CN101025869A - 慢性复合应激动物模型的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种慢性复合应激动物模型的制备方法,具体操作是,取成年Wistar大鼠,采用垂直旋转、睡眠剥夺、捆绑和夜间光照4种应激原无规律交替应激动物6周,每天6h,即制成本发明慢性复合应激动物模型,本动物模型模拟人类所处生存状态产生的应激效应,可用来研究慢性复合应激引起的大鼠学习和记忆能力增强的神经生物学机制。
Description
技术领域
本发明涉及实验动物模型的制作方法,特别是医学实验用动物模型的制作方法。
背景技术
随着社会和经济的发展,使得竞争更激烈,工作和生活节奏加快,人际关系更为复杂,这些因素对人们产生的应激作用,特别是对认知功能的影响已成为当前神经科学研究领域的热点课题之一。关于慢性应激对学习与记忆功能的影响,许多实验结果支持慢性应激损伤学习与记忆功能的观点[参见:1、Lupien SJ,de Leon M,de Santi S,Convit A,Ta rshish C,Nair NP,Thakur M,McEwen BS,Hauger RL,Meaney MJ. Cortisol levels during human aging predict hippocampal atrophyand memory deficits[J].Nature Neurosci,1998;1:69-73.;2、Lupien SJ,McEwen BS. The acute effects ofcorticosteroids on cognition:integration of animal and human model studies[J].Brain Res Brain Res Rev,1997;24:1-27;3、Ohl F,Fuchs E.Differential effects of chronic stress on memory processes inthe tree shrew[J].Brain Res.Cogn Brain Res,1999;7:379-387.],但也有少数实验结果显示慢性应激对学习与记忆功能产生增强作用或者没有损伤作用[参见:1、Bowman RE,Zrull MC,Luine,VN.Chronic restraint stress enhances radial arm maze performance in female rats[J].Brain Res,2001;904:279-289;2、Bowman RE,Beck KD,Luine VN.Chronic stress effects on memory:sex differences in performanceand monoaminergic activity[J].Ho rmones and Behavior,2003,43:48-59;3、Con rad CD,LeDoux,JE,MagarinosAM,McEwen BS.Repeated restraint stress facilitates fear conditioning independently of causinghippocampal CA3 dendritic atrophy[J]Behav Neurosci,1999;113:902-913]。现有文献报导的慢性应激动物模型的制作通常采用的是单一应激原,即捆绑、电击、致痛、强迫游泳、睡眠剥夺或噪音等,应激周期通常为3周,这种动物模型无法模拟人类所处生存状态产生的应激效应。
发明内容
本发明的任务是提供一种慢性复合应激动物模型的制作方法是,使该动物模型具有有效模拟人类所处生存状态产生的应激效应之特点。
本发明提供的这种慢性复合应激动物模型的制作方法是:对成年Wistar大鼠采用垂直旋转、睡眠剥夺、捆绑和夜间光照4种应激原无规律交替应激动物5-6周,优选6周;每天5-7小时,优选6小时。
具体制备方法如下:
1.材料与方法
1.1应激原相应器材的制作及其参数
1.1.1垂直旋转器
