CN101006186A - 用于检测sars冠状病毒的引物和探针，包括该引物和/或探针的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测作为严重急性呼吸综合症(SARS)病原体的变异冠状病毒的引物和/或探针，包含所述引物和/或探针的试剂盒，以及使用所述试剂盒的诊断方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒(Coronavirus)的寡核苷酸，包含引物和/或探针的试剂盒，和使用所涉及试剂盒检测SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒的方法。
背景技术
2002年11月中国广东省爆发了严重急性呼吸综合症(SARS)，蔓延至世界，包括香港、新加坡、越南、加拿大、美国等。该综合症发展为发烧、咳嗽、呼吸困难、非典型性肺炎等。被认为，其病原体被报道是冠状病毒变体，并且主要通过诸如猫、狗等的动物传播(Marra，等人，2003，Science，300：1399-1404；Guan，等人，2003，Science，302：276-278)。
据报道，在2～7天的潜伏期后，80～90％的病人会好转，但10～20％的病人会恶化发展成为死亡率约为10％的严重急性呼吸综合症。由于疫苗和治疗药物还处于开发之中，目前主要集中在早期诊断和检疫上。尽管最近在韩国没有人感染SARS。但是，因为韩国在地理位置上与中国邻近并且人员和物资的交流持续增加，所以并不能完全排除传染的可能性。除禽流感外，仍认为在韩国其变体可能从动物身上出现。
检测病毒感染的方法中最通常的是通过ELISA对血液中的抗原或抗体进行诊断。但是，因为在出现感染症状后7天内很难用该方法对症状进行诊断，所以应该优先进行对该病毒基因的检测。实时PCR设备已经被用于检测高灵敏性病毒基因。因为冠状病毒是RNA病毒，所以可以使用RT-PCR方法对其基因进行检测。早期商业上可以获得的用于检测SARS基因的实时RT-PCR试剂盒是由Roche公司和Artus公司开发的。该试剂盒表现出高灵敏的检测性能，但它的问题是所使用的设备仅限于来自Roche的LightCycler，并且价格昂贵。近来，Artus公司开发了作为ABI Prism系列用于检测SARS冠状病毒的试剂盒。但是，该试剂盒也存在问题，由于成本昂贵并要花费至少3小时来检测病毒，所以难以普遍使用。所以，为了达到解决这些问题的目的，需要开发用于检测SARS冠状基因的新型试剂盒。
发明内容
所以，本发明的发明人尝试开发一种用于检测SARS冠状病毒RNA的实时RT-PCR试剂盒。发明人本人设计了引物和探针来开发一种试剂盒，其与常规试剂盒相比保持或改善了灵敏性和特异性。期望使用本发明自己设计的引物/探针的用于检测SARS冠状病毒RNA的试剂盒的开发将大大有助于在感染的早期阶段对其进行准确检测，该检测试剂盒在韩国内外的广泛应用也将大大有助于预防严重急性呼吸综合症。
为了完成上述目的，本发明人等提供了一种用于使用RT-PCR方法实时检测SARS冠状病毒RNA的引物/探针。本发明的引物优选是在SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中所列出的，本发明的探针优选是在SEQ ID NO：10中所列出的。本发明中，探针的特征是其5’端被修饰为FAM，TET，或VIC，在3’端被修饰为TAMRA。
而且，本发明提供了一种用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒的试剂盒，其包含所述引物和/或探针。
本发明中，该试剂盒的特征是，其进还包含DNA聚合酶或反转录酶。
而且，本发明提供了一种用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒的方法，该方法包括以下步骤：将包含DNA聚合酶和/或反转录酶的酶组合物与包含所述引物和/或探针的反应组合物混合；向在前一步骤中制备的混合物中加入样本RNA；使用RT-PCR方法对包含前一步骤中制备的样本RNA的溶液进行扩增。
本发明的试剂盒在检测SARS冠状病毒RNA方面具有优秀的灵敏性和特异性。
附图说明
在下面详细的说明书中，将借助附图对本发明优选实施方式的这些和其他特征、方面和优点进行更充分的描述。在附图中：
图1是表示实时RT-PCR原理的示意图；
图2表示了SARS冠状病毒的基因图和扩增子RNA在基因组中的位置；
图3是表示利用7M尿素/6％PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测的标准阳性RNA的电泳图；
图4a和4b是表示使用引物组1的实时RT-PCR的结果的图表；其中，图4a表示PCR曲线图，图4b表示标准曲线。“ntc”代表无模板对照，STD1、STD2、STD3和STD4分别代表1×101拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×103拷贝/μl和1×104拷贝/μl的作为反应模板使用的扩增子RNA。
