CN101072508B - 奶的生产方法 - Google Patents
奶的生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101072508B CN101072508B CN200580038762XA CN200580038762A CN101072508B CN 101072508 B CN101072508 B CN 101072508B CN 200580038762X A CN200580038762X A CN 200580038762XA CN 200580038762 A CN200580038762 A CN 200580038762A CN 101072508 B CN101072508 B CN 101072508B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- milk
- antibody
- lipase
- serum
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
- A23C9/158—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives containing vitamins or antibiotics
- A23C9/1585—Antibiotics; Bacteriocins; Fungicides from microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C2230/00—Aspects relating to animal feed or genotype
- A23C2230/15—Animal milk with modified composition due to manipulation of the animal, e.g. animal milk comprising antibodies, selection of animals having specific genotypes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
改进奶半衰期的方法,包括:a)奶与抗体接触,所述抗体针对如下至少一种:i)对能够缩短奶的半衰期的至少一种微生物生存所必需的分子;ii)对能够缩短奶的半衰期的至少一种微生物生长所必需的分子;iii)对能够帮助其它微生物缩短奶的半衰期的至少一种微生物的生存所必需的分子;iv)对能够帮助其它微生物缩短奶的半衰期的至少一种微生物的生长所必需的分子。
Description
发明领域
本发明涉及一种改进奶产品半衰期的方法。尤其地,它涉及一种生产有较长保质期的奶的方法。
背景技术
奶产品的变质可能由很多原因所导致。奶产品可能由于使用外国材料作为包装材料或容器,而与产品发生反应导致化学变化而发生变质。牛油类的脂肪常遭受腐败,这是由用于分解脂肪内的脂肪酸,使之成为更小分子不导致增重的脂肪酸,同时,释放某种气味的化学反应而造成的。
像其他食品一样,奶产品自然地受到微生物的污染。为了保持活性微生物的数量尽可能低,人们发展了一些物理上除掉微生物细胞的方法——例如通过改进卫生设备,加热和控制温度。冷藏也延长了奶产品变质的时间。
奶产品的另一个变质的原因是奶成分被包括脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipases,LPLs)和金属蛋白酶(metalloproteases)在内的酶所降解。酶是所有活的物体产生的化学物质,细菌产生酶来分解食物,这帮助细菌进入营养物质并在环境中扩散。
至于脂蛋白脂肪酶(LPLs),则通过所述过程水解奶脂肪并散发恶臭。脂蛋白脂肪酶(LPLs)能被失活,然而一些细菌性脂蛋白脂肪酶(LPLs)是耐热性的。耐热性脂蛋白脂肪酶(LPLs)是酸败的主要原因(Cousin,1982)。
发明摘要
本发明的首要方面,提供了一种改进奶,加工的奶产品,浓缩液等的半衰期的方法。尤其地,提供一种改进奶保质期的方法。
根据本发明方法的第一个方面,包括如下步骤:制备能缩短奶半衰期或能帮助其它微生物缩短奶半衰期的至少一种微生物中存活或生长所必需的分子的抗体,并使之与奶进行接触。所述抗体,有希望在接触奶时,与所述分子形成一种抗体-抗原反应并且会消耗,移除或阻止所述分子成为所述微生物的营养源或者阻碍所述分子的活性。一类这种抗体是来自荧光假单胞菌(PseudomonasFluorescens)的脂蛋白脂肪酶(LPLs)产生的抗体。
根据本发明方法的第二个方面,包含如下步骤:诱导动物乳腺产生至少一种抗体,所述抗体是由能缩短奶半衰期或能帮助其它微生物缩短奶半衰期的至少一种微生物的存活或生长所必需的分子制备得到的抗体。
根据本发明的第三个方面,提供了一种制造含有抗体的奶的方法,所述方法包含如下步骤:根据上述方法诱导抗体,然后收集并随意处理哺乳动物产生的含有抗体的奶。所述奶的收集采用正常的奶处理过程即为有效。
根据第四方面,本发明提供一种改进了保质期的奶产品,所述奶产品根据上述任何一种方式制备,并且由所述方法制备得到的奶被加工成奶产品。本发明也提供了一种改进了保质期的奶产品,所述产品是一种保质期通过添加由能缩短奶半衰期或能帮助其它微生物缩短奶半衰期的至少一种微生物中存活或生长所必需的分子制备得到的抗体来改进的奶产品或其衍生物。
本发明的其它目的,特征,和优点,可以在上述具体描述中,和下述优选实施例的具体描述中体现。
附图的简要描述
图1是由于接种在动物腹股沟区域的染料迁移造成的乳房上的乳腺被染成蓝色的照片(照片由默多克大学的解剖学系教授Martin CAKE提供);
图2是山羊的鼻内免疫的照片;
图3是在绵羊腹股沟内根据本发明的一个方面植入抗原释放装置的照片;
图4显示绵羊体内图3的植入的抗原释放装置的位置;
图5是用来植入抗原释放装置的设备的示意图;
图6显示抗原释放装置内的脂肪酶根据本发明的一个方面扩散到奶琼脂盘的照片。随着酶从管孔中扩散开,它水解奶琼脂内的脂质,明显地在棒管周围形成暗色区带。脂肪酶蛋白是用来模拟本发明的发展的抗原。
图7是用各种方法免疫山羊得到的羊奶内的抗脂肪酶抗体的水平的图表。采用各种方法免疫山羊得到的羊奶内的抗脂肪酶抗体的水平。每种方法下两种动物的平均吸收值被分成28天。最大抗体水平通过抗原释放装置(CRD)和肌肉注射的方式得到。
图8显示在两种被分别植入抗原释放装置(ARD)和给予肌肉注射的动物体内的各自抗脂肪酶抗体吸收水平的图表;两种被分别植入抗原释放装置(CRD)和给予肌肉注射的动物体内的抗脂肪酶抗体水平。该两个结果突出了免疫过程的繁殖的自然属性。
图9显示通过各种方法免疫的山羊血清内的抗脂肪酶抗体的水平的图表;每种方法下两种动物的平均吸收值被分成28天。
图10显示通过抗原释放装置(ARD)和肌肉注射免疫山羊得到羊奶中(◆)和血清中(■)的平均抗脂肪酶抗体水平的比较。
图11显示植入抗原释放装置的山羊羊奶中(◆)和血清中(■)产生的抗脂肪酶抗体的图表。羊奶中的抗脂肪酶抗体水平和血清中没有观察到含有抗脂肪酶抗体说明植入腹股沟区域的抗原释放装置内的抗原扩散进入了乳房上的淋巴结;
图12显示接种山羊的奶中的IgG、IgA和IgM的水平的图表。两组动物在0,10和19天的时候,在不同部位(组1(G1)在侧腹而组2(G2)在靠近乳房上淋巴结的区域)进行接种。采用ELISA方法判断IgG,IgA和IgM的相对水平。与组1的动物相比,在组2动物的奶中的所有这三类免疫球蛋白的水平都更高;
图13显示在玻璃载玻片上的羊奶琼脂的扩散试验的照片揭示抗脂肪酶抗体抑制了脂肪酶分解脂肪的活性。载玻片1:在孔中加入PBS或生理盐水。载波片2:5mg/ml来自荧光假单胞菌(P.fluorescens)的脂肪酶。载波片3:5mg/ml脂肪酶的抗体阴性血清溶液(1:1稀释)。载波片4:5mg/ml脂肪酶的抗脂肪酶抗体阳性血清溶液(1:1稀释)。
图14显示扩散试验的照片,揭示了在1%琼脂1%奶的条件下,抗脂肪酶抗体对脂肪酶分解脂肪的活性的抑制效果。孔1:1:1预采血的血清和PBS的溶液。孔2:1:1预采血的血清和脂肪酶的溶液。孔3:2.5mg/ml脂肪酶。孔4:1:1抗脂肪酶血清(38天)和PBS的溶液。孔5:1:1抗脂肪酶血清(38天)和脂肪酶。孔6:0.85%PBS。