由交流电机、减速器、转盘和定时控制器构成。转盘直径80cm,垂直连接在减速器上,由后者带动旋转。转盘周边固定12个长×宽×高为20cm×13cm×11cm的鼠笼。交流电机:功率:370W;电压:220V;转速:400转/min。定时控制器由定时器和继电器构成。定时器:为双路定时器,DH48S型,可控时间:1s~99h;继电器:JQX-13F型,电压:220V。由
1.1.2睡眠剥夺水池由方形水池和立台构成。方形水池:长×宽×高为150cm、×100cm×70cm。立台由圆形硬塑料筒和正方形玻璃底板构成,圆形硬塑料筒直径7.5cm、高20cm,筒壁有多个透水孔;正方形玻璃底板边长40cm。硬塑料筒垂直固定在玻璃底板上。
1.1.3捆绑器
用一长方形铁丝网片卷成圆筒,其头端用拉力弹簧套上一个锥形铁皮圆筒,其顶端和侧壁有透气孔。长方形铁丝网片长×宽为20cm×25cm,用其卷成的圆筒长20cm,直径4.5~6.5cm,可根据大鼠的大小调节;锥形铁皮圆筒斜高12cm,锥底直径7cm,底边有3个等距离的小孔,用以固定上述拉力弹簧。
1.1.4夜间光照器
定时器控制继电器供电的300W碘钨灯。
1.2慢性复合应激大鼠模型的制作及其参数
1.2.1实验动物及分组
采用雄性成年Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)37只,首次(dl)用Morris水迷宫测试每个动物的学习与记忆成绩,去除学习与记忆成绩很差的动物。然后随机分为正常对照组(n=14;简称对照组)和慢性复合应激组(n=23;简称应激组)。两组动物同样常规摄食饮水。所处动物饲养室温度为18-22℃,光暗周期为12/12h。
1.2.2模型制作
慢性复合应激由垂直旋转、睡眠剥夺、捆绑和夜间光照4种应激原组成,应激动物6周:垂直旋转、睡眠剥夺和捆绑于白天进行,6h/d,每天进行其中一项,无规律交换项目;夜间光照于每日晚间进行。
1.2.2.1垂直旋转 垂直旋转器转盘上的每个鼠笼内置一个大鼠,注意于转盘直径线两端双双对称放置,且两鼠大小近似,以保持转盘旋转时的平衡。转盘、交流电机、减速器和定时控制器彼此连接,交流电机和减速器带动转盘旋转,并控制转速,定时控制器自动控制转盘旋转时间。转盘转速为47.8转/min,每次旋转时间为25~40s,间歇时间为4~6min,每次的旋转时间和间歇时间每天不固定,随机改变,但转盘转速不变。通过垂直旋转使大鼠产生“过山车”样应激反应。
1.2.2.2睡眠剥夺水睡眠剥夺水池内等距离放置16个立台,池内注水,每个立台上置一只大鼠。大鼠的习惯是白天睡觉,大鼠置于立台上,因担心坠水被淹,不敢睡觉,而产生应激反应。
1.2.2.3捆绑将大鼠置于捆绑器内,用“V”不锈钢丝封住捆绑器圆筒后方的开口,使大鼠在在捆绑器内受到严格约束,不能动弹,产生束缚应激。
1.2.2.4夜间光照 于晚间由定时器控制继电器控制碘钨灯的开关,每次光照时间为5~15s,间歇时间为20~25s。大鼠习惯于晚间活动,并有趋暗习性,夜间光照产生与其习性相悖的应激反应。
本发明实验资料
慢性复合应激大鼠学习与记忆的行为检测
1.主要检测器材
Morris水迷宫系统 由中国药科大学制作提供;
Y-迷宫 自制,每臂长×宽×高为63.5cm×15cm×15cm,迷宫底部铺以直径2mm,间距4mm的铜线,3臂顶端均有15W的信号灯。信号灯亮,该臂箱底铜线不通电,则为安全臂(区);信号灯不亮臂,该臂箱底铜线通电(电压24V,电流强度0.7mA),为不安全臂(区)。
2、与记忆成绩测试
Morris水迷宫测试 两组动物均于应激组动物开始接受复合应激处理程序之前一天和该应激处理程序结束之后的次日,先后分别用Morris水迷宫测试其学习成绩,即实施应激处理程序之前和之后均连续测试3d,每天上午进行,测试5次,每次间隔15min,测试时将大鼠面向池壁分别从4个象限的4个入水点入水,记录其在60sec内寻找平台的时间,即逃避潜伏期(escape latency)。如果达60sec仍未找到平台,则引导其到达平台,停留30sec,本次成绩计为60sec,然后进行下次训练。前2d仅用于对动物的训练,取d3的测试成绩计为动物的学习成绩,即寻找平台潜伏期。
Y-迷宫测试 两组动物于应激组动物完成复合应激处理后,并于Morris水迷宫测试完成的次日,进行Y-迷宫测试。先将大鼠放入迷宫的某一臂,适应环境2~3min后通电电击,致其一次性逃避至安全区为正确反应。休息10sec后开始第二次测试,依次重复,直至学会为止。学会标准为连续10次电击中有9次正确反应,以大鼠达到学会标准所需总电击次数表示学习成绩。连续测试3d,取d3成绩作为动物学习成绩,以正确反应次数占总电击次数的百分比为寻找安全区正确率。
