CN101134100B - 类固醇激素合成急性调节蛋白在制备防治脂肪肝药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及类固醇激素合成急性调节蛋白在降低肝细胞脂肪沉积药物中的应用。本发明通过高血脂动物模型实验，结果表明，正常饮食的apoE基因敲除小鼠与同遗传背景的C57BL/6J小鼠相比，血脂明显升高；用于含StAR基因病毒的小鼠肝组织中甘油三酯和胆固醇的含量明显降低，组织切片染色显示其脂类物质明显减少，证实了类固醇激素合成急性调节蛋白有降低肝细胞中脂肪沉积的作用，可进一步制备降低肝细胞内脂肪沉积的药物。本发明为寻找、治疗临床上脂肪肝等脂质代谢紊乱引起的疾病提供了依据。

Description

类固醇激素合成急性调节蛋白在制备防治脂肪肝药物中的用途

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种胆固醇转运蛋白—类固醇激素合成急性调节蛋白的新用途，具体涉及类固醇激素合成急性调节蛋白在降低肝细胞脂肪沉积药物中的用途。

背景技术

肝内脂肪沉积是脂质代谢紊乱引起的严重的并发症，如果不能及时纠正脂质代谢紊乱，将会进一步发展为脂肪肝、肝脏纤维化和肝硬化等病变，严重影响人们的生活质量。据有关统计，严重的高甘油三酯血症和混合性高脂血症的患者，其脂肪肝的发病率较正常人高5-6倍。通常，肝脏摄取游离脂肪酸后使之转变成甘油三酯，甘油三酯再与特异的载脂蛋白结合生成极低密度脂蛋白。当肝内甘油三酯排泄障碍，便形成肝内脂质储积，即临床上常见的脂肪肝。目前临床上尚无有效的针对脂肪肝的治疗药物，因此，寻找有效的干预药物有着重要的理论意义和应用价值。

类固醇激素合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein，StAR)是促进胆固醇由线粒体外膜转入线粒体内膜的重要转运体(LinD，Sugawara T，Strauss JF，III，Clark BJ，Stocco，DM，Saenger P，Rogol A，Miller WL，1995，Science.267：1828-1831)。近年来有研究表明，StAR在肝细胞胆汁酸酸性合成途径起关键作用，胆固醇由StAR转运至线粒体后，在线粒体内膜细胞色素氧化酶(CYP27A1)的作用下生成27-羟化胆固醇等氧化固醇(oxysterol)，从而增加胆汁酸合成，加快胆固醇排泄(Ren S，Hylemon PB，Marques D，Gurley E，Bodhan P，Hall E，Redford K，Gil G，Pandak WM，2004，Hepatology.40：910-917)。现有技术对StAR的研究均局限于类固醇激素合成组织中，关于其在胆固醇等脂质代谢中的作用未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供类固醇激素合成急性调节蛋白新的药用用途，具体涉及其在制备防治脂肪肝药物中的用途。

类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)是一种胆固醇转运蛋白，可将胆固醇由线粒体外膜转入线粒体内膜，胆固醇可进一步在线粒体内膜细胞色素氧化酶的作用下生成调节性氧化固醇，可调节脂质代谢关键基因的表达，维持胆固醇代谢平衡。

本发明通过动物实验，证实了类固醇激素合成急性调节蛋白在小鼠肝脏内过表达，以及进一步产生的降低肝细胞中脂肪沉积的用途。

本发明采用apoE基因敲除小鼠复制高血脂动物模型，以携带人StAR全长cDNA序列的腺病毒(Pandak WM，Ren S，Marques D，Hall E，Redford K，MalloneeD，Bohdan P，Heuman D，Gil G，Hylemon P，2002，J Biol Chem.277(50)：48158-48164)为载体，采用尾静脉注射腺病毒的方法在小鼠肝脏内过表达StAR，采用逆转录聚合酶法(RT—PCR)及蛋白质免疫印迹实验(Westernblot)的方法证实小鼠肝脏内StAR mRNA及蛋白的过表达；采用血脂检测试剂盒检测肝组织中甘油三酯和胆固醇的含量；进一步采用冰冻切片技术制备小鼠肝脏组织切片，用油红0染色方法显示小鼠肝脏组织中脂肪含量。结果表明，在正常饮食的情况下，24周龄的apoE基因敲除小鼠与同遗传背景的C57BL/6J小鼠相比，血脂明显升高；经过尾静脉注射腺病毒载体可以在小鼠肝脏内过表达StAR的mRNA和蛋白；注射病毒140小时后，利用血脂检测试剂盒显示，注射含StAR基因病毒的小鼠肝组织中甘油三酯和胆固醇的含量较注射生理盐水组以及注射空载体组明显降低；并且利用油红0对肝组织冰冻切片染色显示其脂类物质明显较其它2组减少。因此证实StAR可减轻肝细胞中脂肪沉积。

