CN100592309C - 与表型药物抗性相关的hiv-1逆转录酶中的新突变分布型 - Google Patents

Abstract

本发明提供了与对HIV药物的表型抗性相关的HIV-1逆转录酶和/或蛋白酶基因的突变、突变结合或突变分布型。更特别地，本发明涉及HIV的目标群的基因型特征的应用以及为了在病毒突变分布型和药物抗性之间建立联系而随后在此信息与表型解释间建立的联系。本发明也涉及在数据库、药物开发即药物设计、药物修饰、治疗和处理设计、临床管理和诊断分析中使用本发明的突变分布型的方法。

Description

与表型药物抗性相关的HIV-1逆转录酶中的新突变分布型

本发明涉及核酸诊断和靶核酸序列中的碱基变异鉴定领域。更特别地，本发明涉及HIV的目标群的基因型特征的应用以及为了在病毒突变分布型(profile)和药物抗性之间建立联系而随后在此信息与表型解释间建立的关联，也即联系。本发明也涉及本发明的突变分布型在药物开发即药物设计、药物修饰、药物开发、治疗和处理设计、临床管理和诊断分析中的应用的方法。

逆转录病毒抑制剂可以多种方式阻断病毒复制。例如，核苷逆转录酶抑制剂(NRTI s)通过逆转录酶与天然核苷三磷酸竞争结合到延伸的病毒DNA中。可从天然核苷中区分这些化合物的化学修饰法可造成DNA链终止事件。目前可利用的NRTI包括齐多夫定(ZDV)、地达诺新(ddl)、扎西他宾(ddC)、斯他夫定(stavudine)(d4T)、拉米夫定(lamivudine)(3TC)和阿巴卡夫(abacavir)(ABC)。

核苷酸逆转录酶抑制剂(NtRTIs)与NRTI的作用方式相同，但它们之间存在不同，因为前者已经进行了单磷酸化，因此它们需要更少的代谢步骤。阿德伏沃(Adefovir)(双-POM-PMEA和双-POC PMPA属于此类治疗药品。

非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)是一组结构不同的化合物，它们可通过非竞争性结合或接近病毒逆转录酶的活性位点来抑制HIV逆转录酶，从而抑制其活性。此组中可利用的化合物包括奈韦拉平(NVP)、地拉夫定(delavirdine)(DLV)和依法夫伦(efavirenz)。

蛋白酶抑制剂(PIs)是肽模拟物并结合到病毒蛋白酶的活性位点上，从而抑制产生感染性病毒体的结构成分和酶成分所必需的前体多蛋白的切割。目前可利用的PIs包括噻喹努佛(SQV)、利托努佛(ritonavir)(RTV)、因地努佛(indinavir)(IDV)、尼非努佛(nelfinavir)(NFV)、氨匹努佛(amprenavir)(APV)和ABT-378(洛匹努佛(lopinavir))。

由于可利用新的药物，抗逆转录病毒治疗的选择有了相当的改进。目前的抗逆转录病毒治疗方针推荐一种用于最初治疗的三联治疗方案，例如一种PI和两种NRTIs或一种NNRTI和两种NRTIs。这些联合治疗方案展示出强抗逆转录病毒活性，称为HAART(高活性抗病毒治疗)。

此外，血浆HIV-1 RNA定量检测法的开发和标准化使得病毒负载检测作为了关键的治疗反应监测工具。抗逆转录病毒治疗的目标是将血浆病毒血症长期减少到检测限以下。然而，在相当量的达到此目标的患者中没有取得对病毒复制的最大抑制，相当量的病人经历了病毒负载反弹。病毒负载数据没有提供造成这样的失败的原因。

治疗失败要归因于多种因素，包括治疗方案的抗病毒活性不足、药物代谢和药代动力学的个体差异、难于依从定量给药方案、由于毒性而要求治疗中断以及病毒的药物抗性。此外，接受次最佳抗逆转录病毒治疗的患者可以产生药物抗性，或者患者可被抗药HIV-1所感染。虽然药物抗性可能不是治疗失败的主要原因，但在许多病例中，任何在抑制剂存在的情况下允许病毒复制的情况建立了筛选抗性变体的阶段。

病毒的药物抗性可定义为在抑制剂存在的情况下病毒中可改进其复制的任何改变。最早在1989年就有对HIV-1药物抗性的描述，其涉及利用齐多夫定单独疗法进行治疗的患者，而齐多夫定单独疗法代表了当时唯一的治疗方法。见Larder，B.A.，et al.，Science 243，1731-1734(1989)。在利用单一的抗逆转录病毒药物对患者进行治疗的过程中，几乎一直观察到抗性的出现。类似地，在抗逆转录病毒化合物存在下，病毒培养物通过几轮复制进行的体外传代导致了对那些其复制周期对所用化合物不再具有易感性的病毒的筛选。通过引入双NRTI联合疗法及在给药以多种强效的NNRTIs和PIs过程中也观察到抗性产生。各个抗逆转录病毒药物的抗性产生速度不同：抗性变体的筛选可在治疗数周内进行或抗性可能在更长的治疗阶段后才出现。

对通过体内或体外筛选产生的抗性病毒分离物进行的大量遗传分析表明，抗性一般是由改变病毒基因组某些特定位点的核苷酸序列造成的突变所引起的。对HIV-1来讲，所观察到的和所报道的以及与药物抗性相关联的突变模式是多种多样的：某些抗逆转录病毒剂仅仅需要单一的遗传改变，而另外一些需要多种突变来产生抗性。已经对与药物抗性相关的H I V基因组中的突变进行了总结。见Schinazi，R. F.，Larder，B. A. & Meliors，J. W. 1997. Int. Antiviral  Ncws.5，129-142(1997)。另外，可在http:∥hiv-web.lanl.gov，www.hivb.stanford.edu及http:∥www.hivresistanceweb.com上获得突变的电子列表。

应该指出，此处遗传变体对抗逆转录病毒化合物的易感程度是相对于如在GenBank中发现的野生型病毒(HIVIII/B/LAI参考序列)来表达的，此野生型病毒的序列引入本发明中作为参考。易感性一般以IC₅₀或IC₉₀值来表示(IC₅₀或IC₉₀值为分别有50％或90％的病毒复制受到抑制时的药物浓度)。此外，遗传突变通常参考野生型病毒来进行描述，也即K101N指利用天冬酰胺替代第101位密码子处的赖氨酸。然而，为了限定在本发明的实施范围之内，本发明中的突变不依赖于所列的野生型示例。例如，突变101N指第101密码子处的氨基酸为天冬酰胺，不管突变前第101位密码子处是否为赖氨酸。

当然，抗逆转录病毒药物要长时间给药，通常要相互联合给药，并且由于新的抗逆转录病毒药物开发并加入到现有药物中，所以发现了新的抗性相关遗传变体。特别重要的是抗逆转录病毒剂的联合能够影响抗性特征。例如，在NNRTI-齐多夫定联合治疗基础上筛选了不同的NNRTI抗性相关突变，并且在双NRTI联合治疗中筛选了不同的NRTI抗性相关突变。在后者情况下，其结果是对所有NRT I的高水平多药物抗性。

此外，一旦病毒产生了抗性，补救性治疗由于每类药物内的交叉抗性而受到严格限制。最近，研究兴趣集中在为改善临床管理而进行的病毒药物易感性改变的鉴定上。当要求进行治疗改变来最小化抗性的产生并改善患者长期预后时，这对最初的治疗是重要的。治疗方案的选择是得到循环病毒群抗性分布型方面的知识支持的。此外，如果包括具有在抑制特定病毒群方面已经证明的潜能的药物在内，治疗联合合更有可能是有效的。

为了获得这些以及其他的益处并根据此处实施和大量描述的本发明的目标，本发明在一个方面提供了计算机系统，此系统包含将HIV逆转录酶中的至少一种突变与至少一株HIV对逆转录酶抑制剂(RTI)的抗性相关联的数据库；和/或将HIV蛋白酶中至少一种突变与至少一株HIV对蛋白酶抑制剂(PI)的抗性相关联的数据库。更特别地，数据库包括与突变和药物抗性间的关联相对应的一组记录。