大鼠脑海马取材
部分大鼠经7%水合氯醛麻醉,常规灌流固定,取脑并修取含海马脑段,常规脱水,透明,石蜡包埋,额状连续切片,片厚7μm,用于海马神经元突触后致密物(postsynapticdensities,PSDs)免疫细胞化学染色[参见:1、程少容,刘能保,张敏海,等。慢性复合应激对大鼠学习与记忆及海马NMDA受体亚基NR2A和NR2B表达的影响[J]。神经解剖学杂志2004;20(3):275-280;2、程少容,刘能保,张敏海,等。慢性复合应激对大鼠学习与记忆及海马NMDA受体亚基NR2A和NR2B表达的影响[J]。解剖学杂志2004;27(6):616-619;3、孙臣友,刘能保,张敏海,刘少纯,程少荣,李辉,刘向前,汪薇曦.慢性复合性应激大鼠学习和记忆与海马突触后致密物质CaMKII的表达变化[J]。解剖学报,2005;36(1):24-29;4、李辉,刘少纯,程少容,等。蛋白激酶Cγ和蛋白磷酸酯酶Aα在慢性复合应激性学习记忆增强大鼠海马中表达的变化[J]。中国组织化学与细胞化学杂志2004;13(2):158-163;5、洪小平,刘能保,张敏海,等。慢性复合性应激对大鼠学习和记忆功能及海马PKA-Cβ表达的影响[J]。华中科技大学学报(医学版)2005;34(3):257-261;6、李晓恒,刘能保,张敏海,等。慢性复合应激性学习记忆增强大鼠海马神经细胞增殖和突触后致密物Fyn表达的变化[J]。解剖学报,2005;36(6):]和海马结构各亚区神经细胞计数[参见:刘能保,李辉,刘向前,等。慢性复合应激增强大鼠空间学习和记忆能力[J]。生理学报2004;56(5):615-619];部分大鼠断头取脑海马制作组织匀浆,用于Western blot技术的PSDs蛋白表达研究[参见:1、孙臣友,刘能保,张敏海,刘少纯,程少荣,李辉,刘向前,汪薇曦.慢性复合性应激大鼠学习和记忆与海马突触后致密物质CaMKII的表达变化[J]。解剖学报,2005;36(1):24-29.;2、李辉,刘少纯,程少容,等。蛋白激酶Cγ和蛋白磷酸酯酶Aα在慢性复合应激性学习记忆增强大鼠海马中表达的变化[J]。中国组织化学与细胞化学杂志2004;13(2):158-163;3、洪小平,刘能保,张敏海,等。慢性复合性应激对大鼠学习和记忆功能及海马PKA-Cβ表达的影响[J]。华中科技大学学报(医学版)2005;34(3):257-261.;4、李晓恒,刘能保,张敏海,等。慢性复合应激性学习记忆增强大鼠海马神经细胞增殖和突触后致密物Fyn表达的变化[J]。解剖学报,2005;36(6);]。
统计学处理
每组动物的行为测试数据均以均值±标准差(mean±s)表示,两组均数间用t检验作差异的显著性分析。
结果
Morris水迷宫测试:接受复合应激处理前,应激组和对照组动物学会找到隐蔽平台的潜伏期无明显差异(表1);而完成复合应激处理后,应激组动物学会找到隐蔽平台的潜伏期则明显短于对照组(表1),表明前者的学习成绩明显好于后者;对照组动物学会找到隐蔽平台的潜伏期在应激后明显长于应激前(表1),表明对照组动物学习成绩随着月龄的增大而明显减退;Y-迷宫测试:完成复合应激后学会找到安全区所需次数,应激组动物明显少于对照组(表2),表明前者学习成绩明显好于后者。
Table 1 Learning performance in the Morris water maze(The escape latency to the hidden platform,sec;mean±SD)
Groups | Number of rats | Results | |
Pre-stress | Post-stress | ||
Stressed group | 23 | 16.07±11.05 | 15.89±9.15# |
Control group | 14 | 18.90±10.03 | 27.30±12.51* |
#vs control group after stress,p<0.05;*vs pre-stress,p<0.05
