CN101098892A - 针对IL-13受体α1的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

结合IL-13Rα1、抑制IL-13生物活性并包含可变重链和可变轻链的抗体，其特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR3选自由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR3序列，该抗体用于治疗哮喘和变应性疾病。

Description

针对IL-13受体α1的抗体及其用途

本发明涉及针对IL-13受体α1(IL-13Rα(alpha)1)的人抗体，它们的生产方法和用途。

发明背景

IL-13是主要由Th2细胞而且也由肥大细胞和NK细胞产生的分泌的单体肽。IL-13的生物功能包括调节IgE产生和调节Th2发育。IL-13结合由IL-13受体α1(IL-13Rα1)链和IL-4受体α(IL-4Rα)链组成的受体复合体。IL-13结合主要通过STAT6引发信号转导事件。IL-13以低亲和性结合单独的IL-13Rα1并且不结合IL-4Rα1。与此相反，IL-4结合单独的IL-4Rα并且不结合单独的IL-13Rα1。已经描述了IL-13的另一种受体IL-13Rα2。IL-13以高亲和性结合该受体。该受体同样作为docey受体。

在转基因小鼠中IL-13的可诱导的过表达导致与哮喘患者共有许多特征的表型。它们显示出粘液组织转化、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞富集的炎症、蛋白酶如MMP-9、-12、-13、-2和-14、组织蛋白酶B、H、K和S的上调，并且它们还呈现上皮下纤维质生成。IL-13敲除小鼠由于Th2发育的损伤而显示出Th2细胞因子产生的显著减少。这些小鼠尽管存在嗜酸性粒细胞炎症但是不产生呼吸道高反应性(AHR)。通过施用IL-13恢复了AHR，表明IL-13是诱导小鼠中AHR必要且足够的。IL-13的与哮喘有关的其他重要的生物功能包括诱导杯形细胞组织转化和粘液产生。它直接作用于呼吸道上皮细胞、成纤维细胞和呼吸道平滑肌细胞并诱导这些细胞类型的每一种中不同的转录程序。有趣的是，IL-13降低平滑肌细胞中的α-肾上腺素能应答，促进呼吸道狭窄。IL-13启动子多态性与变应性哮喘的增加的危险有关。IL-13基因中多态性与高血清IgE水平有关。在IL-4和IL-13基因之间基因间序列中的单核苷酸多态性与特应性哮喘有关。

IL-13拮抗剂已经用于动物模型中。例如，可溶性小鼠IL-13Rα2-IgGFc融合蛋白已经用于显示在完全逆转卵白蛋白诱导的AHR和含有粘液的细胞数目中的功效。即使在该表型完全发展后给予治疗也可以得到该逆转。此外，用IL-13融合细胞毒素分子治疗小鼠导致慢性真菌诱导的变应性炎症中呼吸道疾病的所有特征的减少。总之，IL-13是变态反应中效应臂的关键介体。

IL-13Rα1是hemapoietin受体超家族(1型细胞因子受体超家族)的成员并且由Obiri N.I.，等人，J.Biol.Chem.，270(1995)8797-8804)和WO96/29417鉴定和描述。它是427个氨基酸的蛋白质，包括信号序列。它的DNA和蛋白质序列在WO 97/15663和SwissProt No.P78552中描述。IL-13Rα1是以低亲和性结合IL-13的糖基化蛋白质，但是，当连接IL-4Rα成异源二聚体时，它以高亲和性结合IL-13。该复合体也是IL-4的受体。

针对IL-13Rα1的抗体可以从WO 96/29417，WO 97/15663，WO03/080675，Graber P.，等人，Eur.J.Immunol.，28(1998)4286-4298；PoudrierJ.，等人，J.Immunol.，163(1999)1153-1161；Poudrier J.，等人，Eur.J.Immunol.，30(2000)3157-3164；Aikawa M.，等人，Cytokine，13(2001)75-84已知。针对IL-13Rα1的抗体可以从R&D Systems Inc.USA商购。

发明概述

本发明包括结合IL-13Rα1并且抑制IL-13生物活性的抗体，其特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR3选自由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR3序列组成的组。

所述抗体优选是人抗体。

该抗体优选特征是结合IL-13Rα1的亲和性为10^-9M(K_D)或更小，优选10^-9到10^-13M。

优选地，该抗体的特征是它的重链CDR1、CDR2和CDR3序列选自由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。

该抗体优选特征是所述抗体的可变轻链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3选自由SEQ ID NO：2、4、6、8或10的轻链CDR序列组成的组。

该抗体优选特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3选自由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR序列组成的组，并且所述抗体的可变轻链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3选自由SEQ IDNO：2、4、6、8或10的轻链CDR序列组成的组。

CDR序列优选相互独立地选择并且通过FR(构架)区分开。

抗体的优选特征是包含SEQ ID NO：1的CDR作为重链CDR和SEQID NO：2的CDR作为轻链CDR，SEQ ID NO：3的CDR作为重链CDR和SEQ ID NO：4的CDR作为轻链CDR，SEQ ID NO：5的CDR作为重链CDR和SEQ ID NO：6的CDR作为轻链CDR，SEQ ID NO：7的CDR作为重链CDR和SEQ ID NO：8的CDR作为轻链CDR，或SEQ ID NO：9的CDR作为重链CDR和SEQ ID NO：10的CDR作为轻链CDR。

可以根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义确定CDR序列。基于此，SEQ ID NO：1-8的互补决定区(CDR)具有下面的序列：

重链CDR：SEQ ID NO：1、3、5、7、9的CDR1(aa 31-35)，SEQ ID NO：1、3、5、7、9的CDR2(aa 50-66)，SEQ ID NO：1、3、9的CDR3(aa 99-108)，SEQ ID NO：5的CDR3(aa 99-107)，SEQ ID NO：7的CDR3(aa 99-112)；

轻链CDR：SEQ ID NO：2、4、6、10的CDR1(aa 24-34)，SEQ ID NO：8的CDR1(aa 24-35)，SEQ ID N0：2、4、6、10的CDR2(aa 50-56)，SEQID NO：8的CDR2(aa 51-57)和SEQ ID NO：2、4、6、10的CDR3(aa 89-97)，SEQ ID NO：8的CDR3(aa 90-97)。

优选地，本发明提供了抗体，其包含下面的序列作为互补决定区(CDR)：

a)抗体重链，其包含SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR；

b)抗体轻链，其包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的轻链CDR，

其中CDR彼此相互独立地选择。

抗体优选的特征是包含作为重链可变区的SEQ ID NO：1和作为轻链可变区的SEQ ID NO：2，作为重链可变区的SEQ ID NO：3和作为轻链可变区的SEQ ID NO：4，作为重链可变区的SEQ ID NO：5和作为轻链可变区的SEQ ID NO：6，作为重链可变区的SEQ ID NO：7和作为轻链可变区的SEQ ID NO：8，或作为重链可变区的SEQ ID NO：9和作为轻链可变区的SEQ ID NO：10。

该抗体优选的特征在于包含：

a)作为重链可变区的SEQ ID NO：1和作为轻链可变区的SEQ IDNO：2，作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12，

b)作为重链可变区的SEQ ID NO：3和作为轻链可变区的SEQ IDNO：4作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12，

c)作为重链可变区的SEQ ID NO：5和作为轻链可变区的SEQ IDNO：6，作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12，

d)作为重链可变区的SEQ ID NO：7和作为轻链可变区的SEQ IDNO：8，作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12，或

e)作为重链可变区的SEQ ID NO：9和作为轻链可变区的SEQ IDNO：10，作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12。

优选地，抗体的特征在于与抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和/或LC5002-018竞争结合IL-13Rα1。优选地，抗体的特征是包含LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018的可变区作为可变区。这些抗体的可变区在SEQ ID NO：1-10中显示。有用的恒定区是本领域中公知的。实例在SEQ ID NO：11-12中显示。

抗体优选是单克隆的或者重组产生的抗体。

在本发明的一个实施方案中，抗体是类别改变的人抗体。

在本发明的优选实施方案中，抗体含有人γ1重链，其包含

a)氨基酸序列Pro₂₃₃Val₂₃₄Ala₂₃₅，其缺失Gly₂₃₆和/或氨基酸序列

Gly₃₂₇Leu₃₂₈Pro₃₂₉Ser₃₃₀Ser₃₃₁，

b)氨基酸序列Ala₂₃₄Ala₂₃₅或

c)氨基酸Ala₂₆₅和Ala₂₉₇。

优选地，根据本发明的抗体以6nM或者更低的IC₅₀值抑制IL-13诱导的Stat-6磷酸化，以20nM或者更低的IC₅₀值抑制IL-13诱导的嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)产生和/或以10nM或者更低(IL-13)和60nM或者更低(IL-4)的IC₅₀值抑制IL-13或者IL-4诱导的细胞增殖，优选TF-1细胞(ATCC CRL 2003)增殖。根据实施例6到8确定IL-13诱导的Stat-6磷酸化、嗜酸细胞活化趋化因子产生和诱导细胞增殖。

根据本发明的抗体优选不结合变性的IL-13Rα1(结合亲和性K_D为10^-6M或者更高)。该抗体优选特征是显示出基本不与IL-13Rα2和IL-4Rα交叉反应(结合亲和性K_D为10^-6M或者更高)。

本发明还提供了杂交瘤细胞系，其产生针对IL-13Rα1的拮抗性单克隆抗体。

根据本发明优选的杂交瘤细胞系(hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-002(DSM ACC2709)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-003(DSM ACC2710)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-005(DSM ACC2711)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-007(DSM ACC2712))在2005年1月13日保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)，德国)。