图5a和5b是表示使用引物组2的实时RT-PCR的结果的图表；其中，图5a表示PCR曲线图，图5b表示标准曲线。“ntc”代表无模板对照，STD1、STD2、STD3和STD4分别代表1×101拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×103拷贝/μl和1×104拷贝/μl的作为反应模板使用的扩增子RNA。
图6a和6b是表示使用引物组3的实时RT-PCR的结果的图表；其中，图6a表示PCR曲线图，图6b表示标准曲线。“ntc”代表无模板对照，STD1、STD2、STD3和STD4分别代表1×101拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×103拷贝/μl和1×104拷贝/μl的作为反应模板使用的扩增子RNA。
图7a和7b是表示使用BNI引物作为阳性对照的实时RT-PCR的结果的图表；其中，图7a表示PCR曲线图，图7b表示标准曲线。“ntc”代表无模板对照，STD1、STD2、STD3和STD4分别代表1×101拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×103拷贝/μl和1×104拷贝/μl的作为反应模板使用的扩增子RNA。
图8是表示阳性样本的临床数据的图表。
图9a和9b是表示阳性样本的实时RT-PCR的结果的图表；其中，图9a表示PCR曲线图，图9b表示标准曲线。“ntc”代表无模板对照，STD1、STD2、STD3和STD4分别代表1×101拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×103拷贝/μl和1×104拷贝/μl的作为反应模板使用的扩增子RNA。
图10是表示临床结果的图表；
图11是表示使用引物组4作为阴性对照的实时RT-PCR的结果的图表；其中，“ntc”、STD1、STD2、STD3和STD4具有与图4、5、6和7相同的模板浓度。也就是说，“ntc”代表无模板对照，STD1、STD2、STD3和STD4分别代表作为反应模板使用的扩增子RNA的1×101拷贝/μl，1×102拷贝/μl 1×103拷贝/μl和1×104拷贝/μl。从图11中可以看出，在引物组4中完全没有检测到该引物和探针的结合。
实施方明的最佳方式
下面，将对本发明进行详细说明。
为了制造本发明的标准阳性RNA样本，制备了德国BNI(Bernhard-NochtInstitute)推荐的扩增子RNA(见图2)。该扩增子RNA位于该病毒RNA基因组的18120～18421位核苷酸，其长度相当于302个碱基对(bp)。该RNA在被克隆的载体中在体外被转录，然后从尿素/PAGE中被纯化(见图3)。使用UV分光光度计以及和通常商业上可以得到的实时RT-PCR试剂盒的标准RNA，进行定量地计算被纯化的RNA的浓度，
设计了三组引物/探针来检测SARS冠状病毒的标准样本RNA。并且使用BNI推荐的引物/探针和实时RT-PCR来比较它们的灵敏性和特异性(见图4～7)。“ntc”代表无模板对照，STD1、STD2、STD3和STD4分别代表1×101拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×103拷贝/μl和1×104拷贝/μl的作为反应模板使用的扩增子RNA。各种引物中设定阀值为0.02来分析标准曲线的斜率、截距和相关值。当该相关值达到-1时，意味着其可靠性是非常好的。在引物组1(SEQ ID NO：3、4和5)和引物组2(SEQ ID NO：5、6和7)的情况下，标准曲线的相关值分别为-0.99760和-0.98930。假定两个引物组都表现出理想的相关值，但相对于ntc的高背景，在引物之间或者引物和探针之间形成了一些非特异性键(见图4和5)。在引物组3(SEQ ID NO：8、9和10)的情况下，相关值为-0.99586，其表现出非常好的相关性，并且形成了理想的ntc背景(见图6)。在BNI引物组(SEQ ID NO：11、12和13)的情况下，由于标准RNA如STD1和ntc最低的浓度而几乎不能被识别，因此估计其很难检测低拷贝的病毒RNA(见图7)。而且，在作为对照引物使用的引物组4中，正义引物是5′-CCTCTCTTGT TCTTGCTCGC-3′(SEQ ID NO：14)，反义引物是5′-ATAGTGAGCC GCCACACATG-3′(SEQ ID NO：15)，其相当于SARS-CoV的序列第15,271～15,290位(正向)，15,371～15,390位(反向)，所用的探针与引物组1和2中使用的探针相同。