本发明的目的通过下述方法和步骤实现

1、建立小鼠高血脂模型

正常饮食饲喂apoE基因敲除小鼠；

采用血脂检测试剂盒检测小鼠血脂，包括总胆固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。

2、小鼠肝脏内过表达StAR

小鼠随机分生理盐水组、空载体组和过表达StAR组三组；

通过尾静脉注射腺病毒表达载体。

3、小鼠肝脏内StAR过表达的鉴定

注射病毒140小时后，处死小鼠，取小鼠肝组织冻存留用；

逆转录聚合酶法(RT-PCR)鉴定StAR mRNA在肝脏内的过表达：

设计引物：

StAR基因的扩增引物

sense：5’-AAGAGGGCTGGAAGAAGGAG-3’

antisense：5’-TCTCCTTGACATTGGGGTTC-3’

产物片段为183bp，

GAPDH基因的扩增引物

sense：5’-CCATTTGCAGTGGCAAAAG-3’

antisense：5’-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3’

产物片段为201bp；

RT-PCR实验；

蛋白质免疫印迹实验鉴定StAR蛋白在肝脏内的过表达。

4、检测肝脏组织中的甘油三酯和胆固醇含量

注射病毒140小时后，处死小鼠，各取0.2g肝组织；

采用Folch法(Carlson SE，Goldfarb S，1977，Clinica Chimica Acta.79：575-582)提取肝组织中的脂类物质；

采用血脂检测试剂盒测定肝脏组织中甘油三酯和胆固醇的含量。

5、小鼠肝脏组织中的油红0染色

小鼠肝组织的切片制备；

肝组织切片的油红0染色。

本发明所采用的实验动物和材料，其中：

apoE基因敲除小鼠购自北京大学医学部，经过基因型检测证实apoE基因的缺失；C57BL/6J小鼠购自中国科学院上海实验动物中心；啮齿类动物普通饲料(复旦大学实验动物部)；含序列1的人肾上腺1.6kb StAR cDNA的腺病毒表达载体Ad-CMV-StAR，携带增强型绿色荧光蛋白腺病毒空载体Ad-CMV-EGFP，购自北京本元正阳基因技术股份有限公司；血脂检测试剂盒购自上海容盛生物技术有限公司；Trizol Reagent和SuperScript TM IIIFirst-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR(Invitrogen)、Taq DNA Polymerase和dNTP mix(Fermentas)；兔抗大鼠StAR多克隆抗体(AbCom)、山羊抗兔HRP标记IgG抗体(SANTA CRUZ)、Protease inhibitor cocktail for mammalian tissues(Roche)、

West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce)；油红0(Sigma公司)。

本发明为寻找降低肝细胞内脂肪沉积药物、治疗临床上脂肪肝等脂质代谢紊乱引起的疾病提供了依据；也为进一步分析StAR在调节胆固醇代谢平衡中的作用机制奠定了基础。

附图说明

图1是RT-PCR方法证实小鼠注射腺病毒后肝脏中StAR mRNA的过表达图

其中，A：StAR；B：GAPDH；1：DNA ladder；2：注射生理盐水；3：注射空载体病毒；4：注射含StAR基因病毒。

图2是Western blot方法证实小鼠注射腺病毒后肝脏中StAR蛋白的过表达图

其中，1：注射生理盐水；2：注射空载体病毒；3：注射含StAR基因病毒。

图3是三组小鼠肝组织中甘油三酯的含量

其中，NS：注射生理盐水组；Ad-CMV-EGFP：注射空病毒载体组；Ad-CMV-StAR：注射含StAR基因病毒组；**Ad-CMV-StAR vs.NS group P<0.01，##Ad-CMV-StARvs.Ad-CMV-EGFP group P<0.01。