从所述细胞系可得到的抗体是本发明的实施方案。

本发明还提供了编码包含本发明抗体的多肽的核酸、表达所述核酸的表达载体、用于重组产生所述抗体的宿主细胞。本发明还提供了重组产生所述抗体的方法。

根据本发明的核酸编码的多肽为：

a)包含SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR的抗体重链和

b)包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的轻链CDR的抗体轻链。

这些多肽能够与各自的另一抗体链装配产生抗体。

根据本发明的抗体对于需要皮质类固醇(corticosteroid)治疗的患者显示出益处。根据本发明的抗体具有新的和创造性性质，其对于患有哮喘或者变应性疾病的患者产生益处。

本发明还提供了治疗哮喘和变应性疾病的方法。

本发明还包含根据本发明的抗体的用途，用于哮喘治疗和生产根据本发明的药物组合物。此外，本发明包括生产根据本发明的药物组合物的方法。

本发明还包括药物组合物，其包含药物有效量的根据本发明的抗体和任选地用于配制用于药物目的的抗体制剂的缓冲剂和/或佐剂。

本发明还提供了包含药用载体中的此类抗体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物可以包括在制成品或者试剂盒中。

本发明还包括载体，其包含根据本发明的核酸，其能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。

本发明还包括原核或者真核宿主细胞，其包含根据本发明的载体。

本发明还包括产生根据本发明的重组人抗体的方法，其特征是在原核或者真核宿主细胞中表达根据本发明的核酸并从所述细胞回收所述抗体。本发明还包括通过此类重组方法可以得到的抗体。

本发明还包括制备药物组合物的方法，其特征是当与没有所述抗体的测定法比较时，从针对IL-13Rα1的多种抗体中选择针对IL-13Rα1的抗体，通过重组表达产生所述抗体，回收所述抗体并将所述抗体与药用缓冲剂和/或佐剂组合。优选地，抗体具有一种或多种上述额外的性质。

发明详述

术语“IL-13Rα1、鼠IL-13Rα1、IL-13、IL-13Rα2和IL-4Rα”和它们的结构域是本领域中众所周知的并且例如通过SwissProt P78552、O09030、P35225、Q14627和P24394定义。如果不另外指出，术语“IL-13Rα1、IL-13、IL-13Rα2和IL-4Rα”因此表示人多肽IL-13Rα1、IL-13、IL-13Rα2和IL-4Rα。

本文使用的术语“人抗体”包括具有可变区和恒定区(结构域)的抗体，其可以因为它们与这些种系序列的高度序列相似性或同一性而指定为确定的人种系免疫球蛋白序列。人抗体是本领域中众所周知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。也可以在转基因动物(例如，小鼠)中产生人抗体，所述转基因动物当免疫时能够产生人抗体的全部组成成分或者人抗体的选择部分(a selection)而不产生内源免疫球蛋白。在此类种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因的转移导致当抗原攻击时产生人抗体(见例如，Jakobovits，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等人，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等人，Year Immunol.7(1993)33-40)。还可以在噬菌体展示文库中产生人抗体(Hoogenboom，H.R.，and Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D.，等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；和Boerner，P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。人抗体包括多种形式的抗体，优选单克隆抗体，包括但不限于完整抗体、抗体片段、类别改变的抗体和遗传改造的抗体(变体或者突变抗体)只要保持根据本发明的特征性性质。特别优选重组人抗体。本文使用的术语“单克隆抗体”指都具有基本上相同的氨基酸序列的抗体分子的制备物。

本文使用的术语“重组人抗体”意在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从对于人免疫球蛋白基因转基因的宿主细胞如NS0或CHO细胞或者从动物(例如小鼠)分离的抗体，或者使用转染到此类宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经进行体内体细胞高突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是可以分配为特定人种系VH和VL序列的序列，但是不天然存在于体内人抗体种系所有组成成分中。

术语“类别改变的抗体”指通常通过重组DNA技术制备的单克隆抗体，优选人抗体，其包含来自一种来源或者种系的可变区即结合区，和与来自不同来源或者种系的抗体的恒定区匹配的恒定区的至少一部分。此类类别改变的抗体不是天然存在的并且因此不能直接从异种移植物小鼠得到。本发明包括的“类别改变的抗体”的形式是这样的形式，其中恒定区与野生型恒定区序列不同，导致根据本发明的具有不同性质，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的抗体，即，通过改变或者突变Fc而实现。类别改变的抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述基因包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。产生类别改变的抗体的方法包括常规重组DNA和基因转染技术，是本领域中众所周知的(见，例如，Morrison，S.L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244)。

本文使用的“可变区”(轻链可变区(VL)、重链可变区(VH))指每对轻链和重链的直接参与抗体与抗原结合的部分。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包含四个构架(FR)区，它们的序列广泛保守，通过三个“高变区”(或者互补决定区，CDR)连接。构架区采取β折叠构型并且CDR可以形成连接β折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区保持它们的三维结构并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合部位。抗体重链和轻链CDR3区，优选地重链CDR3在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和性中起特别重要的作用，并且因此提供了本发明的另一目的。

术语“高变区”或者“抗体的抗原结合部分”当在本文中使用时指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或者“CDR”的氨基酸残基。“构架”或者“FR”区为不同于本文定义的高变区残基的那些可变结构域区。因此，抗体的轻链和重链从N-末端到C-末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义确定CDR和FR区。

“恒定结构域”不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应功能。取决于它们的重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体或者免疫球蛋白分成下面的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些的一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定区分别称作μ、δ、γ、α和ε。根据本发明的抗体优选为IgG1型。

抗体的Fc部分直接参与补体激活、C1q结合、C3激活和Fc受体结合。对C1q的结合由Fc部分中确定的结合位点引起。此类结合位点是本领域中已知的并且例如由Lukas，T.J.，等人，J.Immuno1.127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，and Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton，D.R.，等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等人，Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434描述。此类结合位点为例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号，见下文)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示出补体激活、C1q结合和C3激活，而IgG4抗体不激活补体系统，不结合C1q并且不激活C3。本文使用的术语“来自人来源的Fc部分”表示Fc部分，其优选具有亚类IgG1的人抗体的Fc部分的氨基酸序列，其以这样的方式修饰使得与人IgG1抗体相比，不能检测到C1q结合、C3激活和/或FcR结合或者结合至少减少50％，优选70％。“抗体的Fc部分”是本领域技术人员众所周知的术语并且基于抗体的木瓜蛋白酶切割定义。根据本发明的抗体含有Fc部分，优选具有人来源的Fc部分的氨基酸序列和优选人恒定区的所有其他部分。优选地，Fc部分是来自人IgG1亚类的突变的人Fc部分。最优选地是包含具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的γ1-重链恒定区(实例在SEQ ID NO：11中显示)(WO99/51642)的Fc部分。

人恒定链，例如，γ1-重链由Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991)，和Brüggemann，M.，等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love，T.W.，等人，Methods Enzymol.178(1989)515-527详细描述。在本发明中优选的恒定结构域不提供补体结合。如本发明中使用“可变区”(轻链可变区(VL)，重链可变区(VH))指每对轻链和重链的直接参与抗体与抗原结合的区域。

如本文使用的术语核酸或者核酸分子意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或者双链的，但是优选为双链DNA。

当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作连接的(operably linked)”。例如，如果前序列或者分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白质，那么所述DNA可操作连接该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么该启动子或增强子可操作连接该编码序列；或者如果核糖体结合部位位于方便翻译的位置上，那么该核糖体结合部位可操作连接编码序列。通常，“可操作连接”指被连接的DNA序列是顺式的，并且对于分泌前导序列的情况，是连续的和读框内的。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点的连接完成连接。如果不存在此类位点，那么根据常规的实践使用合成的寡核苷酸接头或者连接体。

如本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用并且所有此类指定包括子代。因此，单词“转化体”和“转化的细胞”包括原代主题细胞和从其得到的培养物，无论传代次数。还理解由于有意或者无意突变，所有子代不必在DNA含量中精确相同。包括变异子代，其具有在最初转化的细胞中所筛选的相同的功能或者生物学活性。当意在不同的指定时，将从上下文澄清。

本文使用的术语“结合IL-13Rα1”指在体外测定、优选在结合测定中抗体结合IL-13Rα1，在该测定中，抗体结合到表面并且IL-13Rα1的结合通过表面等离子体共振(SPR)测量。结合指10^-8M或者更小，优选10^-13到10^-9M的结合亲和性(K_D)。“不结合”指10^-6M或更多的K_D。根据本发明的抗体结合到人IL-13Rα1并且优选也结合小鼠IL-13Rα1的细胞外结构域。

可以通过BIAcore测定法(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)研究对IL-13Rα1的结合。通过术语ka(抗体从抗体/抗原复合体结合的速率常数)、kd(解离常数)和K_D(kd/ka)定义结合亲和性。

通过根据本发明的抗体抑制IL-13与IL-13Rα1的结合。以ELISA中IL-13与IL-13Rα1/IL-4Rα异源二聚体的结合的IC₅₀测量抑制。为了进行这种测定，将IL-13Rα1固定并加入IL-13和IL-4Rα。根据本发明的抗体对IL-13与IL-13Rα1结合的IC₅₀值不超过6nM。以至少三次独立测量的平均值或者中值测量IC₅₀值。单次IC₅₀值可能在范围之外。

