析所得序列数据，产生所述病毒RNA2的完整序列(SEQ IDNO：1；见图5)。所述RNA的大小是5389个核苷酸，不包括聚A尾。在所述RNA上发现两个开放读框(ORF)。ORF1位于第182-742位核苷酸，长度为561个核苷酸，编码由187个氨基酸组成的蛋白质。发现这个序列在蛋白质和核苷酸水平与NCBI数据库中的序列无同源性。

ORF2是第702-4298位核苷酸的一段序列，长度为3597个核苷酸，编码由1199个氨基酸组成的蛋白质。在NCBI数据库中进行BLAST搜索之后，发现其与一些病毒多蛋白低度同源。为了发现同源性，提供NCBI数据库登记号及病毒名称和蛋白质类型。将这两个核酸序列及在所有三个读框中衍生的氨基酸序列均用于BLAST分析。使用Lasergene_软件包的MAPDRAW鉴别ORF。

所述两个RNA的ORF图

RNA1

RNA1含有一个ORF(ORF1)及典型的解旋酶基序，RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。另外，在氨基酸序列第106-338位观测到与Patchouli mild花叶病毒(PatMMV)(NP647592.1)的蛋白酶辅因子(Pro-Co)具有低水平的氨基酸(aa)序列同源性，相同性为22％。

在推定的多肽的氨基酸序列第398-400、444和495位鉴别了典型的解旋酶基序A(GKS)、B(D)、C(N)。

对于解旋酶区域，发现与如下病毒最接近的相同性：水稻tungro球形病毒(RTSV；在140个氨基酸重叠中42％相同)，玉米缺绿矮小病毒(MCDV；在137个氨基酸重叠中43％相同)，草莓斑驳病毒(SMoV；在135个氨基酸重叠中42％相同)及欧防风(欧洲萝卜)黄色斑点病毒(PYFV；在138个氨基酸重叠中42％相同)。在推定的VpG区域中，发现与其它病毒无序列相似性。

蛋白酶中最高相似性在第1000-1100位氨基酸发现，与马铃薯病毒V(PW；NIa蛋白酶，86个aa重叠中)具有25％相同性。

发现基序I(KDE)至VII(FLSR)之间的RdRp区域在第1303-1554位氨基酸之间(Koonin 1991)。

发现与如下病毒具有最接近的多蛋白序列相同性：水稻tungro球形病毒(RTSV)在751个氨基酸重叠中具有29％相同性，玉米缺绿矮小病毒(MCDV)在742个氨基酸重叠中具有28％相同性，欧防风(欧洲萝卜)黄色斑点病毒(PYFV)在501个氨基酸中具有33％相同性，苹果潜伏的球形病毒(ALSV)在472个氨基酸中具有32％相同性，草莓斑点病毒(SMoV)在680个氨基酸中具有30％相同性，樱桃锉叶病毒(CRLV)在465个氨基酸中具有33％相同性，如表2所示。

表2：ToTV RNA1上ORF1中RdRp基序与其它植物病毒的RdRp基序之间的整体同源性水平

NIMV

PYFV

RTSV

SDV

SMoV

ToTV

ALSV

CRLV

MCDV

NIMV	100	32.7	33.9	88.6	49.4	33.1	39.6	39.6	35.1
										PYFV		100	43.7	33.2	32.0	35.2	36.4	36.0	42.9
RTSV			100	34.3	32.7	35.1	37.5	35.1	69.4
										SDV				100	50.2	33.1	38.4	38.4	36.7
SMoV					100	35.7	40.6	38.5	38.5
										ToTV						100	38.1	38.1	33.7
ALSV							100	79.5	35.5
										CRLV								100	35.1
MCDV									100

NIMV＝脐橙传染性斑点病毒(Sadwa)；PYFV＝欧防风(欧洲萝卜)黄色斑点病毒(Sequivirus)；RTSV＝水稻tungro球形病毒(Waikavirus)；SDV＝无核小蜜橘矮小病毒(Sadwavirus)；SMoV＝草莓斑点病毒(Sadwavirus)；ToTV-番茄torrado病毒(提议的属)；ALSV＝苹果潜伏的球形病毒(Cheravirus)；CRLV＝樱桃锉叶病毒(Cheravirus)；MCDV＝玉米缺绿矮小病毒(Waikavirus)。