图15显示比较抗脂肪酶抗体和非脂肪酶抗体的抑制活性图。脂肪酶的抗体在两种不同动物(X0247和X0248)的血清中培养。这些抗脂肪酶抗体阳性血清与来自4种动物的非脂肪酶抗体阳性血清比较。所有含有血清的板中仅孔5含有以1:1稀释的含有脂肪酶的不同抗体的血清溶液;
图16显示在含有抗脂肪酶抗体的血清8种稀释液中培养的羊奶的pH值的图表,揭示pH值随着抗体浓度的降低而改变,说明血清中的抗体有剂量反应。阳性对照(仅脂肪酶无血清)和阴性对照(仅生理盐水或PBS)也用来一同比较。在实验开始之前和培养1个小时之后测定羊奶的pH值。在1:2和1:5的稀释度时,pH变化最小。随着抗体浓度的降低,pH变化变得明显,说明血清中的抗体有剂量反应;
图17显示在无抗脂肪酶抗体的血清中培养的羊奶的pH值图表。经过一段时间培养(1小时)之后pH值的改变说明羊奶中的脂肪酶正在水解脂肪;
图18显示含有抗脂肪酶抗体的羊奶的pH值和37℃1个小时内脂肪酶的不同水平的图表。对含有高抗体水平的血清而言,pH值没有显著变化,这说明抗脂肪酶抗体抑制脂肪的水解。相反,与带有少量(或无)抗脂肪酶抗体的羊奶的同样比较说明脂肪的水解;
图19显示羊奶中脂肪被脂肪酶(LPL)水解导致随着自由脂肪酸的减少(◆)pH值也降低的图表。血清的脂肪酶抗体降低脂肪酸的速率。pH降低的速率依赖于剂量。与抗体(◆)浓度较高(1000μl)时相比,在抗体(■)浓度(500μl)较低时降低的速率更快;
图20显示通过血清抗脂肪酶抗体对脂肪水解依赖剂量的抑制的图表。羊奶被脂肪酶(LPL)“穿刺”。3种不同浓度的抗脂肪酶抗体被添加并与2种没有任何抗体的羊奶比较(◆:PBS;■:抗体阴性血清)。通过最低抗体浓度(◆:240μl)的pH值变化测得的水解曲线与无抗体情况下的测试相似,说明缺乏抗体能抑制酶。在较高抗体浓度(500μl和1000μl)时,水解形态和速率不同是由抗体的抑制效果导致的;
图21显示在有和无抗脂肪酶抗体的羊奶中的脂肪水解的图表。抗脂肪酶对脂肪酶活性的抑制作用在10℃经过11天来评估。结果显示抗脂肪酶抗体能够抑制脂肪的水解(◆,▲)。然而,有证据显示酸败机制在10℃时最旺盛。无论是在含有抗体,不含抗体或含有生理盐水(PBS)的情况下,pH值的变化速率是相似的。
图22显示在含有或不含有抗脂肪酶抗体的羊奶中的脂肪水解图表。通过4℃经过13天的间隔测量pH值的改变来检测在含有或不含有抗脂肪酶抗体时脂肪被脂肪酶的水解的情况。抗体阳性实验(◆)的pH值在这13天内保持不变。抗体阴性试验以及生理盐水(PBS)阴性对照(分别为▲和■)的pH值在大约第6天时开始降低。曲线的形状发生改变,说明与羊奶变质有关的动力学的可能有差异。
发明描述
概述
本领域技术人员会感激,本发明在此处描述的内容与那些特别描述的不同,均容许改变和修改。应该理解,本发明包括所有此类改变和修改。本发明也包括涉及或在本说明书中描述的所有步骤,特征,合成物和化合物,单独或集合的任何和所有组合物或任何两个或更多的步骤或特征。
本文中引用的任何文件,参考书目,专利申请或专利都是作为参考,这意味着它们应该被作为本文的一部分进行阅读和考虑。本文中引用的文件,参考书目,专利申请获专利并非仅出于简洁的原因而在本文中重复。
本发明不限于这里描述的特定实施例的范围,所述实施例仅是为了举例而存在。
功能相当的产品,合成物和方法明显都属于这里描述的本发明的范围。
通过详细说明,缩写CRD和ARD可以互换使用。都指代这里描述的,公开的和要求权利的抗原释放装置。
整个具体描述,除非内容需要,否则单词“包含”,或类似“包含着”或“正包含”,都表示包含一定的整数或整数集合而不排除任何其他的整数或整数集合。
这里所选用的术语的其他定义可能在本发明和应用的描述中找到。除非由不同方式定义,这里采用的所有其他科学的和技术术语都与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相一致。
本发明的具体描述
本发明基于通过接触由假单胞菌种(例:荧光假单胞菌)产生的脂蛋白脂肪酶的抗体这一项偶然的发现。可能产生与普通巴氏灭菌比较,拥有改良属性和保质期的奶产品。
本发明的第一方面提供一种改进奶的半衰期的方法,包括如下步骤:
a)奶与抗体接触,所述抗体针对如下至少一种:
i)对能够缩短奶的半衰期的至少一种微生物生存所必需的分子;
ii)对能够缩短奶的半衰期的至少一种微生物生长所必需的分子;
iii)对能够帮助其它微生物缩短奶的半衰期的至少一种微生物的生存所必需的分子;
优选地,本方法也能延长奶的保质期。
希望得到的抗体,当与奶接触时,能与所述分子发生抗体-抗原反应并且能耗尽,移动或阻止所述分子成为微生物的营养源或阻碍分子的活性。该类抗体是一类针对来自假单胞菌种(如:荧光假单胞菌)的脂蛋白脂肪酶的抗体。
本发明的方法应用于由哺乳动物产生的奶。优选地,生产奶的哺乳动物为啮齿动物或反刍动物。更优选的,所述哺乳动物为山羊,绵羊或牛。尽管哺乳动物是乳牛品种最佳;但产奶的山羊或绵羊品种也能采用。
这里使用的术语“奶”指哺乳动物产生的乳汁或初乳或任何全脂奶的衍生物,如液体或固体形态的脱脂乳或乳清。
这里使用的术语“抗原”指任何能够在处理过的哺乳动物体内引起抗体反应的物质,所述抗体能连接一种分子,该分子是为能缩短奶的半衰期或帮助其它微生物缩短奶的半衰期的至少一种微生物生存和/或生长所必需的分子。本发明采用的抗原性物质包括,但不仅限于:来自假单胞菌种荧光细菌(如假单胞菌)的脂蛋白脂肪酶和金属蛋白酶。半抗原和多肽作为抗原来使用首先要通过本领域技术人员普遍知道的化学方法与类似蛋白这样的载体物质相连。(Hanly等;多克隆抗体制备方法的评论,ILAR期刊(1995),37:3,93-118)。
被用于本发明的方法的抗体分子包括完整的免疫球蛋白分子,基本完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的包含抗体决定簇的部分。所述含有抗体决定簇的部分包括本领域公知的Fab,Fab’,F(ab’)2和F(V)。Fab和F(ab’)2。抗体的这些部分通过采用公知的方法分别在基本完整的抗体上由木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反应来制备得到。以美国专利号4,342,566为例。Fab’抗体部分同样是公知的并且通过用巯基乙醇还原F(ab’)2部分的两条重链之间的二硫键,并由碘代乙酰胺类试剂烷化前述步骤得到的蛋白硫醇而得到。包含完整抗体分子的抗体是优选的,并在这里采用。
本发明的第二方面,提供一种改良奶的半衰期的方法,包括如下步骤:
a)在动物的乳腺中诱导产生至少一种抗体,所述抗体针对如下至少一种:
i)对能够缩短奶的半衰期的至少一种微生物生存所必需的分子;
ii)对能够缩短奶的半衰期的至少一种微生物生长所必需的分子;
iii)对能够帮助其它微生物缩短奶的半衰期的至少一种微生物的生存所必需的分子;
iv)对能够帮助其它微生物缩短奶的半衰期的至少一种微生物生长所必需的分子。
优选地,所述方法同样延长奶的保质期。
诱导奶产生抗体的方法包括如下步骤:在至少一个乳房上的淋巴结附近或内部植入至少一种抗原释放装置,使用时抗原释放装置在乳房上的淋巴结周围的组织区域释放一种抗原,刺激抗体分泌物进入乳腺。
根据本发明的这一方面,向乳房上的腺体植入的距离至少要足够近到使抗原释放装置释放的抗原能激起哺乳动物(植入到的)的抗体反应维持一定的水平从而使得乳汁产生的抗体达到有效治疗效果或抗菌性的水平。例如,ARD可以植入(牛、羊等的)乳房。可选地,抗原释放装置优选植入离至少一个乳房上的淋巴结距离远至150mm处,使用时抗原释放装置朝乳房上的淋巴结周围的组织区域释放一种抗原,刺激抗体分泌物进入乳腺。优选地,抗原释放装置植入在靠近或在离乳房上淋巴结大约在1mm和100mm之间距离处。最优选地,距离在50mm和100mm之间。
抗原释放装置的植入靠近或位于至少一个乳房上淋巴结内导致抗原释放装置内含抗原朝淋巴结附近和淋巴结内的组织区域释放(图1)。这反过来刺激淋巴结产生针对抗原的抗体。这些抗体被分泌到乳腺从而进入哺乳动物的乳汁。
抗原释放装置的尺寸,特性和选择根据已选抗原的尺寸和性质来定。希望抗原释放装置的选择能够让内含的抗原从所述装置内以能维持在期望水平从而导致被植入的哺乳动物产生抗体反应的速度释放。