根据本发明的抗体优选显示出与选自由抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018组成的组的抗体相同的结合IL-13Rα1的表位或者由于这些抗体导致的结合的立体位阻而与IL-13Rα1的结合受到抑制。可以通过SPR测定使用选自由抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018组成的组的固定化抗体和20-50 nM浓度的IL-13Rα1和100nM浓度的待检测的抗体来检测结合抑制。信号减小50％或者以上表明抗体与选自由抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018组成的组的抗体竞争。术语“表位”指能够特异结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面组如氨基酸或者糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特异电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂的存在下对前者的结合丧失，但是对后者的结合不丧失。本发明还包括结合IL-13Rα1并且抑制IL-13生物活性的人抗体，其特征是对IL-13Rα1结合的亲和性为10^-9M(K_D)或更小，优选10^-9到10^-13M，对鼠IL-13Rα1结合的亲和性为10^-7M(K_D)或更小，优选10^-8到10^-9M。

在本发明的优选实施方案中，根据本发明的抗体进一步通过一种或多种特征表征，所述特征选自结合参数ka、kd和K_D，结合的表位与选自由抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018组成的组的抗体结合的表位相同。

优选通过重组方法产生本发明的抗体。此类方法是本领域中众所周知的并且包括在原核和真核细胞中表达蛋白质和随后分离抗体多肽并通常纯化至药用纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法向表达载体中插入编码轻链和重链或者其片段的核酸。在合适的原核或者真核宿主细胞像CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达并从细胞(裂解后上清液或者细胞)回收抗体。

抗体的重组产生是本领域中众所周知的并且描述于例如Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中。

抗体可以存在于完整细胞、细胞裂解物中或者为部分纯化的或者基本纯化的形式。通过标准技术进行纯化以便除去其他细胞组分或者其他污染物，例如其他细胞核酸或者蛋白质，所述技术包括碱/SDS处理、CsCl显带法(binding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳、和本领域中众所周知的其他方法。见Ausubel，F.，等，ed.Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley Interscience，New York(1987)。

NS0细胞中的表达由例如Barnes，L.M.，等人，Cytotechnology 32(2000)109-123；和Barnes，L.M.，等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬时表达由例如Durocher，Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可变结构域的克隆由Orlandi，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述。优选的瞬时表达系统(HEK 293)由Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，inCytotechnology 30(1999)71-83和Schlaeger，E.-J.，in J.Immunol.Methods194(1996)191-199描述。

适于原核生物的对照序列例如包括启动子，优选地操纵基因序列，和核糖体结合部位。已知真核细胞利用启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。

单克隆抗体适于通过常规的免疫球蛋白纯化方法如蛋白A Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或者亲和层析从培养基分离。可以使用常规方法容易地分离编码单克隆抗体的DNA和RNA并测序。杂交瘤细胞可以用作此类DNA和RNA的来源。一旦分离，就可以将DNA插入到表达载体中，然后将表达载体转染到宿主细胞，如CHO细胞、HEK293细胞或者骨髓瘤细胞，否则所述宿主细胞不产生免疫球蛋白，以得到宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。

此外，根据本发明的抗体包括具有“保守序列修饰”的核苷酸和氨基酸序列修饰的抗体，所述修饰不影响或者改变根据本发明抗体的上述特征。可以通过本领域已知的标准技术如位点定向诱变和PCR介导的诱变引入修饰。保守氨基酸替代包括其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在人抗-IL-13Rα1抗体中预测的非必需氨基酸残基可以优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替代。

可以基于Riechmann，L.，等人，Nature 332(1988)323-327和Queen，C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033描述的分子建模通过诱变进行氨基酸替代。

通过向抗体DNA中引入合适的核苷酸改变或者通过肽合成制备人IL-13Rα1抗体的氨基酸序列变体。然而，如上述，此类修饰仅可以在非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述抗体特征，如IgG同种型和表位结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白质稳定性或者方便纯化。

不参与保持抗-IL-13Rα1抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基也可以一般用丝氨酸替代，以提高分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反地，可以向抗体加入半胱氨酸键以提高它的稳定性(尤其当抗体是抗体片段，如Fv片段时)。

抗体的另一类型的氨基酸变体改变抗体的最初糖基化模式。改变指缺失一个和多个在抗体中发现的糖类部分，和/或加入一个或多个不存在于该抗体中的糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的。N-连接的指糖类部分连接到天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任一氨基酸)是糖类部分酶促连接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列的任一个的存在产生的潜在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列使得它含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，可以方便地完成糖基化位点向抗体的加入。

通过本领域中已知的多种方法制备编码抗-IL-13Rα1抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于，从天然来源(对于天然存在的氨基酸序列变体)分离或者通过寡核苷酸介导的(或者位点定向)诱变、PCR诱变和以前制备的抗-IL-13Rα1抗体的变体或非变体形式的表达盒诱变来制备。

另一类型的共价修饰涉及向抗体化学或者酶促偶联糖苷。这些方法是有利的，因为它们不需要在具有N-或者O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生抗体。取决于使用的偶联方式，糖可以连接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)自由羧基，(c)自由巯基，如半胱氨酸的自由巯基，(d)自由羟基，如丝氨酸、苏氨酸或者羟脯氨酸的自由羟基，(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或者色氨酸的芳族残基，或者(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在WO 87/05330，和在Aplin，J.D.，和Wriston，J.C.Jr.，CRC Crit.Rev.Biochem.(1981)259-306中描述。

可以化学或者酶促地除去存在于抗体上的任何糖类部分。通过将抗体暴露于三氟代甲磺酸或者等同化合物可以完成化学去糖基化。该处理导致切割除了连接糖(N-乙酰基葡糖胺或者N-乙酰基半乳糖胺)之外的多数或者全部糖，而完整的留下抗体。化学去糖基化由Sojahr，H.T.，和Bahl，O.P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57和Edge，A.S.，等人Anal.Biochem.118(1981)131-137描述。通过使用如Thotakura，N.R.，和Bahl，O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359描述的各种内切和外切糖苷酶可以实现抗体上糖类部分的酶促切割。

抗体的另一类型的共价修饰包括以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中给出的方法将抗体连接到多种非蛋白质聚合物之一，例如，聚乙二醇、聚丙二醇或者聚氧化烯。

在另一方面，本发明提供了从转基因非人动物如转基因小鼠分离的B细胞，其表达根据本发明的人抗-IL-13Rα1抗体。优选地，分离的B细胞从转基因非人动物如转基因小鼠得到，所述动物已经用IL-13Rα1抗原的纯化或者富集的制备物和/或表达IL-13Rα1的细胞免疫。优选地，所述转基因非人动物如转基因小鼠的基因组包含编码本发明的抗体的全部或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。然后将分离的B细胞永生化以提供人抗IL-13Rα1抗体的来源(例如，杂交瘤)。因此，本发明还提供了能够产生根据本发明的人单克隆抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，杂交瘤包括从转基因非人动物如转基因小鼠得到的融合永生化细胞的B细胞，所述动物的基因组包含编码本发明的抗体的全部或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。

在具体实施方案中，转基因非人动物是转基因小鼠，其基因组包含编码本发明的抗体的全部或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。该转基因非人动物可以用IL-13Rα1抗原的纯化或者富集的制备物和/或表达IL-13Rα1的细胞免疫。优选地，该转基因非人动物如转基因小鼠能够产生针对IL-13Rα1的人单克隆抗体的IgG1同种型。

通过用IL-13Rα1抗原的纯化或者富集的制备物和/或表达IL-13Rα1的细胞免疫转基因非人动物如转基因小鼠可以产生根据本发明的人单克隆抗体，所述动物的基因组包含编码本发明的抗体的全部或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。然后得到动物的B细胞(例如，脾B细胞)并与骨髓瘤细胞融合形成分泌针对IL-13Rα1的人单克隆抗体的永生的杂交瘤细胞。

在优选实施方案中，使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠可以产生针对IL-13Rα1的人单克隆抗体。这些转基因小鼠在本文中称作″HuMab″小鼠，含有人免疫球蛋白基因小基因座，其编码包括重链(μ和γ)和κ轻链(恒定区基因)的未重排的人免疫球蛋白基因，以及失活内源μ和κ链基因座的定向突变(Lonberg，N.，等人，Nature 368(1994)856-859)。因此，小鼠显示出小鼠IgM或K的降低的表达，并且应答免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性的人IgG单克隆抗体(Lonberg，N.，等人，Nature 368(1994)856-859；Lonberg，N.，Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101；Lonberg，N.，和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93；和Harding，F.，和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci 764(1995)536-546)中综述)。HuMab小鼠的制备在Taylor，L.，等人，Nucleic Acids Research 20(1992)6287-6295；Chen，J.，等人，International Immunology 5(1993)647-656；Tuaillon，N.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90(1993)3720-3724；Choi，T.K.，等人，Nature Genetics 4(1993)117-123；Chen，J.，等人，EMBO J.12(1993)821-830；Tuaillon，N.，等人，Immunol.152(1994)2912-2920；Lonberg，N.，等人，Nature 368(1994)856-859；Lonberg，N.，Handbook ofExperimental Pharmacology 113(1994)49-101；Taylor，L.，等人，Int.Immunol.6(1994)579-591；Lonberg，N.，and Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93；Harding，F.，和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci764(1995)536-546；Fishwild，D.M.，等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述，将这些文献的内容完整引入本文作为参考。另外见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,545,807；5,770,429；WO98/24884；WO94/25585；WO93/1227；WO92/22645；和WO92/03918。