表3：ToTV RNA1上ORF1中解旋酶基序与其它植物病毒的解旋酶基序之间的整体同源性水平(％)

	SDV	SMoV	ToTV	ALSV	CRLV	MCDV	PYFV	RTSV
									SDV	100	42.5	37.2	31.9	33.6	39.8	39.8	38.1
SMoV		100	42.5	31.0	31.9	32.7	33.6	32.7
									ToTV			100	36.0	34.2	46.5	40.4	44.7
ALSV				100	86.7	34.5	31.0	30.1
									CRLV					100	34.5	30.1	31.0
MCDV						100	39.8	69.0
									PYFV							100	42.5
RTSV								100

PYFV＝欧防风(欧洲萝卜)黄色斑点病毒(Sequivirus)；RTSV＝水稻tunggro球形病毒(Waikavirus)；SDV＝无核小蜜橘矮小病毒(Sadwavirus)；SMoV＝草莓斑点病毒(Sadwavirus)；ToTV-番茄torrado病毒(提议的属)；ALSV＝苹果潜伏的球形病毒(Cheravirus)；CRLV＝樱桃锉叶病毒(Cheravirus)；MCDV＝玉米缺绿矮小病毒(Waikavirus)。

RNA2

RNA2含有两个潜在的ORF(图7)。ORF1编码分子量为20kDa的由187个氨基酸组成的推定的蛋白质。序列分析表明其与EMBL数据库中任何蛋白质均无同源性。还未知这个ORF是否编码实际的蛋白质。

与ORF1部分重叠的第二个ORF在框内从三个ATG起始密码子开始。其编码推定分子量为134kDa的由1198个氨基酸组成的推定的蛋白质。通过对分离的外壳蛋白质进行质谱分析进行蛋白质鉴别对在RNA2-ORF2C末端的三个外壳蛋白质顺反子明确作图。

RNA2-ORF2多蛋白的N末端区域很可能编码推定的运动蛋白(MP)，因为与提议的运动蛋白共有序列LxxPxL(Mushegian，1994)非常相似的基序LRVPML在氨基酸序列第262-267位发现。没有在RNA2 ORF2的N末端发现其它序列同源性。

推测ORF2编码必须通过蛋白酶解而从多蛋白前体中切除的四种蛋白质。然而，可以鉴别其与已知的多蛋白切割位点无明显的同源性。这些切割位点的确切位置有待确定。

对于CP1多蛋白，我们仅发现与人parechovirus(HPeV)的同源性，在103个氨基酸中具有21％相同性。

发现CP2多蛋白序列与如下病毒具有最接近的相同性：Rhopalosiphum padi病毒(RhPV)，在168个氨基酸中具有25％相同性；Avian encephalomyeliltis病毒(AEV)，在74个氨基酸中具有33％相同性；Black queen cell病毒(BQCV)，在37个氨基酸中具有43％相同性；Solenopsis invicta病毒(SINV-I)，在51个氨基酸中具有30％相同性。发现与CP3多蛋白序列没有同源性。

未翻译区域(UTR)

RNA1和RNA2的3′UTR分别为1210个核苷酸及1092个核苷酸。

这两个RNA的最后988个核苷酸中具有98％的相同性。为了证实这两个RNA的UTR的3’区域是相同的，使用衍生自相同3′-UTR区域的一个反向引物及两个RNA特异性正向引物对总病毒RNA进行RT-PCR。对所得PCR产物进行测序。

从这些结果推断：分离自番茄植物并暂时称作番茄torrado病毒(ToTV)的病毒为直径大约为28nm的球形颗粒(二十面体)。在纯化后，所述病毒在硫酸铯梯度中显示至少两个条带。当组合这两个条带接种于烟草植物中时具有感染性。病毒颗粒看起来由大约23、26和35kDa的至少三个衣壳蛋白组成。

所述病毒的硫酸铯梯度上部级分含有大约5.5kb的RNA分子(RNA 2；SEQ ID NO：1)，底部级分含有大约8kb的RNA分子(RNA 1；SEQ ID NO：2)。