在进一步的实施方案中，本发明提供了鉴定有效抗HIV的NNRTI或NRTI抗性株的药物的方法，此方法包括以下步骤：提供包含含有具有此处描述的至少一种突变的HIV逆转录酶的至少一株HIV，确定药物对HIV株的表型反应，并利用表型反应来确定药物的有效性。在更进一步的实施方案中，本发明提供了鉴定有效抗HI V的蛋白酶抑制剂(PI)抗性株的药物的方法，其中该HIV株包含含有此处描述的至少一种突变的HIV蛋白酶，确定该药物对该HIV株的表型反应，并利用表型反应来确定药物的有效性。在另一实施方案中，本发明提供了利用本发明的方法鉴定的药物。

本发明也提供了设计用于治疗感染HIV的患者的疗法的方法，其包括：从感染HIV的患者中收集样品；确定样品是否含有编码具有此处描述的至少一种突变的HIV逆转录酶或具有此处描述的至少一种突变的HIV蛋白酶的至少一种核酸；以及利用核酸的存在来设计用于该患者的疗法。

本发明也包括分离的、对至少一种NNRTI或至少一种NRTI具有抗性的HIV逆转录酶复合物，这些复合物含有上述的至少一种突变，并且本发明也包括对PI具有抗性的，含有上述的至少一种突变的分离的HIV蛋白酶复合物。

应该理解，前文的一般描述和随后的详细描述仅仅是示范性和解释性的，并没有限制所要求保护的本发明。

图表简述

图1：源自MDR患者的重组HIV变体的核苷类似物的易感性

如实施例2中所描述，重组病毒是从患者的血浆样品中制备的，并且检测了它们对(a)d4T、(b)ddC和(c)ddl的易感性。展示了具有不同基因型的病毒组，也即密码子151-M多药物抗性簇(n＝27)、在AZT和3TC抗性突变背景中具有69D/N(n＝195)或75M(n＝43)的病毒及在AZT抗性突变背景中的密码子69插入突变体(n＝45)相对于野生型对照组的IC₅₀值的平均增加倍数(平均抗性倍数)。误差柱表示标准误。注意，总数(n＝310)高于此处描述的302个MDR样品，这是因为少量为69D/N和75M双突变体，它们同时表示在这两组中。

图2：其HIV-1分离物产生了密码子69插入突变的三位患者的治疗史

核苷类似物治疗(AZT、3TC、ddC、ddl或d4T)如水平柱所示，其表明了每位患者(1、2或3)接受特定治疗的时间段。利用箭头结合检测到的特定密码子69插入来展示获取用于基因型和表型分析的血浆样品的时间点。这些患者可能接受的包括核苷治疗在内的其他治疗没有在图中展示。

发明详述

本发明在一个方面提供了与抗HIV药物的表型抗性相关联的HIV-1逆转录酶和/或蛋白酶基因的新的突变或突变分布型。更特别地，本发明涉及HIV的目标群的基因型特征的应用以及为了在病毒突变分布型和药物抗性之间建立联系而随后在此信息与表型解释间建立的联系。本发明也涉及在数据库、药物开发即药物设计、药物修饰、治疗和处理设计、临床管理和诊断分析中使用本发明的突变分布型的方法。

本发明涉及一种计算机系统，包含：

至少一个将人类免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶中的至少一种突变的存在与至少一株HIV对逆转录酶抑制剂的抗性相关联的数据库，包含：

对应于选自44D、77L、115F、118I、184V、208Y、210W、211K、214F、215F、215Y、219E、219N及219Q的至少一种突变与对d4T的抗性间的关联的至少一组记录，

对应于突变184I与对拉米夫定的抗性间的关联的记录，

对应于选自115F和184V的至少一种突变与对阿巴卡夫的抗性间的关联的至少一组记录，

62V、75T、77L、116Y和151M的联合与对所有核苷类似物的抗性，

对应于选自101H、101P、103H、103S、103T、106M、181S和190Q的至少一种突变与对奈韦拉平的抗性间的关联的至少一组记录，

对应于选自101H、101P、103H、103N、103S、103T、106M、181C、181S、190Q和236L的至少一种突变与对地拉夫定的抗性间的关联的至少一组记录，

对应于选自101H、101P、103H、103S、103T、106M、181S、190Q和236L的至少一种突变与对依法伏伦的抗性间的关联的至少一组记录，

184V和41L及215Y的联合，其中184V抗性突变逆转了41L和215Y突变对齐多夫定的作用，

236L突变，其提高了对奈韦拉平的敏感性，

将人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶中的至少一种突变与至少一株HIV对蛋白酶抑制剂的抗性相关联的至少一个数据库，包括：

对应于选自54L、54M、54V、84A、84C和84L的至少一种突变及与对选自氨匹努佛、噻喹努佛、尼非努佛、利托努佛、因地努佛的蛋白酶抑制剂的抗性间的关联的至少一组记录。

本发明进一步涉及对HIV感染患者进行的抗病毒治疗的有效性的评价方法，包括：

(a)从HIV感染患者中收集样品；

(b)确定样品是否含有编码具有选自下组的至少一种突变的HIV的至少一种核酸：

(i)编码具有选自下组的至少一种突变的HIV逆转录酶的第一种核酸

44D、77L、115F、118I、184V、208Y、210W、211K、214F、215F、215Y、219E、219N和219Q，及对d4T的抗性，

184I和对拉米夫定的抗性，

115F和184V及对阿巴卡夫的抗性，

62V、75T、77L、116Y和151M及对所有核苷类似物的抗性，

101H、101P、103H、103S、103T、106M、181S和190Q以及对奈韦拉平的抗性，

101H、101P、103H、103N、103S、103T、106M、181C、181S、190Q和236L及对地拉夫定的抗性，

101H、101P、103H、103S、103T、106M、181S、190Q和236L及对依法伏伦的抗性，

184V、41L及215Y，其中184V抗性突变逆转了41L和215Y突变对齐多夫定的作用，

236L突变，其提高了对奈韦拉平的敏感性。

ii)编码具有选自下组的至少一种突变的HIV蛋白酶的第二种核酸：54L、54M、54V、84A、84C和84L以及对选自氨匹努佛、噻喹努佛、尼非努佛、利托努佛、因地努佛的蛋白酶抑制剂的抗性。

(c)利用上述至少一种核酸的存在评价该抗病毒治疗的有效性。

本发明进一步涉及有效抗HIV的药物抗性株的药物的鉴定方法，包括：

i)提供至少一株HIV，其包含：

a)含有选自下组的至少一种突变的至少一种HIV逆转录酶：

44D、77L、115F、118I、184V、208Y、210W、211K、214F、215F、215Y、219E、219N和219Q，及对d4T的抗性，

184I和对拉米夫定的抗性，

115F和184V及对阿巴卡夫的抗性，

62V、75T、77L、116Y和151M及对所有核苷类似物的抗性，

101H、101P、103H、103S、103T、106M、181S和190Q以及对奈韦拉平的抗性，

101H、101P、103H、103N、103S、103T、106M、181C、181S、190Q和236L及对地拉夫定的抗性，

101H、101P、103H、103S、103T、106M、181S、190Q和236L及对依法伏伦的抗性，

184V、41L及215Y，其中184V抗性突变逆转了41L和215Y突变对齐多夫定的作用，

236L突变，其提高了对奈韦拉平的敏感性。

b)包含含有选自下组的至少一种突变的HIV蛋白酶的至少一株HIV：54L、54M、54V、84A、84C和84L以及对选自氨匹努佛、噻喹努佛、尼非努佛、利托努佛、因地努佛的蛋白酶抑制剂的抗性。