为了产生针对IL-13Rα1的完整人单克隆抗体，可以将HuMab小鼠用IL-13Rα1抗原的纯化或者富集的制备物和/或表达IL-13Rα1的细胞根据一般方法免疫，如Lonberg，N.，等人，Nature 368(1994)856-859；Fishwild，D.M.，等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO 98/24884中描述。优选地，当第一次免疫时，小鼠将为6-16周龄。例如，可溶的IL-13Rα1抗原的纯化或者富集的制备物(例如，从IL-13Rα1表达细胞纯化)可以用于腹膜内免疫HuMab小鼠。对于使用IL-13Rα1抗原的纯化或者富集的制备物免疫不产生抗体的情况，也可以用表达IL-13Rα1的细胞，例如用肿瘤细胞系免疫小鼠以促进免疫应答。用多种抗原积累的经验表明当最初用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(i.p.)免疫，接着每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原交替i.p.或者s.c.免疫(例如，长达共6周)时，HuMab转基因小鼠最佳地应答。可以在免疫方案的过程中用通过眶后取血得到的血浆样品监视免疫应答。可以通过ELISA筛选血浆，并且具有足够效价的抗IL-13Rα1人免疫球蛋白的小鼠可以用于对应的B细胞的永生化。可以用抗原静脉内加强小鼠3到4天后处死并除去脾脏和淋巴结。预期可能需要进行每种抗原的2-3次融合。一些小鼠将用每种抗原免疫。例如，可以免疫HCo7和HCo12品种的共5到12只HuMab小鼠。

HCo7小鼠在它们的内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如Chen，J.，等人，EMBO J.12(1993)821-830中描述)，在它们的内源重链基因中具有CMD破坏(如WO 01/14424的实施例1中描述)，KCo5人κ轻链转基因(如Fishwild，D.M.，等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述)，和HCo7人重链转基因(如美国专利号5,770,429中描述)。

HCo12小鼠在它们的内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如Chen，J.，等人，EMBO J.12(1993)821-830中描述)，它们的内源重链基因中的CMD破坏(如WO 01/14424的实施例1中描述)，KCo5人κ轻链转基因(如Fishwild，D.M.，等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述)，和HCo12人重链转基因(如WO 01/14424的实施例2中描述)。

可以分离小鼠淋巴细胞并使用PEG基于标准方法与小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤。然后对所得杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。例如，将来自经免疫的小鼠的脾脏和淋巴结来源的淋巴细胞的单个细胞混悬液用50％PEG融合到1/6的数目的SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)。将细胞以约2×105接种在平底微量滴定板中，然后在选择培养基中培养约2周。

然后通过ELISA筛选个体细胞(well)的人抗IL-13Rα1单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，就分析培养基，通常在10-14天后。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果仍然对于人IgG阳性，那么可以通过有限稀释将抗IL-13Rα1单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生用于表征的抗体。

因为CDR序列负责抗体-抗原相互作用，所以可能通过构架表达载体表达根据本发明的重组抗体，所述表达载体包括来自不同的人抗体的构架序列上的根据本发明的CDR序列(见例如，Riechmann，L.，等人，Nature332(1998)323-327；Jones，P.，等人，Nature 321(1986)522-525；和Queen，C.，等人，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86(1989)10029-10033)。此类构架序列可以来自包括种系人抗体基因序列的公共DNA数据库。这些种系序列将与成熟的抗体基因序列不同，因为它们将不包括完全装配的可变基因，其在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接形成。种系基因序列还将在均匀跨越可变区的个体(individual)处不同于高亲和性次级全套抗体的序列。

本发明优选包含编码结合IL-13Rα1的多肽的核酸片段，其中所述多肽抑制IL-13与IL-13Rα1的结合，所述多肽选自：

a)包含SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR的抗体重链；

b)包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的轻链CDR的抗体轻链。

将重构的重链和轻链可变区与启动子、翻译起始、恒定区、3’非翻译区、多聚腺苷酸化和转录终止的序列组合以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可以组合到单个载体中，共转染、顺序转染或者单独转染到宿主细胞中，然后宿主细胞融合形成表达两条链的单个宿主细胞。

因此，本发明提供了产生根据本发明的重组人抗体的方法，其包括表达核酸，该核酸编码：

a)包含SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR的抗体重链；

b)包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的轻链CDR的抗体轻链。

本发明还包含根据本发明的抗体的用途，用于体外检测IL-13Rα1，优选通过免疫学测定法检测，所述测定法测定样品的IL-13Rα1和本发明抗体之间的结合。

另一方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，其包含本发明的人单克隆抗体或者其抗原结合部分的一种或组合，与药用载体一起配制。

本文使用的“药用载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或者输注)。

“药用盐”指保留抗体的所希望的生物活性并且不赋予任何不希望的毒理学作用的盐(见，例如，Berge，S.M.，等人，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19)。此类盐包括在本发明中。此类盐的实例包括酸式加成盐和碱式加成盐。酸式加成盐包括衍生自无毒的无机酸的盐，如盐酸盐。

本发明的组合物可以通过本领域中已知的多种方法施用。如技术人员将理解的，施用途径和/或方式将取决于所希望的结果而变。

为了通过一些施用途径施用本发明的化合物，必须用物质包衣该化合物或者与该化合物共同施用，以防止它的失活。例如，化合物可以在合适的载体如脂质体或者稀释剂中施用于受试者。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲液。

药用载体包括无菌水溶液或者分散体和无菌粉剂，其用于当时(extemporaneous)制备无菌注射液或者分散体。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域中已知的。

本文使用短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”指不同于经肠和局部施用的施用方式，通常通过注射施用，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的消毒步骤和通过包括多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等确保预防微生物的存在。还希望在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等等。此外，通过包括延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射的药物形式的吸收。

不管所选的施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将可以以合适的水合形式使用的本发明的化合物和/或将本发明的药物组合物配制成药用剂型。

本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变以便得到一定量的活性成分，其对于具体患者、组合物和施用方式有效实现所希望的治疗应答而对患者没有毒性。所选的剂量水平将依赖于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明的具体组合物或者其酯、盐或者酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗史，和医学领域中公知的类似因素。

组合物必须是无菌和流体的以至于组合物可通过注射器递送的程度。除了水，载体可以是等渗的缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇，等)和其合适的混合物。

通过使用包衣如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持合适的流动性。在许多情况中，在组合物中优选包括等渗剂，如糖，多元醇，如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝或者明胶可以引起可注射组合物的长期吸收。

提供下面的实施例、参考文献、序列表和附图帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附的权利要求书中给出。将理解可以在步骤中做出修改而不背离本发明的精神。

序列表描述

SEQ ID NO：1 HuMab LC5002-002的重链可变结构域

SEQ ID NO：2 HuMab LC5002-002的轻链可变结构域

SEQ ID NO：3 HuMab LC5002-003的重链可变结构域

SEQ ID NO：4 HuMab LC5002-003的轻链可变结构域

SEQ ID NO：5 HuMab LC5002-005的重链可变结构域

SEQ ID NO：6 HuMab LC5002-005的轻链可变结构域

SEQ ID NO：7 HuMab LC5002-007的重链可变结构域

SEQ ID NO：8 HuMab LC5002-007的轻链可变结构域

SEQ ID NO：9 HuMab LC5002-018的重链可变结构域

SEQ ID NO：10 HuMab LC5002-018的轻链可变结构域

SEQ ID NO：11κ轻链恒定区

SEQ ID NO：12γ1重链恒定区

附图描述

图1显示了抗-IL-13Rα1抗体与固定的重组人IL-13Rα1多肽的结合。包括多克隆兔抗人IL-13Rα1抗体AF152(R&D systems)和抗-KLH作为阴性对照HuMab。

图2显示了通过抗-IL-13Rα1抗体对IL-13与固定的IL-13Rα1/IL-4Rα受体结合的抑制。

图3显示了通过抗-IL-13Rα1抗体对IL-13与CHO细胞(表达IL-13Rα1和IL-4Rα2)结合的阻断。作为阳性对照，包括通过商业途径可获得的抗-IL-13Rα1抗体(AF152，R&D Systems，Minneapolis，MN)。

图4显示了抗-IL-13Rα1抗体与hIL-13Rα1的结合和与功能上相关的受体hIL-13Rα2和hIL-4Rα的结合性质。

图5显示了抗-IL-13Rα1抗体能够结合固定的重组鼠IL-13Rα1多肽。包括多克隆山羊抗人IL-13Rα1抗体AF152(R&D Systems)和抗KLH作为阴性对照HuMab。

实施例

实施例1

杂交瘤的产生

通过用表达人IL-13Rα1的细胞免疫转基因非人动物，例如转基因小鼠可以产生根据本发明的人单克隆抗体，所述动物的基因组包含编码本发明抗体的所有或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。然后得到动物的B细胞(例如，脾B细胞)并与骨髓瘤细胞融合形成永生化的杂交瘤细胞，其分泌针对IL-13Rα1的人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠可以产生针对人IL-13Rα1的人单克隆抗体。这些转基因小鼠在本文中称作“HuMab”小鼠，含有人免疫球蛋白基因小基因座，其编码包括重(μ和γ)和κ(kappa)轻链(恒定区基因)的未重排的人免疫球蛋白基因，以及失活内源μ和κ链基因座的靶定的突变(Lonberg N.，等人，Nature 368(1994)856-859)。因此，小鼠显示出小鼠IgM或者κ的降低的表达，并且应答免疫，所引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性人IgG单克隆抗体。为了产生针对人IL-13Rα1的完全人单克隆抗体，可以用表达人IL-13Rα1的细胞根据如Lonberg，N.，等人，Nature 368(1994)856-859；Fishwild，D.M.，等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO 98/24884描述的一般方法免疫HuMab小鼠。优选地，当首次免疫时，小鼠将是6-16周龄。例如，可以用IL-13Rα1转染的细胞腹膜内免疫HuMab小鼠。可以在免疫方案过程中用通过眶后取血得到的血浆样品监视免疫应答。可以通过ELISA和/或FACS筛选血浆。具有足够效价的抗人IL-13Rα1人免疫球蛋白的小鼠可以用于永生化对应的B细胞。可以用抗原静脉内加强小鼠，3到4天后处死并除去脾脏和淋巴结。例如，可以免疫HCo7或HCo12品种的HuMab小鼠。HCo7小鼠在它们的内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如Chen等人(1993)EMBO J.12：821-830中描述)，它们的内源重链基因中的CMD破坏(如WO 01/14424的实施例1中描述)，KCo5人κ轻链转基因(如Fishwild，D.M.，等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中描述)，和HCo7人重链转基因(如US 5,770,429中描述)。HCo12小鼠在它们的内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如Chen，J.，等人，EMBO J.12(1993)821-830中描述)，它们的内源重链基因中的CMD破坏(WO 01/14424的实施例1中描述)、KCo5人κ轻链转基因(如Fishwild，D.M.，等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述)，和HCo12人重链转基因(如WO01/14424的实施例2中描述)。可以分离小鼠淋巴细胞并且使用PEG基于标准方案与小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤。然后对所得杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。例如，将来自经免疫的小鼠的脾脏和淋巴结来源的淋巴细胞的单个细胞混悬液用50％PEG融合到SP 2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)。将细胞以约0.75×10⁷接种在平底微量滴定板中，然后在选择培养基中培养约2周。然后通过ELISA和/或FACS筛选个体细胞(wells)的人抗IL-13Rα1单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果仍然对于人IgG阳性，那么可以通过有限稀释将抗IL-13Rα1单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生用于表征的抗体。