慢释放化合物的装置在,例如,美国专利号3,279,996中被描述,同时维持抗原释放的免疫增强装置在,例如,澳大利亚专利号740133中被描述。
充满有益物质的多孔硅注入在专利号DE69917625D中被描述。一种分子递送的可植入装置在美国专利号6,716,208中被描述。其他持续释放准备物的适当例子包括含有蛋白的固态防水性聚合物的半透膜,所述膜是以有形物质的形式存在,例如,薄膜,或压缩成递送装置的微缩胶囊。持续释放膜的例子包括聚合物,水凝胶[例如,Langer等在生物医学材料研究期刊15:167-277(1981)和Langer在化学技术12:98-105(1982)中描述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸盐)(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))或聚(乙烯基醇)(poly(vinylalcohol))],聚交酯(美国专利号3,773,919,EP58,481),L-谷氨酸(L-glutamic acid)共聚物和γ乙烷-L-谷氨酸酯(gammaethyl-L-glutamate)(Sidman等,生物聚合物22:547-556[1983]),无降解乙烯-乙烯基醋酸盐(non-degradable ethylene-vinyl acetate)(Langer等,如前),可降解乳酸-乙醇酸(lactic acid-glycolic acid)共聚物,如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮丙瑞林组成可注射微滴),和聚-D-(-)-3羟基丁酸(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid(EP133,988)),另外的参考是B.Baras,M.A.Benoit&J.Gillard(2000)“影响抗原从喷雾干燥的聚(DL-交酯)微粒(poly(DL-lactide))中释放的参数”。国际制药学期刊,200:133-145。
当如乙烯-乙烯基醋酸盐(ethylene-vinyl acetate)和乳酸-乙醇酸(lacticacid-glycol ic acid)类的聚合物保证分子释放超过100天,某种水凝胶释放蛋白的时间周期较短。当装入胶囊的抗原在体内维持较长时间时,可能会在37℃时由于暴露在水份中而变性或聚合,导致生物活性的丧失及免疫原性可能会改变。
能够想到针对所述机理的抗体稳定化的合理方法。例如,如果发现聚合机制是由于硫-二硫键交换导致的分子间SS或二硫键造成的,稳定化可以通过修改硫氢残基,酸性溶液的亲水化,控制水份含量,采用合适的添加剂,和研究特殊的聚合物膜化合物来实现。
持续释放片段化合物也包括脂质体捕获片断。包含所述抗体的脂质体通过已有技术制备:DE3,218,121;Epstein等,国家科学院学报美国82:3688-3692(1985);Hwang等,国家科学院学报美国77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP142,641;日本专利申请83-118008;美国专利号4,485,045和4,544,545;和EP102,324。通常脂质体是一类微型(大约200-800埃)单层薄膜形式。其他用来在乳房上淋巴结附近的组织内缓慢释放抗原的装置包含在本发明内。
用于治疗的抗原有效量根据,比如,施用目标,施用路线,抗原和/或助剂的类型和哺乳动物的自身条件来定。因此,要获得最佳效果需要治疗师滴定剂量和修订施用模式。典型地,操作者在剂量达到预期效果时停止施用抗原。治疗的过程通过传统方法很容易被监控。
本发明的进一步方面,提供了一种诱导奶中抗体持续释放的方法,还包括步骤:通过在乳腺内,腹膜内,肌肉内,鼻内选择一条施用路线来施用初级化合物。初级合成物的施用可能发生在植入抗原释放装置之前,其间或之后。优选地,初级化合物递送到粘膜表面,这样在粘膜表面(乳腺是其中之一)的抗体产品能优先得到激发。
施用初级化合物可以是单次施用,或可在几天或几周内相隔一段时间多次施用。初级化合物的施用时间通常根据同时免疫实验方案来进行间隔(例如,每2周)。为了避免局部刺激和充血,通常优选地,初级化合物不应该在同一位置以超过每两周的频率施用。所述初级步骤的首次揭露刺激了低水平的抗体产生,随后通过抗原释放装置释放抗原来增加和维持抗体产生。
本发明的方法也可以包括一个在植入抗原释放装置之后,通过选自乳腺内,腹膜内,肌肉内和/或鼻内的施用路径,对哺乳动物施用含有抗原的辅助化合物的辅助步骤。优选地,辅助化合物递送到粘膜表面,这样在粘膜表面(乳腺是其中之一)的抗体产生能优先得到激发。
此类辅助化合物可以是单次施用,或可在几天或几周内相隔一段时间多次施用。辅助化合物的施用通常分隔开以满足操作者的便利。为了避免局部刺激和充血,通常优选地,辅助化合物的施用在同一位置以不超过每周一次的频率为宜。
在优选的方式中,施用的抗原在每一步骤所采用的都一样。因此,同样的抗原可以用于抗原释放装置,初级化合物和/或辅助化合物。
在抗原释放装置和初级及辅助化合物中都需要使用助剂。助剂可以成为组织库从而缓释免疫原,同时作为淋巴系统的激活剂非特异性的增强免疫反应[Hood等,在免疫学,p.384,第二版,Benjamin/Cummings,MenloPark,California(1984)]。本发明与抗原一同使用的合适的助剂包括但不仅限于如下:Freund的完整助剂(Freund’s complete adjuvant(FCA)),Freund的非完整助剂(Freund’s incomplete adjuvant(FIA)),TiterMax GoldTM,助剂65,霍乱毒素B亚组,IL1-B片段163-171合成人类助剂,alhydrogel;或者百日咳博德特氏菌,胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MMD),细胞素(cytokines),皂草苷(saponin),Adju-Phos,Algal Glucau,Algammuliu,铝水凝胶(Alhydrogel),抗原形成剂(Antigen Formulation),(Avridine),Bay R1005,(calcitrial),磷酸钙(calcium phosphate),凝胶(Gel),CRL1005,霍乱全毒素(CT)(choleraHolotoxin(CT)),DDA,DHEA,DMPC,DMPG,DOC/明矾复合物,γ菊粉,Gerbu助剂,GMDP,Imiquimod,Imuither,γ干扰素,ISCOM(s),Iscoprop7.0.3,Loxoribine,LT-0A或LT口服助剂,MF59,MONTANIDE ISA51和ISA720,MPL,MTP-PE,MTP PE脂质体,murametide,murapalmitive,NAGO,非离子表面活性剂小泡,Pleuram,PLGA,PGA和PLA,聚醚(Pluronic)L121,PMMA,PODDS,聚镭(Poly Ra),Polyru Polyphophazene,聚山梨醇酯80,蛋白螺旋(ProteinCochleates),QS-21,Quil A,Rehydrogel HPA,Rehydrogel LV,S-28465,SAF-1,Sclavo,多肽,Seudai Protediposomes,含仙台的脂膜,Span85,specal,squalene,stearyl Tyrosine,Theramide,Threonyl-MDP,Ty颗粒,saponin Q521,MF59,明矾等。
关于施用初级化合物或辅助化合物的步骤,优选地,根据现有实验方法在液体介质中悬浮抗原性物质用来输液或注射。可以采用任何现有的合适的载体,稀释液,缓冲液,和助剂。合适的悬浮液包括生理盐水,水,和生理缓冲液。
初级化合物或辅助化合物的施用是通过注射完成,优选地在注射前抗原先在适当载体中通过使用助剂来乳化,例如,实验室匀质剂。此类方法的一个实施例中,水性抗原与3倍体积的助剂混合,并乳化至形成稳定的油包水结构。稳定乳化物的产生能通过采用现有技术的实验方法被证实。