ii)确定该药物对该HIV株的表型反应；及

iii)利用该表型反应确定该药物的有效性。

本发明提供了有效治疗HIV感染患者的药物的鉴定方法。本发明进一步提供了表型分析方法来评估对个体进行的HIV治疗。

本发明进一步提供了用于治疗感染HIV的患者的疗法的设计方法，包括：

i)从HIV感染患者中收集样品；

ii)确定样品中是否包含

a)编码具有选自下组的至少一种突变的HIV逆转录酶的至少一种核酸：

44D、77L、115F、118I、184V、208Y、210W、211K、214F、215F、215Y、219E、219N和219Q，及对d4T的抗性，

184I和对拉米夫定的抗性，

115F和184V及对阿巴卡夫的抗性，

62V、75T、77L、116Y和151M及对所有核苷类似物的抗性，

101H、101P、103H、103S、103T、106M、181S和190Q以及对奈韦拉平的抗性，

101H、101P、103H、103N、103S、103T、106M、181C、181S、190Q和236L及对地拉夫定的抗性，

101H、101P、103H、103S、103T、106M、181S、190Q和236L及对依法伏伦的抗性，

184V、41L及215Y，其中184V抗性突变逆转了41L和215Y突变对齐多夫定的作用，

236L突变，其提高了对奈韦拉平的敏感性。

b)编码具有选自下组的至少一种突变的HIV蛋白酶的至少一种核酸：54L、54M、54V、84A、84C和84L以及对选自氨匹努佛、噻喹努佛、尼非努佛、利托努佛、因地努佛的蛋白酶抑制剂的抗性。

iii)利用上述的至少一种核酸的存在来设计用于上述患者的疗法。

优先地，在HIV蛋白酶核酸中至少存在至少一种额外的选自10I、20R、20T、241、33F、331、33L、36I、46L、71T、71V、771、77V、82I、82V或90M的突变。更优先地，含有在第54位密码子处的突变的HIV蛋白酶核酸包含至少一种额外的突变，选自密码子10和90处的突变，并且赋予了对选自氨匹努佛，因地努佛、尼非努佛、利托努佛和噻喹努佛的蛋白酶抑制剂的抗性。在一个实施方案中、本发明提供了含有本发明中的至少一种突变的嵌合HIV病毒。

不希望受理论限制，本发明可以利用涉及基因型和表型抗性检测的联合方法来建立突变与抗性表型之间的关联。如果没有上述技术的特定联合，突变和抗性间的关联就无法检测。在对从常规的临床实践得到的分离物中的这些基因型和表型分布型进行的观察之外，实施定点突变来确定这些突变实际上形成了此药物抗性模式的基础。

可鉴定HIV-1基因组中的突变和通过搜索已知与抗性相关的突变模式以推断HIV-1对抗逆转录病毒药物的抗性，从而在基因型水平确定HIV对抗逆转录病毒药物的抗性。另外，可通过在抑制剂存在条件下培养病毒并测定药物对病毒复制的抑制程度从而在表型水平确定HIV对抗逆转录病毒药物的抗性。在这种情况下，可测定突变相互作用、仍然未知的或以前未鉴定的遗传改变、背景基因型等对表型的作用。用于检测HIV-1中的突变的测定方法可基于病毒基因组序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增之上。随后利用杂交或序列分析技术对扩增后的序列进行分析。基于杂交的检测方法包括引物特异性PCR，其利用了设计来选择性引导DNA合成的合成寡核苷酸。见Larder，B.A.，etal.，AIDS 5，137-144(1991)；Richman，D.D.，et al.，J.Infect.Dis.164，1075-1081(1991)；Gingeras，T.R.，et al.，J.Infect.Dis.164，1066-1074(1991)。只有当引物序列与靶序列(野生型或突变体)在3′末端相匹配时，靶序列扩增才有可能进行，才能产生DNA片段。关于引物序列的知识使我们能够在研究情况下推断病毒分离物的序列，但仅仅是推断引物序列涵盖的区域。其他基于杂交的检测方法包括示差杂交法(Eastman，P.S.，et al.，J.Acq.Imm.Def.Syndr.Human Retrovirol.9，264-273(1995)；Holodniy，M.，etal.，J.Virol.69，3510-3516(1995)；Eastman，P.S.，et al.，J.Clin.Micro.33，2777-2780(1995).)、行探针测定(LiPAJHIV-11RT，Innogenetics)(Stuyver，L.，et al.，Antimicrob.Agents Chemotherap.41，284-291(1997).)、以及GENECHIPX

技术(Affymetrix)(D′Aquila，R.T.Clin.Diagnost.Virol.3，299-316(1995)；Fodor，S.P.A.et al.，Nature 364，555-556(1993)；Fodor，S.P.A.Nature 227，393-395(1997)。另一方面，DNA序列分析提供了进行了序列分析的区域的所有核苷酸的信息。利用PCR对靶序列进行扩增。序列分析结果可以蛋白酶基因和逆转录酶基因中相对于野生型参考序列的位点的氨基酸变化来报告。基因型分析报告中包括的这些变化可局限于已知的显然与药物抗性相关的多态性位点的突变。不需要与药物抗性无关的位点的多态性。

表型分析测定法可以测量病毒复制与野生型敏感参考病毒相比在特定抑制剂存在的条件下生长的能力。结果，这些测定法直接测量了病毒对特定抑制剂的抗性和易感性。可进行应用的表型分析测定法包括但并不局限于：PBMC(外周血单核细胞)p24抗原测定，其为确定临床HIV-1分离物中病毒的药物抗性的第一个标准化测定法(Japour，A.J.，et al.，Antimicrob.Agents Chemother.37，1095-1101(1993)；Kusumi，K.et al.，J.Virol.66，875-885(1992)；及重组病毒测定法(RVAs)，其为用于评估对RT-抑制剂的表型抗性的第一个替代方法(Kellam，P.&Larder，B.A.，Antimicrob.AgentsChemother.38，23-30(1994)；and Pauwels，R.，et al.，2ndInternational Workshop on HIV Drug Resistance and TreatmentStrategies，Lake Maggiore，Italy.Abstr.51(1998)。

在利用基因型分析方法的情况下，重组病毒检测法最开始是利用PCR扩增病毒靶序列。利用与缺失的扩增子中的那些序列同源的序列将扩增子掺入前病毒实验室克隆中。这样产生了一簇嵌合病毒。检测病毒在不同浓度的药物存在下的生长能力。通过计算每种抑制剂的IC₅₀值并以μM浓度来表达IC₅₀值的结果，或通过计算嵌合病毒中的IC₅₀值与作为平行对照的野生型易感的实验室病毒的IC₅₀值之比来获取结果。在后者情况下，以相对于野生型易感HIV-1株的“抗性倍数”来表示抗性。为了满足大量检测和个体检测的短循环时间的需要，正对最新开发的表型测定法进行进一步的修正。报告基因系统在易感性检测中的应用使得可进行实验室自动化和标准化。见Pauwels，et al.，J.Virol.Methods 20，309-321(1998)；Paulous，S.，etal.，International Workshop on HIV Drug Resistance，Trea tmentStrategies and Eradication，St.Petersburg，Florida，USA.Abstr.46(1997)；and Deeks，S.G.，et al.，2nd InternationalWorkshop on HIV Drug Resistance and Treatment Strategies，LakeMaggiore，Italy.Abstr.53(1998)。

Antivirogram

测定法(Virco)(WO97/27480)是基于将源自患者的HIV-Igag/PR/RT序列同源重组到相应的缺失gag/PR/RT序列的病毒前HIV-1克隆中。见Pauwels，et al.，J.Virol.Methods 20，309-321(1998)。一种类似的检测法(Phenosense ViroLogic)是基于将源自患者的PR/RT序列酶法连接到具有相应缺失的前病毒载体中，而此载体携带有插入到缺失的HIV-1包膜基因中的荧光素酶这一指示基因。见Deeks，S.G.，et al.，2nd International Workshopon HIV Drug Resistance and Treatment Strategies，Lake Maggiore，Italy.Abstr.53(1998).Hertogs et al.Antimicrob.AgentsChemother.44(3)568-573(2000)，其公开内容在此引用作为参考。

总而言之，高通量的表型分析和基因型分析检测法的开发使得建立了含有超过30,000种临床分离物的表型抗性数据和基因型序列的数据库。数据库的相关数据分析和突变簇分析使得能够对伴随有抗性的突变模式进行搜索。其示例为实际的表型分析(见PCT/EPO1/04445)。