转基因小鼠的免疫程序

将三只HCo7小鼠(3只雄性)，品种GG2201(Medarex，San Jose，CA，USA)，和2只HCo12小鼠(1只雄性和1只雌性)，品种GG2198(Medarex，San Jose，CA，USA)用1×10⁶个HEK293细胞免疫，用IL-13Rα1的表达载体转染。在尾根部交替腹膜内(i.p.)和皮下(s.c.)总共给予8次免疫。对于第一次免疫，将100μl 1×10⁶ HEK293：IL-13Rα1细胞与100μl完全弗氏佐剂(CFA；Difco Laboratories，Detroit，USA)混合。对于所有其他免疫，将PBS中的100μl细胞与100μl不完全弗氏佐剂(ICFA；Difco)混合。

小鼠的加强

当发现抗IL-13Rα1的血清效价足够时，在融合前4天和3天，将小鼠额外用200μl PBS中的1×10⁶ HEK293:IL-13Rα1细胞静脉内(i.v.)加强两次。

实施例2

通过ELISA测试HuMab与固定化的IL-13Rα1的结合

为了确定本发明的抗体结合重组IL-13Rα1的能力，将IL-13Rα1(R&DSystems，UK)的细胞外结构域溶解在PBS(1μg/ml)中并通过在4℃过夜温育允许吸附到微量滴定板(NUNC Maxisorb)。用洗涤缓冲液(WB＝0.9％NaCl；0.1％Tween20)洗涤平板后，通过加入100μl温育缓冲液(IB＝PBS与1％crotein C和0.1％Tween20)并在室温(RT)温育30分钟，封闭非特异性结合位点。然后加入连续稀释的HuMab和对照抗体(100μl/孔，在IB中稀释)并在RT温育1小时。再次洗涤平板，通过与以IB中1∶500的最终稀释度的过氧化物酶缀合的兔抗人κ(DAKO，Denmark)温育来检测结合的人抗体。用过氧化物酶缀合的多克隆猴抗山羊IgG(Santa Cruz；用IB以1∶1000稀释)检测多克隆山羊抗hIL-13Rα1抗体。在RT温育1小时和随后的洗涤步骤后，在室温下黑暗中用随时可用的ABTS^溶液(RocheDiagnostics GmbH)显影平板。最高浓度的吸光度达到足够的OD后在405nm测量吸光度。

所有测试的针对IL-13Ralpha1的抗体都能够结合人IL-13Rα1的固定化的细胞外结构域。对于测试的多种LC抗体，测定的EC50值为0.5-2nM的范围内。阴性对照HuMab抗-KLH不结合IL-13Rα1的固定的细胞外结构域。包括作为阳性对照的多克隆山羊抗人IL-13Rα1抗体也有效结合IL-13Rα1的固定的细胞外结构域(图1)。

实施例3

IL-13与IL-13Rα1/IL-4Rα异源二聚体结合的抑制(ELISA)

将微量滴定板用PBS中3μg/ml的100μl hIL-13Rα1:hFc嵌合蛋白(R&D Systems，UK)在振荡器上4℃过夜温育。用WB洗涤平板后，加入连续稀释的HuMab和对照抗体(100μl/孔；IB中稀释液)并在RT温育30分钟。再次洗涤平板，然后加入IL-13(R&D Systems，UK；0.5μg/ml；用IB稀释)和IL-4Rα(R&D Systems，UK；0.75μg/ml；用IB稀释)的混合液并在RT温育1小时。洗涤平板后，加入浓度为0.4μg/ml的100μl生物素化的抗IL-13抗体(BAF213；R&D Systems，UK)并在RT温育1小时。洗涤平板后，通过用IB稀释1∶5000的过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(RocheDiagnostics GmbH，DE)检测结合的IL-13(RT下温育1小时)。最后，洗涤平板并在黑暗中室温(RT)下用随时可用的ABTS^溶液(Roche DiagnosticsGmbH，DE)显影平板。45到60分钟后测量在405nm处的吸光度。

抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018能够抑制IL-13与异源二聚体受体的结合，最大抑制值为约50％到80-85％。阳性对照为AF152(多克隆兔抗体)。如所预期的，阴性对照抗-KLH不抑制IL-13与异源二聚体受体的结合。对于LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018得到的IC₅₀值为1.5nM到10.1nM(图2)。

实施例4

放射配体结合测定

用结合缓冲液(25mM HEPES，150mM NaCl，1mM CaCl₂，5mMMgCl₂，和0.5％牛血清白蛋白，调节到pH 7.2)中表达人IL-13Rα1和人IL-4Rα的CHO细胞进行¹²⁵I-IL-13结合测定。将每孔1×10⁵个细胞与抗体混合并预温育15分钟到1小时。加入.1nM ¹²⁵I-IL-13，并将混合物在4℃温育4小时。从饱和结合分析、竞争性分析和确定输入¹²⁵I-IL-13达到与细胞系的平衡结合来测定用于测定法中¹²⁵I-IL-13的浓度。在用1％PEI/0.5％BSA预处理的GF/C滤板上收获样品并在Packard TopCount闪烁计数器上计数。用PRISM使用非线性回归曲线拟合进行数据分析(GraphPad Software，San Diego，CA)。

所有测试的针对IL-13Ralpha1的抗体都阻断标记的IL-13与IL-13Rα1/IL-4Rα复合体的结合。对于抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018计算的IC₅₀值在0.09nM到0.32nM之间，对于AF152为84.8nM(图3)。

实施例5

通过HuMab抑制人B细胞和单核细胞上IL-13诱导的CD23上调

通过菲可帕克密度梯度分离外周血单核细胞(PBMC)。用RPMI洗涤细胞后，将它们重悬浮在RPMI/10％FCS中并以3×10⁵ PBMC/孔(体积50μl)分布在96孔平底微量滴定板(Coming Incorporated Costar)中。然后，加入RPMI/10％FCS中终浓度为0.5μg/ml的25μl抗人CD40抗体(Immunotech)和RPMI/10％FCS中终浓度为10μg/ml的25μl抗人IgA+IgG+IgM抗体(Immunoresearch)。然后，加入连续稀释的HuMab和对照抗体(50μl/孔；用RPMI/10％FCS稀释)，并将细胞在培养箱(37℃；5％CO₂)中培养30分钟。然后加入终浓度为0.67ng/ml的重组人IL-13(R&DSystems)(50μl/孔)并在37℃/5％CO₂培养细胞72小时。该培养后，离心平板并吸取培养基。为了贴壁细胞的脱附，加入200μl Accutase(PAA)并将细胞在37℃；5％CO₂下温育约5分钟。通过反复冲洗来脱附细胞并将其转移到圆底平板中。离心并抽出上清液后，将细胞与200μl抗-CD23-PE、抗-CD20-FITC和抗-CD14-APC(都来自BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)的混合物温育。将细胞在4℃温育30分钟，然后离心并抽出上清液。将该洗涤步骤重复一次，最后将细胞重悬浮在200μlPBS/0.1％人血清白蛋白中并使用CellQuest软件在FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)中分析。在多数情况中，获得10000个事件并在光散射栅(gate)上选通(gate)以仅仅包括活的淋巴细胞和单核细胞。将细胞在B淋巴细胞的CD19阳性簇或者单核细胞的CD14阳性簇上预选通(pregate)并进一步分析CD23表达。

对B淋巴细胞上CD23上调的抑制观察到的IC₅₀值对于抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018为0.5nM到＞70nM，对于AF152为13.6nM。对于人单核细胞上IL-13诱导的CD23上调的抑制发现了类似图谱。在单核细胞上，对于抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018的IC₅₀值为0.1nM到62.8nM，对于AF152为62.9nM。

实施例6

应答作为刺激物的IL-13或者IL-4的TF-1增殖测定

TF-1细胞(ATCC#CRL 2003)生长在含有ATCC改良的RPMI，10％FBS，1X青霉素/链霉素，2ng/ml GM-CSF的培养基中。在测定前一天，将细胞在无GM-CSF的培养基中保持。将每孔5×10³个细胞与合适浓度的抗-IL-13Rα1抗体在37℃温育1小时。然后，细胞用2ng/m1人IL-13(R&DSystems，Minneapolis，MN)或者0.1ng/ml人IL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN)刺激并在37℃温育48小时。将细胞用0.5μCi³H-胸苷脉冲并在37℃温育16-18小时。用Perkin Elmer Filtermate 96收获器收获样品到用1％PEI/0.25％BSA预处理的GFC平板上。在Perkin Elmer Top countScintillation计数器上对GFC平板计数。用非线性回归曲线拟合在PRISM中进行数据分析(GraphPad Software，San Diego，CA)。

