CN101094664A - 对ER－α或－β不具有显著亲和性的某些苯基－萘基化合物在治疗多发性硬化症中保护神经元和少突胶质细胞的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了某些对α或β型雌激素受体(ER)不显示亲合性的SERM－样苯基萘基化合物在治疗多发性硬化症中的新用途。

Description

对ER-α或-β不具有显著亲和性的某些苯基-萘基化合物在治疗多发性硬化症中保护神经元和少突胶质细胞的用途
发明领域
本发明涉及治疗多发性硬化症的方法。具体而言，本发明涉及使用式(I)化合物和结构与之相关的化合物、它们的异构体、外消旋物、对映异构体、它们的盐以及含有它们的药剂来保护多发性硬化症患者的神经元和/或少突胶质细胞。
发明背景
多发性硬化症(MS)是自身免疫性疾病，它导致中枢神经系统(CNS)髓磷脂损失、少突胶质细胞死亡以及轴突破坏，从而引起严重的功能缺陷。MS在女性中的发病率比男性高2至3倍(Duquette等人，1992.Can.J.Neurol.Sci.19：466-71.)，雌激素可在妊娠中三月和末三月降低疾病的严重程度(Confavreux等人，1998.N Eng J Med 339：285-291)，但据报道，出现过在分娩后MS临床症状加剧的情况(Evron等人，1984.Am.J.Reprod.Immunol.5：109-113；Mertin和Rumjanek，1985，J.Neurol Sci.68：15-24；Grossman，1989.J.Steroid Biochem.34：241-245；Confavreux等人，1998，N.Engl.J.Med.339：285-291)。采用雌三醇进行的治疗减小了钆增强的病灶损害以及磁共振成像(MRI)容积(Voskuhl和Palaszynski，2001，Neuroscientist.7(3)：258-270；Sicotte等人，2002，Ann Neurol.52：421-428)。此外，雌激素在啮齿动物EAE(实验性变态反应性脑脊髓炎)模型中引起免疫反应移位、临床症状改善以及髓磷脂形成增加(Curry和Heim，1966，Nature 81：1263-1272；Kim等人，1999，Neurology.52：1230-1238；Ito等人，2002，Clin Immunol.102(3)：275-282)。据报道，雌激素保护少突胶质细胞免受细胞毒性诱导的细胞死亡(Takao等人，2004.J.Neurochem.89：660-673)；并据报道，17β-雌二醇(E2)促进少突胶质细胞上多重的、相互关联过程的进行(Zhang等人，2004，J.Neurochem.89：674-684)。
越来越多的证据显示，在对变性疾病和通过增强细胞存活、轴突生长、再生反应、突触传递以及神经形成所造成的损伤的响应中，雌激素起了直接的保护作用。在中枢神经系统内，雌激素合成增加并且在损伤部位雌激素受体表达增强(Garcia-Segura等人，2001，Prog.in Neurobiol.63：29-60)；雌激素介导的细胞保护作用已在许多神经变性体外模型中被确定，包括β-淀粉状蛋白诱导的细胞毒性、兴奋性神经毒性以及氧化应激(Behl等人，1995，Biochem.Biophys.Res.Commun.216，473-482；Goodman等人，1996.J.Neurochem.66：1836-1844；Green等人，1997，J.Neurosci.17：511-515；Behl等人，1999.Trends Pharmacol.Sci.20：441-444)。最新的临床研究表明，雌激素替代疗法也可能降低风险，并延迟阿尔茨海默症和精神分裂症的发作和发展。(综述参见Garcia-Segura等人，2001，Prog.in Neurobiol.63：29-60)。能穿过血脑屏障的亲脂性激素E2维持了脑系统在下起作用(sub-serving)的觉醒、注意力、情绪以及认知能力(Lee和McEwan，2001.Annu.Rev.Pharmacol.&Toxicol.41：569-591)。此外，天然雌激素和合成的选择性雌激素受体调节剂(SERM)如他莫昔芬均减少缺血性中风造成的神经损伤，而E2或雷洛昔芬则保护神经元抵抗1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的毒性(Callier等人，2001，Synapse 41：131-138；Dhandapani和Brann，2003，Endocrine 21：59-66)。