在一个实施方案中，可利用神经网络在基因型和表型信息基础上精确预测治疗剂抗性或敏感性的产生并精确定义治疗剂抗性的遗传学基础(见2000年6月8日提交的美国专利申请No.09/589,167，PCT/EP01/06360，在此特别引用其完整公开内容作为参考)。

下表1在利用抗逆转录病毒药物治疗后的临床分离物中出现的最常见一些抗性相关突变。

表1：在利用抗逆转录病毒药物治疗后的临床分离物中出现的最常见的一些抗性相关突变的示例

除多药物抗性突变外，本发明考虑了与任何类型的HIV治疗的抗性相关的突变，其包括但并不局限于赋予对蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂(NRTIs、NtRTIs和NNRTIs)的抗性的突变。

在一个实施方案中，本发明考虑了赋予对蛋白酶抑制剂(Pls)的抗性的突变。表1列举了所有PIs的两类突变：主要的和次要的突变。性的突变。表1列举了所有PIs的两类突变：主要的和次要的突变。主要突变为对特定药物产生抗性的主要贡献者。次要突变在治疗过程的后期出现并且也引起抗性，或者其已经在未接受PI的病毒分离物中以天然多态性存在。大量的次要突变同时增强了对多种PI抑制剂的抗性。虽然那些次要突变间可能存在细微的不同表型效应，但其可导致对这类抑制剂的广泛交叉抗性。

不为理论所限定，蛋白酶基因中存在的突变可通过蛋白酶损害多蛋白的切割效率。已经在可允许更有效地利用突变的蛋白酶进行更有效位点切割的gag切割位点发现了补偿性突变。对从获得了PI抗性相关的突变的、利用蛋白酶治疗过的患者中得到的临床分离物进行的多种研究表明，在gag p7/p1和/或p1/p6位点发生的突变显著提高了突变病毒的复制效率。

在本发明的实施范围之内的其他突变可赋予对NRTI和NNRTI的抗性。例如，一般赋予对NRTI齐多夫定抗性的突变为M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和K219Q。HIV-1逆转录酶中的多个突变也可赋予对齐多夫定和其他NRTI的高水平抗性。在存在多个突变的情况下，多个突变可协同作用，当与抗性相关的突变数量增加时易感性降低。例如，与对地达诺新的抗性相关联的突变为L74V、K65R。对拉米夫定的抗性也与M184V和M184I突变的出现相关，它们赋予了很高的抗性水平，以及对地达诺新和扎西他宾的低抗性水平。对拉米夫定的低水平抗性也可在不存在184突变的情况下存在，而对阿巴卡夫的抗性与K65R、L74V、Y115F和M184V突变相关。

本发明的另一实施方案涉及多重药物抗性突变(MDR)，特别是对NRTI的MDR。例如，RT突变群A62V、V75T、F77L、F116Y和Q151M一起导致了对所有核苷类似物的抗性。

对非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)赋予抗性的突变也在本发明的范围之内。例如，与对奈韦拉平的抗性相关的突变为A98G、L100I、K103N、V106A、V108I、Y181C/1、Y188C和G190A。对地拉夫定的抗性的突变为K103/N/T、Y181C和P236L、而对依法伏伦的抗性的突变为L1001、K101E、K103N、V108I、V179D、Y181C和Y188L。

本发明的另一方面涉及逆转突变。例如，M184V拉米夫定抗性突变降低了齐多夫定抗性突变M41L和T215Y的作用，而L74V地达诺新抗性突变降低了齐多夫定抗性突变T215Y的作用。不管此处描述的逆转作用表型显著与否，其可依赖于存在的突变的联合。

在另一实施方案中，突变可提高对抑制剂的敏感性。例如，地拉夫定突变P 236L提高了此突变体对奈韦拉平的抑制的敏感性，而拉米夫定抗性突变M184V导致了高于非突变体序列的对阿德伏沃和对PMPA的提高的易感性。提高的敏感性可在提高的治疗结局中体现出来。

在本发明的实施范围之内的H I V-1逆转录酶的新突变(表2)及它们相关的表型药物抗性包括但并不局限于表2中所示的内容。

表2：新的RT突变和相关的药物抗性

逆转录酶突变	抗：
		69SXX70R75A75I75M75T77L115F116Y118I151M184V208Y210W211K214F215F219E219N219Q215Y	d4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4Td4T

表2中的单一突变或任何突变的联合的存在可赋予对d4T或相关类中的一或多种其他治疗的抗性。此外，如果应用了如此处所描述的工具，我们可将已鉴定的突变和相关的抗性应用于一类治疗。因此，本发明也提供了所列的针对相关类药物的突变和突变的新联合，这些突变可用于预测新的抗性表型如对其它的PIs、NRTIs、NNRTIs的抗性或MDR抗性。此外，突变联合的存在可赋予相同或不同的药物抗性分布型。

本发明也涉及利用本发明中的关联的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一数据库，此数据库包含：HIV逆转录酶中的至少一种突变与至少一株HIV对逆转录酶抑制剂(RTI)的抗性间的关联，或HIV蛋白酶中的至少一种突变与至少一株HIV对蛋白酶抑制剂(PI)的抗性间的关联。

在一个进一步的实施方案中，数据库可在开发治疗程序或确定适当的HIV治疗或联合治疗中对医生起辅助作用。例如，Virtual Phenotype

测定系统为监测HIV-1药物抗性的诊断工具。此系统可用于在抗HIV-1药物的临床试验中研究抗性的产生、改进对HIV感染的患者的临床管理及研究药物抗性的流行病学。其允许快速确定在给药以抗逆转录病毒药物的患者或已感染药物抗性HIV-1株的患者的血浆中循环的HIV-1群的敏感性。

本发明也提供了监测HIV-1药物抗性的方法，此方法是利用一种例如Virtual Phenotype

中使用的方法，在检验中结合对源自患者的HIV-1遗传物质的遗传序列的确定及在患者的HIV株中发现的针对可能存在的抗病毒药物抗性的序列变异的解释来进行的。在一个实施方案中，评估了与对不同的核苷逆转录酶抑制剂齐多夫定(AZT)、地达诺新(ddl)、扎西他宾(ddC)、斯他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)和阿巴卡夫、核苷酸逆转录酶抑制剂阿德伏沃(PMEA)、非核苷逆转录酶抑制剂奈韦拉平、地拉夫定和依法伏伦、以及蛋白酶抑制剂噻喹努佛、利托努佛、因地努佛和尼非努佛的抗性相关的突变。

HIV-1药物抗性监测法也可与病毒分离物的表型药物抗性检验结合应用。例如，在一个实施方案中，在构建由从患者病毒RNA中分离纯化的蛋白酶(PR)和逆转录酶(RT)基因序列组成的嵌合HIV-1株的基础之上应用了表型检验。随后利用其中已缺失PR/RT基因序列的标准实验室等基因(HXB2)HIV-1DNA构建体将这些株重组到CD4+T细胞中。随后重组株在上述抗病毒药物存在的情况下生长，病毒分离物的易感性表达为相对于药物对野生型实验室参考株的IC₅₀，药物对患者分离物的IC₅₀的倍数改变值。

在一个实施方案中，待测样品是从患者中制备的，而基因型测定是通过自动化的基于群体的全序列分析(ABI)来进行的。因此，应用的序列分析法可提供关于进行序列分析的区域的所有核苷酸的信息。序列分析结果可报告为相对于野生型参考序列的蛋白酶基因和逆转录酶基因中的位点的氨基酸变化。基因型分析报告中包括的这些变化可局限于显示的药物抗性相关的多态性的已知位点的突变。不需要与药物抗性无关的位点的多态性。

在更进一步的实施方案中，得到的报告表明，已经对患者病毒的区域进行了序列分析，通过检验对突变进行了检测，和/或对获得的证据进行了解释。这些解释可包括抗逆转录病毒药物、即已进行鉴定了已知的抗性相关突变的药物和/或观察到的突变指示对药物的抗性的程度。