图4是三组小鼠肝组织中胆固醇含量

其中，NS：注射生理盐水组；Ad-CMV-EGFP：注射空病毒载体组；Ad-CMV-StAR：注射含StAR基因病毒组；**Ad-CMV-StAR vs.NS group P<0.01，##Ad-CMV-StARvs.Ad-CMV-EGFP group P<0.01。

图5是油红0染色显示肝脏切片中脂肪含量

其中，1：注射生理盐水；2：注射空载体病毒；3：注射含StAR基因病毒。

具体实施方式

实施例1

1、建立小鼠高血脂模型

小鼠喂养：apoE基因敲除小鼠和同遗传背景的C57BL/6J小鼠均以清洁级饲养于室温22℃，相对湿度55％的动物房，喂饲啮齿类动物普通饲料，自由进食及饮水。

小鼠血脂检测：

1)血清的制备：选取24周龄雄性apoE基因敲除小鼠和C57BL/6J各6只，实验前饥饿(正常饮水)12小时(晚8点去掉饲料，次日上午8点进行实验)，采用20％乌拉坦腹腔注射(0.5-0.7ml/100g体重)全麻，眼球取血，置于清洁离心管中，室温静置2小时，待血液凝固，3000rpm离心15min，取上清—20℃保存备用。

2)小鼠血清中血脂浓度测定，包括总胆固醇：T-CHO、甘油三酯：TG、低密度脂蛋白胆固醇：LDL-C及高密度脂蛋白胆固醇：HDL-C，取制备好的小鼠血清样品，分别按照试剂盒说明书检测T—CHO，TG，LDL-C以及HDL-C的浓度。其中n＝6，用SPSS11.5统计软件分析。

2、小鼠肝脏内过表达StAR

实验动物选取及分组：选用24周龄apoE基因敲除雄性小鼠34只，饲养于室温25℃，相对湿度55％的清洁级动物房，自由进食及饮水，适应环境2周后开始实验。小鼠随机分为生理盐水组(NS)11只、空载体组(Ad-CMV-EGFP)11只，和过表达StAR组(Ad-CMV-StAR)12只。

按常规方法，通过尾静脉注射腺病毒表达载体；

根据实验分组，由小鼠尾静脉分别注射0.2ml生理盐水、空载体病毒，约含1×10¹¹病毒颗粒以及含StAR基因病毒，约含1×10¹¹毒颗粒。

3、小鼠肝脏内StAR过表达的鉴定

小鼠肝脏组织提取：在尾静脉注射后140小时提取组织，实验前饥饿(正常饮水)12小时(晚8点去掉饲料，次日上午8点处死小鼠取组织)，采用20％乌拉坦腹腔注射(0.5-0.7ml/100g体重)全麻，无菌操作取肝脏用于抽提RNA和蛋白，—70℃保存。每只小鼠另取0.2g肝组织提取其中的脂类物质。

逆转录聚合酶法(RT-PCR)鉴定StAR mRNA在肝脏内的过表达：

1)设计引物：

StAR基因的扩增引物

sense：5’-AAGAGGGCTGGAAGAAGGAG-3’

antisense：5’-TCTCCTTGACATTGGGGTTC-3’

产物片段为183bp，

GAPDH基因的扩增引物

sense：5’-CCATTTGCAGTGGCAAAAG-3’

antisense：5’-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3’

产物片段为201bp；

2)RT-PCR实验：

Trizol抽提肝组织总RNA，测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值以计算纯度。2ugRNA加oligdT1μl，dNTP mixlμl，用DEPC水补至15μl，65℃加热5min，冰浴1min；加入10×缓冲液2μl、25mM MgCl₂4ul、0.1M DTT2μl、Rnase OUT^TM1μl、SuperScript^TMIIIRT1μl，混匀50℃恒温水浴50min，85℃5min，冰浴2min，加入RNase H1μl，37℃孵育20min合成cDNA第一链。50μl PCR反应体系，包括cDNA、StAR引物、GAPDH引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、去离子水。设置PCR循环参数：预变性94℃5min，变性94℃60s，复性55℃60s，延伸72℃60s，28个循环后延伸，72℃15min。琼脂糖电泳，天能凝胶成像仪检测结果。

蛋白质免疫印迹实验鉴定StAR蛋白在肝脏内的过表达：

1)肝脏组织线粒体的分离及线粒体蛋白提取：

①取200mg组织，加2ml线粒体提取液，于玻璃匀浆器中匀浆；

②匀浆液于低温离心机4℃600g离心15min，去除组织残渣，转移上清至新EP管；

③4℃6500g离心20min，弃上清，沉淀用1ml线粒体提取液重悬；

④继续4℃6500g离心20min，弃上清，沉淀用0.5ml线粒体提取液重悬；

⑤再次4℃6500g离心20min；

⑥小心去上清，加入200μl线粒体提取液重悬沉淀；

⑦移入玻璃匀浆器，上下匀浆5次；

⑧用BCA法测定蛋白浓度。

2)蛋白质免疫印迹实验：

①先将样品1,000rmp离心5min去除沉淀，用裂解缓冲液将样品浓度调成一致，加入等体积的2×上样缓冲液，100℃水浴5min；

②将样品加入电泳孔槽中，空余孔槽加入等体积的1×上样缓冲液，100V恒压电泳至溴酚蓝至凝胶底部；

③先将PVDF膜在甲醇中平衡5-10min，然后将其连同Whatman3MM滤纸以及海绵垫在转膜缓冲液中浸泡10min；

④电泳结束后，参考蛋白质Markers切下目的蛋白所处凝胶区域，将其用转膜缓冲液漂洗；在转膜夹的负极面由下至上依次放海绵垫、3层Whatman3MM滤纸、凝胶、PVDF膜、3张Whatman3MM滤纸、海绵垫，用玻棒去除残留于凝胶和PVDF膜之间的气泡，然后装好转膜装置，270mA恒流转膜1.5h；

⑤转膜完毕后将转膜装置拆卸，将PVDF膜剪角以辩识膜的蛋白面，至封闭液在摇床上室温封闭2h；

⑥用抗体稀释液按1:1000稀释一抗，一抗4℃孵育18h；用TBST漂洗4×10min；二抗(1:4000)室温孵育1h，TBST漂洗4×15min；

⑦将PVDF在事先混合好的ECL试剂中孵育5min，然后将PVDF膜置于显色暗盒，进入暗室用X光胶片曝光、显影，调节显、定影时间以使显影效果最佳。

4、检测肝脏组织中甘油三酯和胆固醇含量

如步骤3所述每只小鼠取0.2g小鼠肝组织备用；

利用Folch法提取肝组织中的脂类物质：

1)组织称重，用氯仿：甲醇(体积比2：1)匀浆肝组织；

2)静置后，吸取氯仿相；

3)用氮气吹干氯仿，加入血脂检测试剂盒中的缓冲液以检测其浓度。

利用血脂检测试剂盒测定肝脏组织中甘油三酯和胆固醇的含量：

按照试剂盒说明书检测肝组织中甘油三酯和胆固醇的含量，数值以每克湿重肝组织中的含量表示(mg/g·wwt)，用SPSS11.5统计软件分析。

5、小鼠肝脏组织的油红0染色

小鼠肝组织冰冻切片的制备：

自尾静脉注射病毒140小时后取肝组织行冰冻切片，实验前饥饿(正常饮水)12小时(晚8点去掉饲料，次日上午8点处死小鼠取组织)，采用20％乌拉坦腹腔注射(0.5-0.7ml/100g体重)全麻，0.9％的生理盐水心内灌注冲洗，4％多聚甲醛固定约30min，取部分肝组织，4％多聚甲醛固定过夜，梯度蔗糖溶液脱水，OCT包埋，于恒低温冰冻切片机行连续切片，每片厚度为15μm。

肝组织切片的油红0染色：

1)油红0染色液的配制：于异丙醇溶液内制备油红0(0.25-0.5％)染色原液，临用时于6ml染色原液内加入4ml蒸馏水，放置5—10min，过滤使用。

2)染色方法：

冰冻切片充分水洗；

置密闭容器盛装的油红0染色液内，染色10—15min；

60％酒精分色至背景清晰，水洗；

胞核淡染苏木素，水洗至变蓝；

贴于载玻片上，甘油胶封固。

3)结果：脂类物质呈鲜红色，胞核呈蓝色。

结果显示：正常饮食apoE基因敲除小鼠血脂明显高于同样情况下的C57BL/6J小鼠。

本发明选用的24周龄雄性apoE基因敲除小鼠和C57BL/6J，利用血脂检测试剂盒检测其血脂水平，结果显示与C57BL/6J小鼠相比，apoE基因敲除小鼠血清中总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)均明显增高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)则明显降低。表1是小鼠血脂水平检测结果，其中n＝6，数数据以均数±标准差(x±s)表示，组间差异用单因素方差分析统计。

表1

其中*P<0.05vs.C57BL/6J，**P<0.01vs.C57BL/6J。

RT-PCR结果显示注射含StAR基因病毒后的小鼠肝脏内StAR mRNA表达较其它2组增高。

本发明以逆转录聚合酶链法在mRNA水平检测注射病毒后，小鼠肝脏中StAR基因的表达，验证了通过尾静脉注射的方法可以在肝脏内过表达StAR基因。用GAPDH作为内参照，结果显示注射含StAR基因病毒后肝脏中StAR mRNA量(4)明显较其它2组(2，3)增高(图1)。

蛋白质免疫印迹显示注射含StAR基因病毒后的小鼠肝脏内StAR蛋白的表达较其它2组增高。

本发明以蛋白质免疫印迹法在蛋白水平检测注射病毒后，小鼠肝脏中StAR蛋白的表达，验证了通过尾静脉注射的方法可以在肝脏内过表达StAR蛋白。小鼠经尾静脉注射病毒140h后，提取肝组织线粒体蛋白质经蛋白质免疫印迹实验检测其中StAR蛋白的表达情况。结果显示注射含StAR基因病毒后肝脏中StAR蛋白量(3)明显较其它2组(1，2)增高(图2)。

利用甘油三酯检测试剂盒显示注射含StAR基因病毒后肝脏组织中甘油三酯的含量明显较其它2组降低。

经尾静脉注射病毒140小时后，取小鼠肝组织，利用氯仿甲醇抽题肝脏中的脂类物质，通过甘油三酯检测试剂盒检测显示注射含StAR基因病毒的小鼠肝组织中甘油三酯的含量均较注射生理盐水组和空载体病毒组小鼠明显降低，其结果如表2和图3所示，数数据以均数±标准差(x±s)表示，组间差异用单因素方差分析统计。

表2

其中**P<0.01vs.NS，##P<0.01vs.Ad-CMV-EGFP。

利用胆固醇检测试剂盒显示注射含StAR基因病毒后肝脏组织中胆固醇的含量明显较其它2组降低。

经尾静脉注射病毒140小时后，取小鼠肝组织，利用氯仿甲醇抽题肝脏中的脂类物质，通过胆固醇检测试剂盒检测显示注射含StAR基因病毒的小鼠肝组织中胆固醇的含量均较注射生理盐水组和空载体病毒组小鼠明显降低，其结果如表2和图4所示，数数据以均数±标准差(x±s)表示，组间差异用单因素方差分析统计。

油红0染色显示注射含StAR基因病毒的小鼠肝脏组织中脂类物质较其它2组明显减少。

经尾静脉注射病毒140h后，取小鼠肝组织制备冰冻切片，用油红0染色显示：注射含StAR基因病毒的小鼠肝组织中脂类物质明显较注射生理盐水组和空载体病毒组小鼠肝组织减少，结果如图5所示。

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

<120>类固醇激素合成急性调节蛋白在制备防治脂肪肝药物中的用途

<130>11

<160>1

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>1605

<212>PRT

<213>人类

<400>1

Claims (2)

1.类固醇激素合成急性调节蛋白在制备防治脂肪肝药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的类固醇激素合成急性调节蛋白利用基因载体使其在肝脏组织中过表达。

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