最后，估计引物组1、2和3可以用于SARS冠状病毒的检测，并且显示，在引物组1、2和3中，引物组3与其他碱基序列的引物组相比，表现出对检测的非常好的可靠性和灵敏性。阳性临床样本得自中国疾病预防控制中心，用来验证使用引物组3是否可以以有效的方式检测来自真正的SARS冠状病毒病人的病毒RNA(见图8)。使用从病人粪便中分离和纯化的病毒RNA来进行实时RT-PCR(见图9)。当阕值被设为699时，R2值表现为0.94096。基于标准曲线，通过进行二重检验来计算临床样本的RNA拷贝数(见图10)。对于阳性/阴性检测，如果RNA以高于4拷贝/ml的量出现，则RNA拷贝数表示为(+)，如果RNA的以低于4拷贝/ml的量出现，则RNA拷贝数表示为(-)。在15个实验样品中，10个实验样品被表示为(+/+)，4个实验样品被表示为(+/-)，1个实验样品被表示为(-/-)。考虑到DaAn公司开发的产品在中国的检测率为66.7％，可以确定其表现出99.3％的非常好的检测率。
下面，以非限定性实施例对本发明进行具体说明。
实施例1
用于表达SARS冠状病毒扩增子RNA的质粒的制备
通过寡核苷酸合成的方式制备单链DNA，其相当于扩增子RNA的302个核苷酸。使用引物T7AMPF(SEQ ID NO：1)和AMPR(SEQ ID NO：2)对该DNA进行PCR扩增，然后使用来自Qiagen公司的Qiaquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)进行纯化。使用Promega公司的pGEM-T easy载体(批号：A1360)对纯化后的PCR产品进行克隆。通过DNA测序方式对最终克隆的插入片段进行鉴定。
实施例2
SARS冠状病毒扩增子RNA的体外转录和纯化
在体外转录反应中使用的是来自Ambion公司的Megascript T7试剂盒(批号：1334)(见附件手册)。通过在TBE缓冲液中的电泳使转录物被固定在7M尿素/6％聚丙烯酰胺凝胶上，然后使用溴化乙啶(ethidium bromide)进行染色，并纯化。下面，进行纯化程序。按照每一条带0.4ml RNA凝胶提取缓冲液进行处理，并于37℃下保持2小时。然后取出上清液，接着按照每一条带0.1ml RNA凝胶提取缓冲液进行处理，并于37℃下保持30分钟，使用酚进行萃取(1×体积)，然后用乙醇进行沉淀。然后，向存在于50μl 0.2M KOAc中的沉淀物中加入乙醇(3×体积)，使用用乙醇进行沉淀，然后用100μl无核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶的水对该沉淀物进行处理。
所述凝胶提取缓冲液(100ml)的组成如下：3.85g NH4OAc+214mgMg(OAc)2+200μl 0.5M EDTA+1ml 10％SDS。
实施例3
对来自病人实验样品的病毒RNA的纯化
使用QIAamp病毒RNA小型试剂盒(QIAGEN，52 904)从病人粪便中分离病毒RNA。
实施例4
实时RT-PCR
最终产物的添加剂和实时RT-PCR的反应条件如下。
通过将3μl/ml的10X酶混合物与17μl/ml的反应混合物混合来制备所需的适量的混合物，然后分成20μl的量。向每等份的混合物中加入10μl样本RNA，使最终数量为30μl。在RT-PCR反应中，将最终混合物在50℃下保持30分钟，并在95℃下保持10分钟；通过重复45个下列循环进行扩增：95℃下15秒，在65℃下1分钟。此时，测量每个循环的荧光吸收。
反应混合物(17μl)组成如下：25μM dNTP 0.3μl+50μM组3的正向引物(SEQ ID NO：8)0.3μl+50μM组3的反向引物(SEQ ID NO：9)0.3μl+25μM组3的探针(SEQ ID NO：10)0.3μl+10X Taq Pol缓冲液3μl+无核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶的水12.8μl。
酶混合物(10μl)的组成如下：Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl+AMV-RT(10u/μl)0.5μl+核糖核酸酶抑制剂(40u/μl)0.5μl+酶储缓冲液8.5μl。
图4、5、7和11中，在实时RT-PCR处理中，除了分别使用探针组1、2、4和BNI引物，并使用SEQ ID NO：5作为探针以外，采用与使用引物组3相同的方式进行PCR扩增。结果分别如图4(引物组1)、图5(引物组2)、图6(引物组3)、图7(BNI引物)和图11(引物组4)所示。
工业实用性
如上所述，设计用来通过使用实时RT-PCR检测SARS冠状病毒RNA引物的碱基序列，可以用于从病人的样本快速准确地检测病人是否感染了SARS冠状病毒。其可以直接用于开发利用TaqMan探针系统来检测SARS冠状病毒RNA的实时RT-PCR试剂盒。因此，预测其将在预防SARS疾病及其经呼吸道传染病的传染方面发挥重要作用。
序列表
<110>牧岩生命工学研究所(MOGAM BIOTECHNOLOGY INSTITUTE)
<120>用于检测SARS冠状病毒的引物和探针，包括该引物和/或探针的试剂盒及其检测方法