相关的基因型和表型知识与新化合物在病毒靶上的催化位点的知识也可结合用于构建新分子和实现HIV的新(联合)治疗。

在另一实施方案中，本发明涉及对感染HIV的患者进行抗逆转录病毒治疗的有效性的评估方法，其包括：从HIV感染患者中收集样品；以及确定样品是否含有编码具有至少一种突变的HIV逆转录酶的至少一种核酸或具有至少一种突变的HIV蛋白酶的至少一种核酸。样品可为血浆样品、血细胞或其他组织。进一步，本发明提高了改善HIV基因型抗性诊断的潜力，并且原则上可得到更好的治疗，并且在特定情况下甚至能够挽救生命。

在进一步的实施方案中，本发明提供了有效抗NNRTI或NRTI抗性HIV的药物的鉴定和设计方法，此方法包括下列步骤：提供至少一株包含编码含有至少一种突变的HIV逆转录酶的核酸的至少一株HIV，确定所述HIV株对所述药物的表型反应。在甚至更进一步的实施方案中，本发明提供了有效抗HIV的PI抗性株的药物的鉴定方法，其中该株HIV包含含有至少一种突变的HIV蛋白酶，并且确定所述HIV株对所述药物的表型反应。本发明在解释HIV分离物的抗性方面也是有用的。其也可用于HIV的完全序列分析。此外，本发明可用于基于杂交的HIV序列分析或药物设计、开发、检测和销售。在进一步的实施方案中，本发明包括利用本发明的方法设计的药物。

本发明也提供了用于治疗感染HIV的患者的疗法的设计方法，其包括在具有上述的至少一种突变的HIV逆转录酶与对至少一种NNRTI或至少一种NRTI的抗性间建立相互联系，或在具有至少一种突变的HIV蛋白酶与对至少一种PI的抗性间建立相互联系。

对本发明中的可比较的突变进行的鉴定可改进抗逆转录病毒药物治疗程序。如上述所述，有大量证据可以证明药物治疗的弱病毒学反应与对一种、多种或在最坏的情况下与所有可利用的抗逆转录病毒药物的基因型和/或表型病毒抗性具有相互联系。结果，利用本发明中的相互联系进行的抗性检验可作为工具来鉴定不再有助于降低血浆病毒负载的那些药物。

实施例

实施例1：对HIV-1逆转录酶中的突变模式和相关的表型抗性进行鉴定

在欧洲和美国的常规临床实践的HIV-1感染个体中获得了血浆样品并在干冰上运送至实验室，在-70℃下贮存直至进行分析。利用重组病毒测定进行表型分析。见Kellam，P.，and B.A.Larder.Antimicrob Agents Chemother 38：23-30(1994)；Hertogs，K.，et al.，Agents Chemother.42：269-276(1998)；简单来讲，利用HIV-1特异性引物从源自患者的病毒RNA扩增得到了蛋白酶(PR)和逆转录酶(RT)编码序列。在将扩增子同源重组到缺失PR-RT的前病毒克隆中，收获得到的重组体病毒，滴定并用于体外检测对抗逆转录病毒药物的易感性。分析结果以抗性倍数值来表示，其反映了相对于利用参考野生型病毒分离物(IIIB/LAI)进行检测时获得的同种药物的平均IC₅₀(uM)，利用源自患者的重组体病毒分离物进行检测时特定药物的平均IC₅₀(uM)增加的倍数。

基因型分析是通过自动化的基于群体的全序列分析(ABI)来进行的。基因型分析结果是以相对于野生型(HXB2)参考序列的逆转录酶基因位点处的氨基酸变化来报告的。通过Virtual Phenotype

进行的簇分析的解释允许在含有临床分离物的基因序列的数据库中对突变模式的存在以及其与相同分离物的相应抗性分布型的联系进行检测。(见PCT EP01/04445)

对于模型研究来讲，利用QuickChange^J定点诱变试剂盒，STRATAGENE⁷，Stratagene Cloning systems，La Jolla，California，USA在野生型实验室HIV-1株HXB2的RT基因中产生了突变。

临床分离物的分析

表3报告了具有对齐多夫定(ZDV)和拉米夫定(3TC)的各种水平的表型抗性的临床分离物中的RT中突变44D/A、118I、184V、215Y

表3报告了具有对齐多夫定(ZDV)和拉米夫定(3TC)的各种水平的表型抗性的临床分离物中的RT中突变44D/A、118I、184V、215Y和41L的频率。此处描述的突变体分离物取自一组临床分离物。

表3：易感于或对ZDV和/或3TC具有抗性的临床分离物中相对于完全易感分离物样品的ZDV和3TC抗性相关突变频率

^a抗性(括号中)表达为相对于同种药物对野生型参考实验室HIV-1株的平均IC₅₀，药物的平均IC₅₀的倍数增加。

易感于ZDV和3TC(n＝195)的分离物(WT)：上述六种突变中的任一种突变都是低频率。

对ZDV具有抗性的分离物(＞10倍，n＝220)：表3表明，ZDV抗性相关的突变215Y、41L和70R在此类和所有的3TC抗性种类中是高频率的。184V突变在高抗性3TC类(＞50倍)中是优势突变，而184V在中等抗性3TC抗性组中很少见，在低水平抗性组和3TC易感组中不存在。在所有3TC抗性类中存在44D/A和118I突变。

对3TC具有抗性的分离物(＞10倍，n＝295)：表3表明，高水平3TC抗性相关突变184V在所有ZDV抗性种类(低，中，高)中是高频的，并且在ZDV易感组和中等抗性组中是优势突变。随着对ZDV的抗性增加，ZDV抗性相关突变41L、70R和215Y的频率也会增加，而突变184V的频率会下降。当对ZDV的抗性增加时突变44D/A和118I的频率也升高很多。

因此，这些结果表明对3TC的低和中等抗性与突变184V的存在没有关联。实际上，此突变在这些类中是不存在的。表3进一步指出，只有在ZDV抗性突变215Y、41L和70R存在的情况下突变44D/A和118I才以高频存在。在对ZDV易感的分离物中，即使3TC抗性大于10倍，ZDV抗性相关突变为低频的，并且44D/A和118I也很少。在此组中，184V的高频说明了对3TC的抗性。

对利用定点诱变产生的突变体进行的分析

表4表明，当不同突变体接受药物易感性测定时，导入野生型HXB2背景中的密码子改变和抗性倍数值。所有6种携带184V突变的突变体对3TC是高抗性的。其中两个携带44D/A和118I突变，而除一个(SDM23)外所有的都携带ZDV抗性相关突变。

表4：利用定点突变得到的突变体中的3TC和ZDV抗性相关突变和表型抗性

^a相对于同种药物对野生型参考实验室HIV-1株的平均IC₅₀，药物的平均IC₅₀的增长倍数。

^bn，每种表型药物抗性确定实验的重复实验次数。

^c括号中表示出标准误。

所有的突变体都具有预测的ZDV抗性或易感性模式。同时，产生了种具有第44位密码子改变的突变体，3种具有第118位密码子改变的突变体和3种具有第44位和第118位密码子改变的突变体。在3组突变体的每组中，两个突变体也携带与对ZDV的抗性相关的位点的改变，而一种突变体在这些密码子处仍然为野生型。表4中所列的药物抗性值清楚地表明，在第44位和第118位密码子处单独或联合存在突变可引起对3TC的中等抗性(8-32倍)，其可与由184V突变引起的对3TC的高抗性(＞62倍)相区别。此外，只有当在ZDV抗性背景(4IL，67N，210W，215Y)中发生第44位和/或第118位突变而由184V突变引起的抗性显然与ZDV抗性无关时才能观察到对3TC的中等抗性。

临床样品中RT位点44或118改变的存在与抗逆转录病毒治疗间的关系

如由表4所推断的，第44位和第118位的改变可在存在或不存在M184V取代的情况下在病毒样品中出现，而它们在具有ZDV抗性的样品中的出现率更高。因此，注意通过对患者给药以含有44D或118I的HIV分离物而进行的抗逆转录病毒治疗是感兴趣的。我们鉴定了具有44D突变的86个样品和具有118I突变的88个样品的亚组，而这些样品都是取自接受过抗逆转录病毒治疗的患者。虽然不能按照治疗史对此亚组中第44位或第118位突变的发生率作出结论，这是由于其并非为随机研究，但此项分析清楚显示了可能导致这些位点的突变的条件。