在本发明的进一步方面,本方法进一步包含一个预筛选步骤。所述步骤中,对每个动物的产生抗体的能力进行测试和筛选。动物个体间存在合理的产生抗体能力的差异。所述预选步骤,动物显示最佳的抗体滴定反应被选择,并帮助减少动物间的差异因素。所述步骤能被类似用来构建一组特别适合产生抗体的动物。
根据本发明的第三个方面,提供一种生产含有抗体的半衰期得到延长的奶,所述方法包括如下步骤:根据前面具体描述的方法诱导抗体,然后收集并随意处理哺乳动物产生的含有抗原的奶。奶的收集可以根据正常的奶的制备过程来进行。优选地,所述方法也延长奶的保质期。
根据本发明的第四个方面,本发明提供一种改进半衰期的奶产品,所述奶产品由前述任何一种方法得到的奶制备得到并且由所述方法得到的奶制成奶产品。
本发明也提供一种改进了半衰期的奶产品,所述产品是通过添加针对至少一种如下物质的抗体而改进其半衰期的奶产品或其衍生物:
i)对能够缩短奶的半衰期的至少一种微生物生存所必需的分子;
ii)对能够缩短奶的半衰期的至少一种微生物生长所必需的分子;
iii)对能够帮助其它微生物缩短奶的半衰期的至少一种微生物的生存所必需的分子;
iv)对能够帮助其它微生物缩短奶的半衰期的至少一种微生物生长所必需的分子。
所述奶直接采自哺乳动物即是有用的,但可以根据需要进行加工。加工步骤的例子包括加热,紫外线照射,浓缩,添加食品添加剂,干燥成浓缩物,奶粉等。
本发明也提供一种延长保质期的奶产品,所述产品是通过添加针对至少一种如下物质的抗原而延长其保质期的奶产品或其衍生物:
i)对能够缩短奶的保质期的至少一种微生物生存所必需的分子;
ii)对能够缩短奶的保质期的至少一种微生物生长所必需的分子;
iii)对能够帮助其它微生物缩短奶的保质期的至少一种微生物的生存所必需的分子;
iv)对能够帮助其它微生物缩短奶的保质期的至少一种微生物生长所必需的分子。
能从本发明的方法获益的奶和奶产品可以包括食品,饮料(例如,能量或运动饮料)和动物饲料。例如,奶可能可以作为一种成份添加到婴儿食品,面包产品(例如,面包,发酵食品或蛋糕)或供应面包的产品(如,奶油冻或面包馅或浇头),奶鸡蛋面糊或面包粉,谷类,糖果,香精或乳状饮料,水果馅,肉汤,汤,酱(如,肉酱)或食品增稠剂,UHT加工过的肉汤,配餐(如,素食餐/配料),肉制品(如,肉糜,香肠,肉夹饼,烤肉,罐头肉,肉派,配置鱼类,馅饼,肉酱和糊),批萨面料,宠物食品,药物或营养品,番茄产品,调味品(如沙拉或低脂肪调味品),快餐或饼干酱(如,开胃菜或甜酱),糊(如,面条),加入脂肪的粉,乳蛋饼或果馅饼,奶酪或奶油类似和其他本发明中没有具体描述的日用品的替代品(如,甜点,调味奶饮料,奶昔,奶酪,奶酪酱或蘸料)。
实施例
本发明的进一步特征在如下的例子中更完整地被描述,但不仅限于以下实施例。应该理解,这里的具体描述仅是为了对本发明进行举例。不应该以任何方式认为是对本发明上述广泛描述的限制。
实施例1
制备无助剂抗原释放装置
材料
(i)0.15g D-甘露醇(Sigma-Aldrich)
(ii)0.15g柠檬酸钠(Proanalys)
(iii)11.25mg荧光假单胞菌的脂肪酶(Sigma-Aldrich)
(iv)0.75ml硅胶A(Dow Corning Q7-4850)
(v)0.75ml硅胶B(Dow Corning Q7-4850)
(vi)2×2.5ml一次性注射器(Terumo)
(vii)2×1ml注射器(Terumo)
(viii)2×12G×4英寸无菌全钢皮下注射器针头
(ix)37℃培养箱
(x)无菌培养皿
(xi)无菌解剖刀
(xii)无菌spachella
(xii)32ml McCartney玻璃瓶
方法
(i)拔去注射器针头活塞
(ii)用压舌板将硅胶A放入1ml注射器内。活塞放回注射器,分0.75ml入一个2.5ml注射器。
(iii)对硅胶B重复上述步骤。
(iv)脂肪酶,甘露醇和柠檬酸钠在小McCartney玻璃瓶中混匀,吸入含有硅胶A的2.5ml注射器中。硅胶B从原注射器移到另一个2.5ml注射器,并在一个注射器中形成硅胶A和硅胶B之间有效“三明治”夹杂脂肪酶,甘露醇和柠檬酸钠的情况。活塞从空的注射器放回这个注射器。第一个注射器中的内容全部移到第二个注射器然后活塞再次盖上。重复此过程20次使所有试剂有效混合。所有试剂最终移到两个12G针内并在37℃保存三天。硅胶从针内提炼出来,在打开的板中切割成3cm长柄放置在UV光下24小时,再放入10ml离心管中-20℃无菌保存。每3cm ARD在总共250μl硅胶中含有1mg脂肪酶,13mg甘露醇,13mg柠檬酸钠。
实施例2
制备含有助剂的抗原释放装置
材料
(i)0.3g D-甘露醇(Sigma-Aldrich)
(ii)0.3g柠檬酸钠(Proanalys)
(iii)22.50mg荧光假单胞菌的脂肪酶(Sigma-Aldrich)
(iv)1.2mg IL1-B人合成片段163-171(Sigma)
(v)1.5ml硅胶A(Dow Corning Q7-4850)
(vi)1.5ml硅胶B(Dow Corning Q7-4850)
(vii)2×2.5ml一次性注射器(Terumo)
(viii)2×1ml注射器(Terumo)
(ix)2×12G×4英寸无菌全钢皮下注射器针头
(x)37℃培养箱
(xi)无菌培养皿
(xii)无菌解剖刀
(xiii)无菌spachella
(xiv)32ml McCartney玻璃瓶
方法
(i)拔去注射器活塞
(ii)用压舌板将硅胶A放入1ml注射器内。活塞放回注射器,分0.75ml入一个2.5ml注射器。
(iii)对硅胶B重复上述步骤。
(iv)脂肪酶,甘露醇和柠檬酸钠在小McCartney玻璃瓶中混匀,吸入含有硅胶A的2.5ml注射器中。硅胶B从原注射器移到另一个2.5ml注射器,并在一个注射器中形成硅胶A和硅胶B之间有效“三明治”夹杂脂肪酶,甘露醇和柠檬酸钠的情况。活塞从空的注射器放回这个注射器。第一个注射器中的内容全部移到第二个注射器然后活塞再次盖上。重复此过程20次使所有试剂有效混合。所有试剂最终移到两个12G针内并在37℃保存三天。硅胶从针内抽提出来,在打开的板中切割成3cm长柄放置在UV光下24小时,再放入10ml离心管中-20℃无菌保存。每3cm ARD在总共250μl硅胶中含有1mg脂肪酶,13mg甘露醇,13mg柠檬酸钠,50μg ILl-B。
实施例3
递送ARD
一个含有10ml无菌可换针头型微量注射针,10G×4英寸无菌全钢皮下注射器,和90mm×10G无菌全钢焊条(图5)的装置,所述装置的针筒活塞上附加穿通整个针头的棒杆。活塞后退大概3cm为靠近针头的位置留出空间插入抗原释放装置。这样,当活塞推入时,抗原释放装置被棒杆推出针筒(图5)。
动物被背朝下放在地上,并由动物处理人控制住。靠近乳房在它右后方大约3cm×10cm区域用碘酒擦拭。2ml2%利诺卡因(lignocaine)由26G皮下注射针筒打入皮肤组织作为局部麻醉。含有ARD的10G针筒刺入所述区域的后端并沿皮下推到前端。所述活塞压下并且针头同时后退。刺入点用碘酒擦拭过。大多数情况下抗原释放装置能在原位被感知。
实施例4
制备脂肪酶鼻部接种体
材料
(i)15.5mg来自荧光假单胞菌的脂肪酶(Sigma-Aldrich)
(ii)38.75ml0.85%生理盐水(Excel实验室)
(iii)1mg霍乱毒素B亚组(US Biological)
(iv)2.5ml注射器
(v)50ml无菌管(Falcon)
(vi)8-10cm长大约20G塑料管(如,来自快速输液系统(Terumo))
方法
(i)所有试剂在首次施用当天混合于50ml管内。
(ii)剩下的4℃保存到下次使用。
实施例5
递送鼻部接种体
2.5ml接种体(包含1mg脂肪酶,64.5μg霍乱毒素B亚组)被吸入带有20G输液管的注射器。60-80%管长放置入动物的右侧鼻孔并缓缓打入同时从鼻孔内退出管子(图2)。
实施例6
制备脂肪酶肌肉注射接种体
材料
(i)36.5mg来自荧光假单胞菌的脂肪酶(Sigma)
(ii)9.1ml0.85%的生理盐水(Excel实验室)
(iii)TiterMax GoldTM助剂
(iv)McCartney玻璃瓶
(v)3ml全塑料注射器(Teruma)
(vi)无菌全钢双轴(double-hub)