使用得自病毒上部级分的5.5kb RNA进行cDNA合成和克隆及随后对序列信息进行分析，将一些重叠群汇总进SEQ ID NO：1中。两个重叠群明确含有聚A尾部，提示所述病毒RNA具有聚A尾。对核苷酸和衍生的氨基酸序列进行BLAST分析未表明与EMBL数据库中的任何已知病毒的任何明显同源性。

上述信息表明ToTV是一种新的及迄今为止还未描述过的病毒。迄今为止获得的信息还未能将所述病毒归属于为特定的病毒科或病毒属。

为了进行病毒检测和鉴别，基于SEQ ID NO：1的序列设计两个RT-PCR引物系列(表4)。

表4：检测ToTV的RT-PCR引物

引物系列A：	长度/温度	序列	SEQ ID No.
				正向引物	17聚体	5’-GAGAGCCGGCATTCACA-3’	SEQ ID NO：3
反向引物	17聚体	5’-GCACAGCTTGGCGACAC-3’	SEQ ID NO：4
				产物长度	493bp
最佳退火温度	54.8℃

引物系列B：
				正向引物	24聚体	5’-CCCATCATCACCCTCCTCTTCGTA-3’	SEQ ID NO：5
反向引物	22聚体	5’-TTCCAGTAATGATCCAACCAAT-3’	SEQ ID NO：6
				产物长度	585bp
最佳退火温度	54.9℃

合适的RT-PCR方案包含如下内容：使用RNA纯化试剂盒例如Qiagen RNA-Easy从大约100μg感染的叶材料中分离和纯化总RNA。将所述总RNA中的大约1μg用于Superscript One-Step RT-PCR反应(Invitrogen)的50μl反应混合物中，所述反应混合物还包含25μl的2×反应混合物，1μl(100ng)上引物和下引物，1μl的RT/Taq混合物及22μl的MilliQ水。为了将所述RNA逆转录为cDNA并扩增该cDNA，可以使用如下RT-PCR程序：步骤1：30分钟@50℃(逆转录反应)；步骤2：3分钟@94℃(Taq聚合酶的活化)；步骤3：30秒@94℃；步骤4：30秒@55℃；步骤5：1分钟@72℃；步骤6：重复步骤(3-5)40次；步骤7：10分钟@72℃；步骤8：10℃直至达到需要的时间。PCR产物可以在1％琼脂糖凝胶上在TAE或TBE缓冲液中分析。

2.6.ToTV的三个衣壳蛋白的氨基酸序列的确定

可以将最大的外壳蛋白的片段(CP1，大约35kDa)与RNA2的ORF2中的一个区域(第487-729位氨基酸)进行排列对比。可以将中等的外壳蛋白条带的片段(CP2，大约26kDa)与RNA2的ORF2的第730-983位氨基酸进行排列对比。

可以将最小的外壳蛋白的片段(CP3，大约23kDa)与RNA2的ORF2的C末端(第984-1195位氨基酸)进行排列对比。从这些结果中可以推断所述三个衣壳蛋白的编码序列位于ToTV的RNA2的ORF2上(5.5kb)，因此所述分离的病毒RNA分子是病毒颗粒的一部分。

实施例2：Marchitez的致病因素的分离和鉴定

在2003年，在中美洲(墨西哥和危地马拉)发现了具有与ToTV症状相似症状的番茄植物。怀疑其致病因素是病毒。该疾病在当地称作“Chocolate”、“Marchitez(virus)”或者“巧克力色斑病”。从2003年以来在田地中生长的易感植物变得严重感染。

本项研究的目的是将导致“巧克力色斑病”的迄今为止未知的病毒的序列与实施例1中分离的ToTV序列进行对比。

方法

使用总RNA分离系统(Promega SV 96)从大约100μg“巧克力色斑病”感染的叶材料中分离RNA。将2μl的总RNA用于50μlSuperscript One-Step RT-PCR reaction(Invitrogen)反应混合物中，所述反应混合物还包含25μl的2×反应混合物，1μl(100ng)正向引物和反向引物，1μl的RT/Taq混合物和22μl的MilliQ水。为了将所述RNA逆转录为cDNA并扩增这个cDNA，使用如下RT-PCR程序：步骤1：30分钟@50℃(逆转录反应)；步骤2：3分钟@94℃(Taq聚合酶的活化)；步骤3：30秒@94℃；步骤4：30秒@55℃；步骤5：1分钟@72℃；步骤6：重复步骤(3-5)40次；步骤7：10分钟@72℃；步骤8：10℃直至需要的时间。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上TAE或TBE缓冲液中分析。