抗-KLH抗体在该测定中没有显示出任何抑制。对于LC5002-007也是这样。所有其他抗体都抑制该应答，即使LC5002-007比其他抗体以更高的IC值抑制该应答。对不同抗体观察到的IC₅₀值：AF152为13.50nM，LC5002-002为9.21nM，LC5002-003为3.07nM和LC5002-005为0.39nM。对于IL-4诱导的TF-1细胞增殖观察到类似的图谱，然而，抗体的效力与IL-13诱导的应答相比降低。IL-4诱导的增殖的IC₅₀值：抗-IL4R抗体为0.02nM，AF152为74.37nM，对于抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018在4.68nM到60nM之间。

实施例7

通过人肺成纤维细胞对应答IL-13的嗜曙红粒细胞趋化因子(eotaxin)的产生的抑制

该测定用HFL-1细胞(人肺成纤维细胞，ATCC#CCL-153)进行。将细胞以每孔100,000个细胞的密度接种在12孔板中并在37℃培养72小时以达到汇合。然后将细胞在无血清的培养基中饥饿24小时并用抗-IL-13Rα1抗体在37℃处理1小时。该处理后，用10ng/m1 IL-13(R&DSystems，Minneapolis，MN)在37℃刺激细胞48小时。收集上清液并使用从R&D Systems(Cat.No.DTX00)可购买的ELISA进行嗜曙红粒细胞趋化因子测定。用Spectromax微量板读数仪读数吸光度，并利用PRISM(GraphPadSoftware，San Diego，CA)分析数据。

测试的抗体显示出抑制嗜曙红粒细胞趋化因子释放的不同的能力。除了LC5002-007之外，所有测试的其它抗体都显示出一定的抑制。来自3到4次不同的实验的计算的平均IC₅₀值：对于AF152为11.5nM，对于抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018在2.45nM到19.8nM之间。

实施例8

人支气管平滑肌细胞中IL-13诱导的Stat-6磷酸化的抑制

按照生产商的使用说明书培养人支气管平滑肌细胞(BSMC；Clonetics，Cat.No CC-2576)。将细胞在12孔组织培养板中生长直到它们达到汇合。将细胞在无血清的培养基中饥饿24小时并加入不同量的抗体。将平板温育1小时然后用2.5ng/ml IL-13(R&D System)刺激。温育15分钟后，除去上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞并加入100μl裂解缓冲液。混合物在冰水快速超声处理并离心。裂解物用于磷酸化的Stat-6的蛋白质印迹检测。将等量的蛋白质装入SDS-凝胶，电泳并转移到膜。使用来自Santa CruzBiotechnology的抗Stat-6抗体(Cat.No.SC-11762R)和偶联到过氧化物酶的二级抗体。用Amersham的ECL Plus System(Cat No RPN 2132)进行检测。在Typhoon 9400 Imager中进行定量。

在该测定中测试的两种HuMabs(LC50002-003和LC5002-005)都抑制IL-13诱导的Stat-6磷酸化。在该测定中发现的效力类似于其他功能测定。计算的IC₅₀值为：AF152为18.64nM，LC5002-003为5.98nM，和LC5002-005为1.18nM。

实施例9

抗hIL-13Rα1 HuMab可变区结构域(κ轻链和γ1重链)的克隆和序列分析

通过标准cDNA合成/PCR程序分离编码抗hIL-13Rα1 HuMab的轻链可变区V_I和重链可变区V_H的核苷酸序列。用GeneRacer^TM试剂盒(Invitrogen)从1×10⁶-1×10⁷个杂交瘤细胞制备总RNA。来自杂交瘤的RNA用作第一链cDNA合成和GeneRacer^TM Oligo-dT引物连接的模板。分别用与κ轻链和γ1-重链恒定区的核苷酸序列互补的反向轻链和重链引物和5’特异性GeneRacer^TM引物进行第二链cDNA合成和编码V_L和V_H的cDNA片段的进一步PCR扩增。用来自Invitrogen^TM Life Technologies的TOPO^TMTA克隆试剂盒和pCR4-TOPO^TM作为克隆载体克隆PCR产物。通过使用EcoRI消化对合适质粒的限制性作图鉴定克隆的PCR产物，V_L和V_H的预期的/计算的DNA片段大小分别为740bp和790bp。通过双链测序测定克隆的PCR片段的DNA序列。GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包10.2和Vector-NTI8(InforMax，Inc)用于一般的数据处理。用GCG模块CLUSTALW比对DNA和蛋白质序列。用程序GENEDOC(版本2.1)进行序列比对。

实施例10

构建抗hIL-13Rα1 IgG1 HuMab的表达质粒

将抗hIL-13Rα1 HuMab轻链和重链编码基因分别装配在哺乳动物细胞表达载体中。由此，将编码抗hIL-13Rα1 HuMab轻链可变区(V_L)和人κ轻链恒定区(C_L，SEQ ID NO：11)的基因区段与抗hIL-13Rα1 HuMab重链可变区(V_H)和人γ1-重链恒定区(C_H1-铰链-C_H2-C_H3，SEQ ID NO：12)的基因片段一样连接。关于给予密码子选择的人轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesman，K.S.，and Foeller，C.，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Ed.，NIHPublication No.91-3242。抗hIL-13Rα1 HuMab κ轻链的转录单位由下面的元件组成：

●来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，

●包括Kozak序列的合成的5’-UT，

●包括信号序列内含子的鼠免疫球蛋白重链信号序列，

●克隆的抗hIL-13Rα1 HuMab可变轻链cDNA，在5’末端排列唯一的BsmI限制性位点，在3’末端是剪接供体位点和唯一的NotI限制性位点，

●基因组人κ-基因恒定区，包括内含子2小鼠Ig-κ增强子[Picard，D.，和Schaffner，W.，Nature 307(1984)80-82]和

●人免疫球蛋白κ-多聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列。抗hIL-13Rα1 HuMabγ1重链的转录单位由下面的元件组成：

●来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，

●包括Kozak序列的合成的5’-UT，

●包括信号序列内含子的经修饰的鼠免疫球蛋白重链信号序列，

●克隆的抗hIL-13Rα1 HuMab可变重链cDNA，在5’末端排列唯一的BsmI限制性位点，在3’末端是剪接供体位点和唯一的NotI限制性位点，

●基因组人γ1-重链基因恒定区，包括小鼠Igμ增强子(Neuberger，M.S.，EMBO J.2(1983)1373-1378)，

●人γ1免疫球蛋白多聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列。抗hIL-13Rα1 HuMab κ轻链和γ1重链表达质粒的功能元件：

除了抗hIL-13Rα1 HuMab κ-轻链或者γ1重链表达盒外，这些质粒还含有

●潮霉素抗性基因

●EB病毒(EBV)的复制起点oriP

●来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和

●β内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。

实施例11

突变的(变体)抗hIL-13Rα1 IgG1的表达质粒的构建

编码突变的抗hIL-13Rα1 γ1-重链的表达质粒可以通过野生型表达质粒的位点定向诱变使用QuickChange^TM位点定向诱变试剂盒(Stratagene)产生并且在表1中描述。根据EU编号[Edelman，G.M.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85；Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesman，K.S.，和Foeller，C.，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Ed.，NIH Publication No.91-3242]对氨基酸编号。

表1

突变	描述
		PVA-236；GLPSS331如通过E233P；L234V；L235A；delta G236详细说明；	人γ1重链的氨基酸序列Glu233Leu234Leu235Gly236被人γ2重链的氨基酸序列Pro233Val234Ala235替换
A327G；A330S；P331S	人γ1重链的氨基酸序列Ala327Leu328Pro329Ala330Pro331被人γ4重链的氨基酸序列Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331替换
		L234A；L235A	人γ1重链的氨基酸序列Leu234Leu235通过氨基酸序列Ala234Ala235替换

实施例12

重组抗hIL-13Rα1 HuMab的产生

通过在补充10％ultra-low IgG FCS(Gibco)，2mM谷氨酰胺(Gibco)，1％v/v非必需氨基酸(Gibco)和250μg/ml G418(Roche DiagnosticsGmbH，DE)的DMEM(Gibco)中瞬时转染贴壁的HEK293-EBNA细胞(ATTC CRL-10852)产生重组HuMabs。对于转染Fugene^TM 6(RocheDiagnostics GmbH，DE)，以3∶1到6∶1的试剂(μl)与DNA(μg)的比例使用转染试剂。使用1∶2到2∶1的轻链与重链编码质粒的摩尔比，从两种不同的质粒表达免疫球蛋白轻链和重链。在转染后第4到11天收获含有HuMab的细胞培养上清液。

关于人抗体在例如HEK293中的重组表达的一般信息在Meissner，P.，等人，Biotechnol Bioeng 75(2001)197-203中给出。

实施例13

a)使用嵌合hIL-13Rα1:hFc对HuMabs LC5002-003、-005和-007的亲和分析

Biacore 3000仪器用于相互作用分析。作为运行和反应缓冲液，使用25℃的HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％polysurfactant P，pH7.4)。捕获分子(山羊抗人-IgG，Fcγ特异的)以20μg/ml的浓度5μl/min的流速进行胺偶联20分钟。以1μg/ml的浓度10μl/min的流速注射HuMabs1分钟。通过注射500nM和30μl/min的人γ球蛋白3分钟实现游离的山羊抗人IgG，Fc_γ的封闭。将分析物(hIL-13Rα1:hFc嵌合蛋白)以5.63nM到90nM之间的5个浓度注射两分钟并用HBS-P洗涤5分钟。通过两次注射100mM HCl，每次1分钟，完成表面的再生。芯片、测定形式和注射的顺序和动力学数据对应于表2中的描述。从样品曲线扣除阴性对照数据(例如，缓冲液曲线)用于校正系统内在基线漂移和减小噪声信号。用BiaEvaluation版本4.01分析传感图(sensorgram)和计算亲和性数据。通过将动力学数据拟合1∶1 Langmuir结合模型计算动力学数据(表2)。