(vii)23G×1英寸皮下注射器针头
方式
(i)在首次施用当天将脂肪酶和生理盐水在McCartney玻璃瓶中混和至4mg/ml的浓度。剩下的4℃保存到下次使用。
实施例7
递送肌肉内接种体
0.5ml4mg/ml的脂肪酶的生理盐水溶液被吸入注射器中,并根据厂商指示,用0.5ml TiterMax GoldTM进行乳化。接种体用接到注射器的23G×1英寸针筒在左后退的背部进行肌肉内(IM)施用。动物在第7天,第14天和第21天接受IM注射。
实施例8
免疫的实验方案1
动物在侧腹处被施以IM注射,这是获得免疫的常规方法。
两只动物在第0天通过肌肉途径(IM)注射来自荧光假单胞菌的脂肪酶以获得免疫,1250μg脂肪酶通过750μl titremax进行乳化后才使用。动物分别在第12天和第24天接受首次注射(950μg脂肪酶和560μl titremax)和二次注射(2500μg脂肪酶和500μltitremax)。动物在免疫当天被抽血,并且血液样本在免疫过程之后每隔一月进行采集。
实施例9
免疫的实验方案2
动物通过抗原释放装置和/或注射进行抗原接种。表1概述了针对6个动物和一种抗原的接种的日程表。
表1:抗原释放装置(ARD)的初期实验方案。
试验CRD和S/C注射抗原促使乳房分泌抗体
实施例10
免疫的实验方案3
实验方案采用每组两只动物的总共12只山羊。6种不同的实验方法分别施加到2只动物身上来确定制备稳定抗体水平的奶的最佳程序,如表4和表5所示。
表4:刺激奶中产生抗体的免疫的实验方案。
表5:刺激奶中产生抗体的免疫的实验方案。
总共对12只山羊进行研究,每两只羊采用同一种接种形式。抗脂肪酶抗体的存在通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来测定。平均吸收值小于空白对照的每日奶样品被划分成小块(图6)。结果在动物内是可重复的,如图7所示。
所有6种方法都能成功产生抗体。然而,每一组的抗体相对浓度都不同。最高平均吸收值代表产生抗体的最高浓度,被记录在组4动物中。组4动物在实验的第0天植入ARD,并在第7,14和21天在后侧腹部位进行3次后续注射。
组4的平均吸收值比组1山羊产生的值要高,组1山羊仅在第7,14和21天接受IM注射。
组1和组4动物大概在第14天的时候出现反应。在第15天时,抗脂肪酶抗体水平充分升高,可能是二次免疫反应的结果。抗体的较高水平维持了整个研究过程,本例中是直到第28天。
对接种动物血清中的抗脂肪酶抗体水平也进行了测量,如图8,9,10和11所示。图8显示在内植有抗原释放装置(ARD)和被进行肌肉内注射的两只动物中的抗脂肪酶抗体的各自吸收水平的结果。图9显示根据不同试验方案免疫的山羊的血清中抗脂肪酶抗体水平的结果。图10显示带有抗原释放装置(ARD)并进行肌肉内注射的山羊免疫产生的奶与血清中平均抗脂肪酶抗体水平的比较结果。图11显示在植入抗原释放装置的山羊的奶和血清中产生的抗脂肪酶抗体。奶中的抗脂肪酶抗体水平及血清中不含抗脂肪酶抗体说明植入腹股沟区域的抗原释放装置释放的抗原正在扩散到乳房上淋巴结。
实施例11
免疫实验方案4
本实验方案采用每组两只正在泌乳的山羊(Capra hircus),总共使用4只山羊。采用的抗原是来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的脂肪酶。
·免疫实验方案的准备工作
1.乳化30mg脂肪酶于15ml0.85%生理盐水。
2.根据制造商的说明书采用Titermax Gold进行乳化。生理盐水中的脂肪酶与等体积Titermax Gold(1:1)混合。
3.分装1ml到2.5ml注射器中以施用(每1ml剂量含有1mg脂肪酶)。
4.两组动物在第0,10和19天接种。
5.组1接种在左侧腹,组2接种在乳房上淋巴结附近。
6.收集奶和血清。
·为酶联免疫吸附试验(ELISA)涂布板
1.制备2.5μg/ml抗原的涂布缓冲液溶液。
2.100μl所述混合液分装到96孔ELISA板的每个孔中。
3.盖上板并在4℃下留待过夜。
·酶联免疫吸附试验(ELISA)方案
1.使用前,所述涂布板用PBS Tween洗3遍。
2.在PBS Tween中含有1%人血清的血清稀释液。
3.将100μl所述血清稀释液装入每孔。
4.将1μl待测样品装入每孔。
5.板在37℃培养2小时。
6.板用PBS Tween洗3遍。
7.制备1/1000稀释的小鼠α-绵羊IgG,小鼠α-绵羊IgA和小鼠α-绵羊IgM的1%血清稀释液(1%人血清的PBS Tween溶液)。
8.100μl装入对应的孔中。
9.板在37℃培养2小时。
10.板用PBS Tween洗3遍。
11.制备1/2500稀释的兔α-小鼠IgG(H+L)的1%血清稀释液。
12.100μl装入每孔。
13.37℃培养2小时。
14.板用PBS Tween洗3遍。
15.制备1/100稀释的250mg/ml磷酸硝基苯酯的乙醇胺缓冲液。
16.100μl装入每孔。
17.室温培养大约20到30分钟。
18.50μl3.75M的NaOH终止反应。
19.405nm读ElISA板。
·结果
收集的奶通过ELISA分析IgG,IgA和IgM的水平。组1(肌肉注射入侧腹-标明为G1)和组2(刺激乳房上淋巴结-G2动物)的结果如图13,显示各组的奶中产生的所有三类免疫球蛋白都具有较高水平。
实施例12
收集并保存奶样品
材料
(i)Beckman Acuspin冷冻离心
(ii)来自高温霉菌(Mucor meihei,Sigma)的二类粗凝乳(Rennet TypeII)的Hp水溶液,其浓度为2mg/ml
(iii)10ml无菌离心管
(iv)P1000微量分注器(pipetteman)
(v)1ml移液管
(vi)5ml塑料储存管
(vii)37℃培养箱
方法
不带任何化学或机械刺激地手工采集奶,并将奶置入32mlMcCartney玻璃瓶。通常在早晨未被幼仔分食的情况下收集奶。样本在收集后即储存在冰上并且尽可能快的转移。奶被转移到无菌10ml离心管内并在4℃以2000rpm的转速离心15分钟。奶通过移液管从固体脂肪层下吸入并置入干净的10ml管中。移液管小心穿透脂肪层进入下方的奶层。2mg/ml粗凝乳(Rennet)溶液以0.4ml粗凝乳对5ml奶的比例加入奶中,摇晃所述管并在37℃培养1到2小时。管子以5000rpm×15分钟的状态4℃离心。上层通过移液管转移并-20℃保存。
奶中的抗体通过ELISA进行定量。
实施例13
收集并保存血液样本
材料
(i)7ml的9ml真空管(VacutainersTM(Bectco Dickinson))进行血清收集
(ii)20G×1.5英寸真空管配套针和固定器
方法
采用真空收集管(VacutainersTM),固定器和针从静脉中采集血样。管子保存在4℃。样本以4000rpm×15分钟在4℃离心。上层通过移液管转移并-20℃保存。
实施例14
酶联免疫吸附试验
材料
(i)10×磷酸生理盐水缓冲液(PBS);1L二次蒸馏水,1.91g KH2PO4(BDHChemicals Aust Pty Ltd),6.1g Na2HPO4(ASAX Chemicals),2g KCl(BDH ChemicalsAust Pty Ltd),
(ii)80g NaCl,1.95g NaN3(Sigma Aldrich),pH到7.4
(iii)200ml pH9.6的碳酸盐涂布缓冲液;200ml二次蒸馏水,3.18g Na2CO3(BDH),5.88g NaHCO3(BDH),0.39g NaN3(Sigma)。
(iv)0.85%生理盐水(Excel Laboratories)
(v)0.25mg/ml来自荧光假单胞菌(Sigma Aldrich)的脂肪酶的碳酸盐涂布缓冲液溶液
(vi)PBS-TW20板洗液(BDH);200ml10×PBS(如上),1800ml蒸馏水,1ml Tween-20(Labchem)
(vii)血清稀释液;200ml甘油(BDH),29g NaCl(BDH),0.2g KH2PO4(BDH),0.61g Na2HPO4(BDH),0.2g KCl(BDH),1.95g NaN3(Sigma),蒸馏水定容到1L,1.5ml Tween-20(Labchem),pH到7.4。4℃保存。使用前,往一定体积内添加干燥的BSA(CSL),浓度为1%。
