CN101148653A - 抑制兰属植物组织培养褐变发生的方法 - Google Patents
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Abstract
抑制兰属植物组织培养褐变发生的方法，其操作是：对现有组织培养方法的步骤(1)外植体表面消毒和步骤(2)诱导不定芽发生进行如下改进：步骤(1)中，外植体消毒后用0.01－0.1％生长调节物质赤霉酸和/或生长素类物质在常温下浸泡5－30分钟；在步骤(2)中的培养基中加入0.001－0.01％的6－BA、4－PU或TDZ，培养的光照强度为2000－3000勒科斯。该方法操作简便，抑制褐变效果好。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种抑制兰属植物组织培养过程发生褐变的方法。
(二)背景技术
植物组织培养技术日趋完善，并在科学研究与现代化农业生产中充分显示出其优越性。在农林作物的脱毒快繁、突变诱发、改革作物栽培、细胞工程和基因工程育种以及种质保存等方面都发挥巨大的作用，是一项具有广阔发展潜力的高新技术。目前兰属植物的组织培养方法一般包括的步骤为：先对叶片或假球茎外植体消毒(一般采用75％乙醇和0.1-0.2％升汞表面消毒)，然后诱导外植体产生不定芽(将已经表面消毒的外植体切块，放在加入细胞分裂素类物质的MS、B5或White固体或液体培养基中，诱导不定芽发生)，再培养生根(将试管苗分切成单株在生根培养基上培养)。
植物组织离体培养时，外植体褐变是影响组织培养的关键因素之一。褐变是指植物组织在离体培养过程中，从自身表面向培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步褐变而死亡的现象。在植物的组织培养中，培养材料(又称外植体)褐化是影响培养成功的重要因素(Choi YE，Yang DC，Choi KT，Induction ofsomatic embryos by macrosalt stress from mature aygotic embryos ofPannax ginseng.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1998，52：177-181)，褐变产生的褐色物质不仅使培养基变褐，严重影响培养材料的生长和分化，并最终导致其死亡。
植物组织培养过程中产生褐变的因素是复杂的，是多种因素共同作用的结果。培养材料的生理状态、基因型、同一基因型的不同栽培条件、营养状况、生长部位和大小以及培养基的成分、培养条件等都影响外植体的褐变(叶梅等.植物组织培养外植体褐变的研究进展.生物技术通讯，2004，15(4)：426-428)。幼龄材料一般比成龄材料褐变轻。用油棕幼嫩器官或组织，如胚等外植体进行培养，褐变较轻，而用高度分化的叶片作外植体，接种后则很容易褐变。此外，消毒时间也影响到外植体的褐变，一般来讲，外植体消毒时间越长，褐变也越严重。
褐变分为酶促褐变和非酶促褐变两种。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，如鞣质等(于守超等.植物组织培养过程中外植体褐变机理研究进展.山东林业科技，2004，5：61-63.)。鞣质(又称单宁)是指广泛存在于植物体内的一类多元酚类化合物。大多鞣质为无定形粉末，仅少数为晶体。鞣质的分子量通常为500至3000，具较多的酚羟基，邻位酚羟基易被氧化，可与多种金属离子络合，产生特征颜色反应。如鞣质的水溶液遇三价铁产生蓝(黑)色或绿(黑色)色或沉淀。
有报道指出鞣质是褐变的原因，是褐变发生酶促的底物。褐变外植体分泌到培养基中褐色或黑色的物质主要是鞣质或是被氧化的酚类(Thorpe TA et al.，Application of micropropagation to forestry.In：Debergh PC，Zimmerman RH(eds)Microprogation.Kluwer，Dordrecht，1991，311-336)。用丙酮提取蝴蝶兰叶片离体培养发生褐变的培养基中的褐色成分，与三氯化铁等反应，呈现出鞣质具有的颜色，经质谱分析证实具有缩合鞣质的吸收光谱特性(许传俊等.蝴蝶兰褐变外植体的显微结构观察以及褐变成分的初步分析.园艺学报，2005，32(6)：1111-1113)。目前尚无抑制鞣质物质的报道。