雌激素的神经保护作用通过bcl-2表达的调控、cAMP和促细胞分裂剂激活的激酶信号传导途径的激活、细胞内钙稳态的调控、抗氧化剂活性的增强和/或可作为激素调节性转录因子的雌激素受体(ER)的激活而介导(Mangelsdorf等人，1995.Cell 83：835-839；Katzenellenbogen等人，1996.Mol.Endocrinol.10：119-131；Singer等人，1996.Neurosci.Lett.212：13-16；Singer等人，1998.Neuroreport 9：2565-2568；Singer等人，1999.Neurosci.Lett.212：13-16；Weaver等人，1997.Brain Res.761：338-341；Watters和Dorsa，1998.J.Neurosci.18：6672-6680；Singh等人，1999.J.Neurosci.19：1179-1188；Alkayed等人，2001.J.Neurosci.21：7543-7550；Garcia-Segura等人，2001.Prog.in Neurobiol.63：29-60)。两种经鉴定的雌激素受体ERα和ERβ均属于I类激素受体家族，该家族作为核转录因子起作用。ERα和ERβ(mRNA或蛋白质形式)表达于各种神经细胞内，包括施万细胞(即周围神经系统的髓磷脂形成细胞)、中枢神经系统神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞(Miranda和Toran-Allerand，1992；Santagati等人，1994；Kuiper等人，1996；Mosselman等人，1996；Thi等人，1998；Platania等人，2003)。在少突胶质细胞(即在MS中损失的中枢神经系统中髓磷脂形成细胞)中，ERα被报道为是细胞核的，而ERβ是细胞质的，并可容易地检测到细胞质和髓鞘内的体内免疫反应性(Zhang等人，2004.J Neurochem 89：674-684)。最近，Arvanitis等人，2004(J Neurosci Res.75：603-613)报导了存在于分离的CNS髓磷脂、脊髓和脑部的髓鞘以及少突胶质细胞的细胞膜中的与ERβ类似的ER。
借助于为ERβ的配体的小分子或在不同于传统ERα的位点上优先模拟雌激素作用的化合物来模拟和/或增强雌激素在MS中的有益作用有可能在MS的治疗中有益处，因为小分子将避免不希望的由ERα介导的雌激素的“激素”作用。这些其它ER位点可包括最近鉴定的ER-X，其在神经元中被鉴定出并在发育上受到调控(Toran-Allerand 2004，Endocrinology 145：1069-1074)；或GPR30，它允许雌激素触发将细胞表面信号与基因转录整合的不同途径(Kanda和Watanabe 2003，J.Invest.Derm.121：771-780)。
这些化合物也可用于治疗或预防其它脱髓鞘疾病、包括沙-马-图病、佩-梅病、脑脊髓炎、视神经脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、吉-巴综合症以及其中髓磷脂形成胶质细胞(少突胶质细胞或施万细胞)被破坏的疾病、包括脊髓损伤、神经病和神经损伤的发展。
发明概述
本发明的主题是某些对α或β型雌激素受体(ER)不显示亲合性的SERM-样苯基萘基化合物在治疗多发性硬化症中的新用途。
广义而言，用于本发明的治疗的化合物具有通式(I)结构：
其中n是0或1；R1代表含有1至4个碳原子的烷基或氢原子；R2代表含有1至4个碳原子的烷基或氢原子；R3代表氢原子，卤素原子，含有1至4个碳原子的烷基，-NRARB基团且其中RA和RB相同或不同并代表氢原子或含有1至4个碳原子的烷基，NO2，5-或6-元环基或杂环基，或含有1至4个碳原子的烷氧基；R4代表氢原子，卤素原子，羟基，含有最多4个碳原子的烷基、链烯基或炔基，烷氧基或烷硫基且其中烷基含有1至4个碳原子，或-NRARB基团且其中RA和RB为碳原子；
其异构体、外消旋物和对映异构体以及所述化合物的可药用盐。
当R1、R2、R3、R4、RA和RB代表含有1至4个碳原子的烷基时，其为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基。当R3和R4是卤素原子时，其为氟、氯、溴或碘。优选其为氯。当R4是含有最多4个碳原子的链烯基时，优选其为乙烯基或丙烯基。当R4是含有最多4个碳原子的炔基时，优选其为乙炔基或丙炔基。当R3或R4代表含有1至4个碳原子的烷氧基时，优选其为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或丁氧基。当R4是含有1至4个碳原子的烷硫基时，优选其为甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基或丁硫基。当R4是NRARB基团且其中RA和RB相同或不同并代表氢原子或含有1至4个碳原子的烷基时，优选R4是氨基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基或甲基乙基氨基。