(viii)生理盐水0.85%(Excel Laboratories)
(ix)驴抗-山羊IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(Promega)
(x)1M H2SO4(AJAX Finechem)
(xi)TMBS EIA溶液(BioRad)部分A&B
(xii)P200微量分注器及枪头
(xiii)P20微量分注器及枪头
(xiv)NuncTM孔吸96孔ELISA板
(xv)Bi oRadTM96孔板分光光度模型450
方法
100μl脂肪酶的碳酸盐缓冲液添加到ELISA板的孔中并且4℃过夜保存。板用PBS-TW洗3次。100μl血清稀释液加入孔中进行血清分析,并且90μl加入孔中进行奶样分析。1μl血清样品和10μl奶样加入血清稀释液中。通过轻轻叩击所述板获得混合物。所述板4℃过夜保存。板用PBS-TW洗3次。100μl1/2500稀释的驴抗-山羊IgG-HRP的0.85%生理盐水溶液添加到每孔。板在室温下培养1小时。板用PBS-TW洗3次。TMBS的部A的9部分和部B的1部分在Schott玻璃瓶中混合并且往每孔中添加100μl。板在室温下培养10分钟。100μl 1MH2SO4添加入每孔中,板在分光光度计的450nm处读数。获得吸收结果的打印输出。收集来自所有测量动物的每一奶和血样本的吸收值被测量。每个动物以吸收值为y轴,时间(天)为x轴制图,得到每组(2个实验个体组成)的平均吸收值。
实施例15
脂肪酶在奶琼脂载玻片上的扩散
(i)制备1%(1g/100ml)琼脂(Oxoid Cat No L13,Basingstoke,Hampshire,England)的磷酸盐生理盐水缓冲液(pH7.4)。
(ii)添加100μl全脂奶(Masters,Perth,Australia)到5ml1%琼脂内。
(iii)对载玻片而言,2.5ml“奶琼脂”倒满玻璃,能用10分钟(2%奶于1%琼脂。)
(iv)在奶琼脂凝胶上用琼脂打孔机准备五个1.5mm直径的洞,并且通过真空移掉琼脂。
(v)琼脂膜与荧光假单胞菌(Aldrich,Milwaukee,WI,USA)的脂肪酶共同过夜培养。5mg/ml脂肪酶制备于0.85%生理盐水中。
(vi)表示脂肪酶实验中脂肪降解的扩散区带,与带有(a)生理盐水,(b)脂肪酶+抗体阴性血清和(c)脂肪酶+抗脂肪酶阳性血清进行比较。
结果如图13显示。每一个奶载玻片上,5个孔都用生理盐水(载玻片1),脂肪酶(载玻片2),带有抗体阴性血清的脂肪酶(载玻片3)和带有抗脂肪酶抗体阳性血清的脂肪酶(载玻片4)填满。载玻片2上,可以看到当脂肪酶水解奶薄膜中的脂肪时产生的水解区带。阴性对照(载玻片1内的生理盐水)确定酶对水解区带有作用。脂肪酶的水解活性能被抗脂肪酶抗体抑制,以载玻片4为证。载玻片3,包含抗体阴性血清,确定是抗体而不是其他血清成分抑制了酶。
实施例15
奶琼脂板
(i)制备1%奶在1%琼脂中。
(ii)10ml溶液倒入Petri盘中室温放置。
(iii)在琼脂上用琼脂打孔机准备六个1.5mm直径的洞,并且通过真空移掉琼脂。
(iv)孔被以下溶液填满:1:1预抽血血清+PBS溶液(孔1),1:1预抽血血清+脂肪酶溶液(孔2),2.5mg/ml脂肪酶(孔3),1:1抗脂肪酶血清(38天)+PBS溶液(孔4),1:1抗脂肪酶血清(38天)+脂肪酶(孔5),和0.85%PBS(孔6)(请参阅图5对照每孔的位置)。
结果如图14和15显示。
图14显示1%奶在带有孔的1%琼脂板上,含有1:1比例的预抽血血清+PBS溶液(孔1),1:1预抽血血清+脂肪酶溶液(孔2),2.5mg/ml脂肪酶(孔3),1:1抗脂肪酶血清(38天)+PBS溶液(孔4),1:1抗脂肪酶血清(38天)+脂肪酶(孔5),和0.85%PBS(孔6)。
在孔2和孔3中,脂肪水解的区带是脂肪酶活性的证据。孔5中,脂肪酶的活性被添加含有抗脂肪酶活性的血清而抑制。孔1,血清中不含有抗体,显示没有水解活性。这显示血清的这些成分不影响奶中的脂肪。相似地,含有抗脂肪酶抗体的血清不水解奶中的脂肪(孔4)。行6是阴性对照(仅含有PBS)并显示没有脂肪水解。
总的来说,添加脂肪酶能水解以孔2和孔3为证的奶琼脂盘内的奶中含有的脂肪。当比较孔3和孔2的区带直径时,看来血清中有元素能增强水解活性。这是未曾预料到的,由于血清是一种富含蛋白质的溶液,它可能含有能与脂肪酶协同作用的元素。然而,脂肪酶的水解活性,包括血清因子,已经完全被含有抗脂肪酶抗体的物质所抑制(见孔5)。单独血清(孔1和4)和生理盐水(孔6)不产生水解活性。
如图15所示,同样的奶琼脂盘设置来比较对脂肪酶的抑制活性。X0247和X0248含有不同来源的抗脂肪酶抗体。X0249,X0250,X0251和X0252含有直接针对其他蛋白质的抗体。六个盘中的每一个的孔2和3,有明显的脂肪水解。含有各自的抗体的孔5内,只有在含有抗脂肪酶抗体的奶盘X0247和X0248种才能看到明显的抑制。相反,其他抗体不抑制脂肪酶活性。
实施例16
通过pH的脂肪酶试验发生脂肪水解
(i)在McCartney瓶中,添加5ml0.05M碳酸钠(Ajax-Univar)到10ml新鲜奶(Harvey Fresh,Harvey,Western Australia)中
(ii)在37℃培养所述混合物5分钟。
(iii)在另一个McCartney中,40℃培养500μl5mg/ml脂肪酶。
(iv)添加奶/碳酸钠溶液到所述脂肪酶中。
(v)插入pH试纸并在预定30秒间隔后记录pH值。
图16概括了测量脂肪酶水解活性的实验结果。主要地,鲜奶与脂肪酶一起37℃培养。在实验开始之前和添加脂肪酶的30秒间隔后测量奶的pH值。由于奶中脂肪被水解,释放出来的自由脂肪酸降低了奶中的pH值。与脂肪酶一起在37℃培养的奶中pH值的改变被制成图表(图16)。pH值的下降为一个双曲线模式。当添加抗脂肪酶抗体时,pH变化速率以剂量-依赖方式下降。在添加更高浓度的抗脂肪酶抗体时pH变化速率更低。进一步,曲线形状是线性的。
实施例17
通过采用抗脂肪酶抗体抑制脂肪被脂肪酶水解
(i)通过pH进行的脂肪水解试验被用于比较研究来评价抗脂肪酶抗体的抑制属性。特别地,一系列脂肪水解试验通过下列添加物确立:
a.预抽血血清(如.抗体阴性血清),
b.240μl抗脂肪酶阳性血清,
c.500μl抗脂肪酶阳性血清,
d.1000μl抗脂肪酶阳性血清。
(ii)pH值在30秒间隔时测量,结果作图。
实施例16和17的结果如图16,17和18所示。进一步的数据如图19和20所示。
图17中,来自图16的数据采用两组附加数据系列来做图。奶与脂肪酶和抗体阴性血清(■)一同培养。显示pH变化的曲线与对照(如.仅奶+脂肪酶)的曲线类似。抗脂肪酶抗体滴定到较低浓度(如.1000μl,500μl和250μl)。结果表明抗体浓度是速率限制因素。250μl曲线是抛物线形而非线性,表明抗体水平受限并且酶的水解活性不完整。
试验在10℃和4℃时重复进行。在10℃,含有抗体和不含抗体的含有脂肪酶的奶的pH变化速率是类似的,表明与脂肪酶水解不同的机制正在工作。4℃时,没有抗体的变化速率与含有抗脂肪酶抗体的样本比较要更快。
实施例18
通过测量作为脂肪水解标志的pH值来估计保质期
(i)通过在10℃和4℃时的pH变化测量脂肪水解。
(ii)每天测量一系列含有生理盐水(PBS),10%预抽血血清(抗体阴性血清)和10%抗脂肪酶阳性血清的样本的pH值。
结果如图21和22所示。
奶与脂肪酶和含有抗脂肪酶抗体的8种稀释度的血清一同培养。制备比较用阳性对照(仅含脂肪酶无血清)和阴性对照(仅生理盐水或PBS)。实验开始前和培育1小时后测量奶的pH值。在1:2和1:5稀释度,pH改变最小。随着抗体浓度减小,pH变化明显,说明抗体剂量对奶脂肪被脂肪酶水解的作用有影响。
相反,与不含抗体的血清一同培养的奶显示了脂肪酶的水解活性。经过培育时间(1小时)的pH改变说明脂肪酶正在水解奶中的脂肪。
尽管本发明的描述中参考了某种优选实施例,许多变化和修正可以在本发明广泛原理范围内发生。因此,应当认为优选实施例和所有此类改变和修正都属于本发明的范围和精神内。
Claims (8)
1.一种改进奶的半衰期的方法,包括如下步骤:
a)奶与抗体接触,所述抗体是一种抗脂蛋白脂肪酶抗体。