<160>15
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>T7AMPF
<400>1
attaatacga ctcactatag ggtaccgtag actcatctct a 41
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AMPR
<400>2
ggtataagat gtttaaactg g 21
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组1的正向引物
<400>3
cccgcgaaga agctattcg 19
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组1的反向引物
<400>4
agttgcatga cagccctcta ca 22
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组1的探针
<400>5
acgttcgtgc gtggattggc tttg 24
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组2的正向引物
<400>6
atcacccgcg aagaagctat t 21
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组2的反向引物
<400>7
tctagttgc tgacagccct ctac 24
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组3的正向引物
<400>8
ccaagtcaat ggttacccta atatgtt 27
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组3的反向引物
<400>9
gccaatccac gcacgaa 17
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组3的探针
<400>10
tcacccgcga agaagctatt cgtcac 26
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BNI正向引物
<400>11
ttatcacccg cgaagaagct 20
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BNI反向引物
<400>12
ctctagttgc atgacagccc tc 22
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BNI探针
<400>13
tcgtgcgtgg attggctttg atgt 24
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物组4的正义引物
<400>14
cctctcttgt tcttgctcgc 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物组4的反义引物
<400>15
atagtgagcc gccacacatg 20
Claims (5)
1.在SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8或SEQ ID NO：9中所列出的引物，其用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒。
2.在SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：10中所列出的探针，其用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒。
3.一种用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1或2所述的寡核苷酸。
4.根据权利要求3所述的用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其还包含DNA聚合酶或反转录酶。
5.一种用于检测SARS(严重急性呼吸综合症)冠状病毒的方法，其特征在于，其包括：
a)将酶混合物与反应混合物进行混合，其中，所述酶混合物包含DNA聚合酶和/或反转录酶，所述反应混合物包含权利要求1或2所述的寡核苷酸；
b)向在步骤a)中所制备的混合物中加入样本RNA；以及
c)利用RT-PCR方法对在步骤b)中所制备的包含样本RNA的反应溶液进行扩增。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070725 |