在RT-PCR中使用不同的引物，已知其与ToTV基因组的RNA1或RNA2在不同位置退火。

表5：基于ToTV的RNA-2序列的RT-PCR引物，其如实施例2中使用的及如图7所示的用于鉴定巧克力色斑病的致病病毒

引物系列P1048/1049：	序列	SEQ ID No.
			正向引物	5’-CAAGCCATCACGGAACCTAC-3’	SEQ ID NO：7

反向引物	5’-AGCATCTTCTTCCTCCGCT-3’	SEQ ID NO：8
			产物长度	从碱基36-544＝508碱基
引物系列P1056/1057：
			正向引物	5’-TGCTGAGGTGCTATCACTGG-3’	SEQ ID NO：9
反向引物	5’-CACACTTTCCACGATTTCCA-3’	SEQ ID NO：10
			产物长度	从碱基2422-2955＝523碱基
引物系列P1060/1061：
			正向引物	5’-AAAGGAAAGAAGCAGCCACA-3’	SEQ ID NO：11
反向引物	5’-GGAAATCTTGGTCAAGCCAG-3’	SEQ ID NO：12
			产物长度	从碱基3599-4170＝571碱基
引物系列P1064/1065：
			正向引物	5’-GCAATGCCAGTGGTTCAGAG-3’	SEQ ID NO：13
反向引物	5’-GGTCAAATGGATACTCGGGA-3’	SEQ ID NO：14
			产物长度	从碱基4820-5327＝507碱基

结果

正如所预期的，所用引物组促进部分ToTV序列的扩增，但是在RT-PCR中使用基于RNA-2序列的四种不同引物(P1048/1049、P1056/1057、P1060/1061和P1064/1065)也可以扩增部分“巧克力色斑病”病毒基因组。这些引物组的退火位置在图1中例示。对所述四种引物组的RT-PCR产物即“巧克力色斑病”的扩增的片段进行测序，示出与实施例1中描述的病毒基因组的序列的相应部分具有100％相同性。

附图说明

图1示出番茄植物叶上ToTV病的症状照片。

图2示出纯化的ToTV颗粒的电子显微照片。颗粒直径为大约28nm。

图3示出纯化的ToTV病毒上部(TAgV-T)和底部(TAgV-B)级分的银染PAGE凝胶的结果，显示大约23、26和35kDa的三种衣壳蛋白。

图4示出变性琼脂糖凝胶电泳的结果。节段的大小以千碱基(kb)表示。所述凝胶用正甲苯胺蓝染色。M：分子大小标准。TagV：1μg的分离的ToTV RNA.。

图5示出ToTV RNA2分子的完整序列(SEQ ID NO：1)。

图6示出ToTV RNA 1分子的完整序列(SEQ ID NO：2)。

图7示出ToTV病毒的一般结构，表明实施例2中所用针对RNA2的各种引物组的退火位点。

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Claims (31)

1.一种称作番茄torrado病毒(ToTV)的植物病毒，于2004年11月24日保藏在德国微生物保藏中心，保藏号为ToTV-E01(DSM16999)。

2.一种病毒，其包含选自以下序列组成的组的至少一种核酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，及与其具有至少50％核苷酸序列同源性的序列。

3.权利要求2的病毒，其中所述病毒与已知称作“Torrado”、“Marchitez”和/或“巧克力斑病”的番茄疾病相关，和/或其中基于基本如表1所述的分类学描述符的数字分类分析，所述病毒显示出与其同任何其它病毒的相关性相比，其与权利要求1所述病毒更加密切相关，并且其中所述病毒与导致番茄坏死损害的疾病相关。

4.一种分离的或重组的核酸或其ToTV-特异性片段，包含选自以下序列组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2具有至少50％核苷酸序列同源性的序列、其互补链和ToTV特异性片段。