Table 2 Brightness-Darkness discrimination Learning in the Y-maze(Correct trials and correct percent of entering safe arm,mean±SD)
Groups | Number ofrats | Results | ||
Total trials | Correct trials | Correct rate | ||
Stressed group | 23 | 1589 | 1255 | 79.01±1.23* |
Control group | 14 | 655 | 435 | 66.12±1.62 |
*vs control group,p<0.01)
本发明在完成慢性复合应激实验后,应激组动物的学习与记忆成绩不是下降,而是上升。为了进一步证实这种结果的可靠性,我们接着又进行了Y-迷宫测试,其结果与Morris水迷宫的测试结果相一致,说明Morris水迷宫的测试结果是可靠的。而且,我们曾多次重复了慢性复合应激动物学习与记忆功能增强的结果。我们的实验结果不同于大多数文献报导的单一应激的结果,这是一个很有意思的发现,究其原因,也许有两种可能:(1)文献报道的慢性应激动物模型的制作周期通常为3周左右,使模型动物的学习与记忆成绩受损(下降)[参见:1、孙臣友,刘能保,张敏海,刘少纯,程少荣,李辉,刘向前,汪薇曦.慢性复合性应激大鼠学习和记忆与海马突触后致密物质CaMKII的表达变化[J]。解剖学报,2005;36(1):24-29;2、Sun Chenyou,Liu Nengbao,Li Honglian,et al.Experimentalstudy of effect of corticosterone on primary cultured hippocampal neurons and theirCa2+/CaMKIIExpression[J].华中科技大学学报(医学外文版)2004;26(6):543-546;],而不是我们所用的6周,这可能提示,随着3周慢性应激周期的进一步延长,如我们所采用的6周或更长,可能使动物逐渐产生适应性和耐受性,而会增强模型动物的学习与记忆成绩,即有害应激随着时间的延长,由于动物逐渐适应,而变成无害,甚至有益的应激;(2)文献报道的慢性应激性学习与记忆受损动物模型的制作通常采用的是单一应激原,即捆绑、电击、致痛、强迫游泳、剥夺睡眠或噪音等[参见:1、Sousa N,Lukoyanov NV,MadeiraMD,Almeida OFX,Paula-Barbosa MM.Reorganization of the morphology of hippocampalneurites and synapses after stress-induced damage correlates with behavioralimprovement[J].Neuroscience,2000;97(2):253-266;2、Luine V,Villegas M,Martinez C,MeEwen BS.Restraint stress causes reversible impairments ofspatial memory performance.[J]Brain Res,1994;639(1):167-170;],如单一捆绑动物等。而我们采用的是4种应激原组合的复合应激。这可能提示,慢性单一应激原,因其单调枯燥,易造成慢性心理疲劳而引起学习与记忆受损;而采用慢性复合应激原应激动物,可能因多种应激原构成一种较为丰富多样的环境条件,应激原间相互取长补短而相互调济,将有害的单一应激复合在一起,交替使用,可能反而会变成有益的应激。上述两个方面的原因也许能为我们的现实生活提供某种有益的启示,如学生每天交替学习几门课要比只学一门课要好,宇航员每天交替训练几个项目要比只训练一个项目要好。
具体实施方式
实施例1
采用雄性成年Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)37只,首次(dl)用Morris水迷宫测试每个动物的学习与记忆成绩,去除学习与记忆成绩很差的动物。然后随机分为正常对照组(n=14;简称对照组)和慢性复合应激组(n=23;简称应激组)。两组动物同样常规摄食饮水。所处动物饲养室温度为18-22℃,光暗周期为12/12h。