自然，本发明还延伸至式(I)化合物的盐的用途，尤其是当式(I)化合物含有氨基官能团时。它们是例如与下列酸所形成的盐：盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、乙酸、甲酸、丙酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、乙醛酸、天冬氨酸，以及烷基磺酸如甲磺酸和乙磺酸，芳烃磺酸如苯磺酸和对甲苯磺酸，以及芳基羧酸。
它们也可以是在碱、碱金属或碱土金属的作用下而形成的盐，以生成例如诸如醇钠或醇钾的衍生物或者诸如酚钾或酚钠的衍生物。
本发明的优选实施方案是化合物、例如如上定义的式(I)化合物的用途，所述化合物选自：
5-[4-(2-二乙氨基-乙氧基)-苯基]-6-(4-羟基-苯基)-萘-2-酚，
Figure A20058004544500081
6-(4-羟基-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苄基]-萘-2-酚盐酸盐，
5，6-二-(4-羟基-苯基)-萘-2-酚
Figure A20058004544500083
1，5-二氯-6-(4-羟基苯基)-2-萘酚
4-(6-羟基甲基-萘-2-基)-苯酚
Figure A20058004544500091
3-(4-甲氧基苯基)-1-萘酚
Figure A20058004544500092
5-氯-6-(4-羟基苯基)-2-萘酚
5-溴-6-(4-羟基苯基)-2-萘酚，和
Figure A20058004544500094
6-(4-羟基-苯基)-2-萘酚
Figure A20058004544500095
含有一个或多个不对称中心的式(I)化合物具有异构形式；这些异构体和混合物构成了本发明的一个部分。这些化合物的外消旋物和对映异构体也构成了本发明的一个部分。
在本发明的方法中所用的式(I)化合物可通过本领域已知的合成方法来制备，例如美国第6,147,119号专利所公开的那些方法。
本文所用的术语具有本说明书所定义的含义。
a)“可药用盐”指任何可能用本发明的化合物制备的酸加成盐或碱加成盐。
“可药用的酸加成盐”指碱性式I化合物的任意无毒性的有机或无机酸加成盐。可形成适宜盐的解释性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸以及酸式金属盐，例如正磷酸氢二钠和硫酸氢钾。可形成适宜盐的解释性有机酸包括一元、二元和三元羧酸。这类酸的解释性实例有乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、对甲苯磺酸，以及磺酸如甲磺酸和2-羟基乙磺酸。可以形成一元酸盐或二元酸盐，这类盐可以以水合形式或基本上无水的形式存在。通常这些化合物的酸加成盐较易溶于水和各种亲水有机溶剂，并且与它们的游离碱形式相比，通常显示出较高的熔点。
“可药用的碱加成盐”指式(I)化合物的无毒性的有机或无机碱加成盐。其实例有碱金属或碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡；氨以及脂肪族、脂环族或芳香族有机胺，例如甲胺、三甲胺和甲基吡啶。选择适当的盐可以是重要的，以便使得酯不发生水解。对适当盐的选择标准是本领域技术人员已知的。
b)“患者”指温血动物，例如大鼠、小鼠、狗、猫、豚鼠以及灵长类如人类。
c)“治疗”指任何形式的治疗，包括但不限于暂时地或永久地减轻症状、消除症状的起因，或者预防或减慢症状的出现和所述疾病或病症的发展。
d)“治疗有效量”指有效治疗所述疾病或病症的化合物的量。
e)“可药用载体”是无毒性的溶剂、分散剂、赋形剂、佐剂，或与本发明的化合物混合以形成医药组合物、即能够施用于患者的剂量形式的其它材料。这类载体的一个实例是通常用于胃肠道外给药的可药用油。
f)“立体异构体”是对区别仅在于原子空间取向不同的单独分子的所有异构体的通称。它包括镜像异构体(对映异构体)、几何异构体(顺式或反式)、以及具有一个以上手性中心的化合物的相互不为镜像的异构体(非对映异构体)。