2.如权利要求1所述的方法,所述抗体,当与奶接触时,能与所述脂蛋白脂肪酶分子发生抗体-抗原反应并且能阻碍分子的活性。
3.如权利要求2所述的方法,所述抗体是针对来自荧光假单胞菌的脂蛋白脂肪酶的抗体。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法,所述抗体分子选自下列:完整的免疫球蛋白分子和包含抗体决定簇的免疫球蛋白分子的一部分。
5.如权利要求4所述的方法,所述包含抗体决定簇的免疫球蛋白分子的一部分选自下列:Fab,Fab’,F(ab’)2和F(V)部分。
6.如权利要求1所述的方法,所述抗体导入于动物乳腺,所述动物为啮齿动物或反刍动物。
7.一种延长了保质期的奶产品,所述奶产品从根据权利要求1-6中任一种方法产生的奶中制备得到,并且由所述方法产生的奶处理成奶产品。
8.如权利要求7所述的奶产品,所述含有抗体的奶通过加热,紫外照射,浓缩,添加食品添加剂,干燥成浓缩物或奶粉的方式制成奶产品。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AU2004905761A AU2004905761A0 (en) | 2004-10-06 | Milk Production Method | |
AU2004905761 | 2004-10-06 | ||
PCT/AU2005/001541 WO2006037183A1 (en) | 2004-10-06 | 2005-10-06 | Milk production method |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101072508A CN101072508A (zh) | 2007-11-14 |
CN101072508B true CN101072508B (zh) | 2011-04-13 |
Family
ID=36142248
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200580038762XA Expired - Fee Related CN101072508B (zh) | 2004-10-06 | 2005-10-06 | 奶的生产方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20090280210A1 (zh) |
EP (1) | EP1806970A4 (zh) |
JP (1) | JP2008515814A (zh) |
CN (1) | CN101072508B (zh) |
CA (1) | CA2582487A1 (zh) |
NZ (1) | NZ554264A (zh) |
WO (1) | WO2006037183A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8498729B2 (en) | 2008-08-29 | 2013-07-30 | Smp Logic Systems Llc | Manufacturing execution system for use in manufacturing baby formula |
CA2913393A1 (en) * | 2013-05-24 | 2014-11-27 | General Mills, Inc. | Food products with yogurt whey |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0074240A2 (en) * | 1981-08-31 | 1983-03-16 | Stephen Leslie Gaffin | Antibodies specific to endotoxins |
EP0228975A1 (fr) * | 1985-11-27 | 1987-07-15 | TRANSIA , Société anonyme dite | Mélange d'anticorps spécifiques des bactériophages de bactéries lactiques et ses applications à la détection et à la neutralisation desdits bactériophages |
CN1210017A (zh) * | 1997-09-01 | 1999-03-10 | 黄河 | 一种功能食品免疫牛奶 |
WO2001032713A1 (en) * | 1999-11-01 | 2001-05-10 | Mucovax B.V. | Production of mammary secretion antibodies in farm animals |
CN1370413A (zh) * | 2001-02-23 | 2002-09-25 | 山东科益人生物工程有限公司 | 配方奶及其加工方法 |
CN1398531A (zh) * | 2001-07-24 | 2003-02-26 | 上海登美生物科技有限公司 | 新的多种保健功能免疫牛奶 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3975517A (en) * | 1972-05-25 | 1976-08-17 | Canadian Patents And Development Limited | Enteric disease vaccine |
US4053644A (en) * | 1975-10-10 | 1977-10-11 | Research Triangle Institute | Process of removing the cooked flavor from milk |
US5585098A (en) * | 1993-11-23 | 1996-12-17 | Ovimmune, Inc. | Oral administration of chicken yolk immunoglobulins to lower somatic cell count in the milk of lactating ruminants |
EP1202745A4 (en) * | 1999-08-16 | 2004-09-22 | Henceforth Hibernia Inc | THERAPEUTIC AND PROPHYLACTIC COMPOSITIONS CONTAINING CATALYTIC BIOMIMETIC SOLIDS AND METHODS OF PREPARING AND USING SAME |
US20040210953A1 (en) * | 2003-01-09 | 2004-10-21 | Murray James D. | Lysozyme transgenic ungulates |
-
2005
- 2005-10-06 WO PCT/AU2005/001541 patent/WO2006037183A1/en active Application Filing
- 2005-10-06 NZ NZ554264A patent/NZ554264A/en unknown
- 2005-10-06 EP EP05791395A patent/EP1806970A4/en not_active Withdrawn
- 2005-10-06 CN CN200580038762XA patent/CN101072508B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-10-06 US US11/665,374 patent/US20090280210A1/en not_active Abandoned
- 2005-10-06 JP JP2007534973A patent/JP2008515814A/ja active Pending