一般用于抑制植物组织褐变的物质有：活性炭、抗坏血酸、柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮、植酸(Chang et al.，Plant CellReports，2001，20：664-669)；这些物质只能减少组织发生褐变的程度，同时又伤害了植物组织，降低了培养材料的存活率，影响其生长发育。处理的方法是：将一定浓度的抑制物质溶解后，加入培养基中，培养材料按照常规方法进行表面消毒后，放置培养基中，在弱光、27℃条件下培养。
(三)发明的内容
本发明的目的是针对现有技术无法很好解决褐变的问题，提供一种抑制兰属植物组织培养过程发生褐变的方法。该方法操作简便，抑制褐变效果好。
为了达到本发明的目的，本发明是在现有组织培养方法包括步骤(1)外植体表面消毒、步骤(2)诱导不定芽发生和步骤(3)试管苗培养生根的基础上，对步骤(1)和(2)进行如下改进：在步骤(1)中，在外植体消毒后，用0.01-0.1％生长调节物质赤霉酸和/或生长素类物质(吲哚乙酸、吲哚丁酸或萘乙酸)在常温下浸泡5-30分钟；在步骤(2)中的培养基中加入0.001-0.01％的6-BA(6-苄基腺嘌呤)、4-PU(4-吡效隆)或TDZ(噻唑隆)，培养的光照强度为2000-3000勒科斯。
在上述方法中，步骤(1)最好用0.03-0.05％赤霉酸浸泡10-15分钟；步骤(2)的培养基的优选方案是加入0.002-0.003％6-BA或0.002％4-PU，光照强度最好为2000勒科斯。
本发明具有如下的优点或效果：
1.由于本发明采用赤霉酸作为主要成分，抑制兰属植物在组织培养过程中，组织发生褐变，降低鞣质含量，同时能促进植物组织的生长发育，为抑制植物组织褐变提供有效、简便的方法，达到了本发明的目的。
2.本发明方法与已有的降低褐变的物质相比，无需增加专用设备，使用浓度小，成本低，操作简便。
(四)具体的实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。在下列实施例中，所述内容均为改进部分，其他均采用现有技术。
实施例1：
(1)蝴蝶兰外植体用0.01％萘乙酸在常温下浸泡5分钟；
(2)培养基加入0.001％的TDZ，光照强度为2000勒科斯。
经实验证明，蝴蝶兰对照叶片褐变发生率为62.3％，经本方法处理的叶片褐变发生率为52.2％。
实施例2：
(1)春兰外植体用0.03％赤霉酸在常温下浸泡10分钟；
(2)培养基加入0.002％的4-PU，光照强度为3000勒科斯。
经实验证明，春兰对照叶片褐变发生率为60.3％，经本方法处理的叶片褐变发生率为45.2％。
实施例3：
(1)蝴蝶兰外植体用0.05％的赤霉酸浸泡15分钟；
(2)培养基加入0.003％的6-BA，光照强度为3000勒科斯。
经实验证明，蝴蝶兰对照叶片褐变发生率为58.0％，经本方法处理的叶片褐变发生率为23.0％，有效降低鞣质含量。
实施例4：
(1)建兰外植体用0.1％的赤霉酸和吲哚乙酸的混合液浸泡30分钟；
(2)培养基加入0.02％的6-BA，光照强度为2000勒科斯。
经实验证明，建兰对照叶片褐变发生率为80.65％，经本方法处理的叶片褐变发生率为48.42％。
Claims (4)
1.一种抑制兰属植物组织培养褐变发生的方法，其特征在于：对现有组织培养方法的步骤(1)外植体表面消毒和步骤(2)诱导不定芽发生进行如下改进：在步骤(1)中，在外植体消毒后，用0.01-0.1％生长调节物质赤霉酸和/或生长素类物质在常温下浸泡5-30分钟；在步骤(2)中的培养基中加入0.001-0.01％的6-BA、4-PU或TDZ，培养的光照强度为2000-3000勒科斯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的生长素类物质采用吲哚乙酸、吲哚丁酸或萘乙酸。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中外植体用0.03-0.05％赤霉酸浸泡10-15分钟；
4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：在步骤(2)的培养基中加入0.002-0.003％的6-BA或0.002％的4-PU，光照强度为2000勒科斯。
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