在治疗患有上述某种病症的患者时，式(I)化合物可以通过任意使得治疗有效量的化合物是生物可利用的形式或模式施用，包括经口、舌下、含服、皮下、肌内、静脉内、透皮、鼻内、直肠、局部等形式或模式。根据针对所治疗病症或疾病而选择的化合物的具体性质、疾病阶段、患者的状况以及其它有关情况，制药领域的熟练技术人员能够决定恰当的给药形式和模式。例如参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack出版公司(1990)，其引入本文作为参考。
本发明的医药组合物可经口施用，例如以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、溶液、糖浆、糯米纸囊剂、咀嚼胶等形式施用，并且可以含有一种或多种下列佐剂：粘合剂，例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，例如胶体二氧化硅；以及甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味香精。当剂量单位形式是胶囊时，其除了上述类型的材料外还可含有液体载体，例如聚乙二醇或脂肪油。其它单位剂量形式还可含有能改变剂量单位的物理形式的其它各种材料，例如包衣。因此，片剂或丸剂可包有糖衣、虫胶或其它肠包衣材料。除了本发明的化合物外，糖浆剂还可含有作为甜味剂的蔗糖以及某些防腐剂、染剂、色素和矫味剂。
本发明的式(I)化合物也可以用于局部给药，在这种情况下，载体可适宜地包括溶液、软膏或凝胶基质。所述基质可例如包含一种或多种凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和酒精，以及乳化剂和稳定剂。
溶液或混悬液也可包含一种或多种下列佐剂：无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐水、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苄醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节渗透压的物质，例如氯化钠或葡萄糖。胃肠道外制剂可被封在安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶内。
根据具体的化合物、病症的严重程度、患者、配方、患者所患的其它潜在疾病以及可共同施用于患者的其它药物，式(I)化合物呈现其治疗能力的剂量范围将有所不同。一般而言，式(I)化合物将于约0.001mg/kg患者体重/日至约100mg/kg患者体重/日的剂量范围呈现其治疗活性。
本文所讨论的所有出版物和专利的内容由此引入本文作为参考。
神经保护测定
将来自人成神经细胞瘤细胞系的SK-N-SH细胞按50,000个细胞/孔铺在Costar Biocoat 96孔涂有聚D-赖氨酸的平板上，培养基为含有青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸和碳酸氢钠的EMEM(含有Earle盐的Eagle最低限度必需培养基)。细胞在含5％CO2的37℃培养箱中培养过夜。第二天，除去培养基，换上新鲜培养基。细胞用SERM预处理1小时，加入SIN-1(3-吗啉代基斯德酮亚胺(sydnonimine)，产生过氧亚硝酸根离子)，得到终浓度为2或10mM。24小时后，移去培养基，采用Promega cytotox 96试剂盒(目录号G1780)分析LDH活性。计算结果，以抵抗SIN-1毒性的保护％表示。
ERK1/2 WESTERNS印迹法
将SK-N-SH细胞按2×106个细胞/孔铺在6孔聚苯乙烯培养板上，培养基为2ml含有青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸和碳酸氢钠的EMEM。细胞在5％CO2和37℃条件下培养过夜。
第二天，除去200μl培养基，向细胞中加入200μl浓度高达培养基中终浓度10倍的化合物。培养适当时间后，抽吸掉培养基，用冷PBS洗涤细胞两次。然后将细胞用100μl含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液溶解。
对于western印迹法，将20μg蛋白质在95℃下、在含有β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中进行变性处理，然后加载到梯度为4-20％的Tris甘氨酸SDS凝胶上并在70伏电压下进行电泳至完全。蛋白质被转移到硝基纤维素膜上，采用适当的抗体探测磷-ERK1/2和总ERK1/2。采用ECLwestern印迹化学发光底物检测色带。磷-ERK ELISA使用Assay Designs公司的ELISA试剂盒。