慢性复合应激由垂直旋转、睡眠剥夺、捆绑和夜间光照4种应激原组成,应激动物6周:垂直旋转、睡眠剥夺和捆绑于白天进行,6h/d,每天进行其中一项,无规律交换项目;夜间光照于每日晚间进行。
垂直旋转 垂直旋转器转盘上的每个鼠笼内置一个大鼠,注意于转盘直径线两端双双对称放置,且两鼠大小近似,以保持转盘旋转时的平衡。转盘、交流电机、减速器和定时控制器彼此连接,交流电机和减速器带动转盘旋转,并控制转速,定时控制器自动控制转盘旋转时间。转盘转速为47.8转/min,每次旋转时间为25~40s,间歇时间为4~6min,每次的旋转时间和间歇时间每天不固定,随机改变,但转盘转速不变。通过垂直旋转使大鼠产生“过山车”样应激反应。
睡眠剥夺水 睡眠剥夺水池内等距离放置16个立台,池内注水,每个立台上置一只大鼠。大鼠的习惯是白天睡觉,大鼠置于立台上,因担心坠水被淹,不敢睡觉,而产生应激反应。
捆绑 将大鼠置于捆绑器内,用“V”不锈钢丝封住捆绑器圆筒后方的开口,使大鼠在在捆绑器内受到严格约束,不能动弹,产生束缚应激。
夜间光照 于晚间由定时器控制继电器控制碘钨灯的开关,每次光照时间为5~15s,间歇时间为20~25s。大鼠习惯于晚间活动,并有趋暗习性,夜间光照产生与其习性相悖的应激反应。
Claims (7)
1.一种慢性复合应激动物模型的制作方法,其特征在于,对大鼠采用垂直旋转、睡眠剥夺、捆绑和夜间光照4种应激原交替应激动物5-6周,每天5-7小时。
2.根据权利要求1所述的慢性复合应激动物模型的制作方法,其特征在于所述的4种应激原交替应激动物6周,每天6小时。
3.根据权利要求1或2所述的慢性复合应激动物模型的制作方法,其特征在于,所述的垂直旋转是将动物置于垂直旋转器转盘上的鼠笼内,注意于转盘直径线两端双双对称放置,且两鼠大小近似,以保持转盘旋转时的平衡,转盘转速为47.8转/min,每次旋转时间为25~40s,间歇时间为4~6min,每次的旋转时间和间歇时间每天不固定,随机改变,转盘转速保持恒定。
4.根据权利要求1或2所述的慢性复合应激动物模型的制作方法,其特征在于,所述的睡眠剥夺是指在睡眠剥夺水池内放置若干个立台,池内注水,将被应激大鼠置于立台上,每一个立台置一只大鼠。
5.根据权利要求1或2所述的慢性复合应激动物模型的制作方法,其特征在于,所述的捆绑是将大鼠置于捆绑器内,使之不能动弹。
6.根据权利要求1或2所述的慢性复合应激动物模型的制作方法,其特征在于,所述的夜间光照是用碘钨灯于晚间进行光照,每次光照时间为5~15s,间歇时间为20~25s。
7.根据权利要求1所述的慢性复合应激动物模型的制作方法,其特征在于所述的大鼠为成年Wistar大鼠。
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CN 200610018376 CN101025869A (zh) | 2006-02-20 | 2006-02-20 | 慢性复合应激动物模型的制作方法 |
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN108812525A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-11-16 | 广州脉缔欣谱医药科技有限公司 | 一种2型糖尿病动物模型的造模方法 |
CN111077925A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-04-28 | 珠海格力电器股份有限公司 | 光照调节设备的控制方法、装置、电子设备及存储介质 |
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- 2006-02-20 CN CN 200610018376 patent/CN101025869A/zh active Pending
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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