表2：使用hIL-13Rα1:hFc对HuMabs的亲和性分析。基于1∶1 Langmuir结合模型的数据分析

芯片	捕获	配体	分析物	ka(l/Ms)	kd(l/s)	KD(M)
							CM5	抗-bFcγ	LC5002-003	hIL-13Rα1:hFc	2.1×105	1.4×10-6	＜6.5×10-12
CM5	抗-hFcγ	LC5002-005	hIL-13Rα1:hFc	1.73×105	3.12×10-6	1.8×10-11
							CM5	抗-hFcγ	LC5002-007	hIL-13Rα1:hFc	1.19×105	1×10-6	＜8.4×10-12

b)使用从hIL-13Rα1:hFc嵌合蛋白切割的hIL-13Rα1的细胞外结构域对HuMabs LC5002-003、-005和-007的亲和性分析

Biacore 3000仪器用于相互作用分析。运行和反应缓冲液为25℃的HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％polysurfactant P，pH7.4)。捕获抗体分子(抗hFcγ)以100μg/ml的浓度5μl/min的流速进行胺偶联20分钟。以10μg/ml的浓度和10μl/min的流速注射HuMabs 30秒。以1.56nM到100nM之间的七种浓度注射切割的hIL-13Rα1分子(M_w40kDa)200秒并用HBS-P洗涤5分钟。通过以10μg/ml的流速两次注射100mM HCl，每次1分钟，完成表面的再生。芯片、测定形式和注射的顺序和动力学数据对应于下面表3中的描述。通过将动力学数据拟合1∶1 Langmuir结合模型计算动力学数据。

表3：

芯片	捕获	配体	分析物	ka(l/Ms)	kd(l/s)	KD(M)
							C1	抗-hFcγ	LC5002-002	hIL-13Rα1	1.1×106	6.5×10-4	6.2×10-10
C1	抗-hFcγ	LC5002-003	hIL-13Rα1	1.3×106	5.1×10-4	3.9×10-10
							C1	抗-hFcγ	LC5002-005	hIL-13Rα1	1.4×106	3.0×10-4	2.2×10-10
C1	抗-hFcγ	LC5002-007	hIL-13Rα1	1.9×105	8.3×10-4	4.4×10-9
							C1	抗-hFcγ	LC5002-005，突变的L234A；L235A	hIL-13Rα1	1.4×106	2.9×10-4	2.1×10-10

c)使用从hIL-13Rα1:hFc嵌合蛋白切割的hIL-13Rα1的细胞外结构域对LC5002-005的重组变体的比较亲和分析

在这些实验中，将来自杂交瘤的最初的IgG1的亲和性与重组变体IgG1-Ala-Ala的亲和性比较。对于相互作用分析，使用Biacore 3000仪器。运行和反应缓冲液为25℃的HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％polysurfactant P，pH 7.4)。捕获抗体分子(抗Fcγ)以20μg/ml的浓度5μl/min的流速进行胺偶联20分钟。以10μg/ml的浓度和10μl/min的流速注射HuMabs。以1.56nM到200nM之间的八种浓度注射切割的hIL-13Rα1分子(分析物)5分钟并用HBS-P洗涤5分钟。通过两次注射100mM HCl，每次1分钟，完成表面的再生。芯片、测定形式和注射的顺序和动力学数据对应于表4中的描述。通过将动力学数据拟合二价分析物结合模型计算动力学数据。

表4：

芯片	捕获	配体	分析物	ka1(l/Ms)	kd1(l/s)	ka2(l/RUs)	kd2(l/s)	KD(M)
									CM5	抗-hFcγ	LC5002-005	hIL-13Rα1	1.33×105	3.6×10-4	5.8×10-3	0.06	2.7×10-9
CM5	抗-hFcγ	IgG1ala-alaLC5002-005	hIL-13Rα1	1.53×105	4.2×10-4	4.1×10-3	0.04	2.8×10-9

实施例14

通过ELISA测试HuMab与hIL-13Rα2和hIL-4Rα的交叉反应性

将嵌合蛋白hIL-13Rα2:hFc和hIL-4Rα:hFc(R&D Systems，UK)溶解在PBS(1μg/ml)中并通过在4℃过夜温育允许吸附到微量滴定板(NUNCMaxisorb)。用洗涤缓冲液(WB＝0.9％NaCl；0.1％Tween20)洗涤平板后，通过加入100μl温育缓冲液(IB＝含有1％crotein C和0.1％Tween20的PBS)并在室温(RT)温育30分钟封闭非特异性结合位点。然后加入连续稀释的HuMab和对照抗体(100μl/孔；IB中稀释液)并在RT温育1小时。再次洗涤平板并通过用IB中1∶500的最终稀释度的过氧化物酶缀合的兔抗人κ(DAKO，Denmark)温育检测结合的抗体。在RT温育1小时和随后的洗涤步骤后，平板在黑暗中RT下用现成可用的ABTS^溶液(RocheDiagnostics GmbH，DE)显色。最高浓度的吸光度达到足够的OD后在405nm测量吸光度。

测试的所有针对IL-13Ralpha1的抗体都能够结合人IL-13Rα1的固定化的细胞外结构域，但是不结合hIL-13Rα2或hIL-4Rα(图4)。

实施例15

HuMab与鼠IL-13Rα1的交叉反应性

将嵌合的蛋白质鼠IL-13Rα1:hFc(R&D Systems，UK)溶解在PBS(1μg/ml)中并通过在4℃过夜温育允许吸附到微量滴定板(NUNC Maxisorb)。用洗涤缓冲液(WB＝0.9％NaCl；0.1％Tween20)洗涤平板后，通过加入100μl温育缓冲液(IB＝含有1％crotein C和0.1％Tween20的PBS)并在室温(RT)温育30分钟封闭非特异性结合位点。然后向孔中加入连续稀释的HuMab和对照抗体(HuMab抗-KLH和多克隆山羊抗-hIL-13Rα1(R&D Systems))(100μl/孔，在IB中的稀释液)并在RT温育1小时。再次洗涤平板，并通过与在IB中1∶500的最终稀释度的过氧化物酶缀合的兔抗人κ(DAKO，Denmark)温育来检测结合的人抗体。通过过氧化物酶缀合的猴抗山羊IgG((Santa Cruz；IB中1∶1000)检测与平板结合的山羊抗hIL-13Rα1抗体。在室温温育1小时和随后的洗涤步骤后，平板在黑暗中RT下用现成可用的ABTS^溶液(Roche Diagnostics GmbH，DE)显色。最高浓度的吸光度达到足够的OD后在405nm测量吸光度(图5)。

实施例16

HuMab与猕猴IL-13Rα1的交叉反应性

通过RT-PCR从猕猴组织分离编码IL-13Rα1的基因并转染到鼠细胞系Ba/F3中。为了测试HuMabs是否与猕猴IL-13Rα1交叉反应，将稳定转染的Ba/F3细胞以及亲本Ba/F3细胞与10μg/ml HuMab和对照抗体温育。使用多克隆的山羊抗hIL-13Rα1(R&D Systems)作为阳性对照。包括的阴性对照为：人IgG1骨髓瘤蛋白(Nordic)和正常山羊血清。使用针对缀合到FITC用于检测HuMabs的人IgG的抗体和针对缀合到FITC用于检测山羊抗体的针对山羊IgG的抗体通过FACS分析检测结合的抗体。对在转染的Ba/F3系和亲本系上测试的各抗体比较平均荧光强度(MFI)。

本发明的所有HuMabs都能够结合在转染的Ba/F3细胞中表达的猕猴IL-13Rα1。如从人和猕猴IL-13Rα1之间的密切同源性预测的，多克隆的AF152抗体也结合猕猴IL-13Rα1。阴性对照当用转染的Ba/F3细胞系测试时仅显示出MFI的可忽略不计(marginal)的增加(表5)。

表5：

	抗体	MFIBa/F3	MFIBa/F3_Cyno_IL-13Rα1	在Cyno_IL-13Rα1存在下MFI的增加倍数
					HuMabs	LC5002-002	3.9	83.7	79.8
LC5002-003	3.4	82.4	79.0
				LC5002-005		14.8	101.5	86.7
LC5002-007	4.1	19	14.9
				对照		AF152	3.2	21.2	18.0
正常山羊IgG	3.3	5.7	2.4
					正常人IgG1(Nordic)	3.5	10.2	6.7
仅抗人IgG-FITC	3.3	5.5	2.2

实施例17

IL-13Rα1 HuMabs对Fcγ受体的结合(NK细胞上FcγRIIIa的结合)

为了测试本发明的抗体结合自然杀伤(NK)细胞上FcγRIIIa的能力，分离外周血单核细胞(PBMCs)并在20μg/ml针对FcγRIIIa的封闭性鼠抗体(抗-CD16，克隆3G8，RDI，Flanders，NJ)的存在或不存在下与20μg/mlHuMab抗体和对照抗体温育，以验证通过FcγRIIIa的结合。使用不结合FcγRIIIa的人IgG2和IgG4(The Binding Site)作为阴性对照。将人IgG1和IgG3(The Binding Site)作为用于FcγRIIIa结合的阳性对照。使用PE标记的小鼠抗人CD56(NK细胞表面标记)抗体(BD Biosciences Pharmingen，SanDiego，CA)组合以FITC-标记的山羊F(ab)2抗人IgG(Fc)抗体(Protosimmunoresearch，Burlingame，CA)通过FACS分析检测NK细胞上结合的抗体。确定20μg/ml(Bmax：MFI±标准误差)HuMab下的最大结合。