5.一种表达载体，其包含权利要求4的核酸。

6.一种多核苷酸，其能在严格条件下与权利要求4的核酸杂交。

7.一种可得自权利要求1-3任一项的病毒的分离的或重组的多肽，或其ToTV-特异性片段。

8.权利要求7的多肽，其中所述多肽选自ToTV的23、26和35kDa的衣壳蛋白、解旋酶、RNA依赖性RNA聚合酶及推定的运动蛋白(MP)及其ToTV特异性片段组成的组。

9.一种包含权利要求7或8的多肽的抗原。

10.一种特异性抗权利要求9的抗原的抗体。

11.产生抗ToTV的抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供ToTV病毒，或其蛋白质或肽片段；

b)用所述病毒、其蛋白质或肽片段免疫合适的脊椎动物宿主；和

c)从所述脊椎动物宿主的血液或脾细胞收获抗所述病毒、其蛋白质或肽片段的抗体。

12.权利要求11的方法，进一步包括以下步骤：选择产生抗体的脾细胞、将所述脾细胞与永生化杂交瘤细胞系融合，及使得所述杂交瘤融合体产生单克隆抗体。

13.可通过权利要求11或12的方法获得的抗体。

14.将病毒分离株鉴别为ToTV病毒的方法，包括将所述病毒分离株或其成分与权利要求10或13的抗体反应。

15.将病毒分离株鉴别为ToTV病毒的方法，包括将所述病毒分离株或其成分与权利要求6的多核苷酸反应。

16.检测样品中ToTV的存在的方法，包括通过将所述样品与权利要求6的多核苷酸或权利要求10或13的抗体反应而确定所述样品中ToTV病毒或其成分的存在。

17.一种鉴别ToTV-抗性植物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)将植物或植物部分暴露于感染剂量的ToTV，

b)在所述暴露后，当出现如下任一现象时鉴别所述植物为ToTV-抗性植物：

-所述植物或植物部分中疾病症状保持不存在、或者延迟表现、或者至少严重程度降低、或者相对于易感对照植物而言是局部化的，和/或

-ToTV病毒或ToTV基因组序列不存在于所述植物或植物部分中，或者ToTV病毒的存在相对于易感对照植物而言至少在数量上降低。

18.权利要求17的方法，其中在步骤b)中所述植物或植物部分中ToTV的存在通过进行权利要求16的方法而确定。

19.一种产生ToTV-抗性植物的方法，包括如下步骤：

a)通过进行权利要求17或18的方法鉴别ToTV-抗性供体植物，

b)将所述ToTV-抗性供体植物与受体植物杂交，和

c)通过进行权利要求17或18的方法从后代植物中选择抗性植物。

20.权利要求19的方法，其中所述供体植物是茄科(Solanaceae)或葫芦科(Cucurbitaceae)的植物。

21.权利要求19的方法，其中所述供体植物是番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜类植物、西瓜植物或者黄瓜植物。

22.权利要求19-21任一项的方法，其中所述受体植物是茄科或葫芦科的植物。

23.权利要求19-21任一项的方法，其中所述受体植物是番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜类植物、西瓜植物或黄瓜植物。

24.权利要求19-21任一项的方法，其中所述受体植物是Solanum lycopersicum种的番茄植物，更优选是具有商业上所希望的特性的S.lycopersicum品系。

25.可通过权利要求19-24任一项的方法获得的ToTV-抗性植物或其部分。

26.进行权利要求16的方法的诊断试剂盒，其包含至少一种选自以下物质组成的组的成分：权利要求1-3任一项的病毒、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的多肽、权利要求9的抗原及权利要求10或13的抗体。

27.权利要求1-3任一项的病毒、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的多肽、权利要求9的抗原或者权利要求10或13的抗体在制备诊断组合物中的应用。

28.诊断组合物，其包含权利要求1-3任一项的病毒、权利要求6的多核苷酸、权利要求7或8的多肽、权利要求9的抗原或者权利要求10或13的抗体。

29.权利要求1-3任一项的病毒、其基因组、或者其抗性赋予部分作为抗病毒剂的应用。

30.权利要求1-3任一项的病毒、其基因组、或其部分作为表达载体的应用。

31.权利要求1-3任一项的病毒的减毒形式、或其基因组或其部分在对植物进行传染免疫中的应用。

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