对于44D亚组来讲，86个样品中的50个样品取自在采样日接受拉米夫定的患者，在采样日前直至采样日，此亚组中的5位患者从未接受3TC。所有5位患者同时接受了齐多夫定/地达诺新，并且所有的HIV分离物在第184位上都是野生型。由于历史原因，zidouvudine治疗经历很广泛。除一位患者外所有患者接受了与其他NRTI联合给药的齐多夫定，86位患者中的70位过去接受过齐多夫定单独疗法。报告的未接受齐多夫定的一位患者曾接受过斯他夫定。此样品含有41L和215Y。

118I亚组的结果类似，因为88个样品中的55个是取自在采样日接受拉米夫定的患者，而两位患者从未接受拉米夫定(都接受过齐多夫定加地达诺新)。绝大多数患者，88位患者中的83位接受过与其他NRT I联合给药的齐多夫定，并且70位患者已经接受过齐多夫定单独疗法。88位患者中的5位未接受齐多夫定的患者曾接受过斯他夫定。对一些患者来讲，可利用连续样品来表明44D或118I的进化。

这些结果表明，当在具有ZDV抗性背景的临床分离物中存在时，HIV-1RT中的E44D/A和V118I突变可赋予对3TC的低到中等水平的抗性。利用基因型和表型簇分析对临床分离物进行鉴定，从定点诱变实验中得到的结果进一步证实在第44和第118位密码子处的突变实际上与对3TC的低到中等水平的抗性相关，其限制是存在ZDV抗性相关突变。此外，对具有治疗史并在此前接受过ZDV的临床样品进行的分析证实了从我们的大量临床数据组中得到的结果，即ZDV突变中的范围中存在44D/A和118I突变。

突变44D/A和118I能各自独立的引起对3TC的抗性。定点诱变实验没有表明这两种突变体在它们对3TC抗性的表型作用方面存在协同效应。

实施例2：确定HIV-1多核苷抗性的遗传学基础

在我们通过标准化的、基于重组表型测定和利用DNA序列分析从患者的失败治疗中建立的抗性数据库中调查了892个HIV-1样品。多核苷抗性与RT编码区域中复杂的突变模式相关。血浆样品从已接受抗逆转录病毒治疗的患者中获得。在病毒负载＞1000HIV RNA拷贝/ml的基础之上进行选择，对于此项研究，具有此水平的血浆HIV-1的患者可认为是失败治疗。

按照操作指南，利用QIAAMP

病毒RNA提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从200uL患者血浆中提取病毒RNA。如前所述，利用Expand^TM逆转录酶(Boehringer Mannheim)制备包含有部分pol基因的cDNA。见Hertogs K.，et al.，Antimicrob.Agents Chemother.42：269-276(1998)。随后利用PCR引物和上文描述的条件通过嵌套的聚合酶链式反应(PCR)对编码蛋白酶和RT区域的2.2kb片段进行扩增。随后将此遗传物质应用于表型分析和基因型分析实验中。

按照以前的描述，利用pol基因PCR片段和蛋白酶RT缺失的HIV-1分子克隆Pgem3_PRT对MT-4细胞(Harada S.，et al，Science 229：563-566(1985))进行共转染。见Hertogs K.，et al.，Antimicrob.Agents Chernother.42：269-276(1998)。这样产生了含有源自供体PCR片段的蛋白酶/RT的可存活的重组病毒。如上文描述，利用MT-4细胞病毒细胞病理作用(CPE)保护测定法确定了对核苷类似物的表型易感性。用患者的重组病毒的平均IC₅₀除以野生型对照病毒(株HXB2-D)得到抗性倍数值。通过基于双脱氧核苷酸的序列分析对从患者血浆样品中获得的PCR产物进行基因型分析。利用BigDye^TM终止子试剂盒(Applied Biosystems，Inc.(ABI))对样品进行序列分析，并且在ABI377DNA序列分析仪上分辨。

通过对包含HIV-1pol基因的野生型HXB2-D EcoR1-Pstl限制性酶片段进行定点诱变以在RT编码区域中产生突变并克隆到pGEM3(Promega)中。利用ExSite^TM诱变试剂盒(Strategene)将单和多核苷酸改变导入RT中。通过对整个RT进行DNA序列分析以证实所有突变体克隆。如上所述，利用同源重组从突变的克隆制备PCR片段并将改变的RT编码区域转移到HIV-1HXB2-D遗传背景中。随后利用上述的MT-4细胞CPE保护测定法确定这些重组体病毒对核苷类似物的易感性。

表型易感性分析

使用重组病毒测定(Antivirogramt

)同时确定样品对AZT、3TC、d4T、ddl和ddC的易感性。从分析结果可知，经鉴定，302个样品在对这些抑制剂中的至少四种抑制剂的IC₅₀(相对于野生型对照病毒)具有4倍或更大的提高。因此，在样品中存在大量的MDR病毒。

多核苷抗性样品的基因型分析

利用双脱氧核苷酸序列分析对所有的892个样品进行基因型分析。在MDR样品的RT编码区观察到多个突变的复合模式。这些突变包括AZT和3TC抗性突变的联合(特别是41L、67N、210W和215Y与184V/I)加第69位密码子(T69A/N)和/或第75位(V75M)密码子处的突变。此项分析突出了MDR组中密码子151突变簇的发生率。此外，MDR组中在密码子67-70间的氨基酸插入和重排的新家族也是普遍的。这两种突变模式与高水平表型多核苷抗性相关(图2)，27个样品具有密码子151簇，45个样品存在插入和重排(一般为T 69S取代，随后插入两个氨基酸)。图2展示了这些不同组的d4T、ddl和ddC的IC₅₀的平均倍数增长。此项分析表明，密码子69插入突变体具有高度的d4T和ddC抗性(＞10倍)，这在具有密码子151簇的突变体中也可观察到。然而，具有AZT和3TC抗性突变加T69A/N或V175M的样品仅仅对这些药物展示出中等水平的抗性(图2)。毫不惊讶，图2中的所有四组都展示出对AZT和3TC的高度抗性(AZT的IC₅₀的平均提高倍数＞500倍而3TC的IC₅₀的平均提高倍数＞30倍)。这是因为多种MDR样品含有赋予AZT抗性(如4IL、67N、210W和215Y)和3TC抗性(Met 184V/I)的突变。

在RT密码子60-70区域中观察到的不同插入谱

表3总结了在RT的密码子67-70间的多种插入。最大的组(n＝16)存在T69S取代，随后是插入两个S残基。第二大组(n＝10)也存在T69S取代，但这种情况下存在不同的S-G插入。也对69位Ser后存在大量不同的双氨基酸插入的样品进行了鉴定。此外，也观察到在密码子68和69之间存在两或三个氨基酸插入。这些插入的位点是基于T69和L70相邻这一事实。在一些样品中，很少观察到在第67位密码子处的取代(A67G/S/G)，也没有观察到常见的67N AZT抗性突变。在两个样品中观察到第70位密码子缺失(在68位和69位密码子间插入3个残基后)，并且在4个样品中观察到T69S的单取代而没有观察到插入(表3)。插入的残基没有任何明显的密码子应用模式。例如，S-S插入很少指导S69密码子的重复，这表明S69的单重复不能解释RT中的这些插入的存在。

与第69位密码子插入相关的患者治疗模式

第69位密码子插入总是存在于AZT抗性突变，尤其是T215Y/F的背景中。这并不令人吃惊，因为其样品在本研究中进行了分析的多位患者的治疗史表明了其后为核苷和蛋白酶抑制剂(数据没有展示)联合治疗的AZT治疗的常见模式。图2展示了对三位患者的典型治疗模式，其说明获得用于病毒学分析的样品的时间。不可能从这些治疗史中精确确定核苷类似物负责选择第69位密码子插入。在3TC/d4T联合治疗期间内，从患者1取得的连续样品揭示了从69S-[S-S]到69S-[S-G]的令人感兴趣的转移。

通过定点诱变构建的HIV-1变体的易感性分析

为了研究观察到的与MDR病毒相关的突变模式，我们在确定的遗传背景(HXB2-D)中通过引起特定改变的定点诱变构建了一系列病毒。AZT突变背景中的T69A和V75M很少赋予或不赋予对3TC、d4T、ddl或ddC的抗性。单独利用69S-[S-S]或联合利用69S-[S-S]与两种AZT抗性突变(210W和215Y)也构建了变体。此外，通过将此突变添加到69S-[S-S]加210W/215Y背景中，对与插入也经常相关的一种取代也进行了研究，而此种取代为A62V的潜在作用。表4中总结了六种核苷类似物的易感性数据。这些数据表明，单独的69S-[S-S]插入不能赋予多核苷抗性。事实上，此病毒仅仅能够显著降低对3TC的易感性。相反，存在插入加AZT抗性突变的变体降低了对AZT、3TC、d4T、ddC和阿巴卡夫(4-[(2-氨基-6-环丙基-氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-环戊烯-1-甲醇，1592U89)的易感性，这进一步证明69插入加AZT突变赋予了MDR表型。

实施例3：利用神经网络定义HIV-1对d4T的抗性的遗传基础

开发了三种神经网络模型(9RT、26RT和60RT模型)以研究突变模式是怎样影响d4T抗性的。9RT模型是在与d4T抗性(62V、69D、69N、69SXX、75I、75T、77L、116Y和151M)相关的Stanford序列数据库(http://www.hivb.stanford.edu)中所列的9种突变基础上建立起来的。其他模型是在d4T抗性样品中添加其次最常见的17或51种突变的基础上建立的。因此，26RT突变模型包括9RT突变模型加d4T抗性样品中的17种最常见的突变。这17种突变为41L、44D、67N、70R、75A、75M、115F、118I、184V、208Y、210W、214F、215F、215Y、219E、219N和219Q。60RT模型由26RT突变模型加d4T抗性样品中其次最常见的34种突变组成的。这34种突变为20R、35I、39A、43E、60I、65R、122K、123E、135T、162C、177E、196E、200A、207E、211K、228H、272A、277K、286A、293V、297K、329L、356K、357T、358K、359S、360T、371V、375V、376A、386I、390R、399D和400A。为了揭示何种突变有助于对预测进行改进，通过对比待检测组的9-模型和26-模型的表型结果、以及实验中的9-模型和60-模型对改进的样品IS9-26和IS9-60进行鉴定。收集并分析改进的样品的相应的基因型，屏弃包含在改进的样品中的所有额外突变，计算在IS9-26和IS9-60中发现的每种突变的频率并将其与全样品中发祥的突变进行比较。对两种频率间存在高度差异的所有突变进行鉴定，并且认为它们在赋予对d4T的抗性方面发挥了作用。在本实施例中，域值频率设为9％。从9-和26-模型中对下列突变进行了鉴定：41L(44％-79％)、44D(13％-26％)、67N(36％-56％)、70R(21％-30％)、118I(21％-36％)、210W(34％-65％)及215Y(44％-81％)。从9-和60-模型中对下列突变进行了鉴定：41L(44％-73％)、67N(36％-56％)、181I(21％-32％)、210W(34％-62％)、211K(49％-59％)及215Y(44％-74％)。总之，这些结果表明包括AZT突变在内的至少17种RT突变(此处鉴定的8种加从Standford数据库中鉴定的9种)赋予了d4T抗性。结果也鉴定出其他10种可赋予抗性的突变：184V(36％-42％)、214F(88％-94％)、75A(0.7％-0.6％)、75M(4％-8％)、115F(1％-0.2％)、208Y(13％-21％)、215F(9％-11％)、219E(5％-4％)、219N(4％-11％)及219Q(12％-16％)。

实施例4：

抗性的平均提高倍数及HIV逆转录酶基因序列中101突变的作用的概述。从药物相对于同种药物对野生型参考实验室HIV-1株的平均IC₅₀的平均IC₅₀的提高来计算抗性的提高倍数。利用奈韦拉平、地拉夫定和依法伏伦研究了突变的作用。结果以平均提高倍数及其标准差来表示。

表5：101位的逆转录酶突变及它们对逆转录酶抑制剂的抗性的相应影响的概述。数据以相对于实验室参考株(WT)的抗性提高倍数来表示。

实施例5：

抗性的平均提高倍数及HIV逆转录酶基因序列中103突变的作用的概述。从药物相对于同种药物对野生型参考实验室HIV-1株的平均IC₅₀的平均IC₅₀的提高来计算抗性的提高倍数。结果以平均提高倍数及其标准差来表示。

表6：103位的逆转录酶突变及它们对逆转录酶抑制剂的抗性的相应影响的概述。数据以相对于实验室参考株(WT)的抗性提高倍数来表示。

实施例6

抗性的平均提高倍数及HI V逆转录酶基因序列中181突变的作用的概述。从药物相对于同种药物对野生型参考实验室HIV-1株的平均IC₅₀的平均IC₅₀的提高来计算抗性的提高倍数。结果以平均提高倍数及其标准差来表示。

表7：181位的逆转录酶突变及它们对逆转录酶抑制剂的抗性的相应影响的概述。数据以相对于实验室参考株(WT)的抗性提高倍数来表示。

实施例7

抗性的平均提高倍数及HIV逆转录酶基因序列中190突变的作用的概述。从药物相对于同种药物对野生型参考实验室HIV-1株的平均IC₅₀的平均IC₅₀的提高来计算抗性的提高倍数。结果以平均提高倍数及其标准差来表示。

表8：190位的逆转录酶突变及它们对逆转录酶抑制剂的抗性的相应影响的概述。数据以相对于实验室参考株(WT)的抗性提高倍数来表示。

实施例8：通过84A突变(背景中)获得的蛋白酶抑制剂抗性的提高倍数

表9：抗性的平均提高倍数及HIV蛋白酶序列中84A突变的作用的概述。从相对于同种药物对野生型参考实验室HIV-1株的平均IC₅₀的药物的平均IC₅₀的提高来计算抗性提高倍数。

#	基因型	因地努佛	利托努佛	尼非努佛	噻喹努佛	氨匹努佛
							192021	771nStdev10I+46I+71V+771+84VnStdev10I+46I+71V+77I+84AnStdev10I+33L/I+46I+71V+77V/I+84AnStdev	62.62.235.257.9522.231.4516	60.73.132.1121.3571.438.6514.9	51.82.838.068.6522.163.1613.5	60.82.532.147.156.144.766	60.41.430.51546.610.955.5

此表例示了PR突变的背景中的84A突变，此突变赋予了对所研究的蛋白酶抑制剂的额外作用。其表明，即使在突变的复合背景中，84A突变也具有效用。相对于84V，84A突变展示了不同的抗性分布型，这教导了不仅突变的存在，而且突变的确切特性是重要的。

实施例9通过84L突变(背景中)获得的蛋白酶抑制剂抗性的提高倍数

表10：抗性的平均提高倍数及HIV蛋白酶序列中84L突变的作用的概述。从相对于同种药物对野生型参考实验室HIV-1株的平均IC₅₀的药物的平均IC₅₀的提高来计算抗性提高倍数。

#	基因型	因地努佛	利托努佛	尼非努佛	噻喹努佛	氨匹努佛
							123	10I +36I+71VnStdev10I+36I+71I+84VnStdev10I+36I+71I+84LnStdev	1.460.51.013.743.4	1.260.51.510.850.9	1.560.60.8139.4517.4	1.660.80.8110.256.5	1.060.61.110.350.2

与从相同背景中的84V突变得到的结果相对比，样品的基因型分析表明84L突变是与蛋白酶抗性相关联的。

实施例10通过84C突变(背景中)获得的蛋白酶抑制剂抗性的提高倍数

表11：抗性的平均提高倍数及HIV蛋白酶序列中84C突变的作用的概述。从相对于同种药物对野生型参考实验室HIV-1株的平均IC₅₀的药物的平均IC₅₀的提高来计算抗性提高倍数。

#	基因型	因地努佛	利托努佛	尼非努佛	噻喹努佛	氨匹努佛
							891011	77I+84VnStdev77I+84CnStdev77I+84CnStdev10I+24A+36I+46I+71V+84C	2.513.151.73.252.97.5	5.012.841.33.261.447	2.8161.9524.138.2622.351.7	3.5118.1513.318.5512.146.4	3.312.251.24.962.512.8

独特的84C突变赋予了对蛋白酶抑制剂的抗性。84C突变的出现是nelfinvir抗性的指示，但却并不局限于nelfinvir。

实施例11通过54M突变(背景中)获得的蛋白酶抑制剂抗性的提高倍数

表12：不同的蛋白酶突变的背景中的54M突变的影响以及它们对蛋白酶抑制剂抗性的相应作用。所研究的化合物的作用以相对于对野生型参考实验室HIV株确定的平均IC₅₀的其IC₅₀的平均倍数变化来表示。

病毒ID	基因型	因地努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	利托努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	尼非努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	噻喹努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	氨匹努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化
							V048880V048877V052979V052982V052981V048869V052980V052942V052949V052948V030496V052947V052943V052944V052950V048872V048873V052955V052951V052954V052940V052946V19263V052945V20160	10I+33F+77I+90M10I+33F+77I+90M10I+54M10I+54M+71V+77I+90M10I+54M+71V+90M10I+54M+77I+90M10I+54M+90M10I+71V10I+71V+77I+90M10I+71V+90M10I+77I10I+77I+90M10I+90M10I+90M33F33F+54M+77I+90M33F+54M+77I+90M33F+71V+90M33F+77I33F+77I+90M71V71V+90M77I77I+90MWT	1.32.91.82.43.27.11.30.62.78.60.42.90.50.50.63.21.75.30.41.70.70.90.40.60.9	3.620.520.013.49.420.04.10.62.310.50.56.91.81.51.58.711.477.90.32.20.42.00.41.90.6	4.99.43.810.18.728.57.00.98.69.00.78.22.21.41.07.47.736.65.25.90.63.00.93.00.7	2.71.51.44.25.45.11.40.82.14.80.33.91.10.71.25.23.120.40.41.70.81.40.31.40.9	3.87.910.43.18.99.31.40.50.62.00.51.20.40.70.730.337.52.70.32.10.30.50.60.31.0

实施例12：通过54L突变(背景中)获得的蛋白酶抑制剂抗性的提高倍数

表13：不同的蛋白酶突变的背景中的54L突变的影响以及它们对蛋白酶抑制剂抗性的相应作用。所研究的化合物的作用以相对于对野生型参考实验室HIV株确定的平均IC₅₀的其IC₅₀的平均倍数变化来表示。

病毒ID	基因型	因地努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	利托努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	尼非努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	噻喹努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	氨匹努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化
							V021667V053832V048875V048874V052969V052953V048880V048877V052971V052976V048868V052975V052973V052974V052942V052949V052948V030496V052947V052943V052944V052968V052950V052955V052951V052954V052970V053854V052972	10I10I+33F10I+33F+54L+71V+7.7I+90M10I+33F+54L+71V+77I+90M10I+33F+54L+90M10I+33F+77I10I+33F+77I+90M10I+33F+77I+90M10I+54L10I+54L+71V+77I+90M10I+54L+71V+77I+90M10I+54L+71V+90M10I+54L+77I10I+54L+90M10I+71V10I+71V+77I+90M10I+71V+90M10I+77I10I+77I+90M10I+90M10I+90M10L/I+33F/L+54L+77I33F33F+71V+90M33F+77I33F+77I+90M54L54L+71V54L+77I	0.70.43.72.11.30.81.32.90.71.76.210.20.81.70.62.78.60.42.90.50.51.30.65.30.41.70.61.70.8	1.22.925.121.34.81.13.620.51.56.59.730.51.43.60.62.310.50.56.91.81.54.71.577.90.32.22.02.32.4	1.01.612.514.53.40.94.99.41.08.915.641.32.82.60.98.69.00.78.2221.43.51.036.6525.91.65.93.0	0.90.512.04.61.41.22.71.50.71.816.524.20.81.10.82.14.80.33.91.10.71.51.220.40.41.70.70.91.0	1.10.624.632.110.41.53.87.92.62.04.16.22.11.20.50.62.00.51.20.40.72.90.72.70.32.10.85.01.1

病毒ID	基因型	因地努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	利托努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	尼非努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	噻喹努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	氨匹努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化
							V052940V052946V19263V052945V20160	71V71V+90M77I77I+90MWT	0.70.90.40.60.9	0.42.0041.90.6	0.63.00.93.00.7	0.81.40.31.40.9	0.30.50.60.31.0

实施例13：通过54V突变(背景中)获得的蛋白酶抑制剂抗性的提高倍数

表14：不同的蛋白酶突变的背景中的54V突变的影响以及它们对蛋白酶抑制剂抗性的相应作用。所研究的化合物的作用以相对于对野生型参考实验室HIV株确定的平均IC₅₀的其IC₅₀的平均倍数变化来表示。

病毒ID	基因型	因地努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	利托努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	尼非努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	噻喹努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化	氨匹努佛的IC<sub>50</sub>的倍数变化
							V052965V052942V052949V052948V030496V052947V052943V052944V052950V053831V053358V048876V052955V052951V052954V052961V052964V052963V052940V052946V19263V052945V20160	10I+54V+77I+90M10I+71V10I+7IV+77I+90M10I+71V+90M10I+77I10I+77I+90M10I+90M10I+90M33F33F+54V33F+54V+77I+90M33F+54V+77I+90M33F+71V+90M33F+77I33F+77I+90M54V54V+71V+90M54V+77I+90M71V71V+90M77I77I+90MWT	8.20.62.78.60.42.90.50.50.65.41.20.65.30.41.70.70.71.20.70.90.40.60.9	12.50.62.310.50.56.91.81.51.5129.74.95.677.90.32.21.27.12.00.42.00.41.90.6	15.10.98.69.00.78.22.21.41.05.92.11.636.65.25.91.03.33.20.63.00.93.00.7	6.30.82.14.80.33.91.10.71.21.01.31.520.40.41.71.01.41.30.81.40.31.40.9	0.70.50.62.00.51.20.40.70.77.51.01.12.70.32.10.50.30.50.30.50.60.31.0

此处引用的参考文献、专利及专利申请在此全文引入作为参考。

在不偏离本发明的思想或范围的情况下，可对本发明中的组合物和方法进行多种修饰和改变，这对于本领域中的那些熟练技术人员来讲是显而易见的。因此，只要它们在所附权利要求和它们的等同物范围之内，本说明书涵盖对本发明进行的修饰和改变。

Claims (6)

1.编码具有选自54L、54M、54V和第84位密码子处的任何突变的至少一种突变的HIV蛋白酶的核酸在制备用于评价蛋白酶抑制剂作为HIV感染患者的抗病毒疗法的有效性的药物中的用途，其中所述蛋白酶抑制剂选自氨匹努佛、因地努佛、尼非努佛、利托努佛和噻喹努佛，并且其中第84位密码子处的突变选自84A、84C和84L。

2.权利要求1的用途，其中HIV蛋白酶中的至少一种突变与HIV蛋白酶第10和/或第90位密码子处的至少一种突变相联合。

3.权利要求1或2的用途，其中HIV蛋白酶中的至少一种突变与HIV蛋白酶中选自10I、20R、20T、24I、33F、33I、33L、36I、46L、71T、71V、77I、77V、82I、82V或90M的至少一种突变相联合。

4.编码具有选自54L、54M、54V和第84位密码子处的任何突变的至少一种突变的HIV蛋白酶的核酸在制备用于用蛋白酶抑制剂治疗HIV感染患者的疗法的设计方法的药物中的用途，其中所述蛋白酶抑制剂选自氨匹努佛、因地努佛、尼非努佛、利托努佛和噻喹努佛，并且其中第84位密码子处的突变选自84A、84C和84L。

5.权利要求4的用途，其中HIV蛋白酶中的至少一种突变与HIV蛋白酶第10和/或第90位密码子处的至少一种突变相联合。

6.权利要求4或5的用途，其中HIV蛋白酶中的至少一种突变与HIV蛋白酶中选自10I、20R、20T、24I、33F、33I、33L、36I、46L、71T、71V、77I、77V、82I、82V或90M的至少一种突变相联合。

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