如通过580.6±245.8的Bmax(MFI)值所示的，LC5002-005能够有效结合FcγRIIIaI(与对照IgG1抗体相当)。加入针对FcγRIIIa的封闭抗体显著减小LC5002-005与NK细胞的结合(260.4±95.90的Bmax(MFI)值)，表明对FcγRIIIa的特异结合。

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序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司

<120>针对IL-13受体α1的抗体及其用途

<130>22922

<150>EP 05000003

<151>2005-01-03

<150>EP 05002229

<151>2005-02-03

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>119

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-002 VHγ/重链可变结构域

<400>1

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Set Val Ile Ser Gly Arg Gly Ile Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Gly Ser Ser Ser Trp Thr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>2

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-002 VLκ/轻链可变结构域

<400>2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp

            20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                105

<210>3

<211>119

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-003 VHγ/重链可变结构域

<400>3

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Val Ile Ser Gly Arg Gly Ile Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Gly Ser Ser Tyr Trp Thr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>4

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-003 VLκ/轻链可变结构域

<400>4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>5

<211>118

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-005 VHγ/重链可变结构域

<400>5

Glu Val Gln Val Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr

            20                  25                  30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Glu Gly Asp Trp Ile Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

            100                 105                 110

Leu Val Ile Val Ser Ser

        115

<210>6

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-005 VLκ/轻链可变结构域

<400>6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser His Pro Pro

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>7

<211>123

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-007 VHγ/重链可变结构域

<400>7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Glu Gly Glu Thr Leu Asp Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>8

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-007 VLκ/轻链可变结构域

<400>8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

            20                  25                  30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ile Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65                  70                  75                  80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Ser Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>9

<211>119

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-018 VHγ/重链可变结构域

<400>9

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ale Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Gly Ser Ser Trp Tyr Val Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>10

<211>107

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>LC5002-018 VLκ/轻链可变结构域

<400>10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>11

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>11

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1               5                   10                  15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

            20                  25                  30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

        35                  40                  45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

    50                  55                  60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65                  70                  75                  80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

                85                  90                  95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

            100                 105

<210>12

<211>330

<212>PRT

<213>人

<400>12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1               5                   10              15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

            20                  25              30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

        35                  40              45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

    50                  55              60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65                  70              75                      80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                85              90                      95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100             105                     110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115             120                     125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130             135                     140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

PCT/RO/134表

PCT/RO/134表的中文译文

涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示

(PCT细则13bis)

A.以下做出的指示涉及在说明书第 6页第 11-16行(注：中文说明书第 5页第 15-21行)中提及的保藏的微生物或其它生物材料
		B.保藏鉴定    更多的保藏在附页上鉴定□
保藏机构名称德意志微生物保藏中心(DSMZ)
		保藏机构地址(包括邮政编码和国家)Mascheroder Weg 1bD-38124不伦瑞克德国
保藏日期13.01.2005	保藏号DSM ACC2709+
		C.另外的指示(如果不适用留空)  该信息在附页上继续□
关于保藏的生物材料DSM ACC2709，DSM ACC2710，DSM ACC2711和DSMACC2712，涉及专家解决方案的说明
		D.做出指示的指定局  (如果其指示不是针对所有指定局)
CA(加拿大)，EP(欧洲专利局)，SG(新加坡)
		E.指示的单独说明(如果不适用留空)
以下所列指示以后将提交给国际局(规定指示例如“保藏登记号”的一般性质)
		仅供受理局使用□该页与国际申请一起收到	仅供国际局使用□该页于2006年2月27号被国际局接收。
授权官员	授权官员M.FOURNE-GODBERSEN

C.附加指示(附页)

申请人：              霍夫曼-拉罗奇有限公司，等

申请人文件参考号：    22922 WO-SR

国际申请号：          PCT/EP2005/000005

关于说明书引用的保藏生物材料的专家解决方案相关的指示

涉及保藏的生物材料的指示全部包含在说明书中。下列另外的指示不要求是说明书的一部分，并且应当作为“分开的指示”对待。它们仅涉及专家解决方案。

以下作出的另外的指示涉及在说明书第6页(注：中文第5页)中称为：

Hu-MAB<h-IL-13R alpha>LC.5002-002 DSM ACC2709

Hu-MAB<h-IL-13R alpha>LC.5002-003 DSM ACC2710

Hu-MAB<h-IL-13R alpha>LC.5002-005 DSM ACC2711

Hu-MAB<h-IL-13R alpha>LC.5002-007 DSM ACC2712

的保藏的生物材料。

                            另外的指示是：

对于CA(加拿大)指定：

对于加拿大的指定，按照加拿大专利法案专利细则第107和108条规定，只有通过将样品签发给局长提名的独立专家(细则10(4))，直到授予加拿大专利，或直到申请被驳回或被放弃且不再要求恢复、或被撤回的日期，才可以提供保藏的生物材料的样品。

对于EP(欧专局)指定：

关于EPO的指定，按照EPC实施细则的细则28(3)的规定，只有通过将样品签发给请求人提名的专家(细则28(4)EPC)，直到欧洲专利授权通知公开，或者如果申请被驳回或撤回或视撤，直至从申请日起20年，才可以提供保藏的生物材料的样品。

对于SG(新加坡)指定：

申请人由此提请注意，我们意欲根据1995年专利法则目录四的第3段，上述培养物仅可提供给专家。

Claims (20)

1.抗体，其特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR3选自由SEQID NO：1、3、5、7或9的重链CDR3序列组成的组。

2.根据权利要求1的抗体，其特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR1和CDR2选自由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR1和CDR2序列组成的组。

3.根据权利要求1或2的抗体，其特征是所述抗体的可变轻链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3选自由SEQ ID NO：2、4、6、8或10的可变轻链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3组成的组。

4.根据权利要求1到3的抗体，其特征是包含人γ1-重链，该γ1-重链包含

a)氨基酸序列Pro₂₃₃Val₂₃₄Ala₂₃₅，其缺失Gly₂₃₆，和/或氨基酸序列Gly₃₂₇Leu₃₂₈Pro₃₂₉Ser₃₃₀Ser₃₃₁，

b)氨基酸序列Ala₂₃₄Ala₂₃₅或

c)氨基酸Ala₂₆₅和Ala₂₉₇。

5.根据权利要求1到4的抗体，其特征是它是人抗体。

6.根据权利要求1到5的抗体，其特征是它对IL-13Rα1的结合亲和力为10^-9M(K_D)或更小，优选10^-9到10^-13M。

7.根据权利要求1到6的抗体，其从杂交瘤细胞系DSM ACC2709、DSM ACC2710、DSM ACC2711或DSM ACC2712获得。

8.根据权利要求1到7的抗体，其特征是包含作为重链可变区的SEQID NO：1和作为轻链可变区的SEQ ID NO：2，作为重链可变区的SEQ IDNO：3和作为轻链可变区的SEQ ID NO：4，作为重链可变区的SEQ ID NO：5和作为轻链可变区的SEQ ID NO：6，作为重链可变区的SEQ ID NO：7和作为轻链可变区的SEQ ID NO：8，或作为重链可变区的SEQ ID NO：9和作为轻链可变区的SEQ ID NO：10。

9.根据权利要求1到6的抗体，其特征是包含

a)作为重链可变区的SEQ ID NO：1，作为轻链可变区的SEQ ID NO：2，作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12，

b)作为重链可变区的SEQ ID NO：3和作为轻链可变区的SEQ ID NO：4，作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12，

c)作为重链可变区的SEQ ID NO：5和作为轻链可变区的SEQ ID NO：6，作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12，

d)作为重链可变区的SEQ ID NO：7和作为轻链可变区的SEQ ID NO：8，作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12，或

e)作为重链可变区的SEQ ID NO：9和作为轻链可变区的SEQ ID NO：10，作为κ轻链恒定区的SEQ ID NO：11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为γ1重链恒定区的SEQ ID NO：12。

10.根据权利要求1到9的抗体用于生产药物组合物的用途。

11.药物组合物，其包含药学有效量的根据权利要求1到9的抗体。

12.重组宿主细胞，其能够产生根据权利要求1到9的重组抗体。

13.生产包含药学有效量的根据权利要求1到9的抗体的药物组合物的方法。

14.核酸，其编码能够与下面定义的各自另一抗体链一起装配的多肽，其中所述多肽任一个为

a)包含SEQ ID NO：1、3、5、7或9的重链CDR的抗体重链；

b)包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的轻链CDR的抗体轻链，

其中所述CDR相互独立地选择。

15.包含根据权利要求14的核酸的表达载体，其能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。

16.包含根据权利要求15的载体的原核或者真核宿主细胞。

17.产生结合IL-13Rα1并且抑制IL-13与IL-13Rα1的结合的多肽的方法，其特征是在原核或者真核宿主细胞中表达根据权利要求14的编码重链的核酸和编码轻链的核酸并从所述细胞回收所述多肽。

18.治疗需要哮喘或者抗变应性治疗的患者的方法，其特征是对所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1到9的抗体。

19.制备药物组合物的方法，其特征是通过重组表达产生根据权利要求1到9的抗体，回收所述抗体并将所述抗体与药用缓冲剂和/或佐剂组合。

20.杂交瘤细胞系DSM ACC2709、DSM ACC2710、DSM ACC2711或DSM ACC2712。

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