Bcl-2 荧光素酶
将SK-N-MC Bcl-2(neo)克隆218按25,000个细胞/孔铺在PackardView平板上，培养基为含有青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、碳酸氢钠以及200ug/ml G418的不含酚红的EMEM。细胞在含5％CO2的37℃培养箱中培养过夜。
第二天，除去培养基，并换成含有ITS补充剂的无血清EMEM(BDBiosciences#35 4352)。第三天和第四天再次更换培养基；第四天时，向细胞中加入化合物，最终体积为100μl。加入化合物24小时后，加入100μlSteadyGlo(Promega#E2510)，并在Packard Topcount液体闪烁计数器中测量荧光素酶。
少突胶质细胞毒性分析
从出生2-3天后的大鼠(Sprague Dawley)的大脑获取原代大鼠少突胶质细胞祖细胞。移去脑脊膜，以机械方式剥离组织。将细胞铺在T75烧瓶中并用DMEM+10％FBS喂养。
通过机械分离法从星形胶质细胞单层收集浓缩的OLP，在补充有促细胞分裂剂PDGF-AA(10ng/ml)和FGF-2(10ng/ml)的无血清培养基(SFM)中扩展。
为了产生成熟的少突胶质细胞，在培养24小时后将祖细胞转移至补充有IGF-1(10ng/ml)的SFM中，使细胞在这些条件下生长7天，然后进行实验分析。
将细胞铺在96孔板上，每孔10,000个细胞。将培养基换为新鲜培养基，细胞用化合物预处理1小时。加入毒素，得到下列终浓度：
Sin-1 10mM
邻苯三酚500μM
C2神经酰胺100μM
喜树碱10μM
24小时后，移去培养基并采用Promega cytotox 96试剂盒(产品目录号G1780)分析LDH活性。计算结果，以对抗毒素诱导的毒性的保护％表示。
评估了这些化合物抵抗毒性物质如SIN-1(3-吗啉代基斯德酮亚胺，产生过氧亚硝酸根离子)、C2神经酰胺、喜树碱、星孢菌素、SNAP(S-亚硝基-N-乙酰青霉胺，可产生氧化氮)以及邻苯三酚(产生超氧阴离子)造成细胞死亡的神经保护功效。体外评估的靶细胞是：人成神经细胞瘤细胞系[SK-N-SH，SH-SY5Y]以及啮齿动物少突胶质细胞祖细胞的初级培养物以及它们的成熟副本。将这些化合物的保护作用与17-β-雌二醇和他莫昔芬进行比较(见下表1)。通过采用经典的核(基因组)ERα或β以及对MAPKp40/p42(ERK1/2)磷酸化的作用的评估，研究了该神经保护作用的作用机理。
表1
Figure A20058004544500141

Claims (3)

1.通过保护它们的神经元或少突胶质细胞治疗多发性硬化症患者的方法，该方法包括给多发性硬化症患者施用治疗有效量的式(I)化合物或结构与之相关的化合物、它们的异构体、外消旋物和对映异构体以及所述化合物的可药用盐，
Figure A2005800454450002C1
其中n是0或1；R1代表含有1至4个碳原子的烷基或氢原子；R2代表含有1至4个碳原子的烷基或氢原子；R3代表氢原子，卤素原子，含有1至4个碳原子的烷基，-NRARB基团且其中RA和RB相同或不同并代表氢原子或含有1至4个碳原子的烷基，NO2，5-或6-元环基或杂环基，或含有1至4个碳原子的烷氧基；R4代表氢原子，卤素原子，羟基，含有最多4个碳原子的烷基、链烯基或炔基，烷氧基或烷硫基且其中烷基含有1至4个碳原子，或-NRARB基团且其中RA和RB为碳原子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自：
5-[4-(2-二乙氨基-乙氧基)-苯基]-6-(4-羟基-苯基)-萘-2-酚，
6-(4-羟基-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苄基]-萘-2-酚盐酸盐，
5，6-二-(4-羟基-苯基)-萘-2-酚，
5-氯-6-(4-羟基苯基)-2-萘酚，
5-溴-6-(4-羟基苯基)-2-萘酚，
1，5-二氯-6-(4-羟基苯基)-2-萘酚，
6-(4-羟基-苯基)-2-萘酚，
4-(6-羟基甲基-萘-2-基)-苯酚，和
3-(4-甲氧基-苯基)-1-萘酚。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述有效量每日施用，为约0.001至约100mg/kg患者体重/日。
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