- 2005-10-06 CA CA002582487A patent/CA2582487A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-04-13 US US11/787,226 patent/US20080107769A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0074240A2 (en) * | 1981-08-31 | 1983-03-16 | Stephen Leslie Gaffin | Antibodies specific to endotoxins |
EP0228975A1 (fr) * | 1985-11-27 | 1987-07-15 | TRANSIA , Société anonyme dite | Mélange d'anticorps spécifiques des bactériophages de bactéries lactiques et ses applications à la détection et à la neutralisation desdits bactériophages |
CN1210017A (zh) * | 1997-09-01 | 1999-03-10 | 黄河 | 一种功能食品免疫牛奶 |
WO2001032713A1 (en) * | 1999-11-01 | 2001-05-10 | Mucovax B.V. | Production of mammary secretion antibodies in farm animals |
CN1370413A (zh) * | 2001-02-23 | 2002-09-25 | 山东科益人生物工程有限公司 | 配方奶及其加工方法 |
CN1398531A (zh) * | 2001-07-24 | 2003-02-26 | 上海登美生物科技有限公司 | 新的多种保健功能免疫牛奶 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101072508A (zh) | 2007-11-14 |
WO2006037183A1 (en) | 2006-04-13 |
JP2008515814A (ja) | 2008-05-15 |
EP1806970A1 (en) | 2007-07-18 |
EP1806970A4 (en) | 2011-06-29 |
US20080107769A1 (en) | 2008-05-08 |
CA2582487A1 (en) | 2006-04-13 |
NZ554264A (en) | 2010-01-29 |
US20090280210A1 (en) | 2009-11-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN100552016C (zh) | 用于治疗炎性疾病的双歧杆菌 | |
CN1942197B (zh) | 乳酸菌在制备用于改进哺育婴儿母乳的药品中的应用 | |
RU2247569C2 (ru) | Штамм lactobacillus paracasei cncm i-2116 (ncc 2461), обладающий способностью предотвращать колонизацию кишечника патогенными бактериями, вызывающими диарею, и предотвращать заражение эпителиальных клеток кишечника ротавирусами, пищевой продукт и фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с диареей | |
JP2670691B2 (ja) | 直接摂取するための再構成可能な乾燥生成物及びその製造方法 | |
Willard et al. | Effects of dietary fructooligosaccharide on selected bacterial populations in feces of dogs | |
CN106591458A (zh) | 生物饲料活性度的评价方法 | |
CN107075455A (zh) | 具有抗炎症及代谢疾病改善功效的植物乳杆菌hac01菌株及其用途 | |
Klein et al. | Variation among populations in the immune protein composition of mother’s milk reflects subsistence pattern | |
CN101072508B (zh) | 奶的生产方法 | |
CN100348119C (zh) | 罗伊乳酸杆菌菌株用于制备改善哺乳动物免疫功能的组合物的用途 | |
CN101072580B (zh) | 抗体制备方法 | |
CN104938627A (zh) | 一种乳酸菌发酵功能性酸奶的制备方法 | |
CN104997813B (zh) | 益生微生态制剂的制备方法 | |
DE69121999T2 (de) | Verfahren und Produkt für die Behandlung von Magenkrankheiten | |
Plé et al. | Designing specific cheese-ripening ecosystems to shape the immune effects of dairy products? | |
RU2120762C1 (ru) | Способ получения жидкой или сухой бактериальной закваски для производства кисломолочных продуктов | |
Umam et al. | Study on the bulk milk somatic cell counts and milk quality in different seasons | |
AU2005291857A1 (en) | Milk production method | |
Kurniati et al. | Halal critical point of microbial bioprocess based-dairy products | |
AU2005291856B2 (en) | Antibody production method | |
RU2541778C2 (ru) | Способ получения бактериального концентрата и его применение в качестве пробиотической биологически активной добавки к пище. | |
O'Connor et al. | The economic impact of suboptimal mobility in springcalving, pasture-based dairy herd | |
de Haas et al. | Is it possible to selectively breed low enteric methane-producing dairy cows and maintain health and productivity? | |
de Bruijn et al. | Peripartum feeding behavior is related with onset of ovarian cyclicity in dairy cows with different dry period lengths | |
Al Sattar | Isolation and identification of Staphylococcus aureus from bovine milk |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110413 Termination date: 20191006 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |