CN101100642A - 一种提高超声波破碎效率的方法 - Google Patents

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施定基
李轩
李丹
王悦
赵兴贵
宋冬辉
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Abstract

本发明技术属于生物科学和生物技术等领域。在超声波破碎的同时，向破碎液中加入适量的石英砂或玻璃渣等填充物，可以提高破碎效率，缩短破碎时间，减少能耗，降低由于高温而使蛋白质变性失活的可能。本发明技术主要应用于细胞工程和基因工程中细胞破壁等领域。

Description

一种提高超声波破碎效率的方法
技术领域
本发明涉及一种提高超声波破碎效率的方法，适用于基因工程和细胞工程中的细胞破壁，从而利用胞内制药和提取活性物质。
背景技术
现代生物制药产业中，为了提取微生物和藻类细胞内的活性物质，常常需要进行细胞破碎。在细胞破碎时，通常不用化学法或生物化学法，以免有外加化学物质污染目的产物，一般用物理或机械法。适用于实验室内小规模的细胞破碎的物理或机械法有French压榨法、珠磨法、超声波和冻融法。珠磨法中，在珠磨机的破碎室内填充玻璃或氧化锆微珠，填充率为80％-85％。在搅拌浆的高速搅拌下微珠高速运动，微珠和微珠之间以及微珠和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。珠磨破碎操作的有效能量利用率仅为1％左右，破碎过程中会产生大量的热能，因此，在实验设计中应充分考虑换热能力问题。
超声波破碎法是利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物和藻类的破碎。超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程中会产生极大的热量，所以在实验中需在冰水中进行，防止胞内生化物质变性失活。
发明内容
将实验室中用于细胞破碎的两种方法——超声波破碎法和珠磨法联合使用，在超声波破碎的同时向破碎液中加入70-100目的经过预处理过的石英砂，使石英砂的填充率达到5％-10％，可以大大提高破碎效率，缩短破碎时间，降低能耗，同时，可以防止长时间超声波破碎时产生的大量热能使蛋白变性失活。
由于石英砂在制作过程中不同于实验室使用的其它药品，在使用石英砂之前应对石英砂做预处理，具体方法是：用0.1mol/L的HCL反复冲洗石英砂3遍，后用蒸馏水调PH至中性，用超声波对石英砂进行超声处理至上清清澈，用75％的无水乙醇封存。使用前，将无水乙醇洗净并将PH值调至中性。使用后的石英砂在洗净后可以反复使用多次。
本专利技术主要应用于基因工程和细胞工程等技术等领域。
附图说明
图1，加入石英砂的样品的破碎率明显增高。添加石英砂后，破碎6min时的细胞破碎率和不添加石英砂时破碎8min时的细胞破碎率相当。
图2，加入石英砂后，随着细胞破碎率的提高，蛋白质溶出率明显增高。但是在添加石英砂利不添加石英砂的样品中，破碎8min后，总蛋白含量均有下降。
具体实施方式
实验1：
取等量湿藻体溶于Tris-HCl缓冲液(EDTA：3.7240g/L，pH＝7.5，NaCl：0.2mol/L)中，以50ml为一份，共配置等体积两分。向其中一份中加入适量石英砂，每隔一分钟取样一次，以细胞破碎率、上清中总蛋白含量研究石英砂对超声波破碎的影响。(图1、2)
实验2：
取适量湿藻体溶于Tris-HCl缓冲液(EDTA：3.7240g/L，pH＝7.5，NaCl：0.2mol/L)中，按每份总体积50ml配制9份。根据单因素实验，设石英砂添加量(A)、超声波功率(B)、破碎时间(C)和破碎液浓度(D)四个因素，每个因素下设3个水平，取L9(34)正交表进行实验，以细胞破碎率、上清中总蛋白含量对超声波破碎条件进行优化。具体实验方案如表1所示。
表1：超声波破碎条件实验方案
    所在列   A     B     C   D
    因素   石英砂添加比例     破碎液浓度     破碎时间   破碎功率
    实验1   2％     10倍稀释     2min   400w
    实验2   2％     15倍稀释     4min   500w
    实验3   2％     20倍稀释     6min   600w
    实验4   5％     10倍稀释     4min   600w
    实验5   5％     15倍稀释     6min   400w
    实验6   5％     20倍稀释     2min   500w
    实验7   10％     10倍稀释     6min   500w
    实验8   10％     15倍稀释     2min   600w
    实验9   10％     20倍稀释     4min   400w
根据表2、3可知，影响细胞破碎率的主次因素为A＞C＞D＞B，实验范围内最优条件为A3C3D3B3。
表2：超声波破碎后细胞破碎率直观分析表
所在列 A B C D
    因素   石英砂比例   破碎液浓度     破碎时间     破碎功率     实验结果
    实验1   1   1     1     1     0.6590
    实验2   1   2     2     2     0.8347
    实验3   1   3     3     3     0.9292
    实验4   2   1     2     3     0.9234
    实验5   2   2     3     1     0.9102
    实验6   2   3     1     2     0.8807
    实验7   3   1     3     2     0.9478
    实验8   3   2     1     3     0.9124
    实验9   3   3     2     1     0.9354
    均值1   0.808   0.843     0.817     0.835
    均值2   0.905   0.886     0.898     0.888
    均值3   0.932   0.915     0.929     0.922
    极差   0.124   0.072     0.112     0.087
表3：超声波破碎后细胞破碎率方差分析表
    因素   偏差平方和     自由度   F比     F临界值
    A     0.026     2   3.250     19.000
    B     0.008     2   1.000     19.000
    C     0.020     2   2.500     19.000
    D     0.011     2   1.375     19.000
    误差     0.01     2
根据表4、5可知，影响总蛋白含量的主次因素为A＞C＞D＞B，实验范围内的最优实验条件为A3C3D3B2。
表4：超声波破碎后总蛋白含量(μg/μl)直观分析表
  所在列     A     B     C     D
  因素   石英砂比例   破碎液浓度   破碎时间   破碎功率   实验结果
  实验1     1     1     1     1   5.6914
  实验2     1     2     2     2   8.1026
  实验3     1     3     3     3   8.5902
  实验4     2     1     2     3   8.8924
  实验5     2     2     3     1   9.0523
  实验6     2     3     1     2   8.4424
  实验7     3     1     3     2   9.1421
  实验8     3     2     1     3   8.6413
  实验9     3     3     2     1   8.7021
  均值1     7.461     7.909     7.592     7.815
  均值2     8.796     8.599     8.566     8.562
  均值3     8.829     8.578     8.928     8.708
  极差     1.368     0.69     1.336     0.893
表5：超声波破碎后总蛋白含量方差分析表
  因素   偏差平方和   自由度   F比   F临界值
    A     3.65     2   3.946   19.000
    B     0.925     2   1.000   19.000
    C     2.866     2   3.098   19.000
    D     1.376     2   1.488   19.000
  误差     0.93     2
实验3：
取转人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的工程鱼腥藻，称适量溶于Tris-HCl缓冲液(EDTA：3.7240g/L，pH＝7.5，NaCl：0.2mol/L)中，按每份总体积50ml配制2份，向其中一份中加入适量的石英砂。在两份样品的细胞破碎率达到93％时，用ELISA测定破碎后上清中的TNF-ct含量，以测定优化后的超声波破碎条件对目的蛋白的保护作用。
根据下表可知，在相同破碎条件下，添加石英砂后TNF-α的含量上升约17.5％。
    编号     石英砂   总蛋白浓度(μg/l)   TNF-α含量(pg/ml)
    1     -     9.18   0.3672×108[100％]
    2     +     10.785   0.4314×108[117.5％]
                                                                                                                            。

Claims (2)

1、提高超声波破碎效率的方法
在使用超声波破碎细胞时，向破碎液中加入适量的石英砂或玻璃渣等填充物，可以提高破碎效率。
2、超声波破碎条件优化
加入石英砂后，对超声波破碎条件进行优化，可以缩短破碎时间，在保证蛋白质活性的同时提高破碎效率。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104549684A (zh) * 2014-08-05 2015-04-29 浙江大学 超声波改变湿藻细胞分形结构促进油脂萃取的方法
CN108004008A (zh) * 2017-12-07 2018-05-08 河西学院 一种微藻油脂的提取方法
CN109529781A (zh) * 2018-12-27 2019-03-29 沈阳建筑大学 一种污水除汞用石英砂改性负载巯基材料及其制备方法
CN114292805A (zh) * 2022-01-10 2022-04-08 中国原子能科学研究院 充分提取贴壁细胞总蛋白的方法

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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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